CN111304283A - 一种基于循环酶速率法测定hcy的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测试剂制备领域，提供了一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。试剂R1包括缓冲液、S‑腺苷甲硫氨酸、NADH、三(2‑羧乙基)膦氯化氢、防腐剂、稳定剂、表面活性剂。试剂R2包括缓冲液、无机盐、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、a‑酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、HCY甲基转移酶、腺苷脱氨酶、防腐剂、稳定剂、表面活性剂。本发明还提供了一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的制备使用方法。本发明试剂盒用于测定HCY的含量，其操作简便、检测速度快、精密度高、易于自动化，且适于大批量标本同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂制备领域，尤其涉及一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
同型半胱氨酸(HCY)在血浆中分两种形式存在：“氧化型同型半胱氨酸”和“还原型同型半胱氨酸”。还原型同型半胱氨酸中游离的巯基具有高度活性，其容易氧化，从而形成二硫化物的形式。氧化型是同型半胱氨酸在血浆中的主要存在形式，以二硫化物形式或是与蛋白质共价结合的形式存在。
HCY可使氧化自由基大量产生引起内皮细胞损伤，使脂质过氧化和氧化型的低密度增加，从而对血管造成的损伤和破坏。在HCY的作用下，破损的血管壁生成了斑块，促进动脉粥状硬化。
HCY主要临床应用如下：
1、心血管病防治
(1)HCY升高与动脉粥样硬化(AS)的关系
1969年就曾有人从尸检中发现2例血浆HCY浓度超过正常人几十倍的病人存在广泛的动脉粥样硬化和动脉血栓。临床上发现，高胱氨酸尿症病人早年多因全身动脉粥样硬化和血栓形成死于脑梗塞和心肌梗塞，这与血中HCY升高有关。
(2)HCY水平与心血管疾病的危险性
通过血管内超声观察AS斑块情况观察到，当血浆HCY浓度<8umol/L时，斑块较小(0.17-0.76mm)；当血浆HCY浓度>8umol/L时，斑块明显增大(0.27-1.04，p<0.001)，表明与冠状动脉病变程度呈正相关。轻度、中度HCY水平升高可使心血管疾病死亡危险性增加4-6倍，血浆总HCY水平每升高5μmol/L，则CHD危险性男性增加60％，女性增加80％。
2、HCY与神经系统疾病
脑血管病是目前严重危害人类健康的主要疾病。近年来，随着分子生物学的深入发展，HCY在脑卒中的作用日益受到重视，普遍认为血浆HCY>15umol/L为高HCY血症，普通人群血浆HCY水平升高者只有不到5％，而在脑卒中患者中可达30-40％
HCY的升高是与中风有重要关联的危险因子。美国最新的数据显示中年后期男性中风发病率，处于55-64这个年龄段的男性相对于45-54年龄段的男性而言，前者患中风的几率是后者的三倍。
高HCY是造成老年痴呆症与帕金森的重要因素。
3、糖尿病及并发症防治
国内外大量研究结果显示，血浆HCY水平可作为2-型糖尿病患者患大血管疾病的独立危险因素。
监测糖尿病患者HCY水平，有利于对其预后的评估。HCY升高在糖尿病伴肾脏、视网膜及血管并发症的患者更为严重。高HCY血症也能促进糖尿病微血管并发症的发生与发展。
4、慢性肾衰并发症防治
慢性肾功能衰竭(CRF)患者普遍有高HCY血症，其发生率是正常人33倍。
尿毒症时，一方面肝脏蛋氨酸腺苷转移酶活性升高，导致S-腺苷蛋氨酸水平升高；另一方面肾功能下降，使HCY代谢的必需产物-丝氨酸合成减少，导致HCY代谢受抑制引起HCY的堆积。
5、肺血栓栓塞症防治
研究表明，高HCY血症(>20μmol/L)使得深静脉血栓的危险性明显增大，高HCY血症可使深静脉血栓发生率增加4倍。
高HCY是我国汉族人群肺血栓栓塞症(PTE)发病的一个独立的危险因子，降低HCY可降低国人静脉血栓栓塞症(VTE)的危险。
目前，HCY的常用检测方法要有色谱法(HPLC、GC-MS)、荧光偏振免疫检测法(FPLA)、酶联免疫法、化学发光法和循环酶法。其中，色谱法具有很高的准确度和稳定性，但其处理标本的能力有限，临床实验室未配备设备及操作人员，常作为同型半胱氨酸检测的参考方法；荧光偏振免疫检测法成本高，需专用仪器；酶联免疫法灵敏度高、特异性强，但其精密度差，耗费人力，操作时间长，不适宜做单个标本和急诊标本；化学发光法成本高，需专用仪器；循环酶法可在大型生化分析仪上使用，操作简单，结果准确可靠，且可和其他参数进行同时分析，是目前最为常用的临床检测方法。
据此，目前急需一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒及其制备使用方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、检测速度快、精密度高、易于自动化，且适于大批量标本同时检测的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：缓冲液5-10g/L，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)5-15g/L，NADH 10-30g/L，三(2-羧乙基)膦氯化氢(TCEP)10-25g/L，防腐剂1-3mL/L，稳定剂3-14g/L，表面活性剂0.5-2.5mL/L，溶剂为纯化水；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：缓冲液2-10g/L，无机盐5-15g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)2-8.5g/L，a-酮戊二酸5-10g/L，谷氨酸脱氢酶(GLDH)2-11g/L，HCY甲基转移酶(HMTase)0.5-5g/L，腺苷脱氨酶(ADA)0.5-1.5g/L，防腐剂1-3mL/L，稳定剂20-46g/L，表面活性剂1-7mL/L，溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，在所述试剂R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述防腐剂为Proclin300、庆大霉素和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、甘氨酸和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1的pH为6.1-6.6。
作为本发明的优选方式之一，在所述试剂R2中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300、庆大霉素和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、甘氨酸和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的pH为6.5-7.7。
一种上述基于胶乳增强免疫比浊法测定HCY的试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
(3)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存。
一种上述基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取13μL样本，加入240μL试剂R1，37℃孵育3-5min；
(2)再加入60μL试剂R2，混匀；
(3)37℃孵育180s，在主波长340nm/副波长405nm下连续监测2分钟吸光度变化，计算△A/min，根据ΔA测算样本中HCY含量。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒用于测定HCY的含量，其操作简便、检测速度快、精密度高、易于自动化，且适于大批量标本同时检测；
(2)本发明优先选择效果好的缓冲液，使用高效的防腐剂、稳定剂、保护试剂，从而较好的保证了试剂的稳定性，尤其是热稳定性，方便临床的推广和使用；
(3)通过本发明配方和方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求。
附图说明
图1是实施例6中本发明试剂盒的拟合曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液5g/L，S-腺苷甲硫氨酸5g/L，NADH10g/L，三(2-羧乙基)膦氯化氢10g/L，庆大霉素1mL/L，甘氨酸3g/L，吐温-80 0.5mL/L，溶剂为纯化水，pH6.1。
试剂R2包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液2g/L，氯化镁或氯化钾5g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶2g/L，a-酮戊二酸5g/L，谷氨酸脱氢酶2g/L，HCY甲基转移酶0.5g/L，腺苷脱氨酶0.5g/L，庆大霉素1mL/L，甘氨酸20g/L，吐温-80 1mL/L，溶剂为纯化水，pH 6.5。
实施例2
本实施例的一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1包括的成分及相应含量为：2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液或3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液10g/L，S-腺苷甲硫氨酸15g/L，NADH 30g/L，三(2-羧乙基)膦氯化氢25g/L，硫柳汞3mL/L，蔗糖14g/L，曲拉通X-100 2.5mL/L，溶剂为纯化水，pH 6.6。
试剂R2包括的成分及相应含量为：甘氨酸缓冲液10g/L，氯化锌或氯化钙15g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶8.5g/L，a-酮戊二酸10g/L，谷氨酸脱氢酶11g/L，HCY甲基转移酶5g/L，腺苷脱氨酶1.5g/L，硫柳汞3mL/L，蔗糖46g/L，曲拉通X-100 7mL/L，溶剂为纯化水，pH7.7。
实施例3
本实施例的一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1包括的成分及相应含量为：三羟甲基氨基甲烷缓冲液8.16g/L，S-腺苷甲硫氨酸10.4g/L，NADH 20g/L，三(2-羧乙基)膦氯化氢15g/L，Proclin3001.8mL/L，BSA 6g/L，吐温-20 1.5mL/L，溶剂为纯化水，pH 6.4。
试剂R2包括的成分及相应含量为：3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液3.2g/L，氯化钠11.9g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶4.1g/L，a-酮戊二酸6.9g/L，谷氨酸脱氢酶6.2g/L，HCY甲基转移酶1.9g/L，腺苷脱氨酶0.9g/L，Proclin3001.8mL/L，BSA 25g/L，吐温-204.5mL/L，溶剂为纯化水，pH 7.1。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
(4)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的使用方法。
检测仪器：日立7180；
温度：37℃；
比色杯：1cm
分析方法：速率法；
主副波长：340/405；
样本量/R1/R2：13uL/240uL/60uL；
反应方向：下降(-)。
使用步骤：参见表1。
表1本发明试剂盒的使用步骤
校准方式为Rate，建立工作曲线。
计算方法：以校准品浓度对相应△A拟合校准曲线，样本浓度值通过校准曲线得出。
实施例6
本实施例的用以评价上述实施例中基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的性能：
(1)线性
线性相关系数：在[0umol/L-50.0umol/L]范围内的高值标本用蒸馏水倍比稀释成5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次，分别计算测定结果的均值(yi)，见表2。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应满足线性相关系数r≥0.9900。
表2本发明试剂盒的线性相关性比对值
图1是本发明试剂盒的拟合曲线图，如图1所示，本发明试剂盒的直线拟合曲线为：y＝0.999x+0.1825，R2＝1.0，R2>0.99，满足临床要求。
(2)精密度、重复性验证
重复性：在重复条件下，取高，低值质控血清标本(或校准品)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准差，按公式(2)计算批内变异系数(CV)，所得结果CV应≤8.0％。
式中：SD为标准差，计算公式为
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
xn为同水平各次所测值；
结果如表3所示。
表3本发明试剂盒的重复性检测结果总结表
由检测结果可以看出，低值样本的CV为1.88％，高值样本的CV为1.69％，均小于8％，满足临床要求。
(3)准确度验证
取高、低两个水平的质控血清标本，按照说明书操作步骤进行测定，用同一批号试剂重复测定3次，测试结果记为(xi)，按公式(3)求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测试20次，并分别按照公式(3)计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证，即符合测定值与质控品靶值相对偏差≤15.0％的要求。
式中：xi为测定结果；
T为靶值。
结果如表4所示。
表4本发明试剂盒的准确度检测结果总结表
从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为2.67％，高值质控的相对偏差为3.43％，均小于15％，故满足临床要求。
综上所述，本发明提供了一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒及其制备使用方法，能有效的提升HCY检测试剂的灵敏度与特异性，实现了上全自动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1包括的成分及相应含量为：缓冲液5-10g/L，S-腺苷甲硫氨酸5-15g/L，NADH10-30g/L，三(2-羧乙基)膦氯化氢10-25g/L，防腐剂1-3mL/L，稳定剂3-14g/L，表面活性剂0.5-2.5mL/L，溶剂为纯化水；
所述试剂R2包括的成分及相应含量为：缓冲液2-10g/L，无机盐5-15g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶2-8.5g/L，a-酮戊二酸5-10g/L，谷氨酸脱氢酶2-11g/L，HCY甲基转移酶0.5-5g/L，腺苷脱氨酶0.5-1.5g/L，防腐剂1-3mL/L，稳定剂20-46g/L，表面活性剂1-7mL/L，溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，其特征在于，在所述试剂R1中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述防腐剂为Proclin300、庆大霉素和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、甘氨酸和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH为6.1-6.6。
4.根据权利要求1所述的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，其特征在于，在所述试剂R2中：
所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种；
所述无机盐为氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或多种；
所述防腐剂为Proclin300、庆大霉素和硫柳汞中的一种；
所述稳定剂为BSA、甘氨酸和蔗糖中的一种；
所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的pH为6.5-7.7。
6.一种如权利要求1-5任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定HCY的试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存；
(2)配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量称取各原料，并置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶解，搅拌均匀；然后，将pH调节到目标值；最后，将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，再用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8℃保存。
7.一种如权利要求1-5任一所述的基于循环酶速率法测定HCY的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取13μL样本，加入240μL试剂R1，37℃孵育3-5min；
(2)再加入60μL试剂R2，混匀；
(3)37℃孵育180s，在主波长340nm/副波长405nm下连续监测2分钟吸光度变化，计算△A/min，根据ΔA测算样本中HCY含量。
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