CN106053830A - 一种测定同型半胱氨酸的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定同型半胱氨酸的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：磷酸盐缓冲液、氯化钠、S‑腺苷甲硫氨酸、还原型辅酶Ⅱ、三（2‑羧乙基）膦氯化氢、叠氮钠，试剂R2：磷酸盐缓冲液、HCY甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶、牛血清白蛋白、叠氮钠，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的同型半胱氨酸的浓度。本发明具有操作方便、准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定同型半胱氨酸的试剂盒及其制备方法。
背景技术
同型半胱氨酸，又称高半胱氨酸，是蛋氨酸去甲基后形成的一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸循环的中间产物，由S-腺苷同型半胱氨酸水解而来，同时也是胱硫醚β合成酶合成胱硫醚的底物。血液中的总同型半胱氨酸包括同型半胱氨酸、同型半胱氨酸二硫化合物和胱氨酸-同型半胱氨酸，3种形式，它们大部分以蛋白结合方式存在，小部分处于游离状态。
血浆同型半胱氨酸是蛋氨酸循环的中间产物，受到遗传因素、营养状况、肝、肾功能及一些疾病时的代谢状况的影响,已开展的众多研究表明，同型半胱氨酸可称为心、脑及外周血管疾病的一种独立危险因素，维生素B6、叶酸等物质可在一定程度上降低其水平。
目前检测同型半胱氨酸的方法主要为同位素法、色谱法、免疫学法,但是这些方法操作繁琐，而且会造成放射污染，且所需的检测仪器较为昂贵，成本较高，对于临床大规模开展检测标本的推广有一定的难度，另外市场上的其它方法也存在准确度差的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、成本高以及准确度差的缺陷，而提供一种测定同型半胱氨酸的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定同型半胱氨酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
氯化钠 40~120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2~1.4 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2~8 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6~3.0 mmol/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0~3.5 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5~3.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 2.0~4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定同型半胱氨酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
氯化钠 80mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.8 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 5 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 1.8mmol/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 50 mmol/L
HCY甲基转移酶 2 KU/L
谷氨酸脱氢酶 2.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 3.0 KU/L
牛血清白蛋白 25 g/L
叠氮钠 0.7g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明还公开了上述测定同型半胱氨酸的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
氯化钠 40~120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2~1.4 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2~8 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6~3.0 mmol/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0~3.5 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5~3.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 2.0~4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的同型半胱氨酸的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为5:1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比的比例在1:10到1:30之间。
本发明的检测原理是：在三（2-羧乙基）膦氯化氢作用下，氧化结合型同型半胱氨酸转化为游离型同型半胱氨酸，游离型同型半胱氨酸与S-腺苷甲硫氨酸（SAM）反应生成S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），SAH被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶水解成腺苷和同型半胱氨酸，形成同型半胱氨酸可以循环加入反应，腺苷水解生成的氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使还原型辅酶Ⅱ（NADPH）转化为氧化型辅酶Ⅱ（NADP），在340nm处测定NADPH的吸光度变化，求得同型半胱氨酸含量。
样本中同型半胱氨酸（HCY）的活性（umol/L）= CS ×（umol/L）
式中：ΔAU/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值
ΔAB/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值
CS 校准液中HCY的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明可应用于全自动生化分析仪，大大简化了操作，且检测时间短，在试剂中添加了稳定剂牛血清白蛋白和防腐剂叠氮钠，使得试剂中的酶稳定性上升，检测结果更加准确。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
氯化钠 80mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.8 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 5 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 1.8mmol/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 50 mmol/L
HCY甲基转移酶 2 KU/L
谷氨酸脱氢酶 2.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 3.0 KU/L
牛血清白蛋白 25 g/L
叠氮钠 0.7g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20mmol/L
氯化钠 120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6 mmol/L
叠氮钠 0.3g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 1.1 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
氯化钠 80mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.8 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 5 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 1.8mmol/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 50 mmol/L
HCY甲基转移酶 2 KU/L
谷氨酸脱氢酶 2.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 3.0 KU/L
牛血清白蛋白 25 g/L
叠氮钠 0.7g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负方向；
3、检测步骤
（a） 取200μl试剂R1与12μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 根据样本中同型半胱氨酸（HCY）的活性（umol/L）= CS × （umol/L）计算出样本中的同型半胱氨酸的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20mmol/L
氯化钠 120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6 mmol/L
叠氮钠 0.3g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15 g/L
叠氮钠 1.1 g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负方向；
3、检测步骤
（a） 取200μl试剂R1与12μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入40μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 根据样本中同型半胱氨酸（HCY）的活性（umol/L）= CS × （umol/L）计算出样本中的同型半胱氨酸的浓度。
表1为实施例1所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的同型半胱氨酸的浓度为 18.0 umol/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（umol/L） | 第2次（umol/L） | 第3次（umol/L） | 均值（umol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 18.7 | 17.6 | 18.3 | 18.20 | 1.11 |
| 实施例2 | 18.9 | 18.4 | 18.4 | 18.57 | 3.17 |
由表1可知，本发明所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的同型半胱氨酸的浓度为32.0 umol/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（umol/L） | 第2次（umol/L） | 第3次（umol/L） | 均值（umol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 31.2 | 31.4 | 32.7 | 31.77 | 1.00 |
| 实施例2 | 32.3 | 32.6 | 32.8 | 32.57 | 1.78 |
由表2可知，本发明所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定同型半胱氨酸的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种测定同型半胱氨酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
氯化钠 40~120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2~1.4 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2~8 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6~3.0 mmol/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0~3.5 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5~3.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 2.0~4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定同型半胱氨酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 50mmol/L
氯化钠 80mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.8 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 5 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 1.8mmol/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 50 mmol/L
HCY甲基转移酶 2 KU/L
谷氨酸脱氢酶 2.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 3.0 KU/L
牛血清白蛋白 25 g/L
叠氮钠 0.7g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种测定同型半胱氨酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
氯化钠 40~120 mmol/L
S-腺苷甲硫氨酸 0.2~1.4 mmol/L
还原型辅酶Ⅱ 2~8 KU/L
三（2-羧乙基）膦氯化氢 0.6~3.0 mmol/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
磷酸盐缓冲液 20~80 mmol/L
HCY甲基转移酶 1.0~3.5 KU/L
谷氨酸脱氢酶 1.5~3.5 KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶 2.0~4.0 KU/L
牛血清白蛋白 15~30 g/L
叠氮钠 0.3~1.1 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的同型半胱氨酸的浓度。
4.根据权利要求1所述的一种测定同型半胱氨酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为5:1。
5.根据权利要求1所述的一种测定同型半胱氨酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比的比例在1:10到1:30之间。
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