CN101413878A - 同型半胱氨酸的测定方法与同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用间接酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的同型半胱氨酸含量的测定方法，还涉及一种同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒。本发明的测定方法灵敏度高、误差小，因此本发明的测定方法与试剂盒可以广泛地应用于临床检验。

Description

同型半胱氨酸的测定方法与同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒

【技术领域】

本发明涉及医学检验测定技术领域，更具体地，本发明涉及同型半胱氨酸诊断/测定方法及其试剂盒。

【背景技术】

测定血浆中同型半胱氨酸的方法有很多种，其中包括高效液相色谱法(HPLC)、氨基酸分析测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管气相色谱-质谱分析法，荧光偏振免疫分析(FPIA)法以及电化学法及酶法等。

1、高效液相色谱法(HPLC)是一种经典的参考方法，但其有操作比较复杂，试验耗时比较长，试验数据变异比较大的缺点，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法是先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。

2.酶联免疫分析法(EIA)是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法，其特点是操作比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗时等。酶联免疫分析法其基本分析原理：先使用酶将血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的单克隆或多克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗体竞争结合，然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出同型半胱氨酸浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。

3.离子色谱法主要用于实验研究，临床上较少使用。其基本分析原理是色谱分析的一种，主要是其固定相采用离子交换物质，根据其对不同离子的吸附力不同可将同型半胱氨酸与其它物质分开进行测定。

4.毛细电泳法主要用于实验研究，有临床使用的报道。其特点与高效液相色谱方法相似，如其有操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。基本分析原理是先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光试剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的样品进行毛细电泳分析。将样品放置于10千伏左右的高压电场中，因为各种物质所带电荷不同，其等电点也不相同，因此其在电场中的迁移速度也就不同，根据这一原理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质分开，再以荧光检测器检测同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定总同型半胱氨酸的水平。

5.荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法，该方法完全自动化仪器分析，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理：样品中游离同型半胱氨酸和抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同，将样品、标准品与标抗体竞争结合，采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与荧光偏振强度的标准曲线，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。

6.酶法是因应市场需求而新开发出来的测试方法，目前国内有多项专利申请，例如CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶(E.C.2.1.1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3.1.1)的循环扩增作用，再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶等，或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸γ-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之产生巯化氢后再与莹光化合物DMPD2HCl作用产生荧光，该方法使用全自动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理是用基因重组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之巯化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测量之荧光化合物。但是，这些方法还是存在一些缺点，例如线性范围狭小、灵敏度差。因此，本发明人经过大量试验研究，终于作出了本发明。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种同型半胱氨酸的测定方法。

本发明的另一个目的是提供一种同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明的方法是一种采用间接酶循环扩增法(Indirect EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)与酶(偶)联法(Couple Reaction)的联用技术，利用测定还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处的吸光度变化测定同型半胱氨酸的方法。

本发明同型半胱氨酸测定方法的基本原理如下：

同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸脱巯基酶巯化氢+氨+α-氧代丁酸

氨+2水+6高铁细胞色素c亚硝酸还原酶/Ca ²⁺ 亚硝酸+6亚铁细胞色素c

亚硝酸+3还原型辅酶亚硝酸还原酶氢氧化铵+3氧化型辅酶+水

本发明的方法利用同型半胱氨酸脱巯基酶(homocysteinedesulfhydrase；EC 4.4.1.2)与亚硝酸还原酶(nitrite reductase；EC 1.7.2.2)作为作用酶，将同型半胱氨酸酶解生成氨(在水溶液中为铵离子)，再产生亚硝酸。而亚硝酸还原酶(nitrite reductase；EC 1.7.1.4)作为循环酶，它的酶促作用使生成的亚硝酸转化成氢氧化铵(铵离子+氢氧离子)，该铵离子再继续进行所述反应过程，因此使氨不断地被重复循环利用。与此同时，亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)还作为显色酶，一次可将三个还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为三个氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，这样可以通过测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，测定同型半胱氨酸的含量。

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种同型半胱氨酸的测定方法。该同型半胱氨酸测定方法的步骤如下：

A、样品准备：

人血液中的同型半胱氨酸的大部分(90％-95％)是以双硫键的形式和蛋白质、自身及其他含硫基化合物结合，仅有少量是游离状态；因此，欲测血液中的同型半胱氨酸含量，样品需要用双硫键截断剂做预处理。

1)标准样品的制备

将一定量的同型半胱氨酸溶于水或缓冲液中，再将同型半胱氨酸浓度调整到200微摩尔/升，得到的溶液与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为标准样品；

2)待测样品预处理

血浆样品与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为待测样品；

3)空白样品

所述的水或缓冲液与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为空白样品，其同型半胱氨酸浓度为0克/升；

所述的混合处理是与双硫键截断剂混合后该混合物在室温下静置10分钟或者在温度37℃下保持1-5分钟；

所述的双硫键截断剂选自2-巯基乙醇或二硫苏糖醇及具有其同样功能的其它硫基化合物。

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c与氯化钙，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-50mmol/L与1-50mmol/L；

C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/100进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；

F、数据处理

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到同型半胱氨酸的含量：

式中：

△A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；

△A(空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化；

△A(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。

根据本发明，在所述的同型半胱氨酸测定方法中，所述的缓冲液应该理解是能够使其测定介质的pH基本保持稳定(一般是7.5-9.5)的溶液。如果该pH高于9.5或pH低于7.5，则该测定方法使用的酶的活性达不到预期的活性效果，因此需要添加更多的介质与酶，才有可能达到预期的活性效果。

在本发明中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。

优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。

更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。

根据本发明，在所述的同型半胱氨酸测定方法中，所述的稳定剂应该理解是一种能保护试剂中的介质(底物)与酶不会随着时间推移而改变其性质，进而失去活性的物质，它会使得试剂具备很长的活性寿命，通常长达数月，甚至一、二年。如果没有所述的稳定剂，则试剂的活性在溶液中只能维持数十小时，顶多数天，就会失去活性而不再具备检测性能。在本发明中，所述的稳定剂使用量是0.01-7mol/L。如果所述的稳定剂使用量不够，则试剂活性的寿命就会缩短；如果所述的稳定剂使用量过高，则会增加成本。

在本发明中，所述的稳定剂是本技术领域的技术人员熟知的，例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠食品防腐剂的稳定剂。

优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。

更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。

所述双硫键截断剂选自2-巯基乙醇或二硫苏糖醇或其它具有与它们同样功能的化合物，这些化合物也都是在本发明的保护范围内。

在本发明中，所述的还原型辅酶例如是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。

根据一种本发明的优选实施方式，本发明使用全自动生化分析仪测定同型半胱氨酸时，所述双硫键截断剂、待测样品、所述标准样品与所述空白溶液由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为速率法或二点终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/100，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间4分钟。

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂溶液配制成如下三剂试剂：

双硫键截断剂的试剂1

由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素c与氯化钙组成的试剂2；

由所述的缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC1.7.2.2)与亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)组成的试剂3；

其中还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂2或试剂3中的位置是不限定的。

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明使用的试剂配制成如下四剂试剂：

双硫键截断剂的试剂1

由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素c与氯化钙组成的试剂2；

由所述的缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)组成的试剂3；

由所述的缓冲液、稳定剂与同型半胱氨酸脱巯基酶组成的试剂4；

其中还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂2、试剂3或试剂4中的位置是不限定的。

在本发明同型半胱氨酸测定方法中使用的测定仪器可以是紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。

本发明还涉及同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒。该同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂：

双硫键截断剂                  1-4mmol/L

缓冲液                        20-500mmol/L

稳定剂                        0.001-7mol/L

还原型辅酶                    0.1-0.35mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶          1000-80000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)      1000-80000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)      1000-80000U/L

高铁细胞色素c                 1-50mmol/L

氯化钙                        1-50mmol/L。

其中双硫键截断剂是用于处理样品，其它化学试剂用于测定样品中的同型半胱氨酸含量，下述的试剂盒同样如此。

根据一种本发明的优选实施方式，本发明的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒有：

试剂1：

双硫键截断剂                   3mmol/L

组成如下的试剂2：

缓冲液                         100mmol/L

稳定剂                         500mmol/L

还原型辅酶                     0.25mmol/L

高铁细胞色素c                  5mmol/L

氯化钙                         5mmol/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                         100mmol/L

稳定剂                       500mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶         6000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)     8000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)     10000U/L。

根据另一种本发明的优选实施方式，本发明的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒有：

试剂1：

双硫键截断剂                 3mmol/L

组成如下的试剂2：

缓冲液                       100mmol/L

稳定剂                       500mmol/L

还原型辅酶                   0.25mmol/L

高铁细胞色素c                5mmol/L

氯化钙                       5mmol/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                       100mmol/L

稳定剂                       500mmol/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)     8000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)     10000U/L；

组成如下的试剂4：

缓冲液                       100mmol/L

稳定剂                       500mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶         6000U/L。

根据另一种本发明的优选实施方式，在本发明的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒中，所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。

优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐缓冲液或“PBS”缓冲液。

更优选地，所述的缓冲液例如选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)缓冲液或磷酸盐缓冲液。

在本发明中，所述的稳定剂是本技术领域的技术人员熟知的，例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠食品防腐剂的稳定剂。

优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、丙二醇、甘油双乙酸钠或叠氮钠的稳定剂。

更优选地，所述的稳定剂例如是一种或多种选自甘油、硫酸铵或双乙酸钠的稳定剂。

所述的双硫键截断剂选自2-巯基乙醇或二硫苏糖醇及具有与这些化合物同样功能的其它硫基化合物。

在本发明中，无论是单剂试剂、双剂试剂、三剂试剂还是四剂试剂，在本发明测定同型半胱氨酸的方法中，所述的还原型辅酶可以是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。

使用本发明的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒时，可以使用紫外/可见光分析仪，例如上海精密仪器仪表有限公司销售的紫外可见分光光度计、天津喀纳斯光学分析仪器有限公司销售的723可见分光光度计；半自动生化分析仪，例如上海伟思医用设备有限公司的BTS-330半自动生化分析仪；全自动生化分析仪，例如：由迈瑞公司以商品名BS300、奥林帕斯公司以商品名AU400、东芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或贝克曼公司以商品名CX20销售的全自动生化分析仪。

在采用本发明方法测定同型半胱氨酸时，可以根据下式要求进行多次试验，然后将得到的这些试验结果按照下式计算出精密度(CV)：

$S=\sqrt{\mathrm{\Σ}{(\stackrel{\‾}{X}-X_i)}^2/n-1}$

式中：

X-试验结果平均值；

Xi-各次试验结果；

n-试验次数.N≥10

CV＝S/X*100％

将得到的这些试验结果按照下式计算出相对极差：

$\mathrm{\Δ}=\frac{\stackrel{\‾}{U}-\stackrel{\‾}{V}}{(\stackrel{\‾}{X}+\stackrel{\‾}{Y}+\stackrel{\‾}{Z})+3}$

X——第一批各次试验结果平均值

Y——第二批各次试验结果平均值

Z——第三批各次试验结果平均值

U——为X，Y，Z中的最大值

V——为X，Y，Z中的最小值

每批试样数取n≥3

经过大量试验确定，对于同型半胱氨酸含量为0-600mol/L的样品，其分析误差可以达到≤6％；而现有测定方法，其分析误差可以达到≤10％，因此与现有技术相比，本发明方法的误差小得多。

本发明方法的灵敏度可以达到0.5mol/L。

通过大量试验确定，本发明方法测定同型半胱氨酸含量范围是0-600mol/L，本发明方法适合于医学临床诊断。

[有益效果]

本发明具有下述积极效果：

本发明的方法测定灵敏度比现行方法高3倍，线性范围大12倍，使用剂量仅为1/2，大大节省成本，因而具有广泛应用的前景。

【具体实施方式】

下述实施例说明本发明而不限制本发明的保护范围。

实施例1：血浆中同型半胱氨酸含量的测定

1)标准样品的制备

将一定量的同型半胱氨酸溶于水或缓冲液中，再将同型半胱氨酸浓度调整到200微摩尔/升，得到的溶液与同体积的3mmol/L 2-巯基乙醇进行混合处理后作为标准样品；

2)待测样品预处理

血浆样品与同体积的3mmol/L2-巯基乙醇进行混合处理后作为待测样品；

3)空白样品

所述的水或缓冲液与同体积的3mmol/L2-巯基乙醇进行混合处理后作为空白样品，其同型半胱氨酸浓度为0克/升；

所述的混合处理是在与2-巯基乙醇混合后该混合物在室温下静置10分钟。

B、试剂溶液的制备：

本实施例的同型半胱氨酸诊断/测定试剂为单剂试剂，它含有：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液          100mmol/L

甘油                                   1mol/L

NADPH                                  0.25mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶                   6000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)               8000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)               10000U/L

高铁细胞色素c                          5mmol/L

氯化钙                                 3mmol/L

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。

C、待测血浆样品，与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/20进行混合，在温度37℃下反应5分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化ΔA(样品)为0.0277；

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化ΔA(标准)为0.0523；

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水作为空白溶液的吸光度随时间的变化ΔA(空白)为0.0106；

F、数据处理

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到同型半胱氨酸的含量：

式中：

ΔA(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；

ΔA(空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化；

ΔA(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。

通过上式计算得到该血浆样品的同型半胱氨酸含量为82mol/L，其误差是±4mol/L。

实施例2：血浆中同型半胱氨酸含量的测定

1)标准样品的制备

将一定量的同型半胱氨酸溶于水中，再将同型半胱氨酸浓度调整到200微摩尔/升，作为标准样品；

2)待测样品的制备

血浆样品作为待测样品；

3)空白样品

所述的水作为空白样品，其同型半胱氨酸浓度为0克/升；

B、试剂溶液的制备：

同型半胱氨酸诊断/测定试剂为三剂试剂，它含有：

组成如下的试剂1：

二硫苏糖醇                         3mmol/L

组成如下的试剂2：

磷酸盐缓冲液                       100mmol/L

NADH                               0.25mmol/L

高铁细胞色素c                      5mmol/L

氯化钙                             5mmol/L

组成如下的试剂3：

磷酸盐缓冲液                       100mmol/L

乙二醇                             5mol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶               6000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)           32000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)           40000U/L

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定

该全自动生化分析仪主要操作参数如下：

计量方法        ：两点终点法

测试计量时间点  ：21，31

主波长          ：340

副波长          ：405

反应温度        ：37

样品体积        ：20

试剂1(R1)体积   ：20

试剂2(R2)体积   ：200

试剂3(R3)体积   ：50

反应方向        ：负

标准样品1       ：0

标准样品2       ：200

定标结果显示K值为-5011，换算成灵敏度为0.00020A/mol/L。

测试结果显示该血浆中含有同型半胱氨酸为21μmol/L。其误差是±1 mol/L。

实施例3：血浆样品中同型半胱氨酸含量的测定

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是本实施例：

B、试剂溶液的制备：

同型半胱氨酸诊断/测定试剂为四剂试剂，它含有：

组成如下的试剂1：

2-巯基乙醇                             3mmol/L

组成如下的试剂2：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液          100mmol/L

NADH                                   0.25mmol/L

高铁细胞色素c                          6mmol/L

氯化钙                                 5mmol/L

组成如下的试剂3：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液          100mmol/L

硫酸铵                                 1mol/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)               48000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)               60000U/L

组成如下的试剂4：

三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液          100mmol/L

硫酸铵                                 2mol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶                   36000U/L

按照上述浓度将这些试剂加入去离子水全部溶解配制好待用。

C、样品使用日立7080全自动生化分析仪测定

该全自动生化分析仪主要操作参数如下：

计量方法         ：两点终点法

测试计量时间点   ：21，31

主波长           ：340

副波长            ：405

反应温度          ：37

样品体积          ：20

试剂1(R1)体积     ：20

试剂2(R2)体积     ：200

试剂3(R3)体积     ：50

试剂4(R4)体积     ：50

反应方向          ：负

标准样品1         ：0

标准样品2         ：200

定标结果显示K值为-4705，换算成灵敏度为0.00021A/mol/L。

测试结果显示该血浆中含有同型半胱氨酸为78mol/L。其误差是±2mol/L。

实施例4：稳定性试验

该实施例的操作方式与实施例1相同，只是在实施例1实施后，实施例1使用的试剂在密闭试剂瓶中在2—8℃下存放了半年与一年。

使用同样的标准样品，使用与实施例2同样的新试剂与上述存放半年与一年的试剂分别进行了测定，其它条件都与实施例2相同，其测定结果如下：

表1

表1 结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法可以保证获得稳定的结果，其稳定性至少一年以上。

实施例5：线性试验

该实施例的操作方式与实施例2相同，只是配制新的标准样品浓度达到800mol/L，将800mol/L的同型半胱氨酸依倍比稀释，然后进行测试，其测定结果如下：

表2

表2结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法可以保证线性可以达到600mol/L。

申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。

总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(A)≤0.01；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达600mol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±5％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤5％；试剂的灵敏度可达0.0002±0.0001A/mol/L；试剂在2—8℃下保存，活性可以稳定一年；本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。

Claims (10)

1、一种同型半胱氨酸的测定方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、样品准备：

1)标准样品的制备

将一定量的同型半胱氨酸溶于水或缓冲液中，再将同型半胱氨酸浓度调整到200微摩尔/升，得到的溶液与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为标准样品；

2)待测样品预处理

血浆样品与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为待测样品；

3)空白样品

所述的水或缓冲液与同体积的1-4mmol/L双硫键截断剂进行混合处理后作为空白样品，其同型半胱氨酸浓度为0克/升；

所述的混合处理是与双硫键截断剂混合后该混合物在室温下静置10分钟或者在温度37℃下保持1-5分钟；

B、试剂溶液的制备：

分别移取或称取缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c与氯化钙，然后将它们混合均匀，用水溶解得到所述的试剂溶液，它们的浓度分别是20-500mmol/L、0.001-7mol/L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-50mmol/L与1-50mmol/L；

C、待测样品与在步骤B)得到的试剂溶液按照体积比1/10至1/100进行混合，在温度15-45℃下反应5-60分钟，在主波长340nm与副波长405nm下进行测定，测定其吸光度随时间的变化；

D、在与步骤C)同样的条件下测定步骤A)标准样品的吸光度随时间的变化；

E、在与步骤C)同样的条件下测定在步骤A)使用的水或缓冲液作为空白溶液的吸光度随时间的变化；

F、数据处理

由步骤C-E)所述测定的主波长340nm的吸光度随时间的变化，根据下式计算得到同型半胱氨酸的含量：

△A(标准)-△A(空白)

式中：

△A(样品)表示步骤C)得到的待测样品的吸光度变化；

△A(空白)表示步骤E)得到的空白溶液的吸光度变化；

△A(标准)表示步骤D)标准样品的吸光度变化。

2、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于使用全自动生化分析仪测定时，所述双硫键截断剂、待测样品、所述标准样品与所述空白溶液由该分析仪在设定条件下自动取样，然后在下述条件下进行测定：测定方法为速率法或二点终点法，温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1/10-1/100，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间4分钟。

3、根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于所述的双硫键截断剂选自2-巯基乙醇或二硫苏糖醇；所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠、叠氮钠食品防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液。

4、根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶。

5、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的试剂溶液配制成如下双剂试剂：

试剂1，它是双硫键截断剂；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素c与氯化钙组成的；

试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)与亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)组成的；

其中还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂1或试剂2中的位置是不限定的。

6、根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的试剂配制成如下三剂试剂：

试剂1，它是双硫键截断剂；

试剂2，它是由所述的缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、高铁细胞色素c与氯化钙组成的；

试剂3，它是由所述的缓冲液、稳定剂、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)组成的；

试剂4，它是由所述的缓冲液、稳定剂与同型半胱氨酸脱巯基酶组成的；

其中还原型辅酶、同型半胱氨酸脱巯基酶、亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)、亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)、高铁细胞色素c、氯化钙在试剂1、试剂2或试剂3中的位置是不限定的。

7、一种同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于它由下述粉状试剂组成，在使用时用水将它们溶解得到具有下述浓度范围的可直接使用的液体试剂：

试剂1：双硫键截断剂；                    1-4mmol/L

组成如下的试剂2：

缓冲液                                   20-500mmol/L

稳定剂                                   0.001-7mol/L

还原型辅酶                      0.1-0.35mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶            1000-80000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)        1000-80000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)        1000-80000U/L

高铁细胞色素c                   1-50mmol/L

氯化钙                          1-50mmol/L。

8、根据权利要求7所述的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于它有：

试剂1：双硫键截断剂              3mmol/L

组成如下的试剂2：

缓冲液                           100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

还原型辅酶                       0.25mmol/L

高铁细胞色素c                    5mmol/L

氯化钙                           5mmol/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                           100mmol/L

稳定剂                           500mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶             6000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)         8000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)         10000U/L。

9、根据权利要求7所述的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于它有：

试剂1：双硫键截断剂               3mmol/L

组成如下的试剂2：

缓冲液                            100mmol/L

稳定剂                            500mmol/L

还原型辅酶                        0.25mmol/L

高铁细胞色素c                   5mmol/L

氯化钙                          5mmol/L；

组成如下的试剂3：

缓冲液                          100mmol/L

稳定剂                          500mmol/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.2.2)        8000U/L

亚硝酸还原酶(EC 1.7.1.4)        10000U/L；

组成如下的试剂4：

缓冲液                          100mmol/L

稳定剂                          500mmol/L

同型半胱氨酸脱巯基酶            6000U/L。

10、根据权利要求7-9中任一项权利要求所述的同型半胱氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于所述的稳定剂是一种或多种选自硫酸铵、氯化钠、乙二醇、丙二醇、甘油或双乙酸钠或叠氮钠食品防腐剂的稳定剂；所述的缓冲液是一种或多种选自三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、二乙醇胺缓冲液或“PBS”缓冲液的缓冲液；所述的还原型辅酶是一种或多种选自NADPH、NADH或thio-NADH的还原型辅酶；所述的双硫键截断剂选自2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。