CN104111337A - 抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗干扰性强的检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括体积比为4:1的组分1和组分2，本试剂盒能够与化学发光检测的结果具有高度的一致性，检测临床样本准确度、灵敏度比常规的试剂要好，有利于提高临床检测同型半胱氨酸的准确性。

Description

抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒。 

背景技术

同型半胱氨酸即高半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，在旁链部份硫醇基（-SH）前包含一个额外的亚甲基（-CH2-），1969 年Mccully 从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现, 其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化（AS）的病理表现，由此提出高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia,HHCY） 可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。此后，各国学者对HCY 与心脑血管疾病的相关关系做了大量研究。Hcy 是一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。在体内，约1/2 的Hcy 和甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶（Methionine Synthase reductase,MS）的作用下，生成蛋氨酸和四氢叶酸，四氢叶酸在N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetralydrofolate,MTHFR） 的作用下生成甲基四氢叶酸；其余约1/2 的Hcy 通过转硫基途径，即Hcy 与丝氨酸在胱硫醚β合成酶（Cystathionineβ-synthase,CBS）作用下形成胱硫醚，一部分在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸，最后生成丙酮酸、硫酸和水，此过程需维生素B6 为辅酶及丝氨酸羟甲基转移酶，另一部分则生成同型丝氨酸。任何原因引起前两条代谢途径障碍时，升高的Hcy 在氨基酰-tRNA 合成酶的作用下，生成同型半胱氨酸硫内酯（homocysteine thiolactone,HTL），HTL 是Hcy 在氨基酰-tRNA合成酶编辑或校正过程中形成的反应产物，属一种环硫酯。Hcy可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成。 

最早检测同型半胱氨酸是氨基酸分析法，Ueland等测定血清中同型半胱氨酸，后经改良，目前常用方法包括以下几种。 

同位素法：由Refsum等1985年建立的方法。该方法通过14C标记的腺苷与HCY缩合后，经色谱分离，液体闪烁计数放射强度来测HCY浓度。该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，未能推广使用。 

色谱法：1987年Stabler首先报道了气相色谱―――质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。虽然灵敏度、特异性好，但仪器价格昂贵而不能推广。高效液相色谱法（HPLC）是目前比较成熟且推广使用的方法，不足之处是样品处理、层析条件、样品检测及定量的诸多变异，使其难以标准化。Fiskertrand等首先于1993年用全自动高效液相色谱法对血浆和尿液的HCY和硫醇物进行测定。HPLC根据衍生方式（柱前或柱后衍生）、检测方法（荧光、电化学）可分为多种方法。应用HPLC准确测定同型半胱氨酸需要优良的设备、高超的技术经验和应用HPLC方法适当的时间，另外选择和制备内部质控也相当重要。 

免疫学法：该法应用特异性的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆技术，采用荧光偏振法或免疫法测定HCY.美国雅培公司采用全自动荧光偏振免疫技术，用AXSYM仪器检测HCY，反应原理为：正常人血浆中HCY约1%以还原型存在，70%与白蛋白结合，30%形成小分子二硫化物。血浆标本在含二硫苏糖醇的预处理液作用下，HCY、混合的二硫化物及蛋白结合型等均被还原成游离HCY形式（tHCY）：tHCY在S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）水解酶和过量腺苷存在下，被转换成SAH；预稀释的SAH混合物、抗-SAH单克隆抗体及标记的荧光S-腺苷-L-半胱氨酸示踪物一同孵育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本总HCY水平。此方法快捷、操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，具有良好的准确度与精密度，适合大多数临床实验室应用。 

其中HPLC法是最常用的方法，但是需要特殊设备。免疫学法是利用酶的底物特性，放大靶物质（被测物）的检测方法，此法仅循环靶物质，具有快速、简便、灵敏度高，易于自动化等特点。 

免疫学法的检验原理是：在TCEP作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型HCY，游离型HCY与共价底物S腺苷甲硫氨酸（SAM）在HCY甲基转移酶催化下反应形成蛋氨酸（Met）和S腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH被SAH水解酶水解成腺苷和HCY，形成的HCY可以循环加入反应，从而放大检测信号，腺苷(Ado)水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的HCY的浓度与NADH的变化成正比 

利用酶法对同型半胱氨酸进行检测的方法操作简单，而且检测同型半胱氨酸对临床心血管疾病诊断有着很好指导意义，因此最近几年得到了很好的推广。但是该检测方法，容易受到血清中丙酮酸等杂质物质的干扰，造成检测的结果不准确，在与化学发光检测试剂盒比对时，结果有偏差，不利于临床检测应用。

发明内容

针对于上述常规同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）存在的技术问题，本发明提供了一种抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），本试剂盒能够与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），检测临床样本准确度、灵敏度比常规的试剂要好，有利于提高临床检测同型半胱氨酸的准确性。 

本试剂盒的特征在于： 

本试剂盒包括体积比为4:1的组分1（R1）和组分2（R2），各组分的原料及含量如下：

试剂1（R1）：                                        

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                          0.1mM

NADH                                          0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                  5 mM

α－酮戊二酸                                     5.0mM

抗坏血酸氧化酶                                 2.5 KU/L；

试剂2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase）                       5 KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                             10 KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）        2.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                             5.0KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS）                          20-30 KU/L

本发明的有益效果：

本发明提供的灵敏度高的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），通过在组分2中加入胱硫醚β-合成酶和抗坏血酸氧化酶，有效地增加了试剂的抗干扰性，提高了试剂盒的分析灵敏度，比常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）抗干扰性强，灵敏度高，增强了市场竞争力，有利于试剂的市场推广。

附图说明

图1对照组检测结果与化学发光性检测结果相关性图。 

图2为本发明检测结果与化学发光性检测结果相关性图。 

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。 

实施例1

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                          0.1mM

NADH                                          0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                  5 mM

α－酮戊二酸                                     5.0mM

抗坏血酸氧化酶                                 2.5 KU/L；

试剂2（R2）：

Hcy甲基转移酶（HMTase）                       5 KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                             10 KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）        2.5KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                             5.0KU/L

胱硫醚β-合成酶（CBS）                          20-30 KU/L

本实施例描述的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝40自动分析仪，操作如表1：

表1 同型半胱氨酸检测试剂检测方法

计算：同型半胱氨酸浓度＝（测定/min÷标准/min）×C标准

  线性相关性实验：

对Sigma-Aldrich超纯物质同型半胱氨酸配制成51.2 μmol/L浓度的高值样本，对该样本等比例稀释成25.6μmol/L、12.8μmol/L、6.4μmol/L、3.2μmol/L、0μmol/L浓度的样本，对照组以市售的北京九强生物技术有限公司销售的同型半胱氨酸检测试剂盒，实验组以本发明中实施例制备的试剂盒为检测试剂，。检测结果如表2所示：

表2 线性相关性检测结果

通过检测理论标准品，实施例1检测结果相关性为0.9928，实施例2检测结果的相关性为0.9999，说明在试剂中加入抗坏血酸氧化酶和胱硫醚β-合成酶（CBS），增强了试剂检测的线性相关性，检测结果更精确。

准确度验证实验：

应用实施例1和北京九强生物技术有限公司销售的同型半胱氨酸的试剂盒，对比Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的同型半胱氨酸检测试剂盒（化学发光），对40个样本进行检测，检测的结果如图1和图2所示。

通过检测结果的对比，对照组的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的化学发光试剂盒检测结果相关性为0.9581，小于要求的0.990，相关性比较差，而实施例1的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的化学发光试剂盒检测结果相关性为0.9989，能达到≥0.990的要求，显示本发明的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的同型半胱氨酸检测试剂盒（化学发光）有高度一致性。 

抗干扰性试验

取新鲜混合血清，分成11等份，然后将每等份再分成10等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表3的要求。对照组以市售的北京九强生物技术有限公司销售的同型半胱氨酸检测试剂盒，实验组以本发明中实施例1制备的试剂盒为检测试剂，分别测定血清中HCY的含量，对照组与实验组的测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表3。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表3可以看出，本发明对检测结果没有明显的干扰，而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明本发明试剂的抗干扰性能力远远优于对照组市售试剂。 

  

表3   对照组与实验组抗干扰性能比较

本发明提供的抗干扰性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），包括体积比为R1：R2=240:65的组分1（R1）和组分2（R2）组成。通过在组分1中加入抗坏血酸氧化酶，有效地增强了试剂盒的抗干扰性，减小了丙酮酸等干扰物质对试剂盒检测的影响，从而增强了试剂检测的准确性，与化学发光检测试剂盒检测结果达到极高的一致性，比常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）灵敏度和准确度高，增强了市场竞争力，有利于试剂的市场推广。

Claims (1)

1.一种抗干扰性强的检测试剂盒，其特征在于，由体积比为4:1的组分1和组分2组成，各组分的原料及含量如下：

试剂1：                                        

S-腺苷甲硫氨酸                          0.1mM

NADH                                          0.3mM

三（2羧乙基）膦氯化氢                  5 mM

α－酮戊二酸                                     5.0mM

抗坏血酸氧化酶                                 2.5 KU/L；

试剂2：

Hcy甲基转移酶                              5 KU/L

谷氨酸脱氢酶                                10 KU/L

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶        2.5KU/L

腺苷脱氨酶                                    5.0KU/L

胱硫醚β-合成酶                              20-30 KU/L 。