CN109358017B - 同型半胱氨酸测定试剂盒及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同型半胱氨酸测定试剂盒及其制备方法和检测方法，该同型半胱氨酸测定试剂盒包括试剂R1和试剂R2，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：磷酸缓冲液、1.8～2.2mL/L的曲拉通X‑100、0.11～0.16g/L的L‑丝氨酸、805～815KU/L的乳酸脱氢酶、0.5～0.75g/L的NADH以及0.8～1.2mL/L的ProcLin300；试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：磷酸缓冲液、1.8～2.2mL/L的曲拉通X‑100、0.05～0.10g/L的二水合乙二胺四乙酸二钠盐、0.8～1.2mL/L的ProcLin300、20.0～22.0KU/L的胱硫醚‑β‑合成酶以及10.0～14.0KU/L的胱硫醚‑β‑分解酶。该同型半胱氨酸测定试剂盒通过筛选包含特定配比的各组分分别形成试剂R1和试剂R2，检测下限低，灵敏度高，整体的线性范围宽，稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种同型半胱氨酸测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
背景技术
同型半胱氨酸(HomoLysteine，HCY)又称高半胱氨酸，是一种含巯基的氨基酸，为白色结晶，熔点232℃～233℃，能溶于水及乙酸，微溶于醇，不溶于醚，是胱硫醚和蛋白酸转硫化或甲基化代谢旁路中形成的中间产物，是蛋白质生物合成过程中没被正常利用的一种氨基酸前体。HCY在人体主要两种代谢过程，即再甲基化过程和转硫基过程。再甲基化过程：HCY可以再甲基化重新形成蛋氨酸而参加蛋氨酸循环，此过程需维生素B12、甲基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、叶酸、甜菜碱及胆碱。转硫基过程：HCY和丝氨酸在胱硫醚合成酶作用下生成胱硫醚，再在胱硫醚酶作用下形成半胱氨酸，然后分解为丙酮酸、硫酸和水。在此过程中，β-胱硫醚合成酶和胱硫酸酶的活性都依靠于维生素B6。
同型半胱氨酸已成为心血管、动脉粥样硬化和中风等疾病诊断的重要因素。关于同型半胱氨酸的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC法)、气相色谱-质谱法(GC-MS法)、酶免疫检测法(ELA法)、荧光偏振免疫检测法(FPLA法)、高效毛细管电泳法和循环酶法。然而，目前常规循环酶法所采用的HCY试剂盒的灵敏性和开盖稳定时间依然有待提升。
发明内容
基于此，有必要针对提供一种灵敏度高且开盖稳定时间长的同型半胱氨酸测定试剂盒及其制备方法和检测方法。
一种同型半胱氨酸测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
在其中一个实施例中，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
在其中一个实施例中，所述同型半胱氨酸测定试剂盒还包括校准品，所述校准品选自北京世纪沃德生物技术有限公司生产的HCY校准品，浓度为28μmol/L。
一种上述任一项所述的同型半胱氨酸测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
配制试剂R1：按照上述任一项所述的试剂R1的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100和Proclin300，混匀，再加入L-丝氨酸，溶解，再依次加入乳酸脱氢酶和NADH，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存；
配制试剂R2：按照上述任一项所述的试剂R2的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100、二水合乙二胺四乙酸二钠盐和Proclin300，溶解，再加入胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存；
将制备获得的试剂R1和试剂R2按照体积比10:1的比例分别分装，再将分装后的试剂R1和分装后的试剂R2一对一组装，即得。
一种上述任一项所述的同型半胱氨酸测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
选取如下表所示的试验条件：
| 主波长 | 340nm | 副波长 | 400～700nm |
| 分析方法 | 速率法 | 反应时间 | 10min |
| 校准方法 | 两点线性法 | 反应方向 | 向下 |
按照下表所示的步骤进行测试：
按如下公式计算待测样品中的同型半胱氨酸的含量：
样本中HCY含量(μmol/L)＝(ΔA样品/min－ΔA空白/min)×C标准/(ΔA标准/min－ΔA空白/min)
式中：C标准指标准品HCY的质量浓度；
ΔA样品/min指样品管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA标准/min指标准管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA空白/min指空白管平均每分钟的吸光度变化。
本发明的有益效果是：
本发明的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒采用循环酶法，通过筛选包含特定配比的各组分分别形成试剂R1和试剂R2，不含还原剂成分，即可使得对血清中HCY的检测下限达1μmoL/L，灵敏度高，与HPLC法具有良好的线性相关性，准确度高，开盖后依然可稳定1个月，稳定时间长。
附图说明
图1为实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与CDCREFERFNCE HPLC方法测试标本结果相关性比较拟合图，横纵坐标轴的单位均为μmoL/L；
图2为实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的稳定性测试结果统计图，横轴指代存储的时间，横轴的单位为月，纵轴的单位为μmoL/L；
图3为实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与AXSYM公司生产的HCY试剂盒同时在AU400全自动生化仪测定SST血清样本，测定结果相关性比较拟合图，其中，横轴代表AxSYM公司HCY试剂盒测定SST血清样本结果，纵轴代表实施例1的HCY试剂盒测定SST血清样本结果，横纵轴的单位均为μmoL/L；
图4为实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与AXSYM公司生产的HCY试剂盒同时在AU400全自动生化仪测定肝素抗凝血浆样本，测定结果相关性比较拟合图，其中，横轴代表AxSYM公司HCY试剂盒测定SST血清样本结果，纵轴代表实施例1的HCY试剂盒测定SST血清样本结果，横纵轴的单位均为μmoL/L。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(循环酶法)，包括独立包装的试剂R1、试剂R2和校准品，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
校准品选自北京世纪沃德生物技术有限公司生产的HCY校准品，浓度为28μmol/L。
本实施例提供的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(循环酶法)的制备方法，包括如下步骤：
配制试剂R1：按照本实施例的试剂R1的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100和Proclin300，混匀，再加入L-丝氨酸，溶解，再依次加入乳酸脱氢酶和NADH，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存；
配制试剂R2：按照本实施例的的试剂R2的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100、二水合乙二胺四乙酸二钠盐和Proclin300，溶解，再加入胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶(胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶可根据活力单位换算成质量)，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存。
将制备获得的试剂R1和试剂R2按照体积比10:1的比例分别分装，再将分装后的试剂R1和分装后的试剂R2一对一组装，即得。
对比例1
本对比例提供一种同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒，包括独立包装的试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的pH为7.4的水溶液：
本对比例的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的制备方法与实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的制备方法相同。
对比例2
本对比例提供一种同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒，包括独立包装的试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
本对比例的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的制备方法与实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的制备方法相同。
可靠性验证
本发明还提供一种的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(循环酶法)的检测方法，包括如下步骤：
选取试验条件(可根据不同检测仪器索取不同的上机参数)如下表1：
表1试验条件
| 主波长 | 340nm | 副波长 | 404(实际可选自400～700)nm |
| 分析方法 | 速率法 | 反应时间 | 10min |
| 校准方法 | 两点线性法 | 反应方向 | 向下 |
样品(血清样本)来源于医院检验科。按下表2的步骤进行测试：
表2测试步骤
备注：试剂和样本量可根据不同生化分析仪要求按比例适当增减。
计算：
样本中HCY含量(μmol/L)＝(ΔA样品/min－ΔA空白/min)×C标准/(ΔA标准/min－ΔA空白/min)
式中：
C标准指标准品HCY的摩尔浓度；
ΔA样品/min指样品管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA标准/min指标准管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA空白/min指空白管平均每分钟的吸光度变化。
按照本发明的检测方法进行检测，分别对实施例1、对比例1、对比例2以及常规市售的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒进行线性范围测试、精密度测试、抗干扰性测试以及稳定性测试，统计结果见下表3：
表3结果统计表
另外，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与CDCREFERFNCE HPLC方法测试标本结果相关性比较拟合图见图1。从图1中可明显看出，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的组分配比的测试准确性与HPLC方法的测试准确性几乎相同。
实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒的稳定性见图2。从图2中可明显看出，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒可稳定达18个月。
另外，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与AXSYM公司生产的HCY试剂盒同时在AU400全自动生化仪测定SST血清样本，测定结果相关性比较拟合图见图3；实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒与AXSYM公司生产的HCY试剂盒同时在AU400全自动生化仪测定肝素抗凝血浆样本，测定结果相关性比较拟合图见图4。从图3和图4中可以看出，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒适用于肝素抗凝血浆、SST血清样本的测试。
与市场HCY试剂比较，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒准确度更高，精密度更优异，具体见下表4:
表4与市场HCY试剂的比较结果统计表
| CV％ | Bias％ | Sigmametric | |
| ADVIACentaur | 4.3 | 11.3 | 1.48 |
| AbbottARCHITECTI2000 | 2.1 | 2.73 | 7.13 |
| AxSYM | 3.4 | 4.93 | 3.75 |
| 实施例1 | 3.4 | 5.33 | 3.64 |
| Diazyme(RocheModularP) | 2.5 | 11.2 | 2.60 |
| IMMULITE20000 | 8.3 | 9.07 | 1.04 |
另外，本实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒还可以提供三水平质控血清；低、中、高三水平质控血清能够更好的确保测定结果的准确性和可靠性，统计结果见下表5。NIST认可的校准品，可溯源到SRM 1955。
表5低、中、高三水平质控血清的统计结果表
| LowC1μmol/L | MidC2μmol/L | HighC3μmol/L | |
| N | 30Test | 30Test | 30Test |
| Mean | 7.30 | 11.76 | 28.62 |
| CV％ | 3.3 | 1.9 | 1.6 |
综上所述，与对比例1和对比例2相比，实施例1的同型半胱氨酸(HCY)测定试剂盒(循环酶法)通过特定配比的各组分形成试剂R1和试剂R2，使得对血清中HCY的检测下限达1.0μmoL/L，灵敏度高，整体的线性范围可达56.0μmoL/L，精密度高，对血清中其他成分的干扰能力强，特异性好，可达到常规市售同型半胱氨酸试剂盒的线性要求。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于，包括HCY校准品、试剂R1和试剂R2，所述HCY校准品选自北京世纪沃德生物技术有限公司生产的HCY校准品，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
检测使用时，所述试剂R1和试剂R2的体积比为10:1。
2.根据权利要求1所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
所述试剂R2为由以下浓度的各组分制备而成的水溶液：
3.根据权利要求1或2所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于，所述HCY校准品浓度为28μmol/L。
4.一种权利要求1至3任一项所述的同型半胱氨酸测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制试剂R1：按照权利要求1至3任一项所述的试剂R1的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100和Proclin300，混匀，再加入L-丝氨酸，溶解，再依次加入乳酸脱氢酶和NADH，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存；
配制试剂R2：按照权利要求1至3任一项所述的试剂R2的组成称量各组分，向4/5倍预配制溶液体积的纯化水中加入十二水磷酸氢二钠和二水磷酸二氢钠，搅拌，溶解，调整溶液pH值为7.40±0.1，再依次加入准确称量的曲拉通X-100、二水合乙二胺四乙酸二钠盐和Proclin300，溶解，再加入胱硫醚β-合成酶和胱硫醚β-分解酶，搅拌溶解，加入余量的纯化水定容至预配制体积，混匀，置于2℃～8℃储存；
将制备获得的试剂R1和试剂R2按照体积比10:1的比例分别分装，再将分装后的试剂R1和分装后的试剂R2一对一组装，即得。
5.一种权利要求1至3任一项所述的同型半胱氨酸测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
选取如下表所示的试验条件：
按照下表所示的步骤进行测试：
按如下公式计算待测样品中的同型半胱氨酸的含量：
样本中HCY含量(μmol/L)＝(ΔA样品/min－ΔA空白/min)×C标准/(ΔA标准/min－ΔA空白/min)
式中：C标准指标准品HCY的摩尔浓度；
ΔA样品/min指样品管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA标准/min指标准管平均每分钟的吸光度变化；
ΔA空白/min指空白管平均每分钟的吸光度变化。
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