CN1435692A - 一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用 - Google Patents

一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用 Download PDF

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CN1435692A
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邹爱平
李品兰
李勤
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Abstract

本发明涉及一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及其制备方法与应用，本试剂盒根据一般实验室测定同型半胱氨酸的需要，设计成一种通用测定试剂盒，使用方便，有高效液相色谱仪及荧光检测仪的实验室都可以使用；本试剂盒采用了一种新的内标硫羟基乙酸作为质量控制，并保证这种内标与同型半胱氨酸的色谱峰清晰地分离并区隔，从而保证了测定的准确性及质量控制，比其它方法更精确。用本试剂盒测试同型半胱氨酸所需样本量少，仅需50微升血浆即可；此外，测定时反应时间短，操作简单，适用于大量检测。本试剂盒费用低(约900－1000元/15人次)，比所有其它同型半胱氨酸分析试剂盒所需费用都低。

Description

一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用
               技术领域
本发明属于生物技术诊断试剂，具体是一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及其制备方法与应用。
               背景技术
近年来，大量的流行病学及临床病例研究证明：血同型半胱氨酸增高是一种比胆固醇更直接引起血管硬化并导致心血管病的致病因子。正常人血同型半胱氨酸平均为7-10微摩尔/升，超过10微摩尔/升称为同型半胱氨酸血症。1999年底，美国心脏协会已号召全美医师对有心血管病家族的病人进行血同型半胱氨酸的检测并开展降低血同型半胱氨酸的临床治疗。美国国家药物及食品管理局(FDA)已下令所有生产成品谷类食物如麦片等的厂家添加叶酸等降低血同型半胱氨酸的成分。2000年6月，加拿大国家预防医学规划委员会也发表了开展血同型半胱氨酸检测与治疗的指南。在其它发达国家如德国、法国、英国，关于血同型半胱氨酸血症作为心血管病危险因子已通过媒体如BBC等进行广泛的宣传。在我国，有关同型半胱氨酸血症在心血管病发病中的作用已成为引人注目的重大课题，今后几年将在全国各级医院开展有关这种心血管危险因子的诊断和治疗，这将为开展心血管病的防治带来一次深刻的革命，更重要的是将为众多动脉粥样硬化等心血病的患者带来新的希望。
目前世界范围内通用的血浆或血清同型半胱氨酸检测方法主要有两种。其一是酶联免疫吸附法(ELISA)，其二是高效液相色谱荧光分析法(HPLC)两种方法中，酶联免疫吸附法有赖于抗同型半胱氨酸的抗体的特异性及滴度。尽管已有这种免疫诊断试剂盒，但大量的比较研究证明这种酶联免疫吸附法仅可用于测定并诊断血同型半胱氨酸增加很高的病人，不能用于轻度同型半胱氨酸血症的病人。因此不是最好的诊断同型半胱氨酸血症作为一种心血管病危险因子的方法。
另一种血同型半胱氨酸的分析方法高效液相色谱分析被认为是一种标准的血同型半胱氨酸检测方法。其主要测定步骤包括还原所有的氧化同型半胱氨酸，解离与血浆蛋白结合的同型半胱氨酸、荧光标记反应以及血中总同型半胱氨酸的高效液相色谱分离与定量。在这种测定中，除测定同型半胱氨酸外，还可同时测定血中有关的同型半胱氨酸代谢产物如半胱氨酸，半胱-甘氨酸以及谷胱甘肽，这些巯基化合物也可同时提示机体的抗氧化功能状态。
至今尚无用于高效液相荧光分析血同型半胱氨酸的通用测定试剂盒。尽管英国DREW公司已经开发一种试剂盒用于该公司所生产的同型半胱氨酸测定仪，但其并不能用于其它高效液相分析仪。
               发明内容
本发明的目的是提供一种既能检测血同型半胱氨酸，又不需要专用测定仪的检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用，以克服上述的不足。
为了实现上述目的，本发明的特点是：试剂及制备方法配制原料为：1.标准品名称：
同型半胱氨酸(DL-homocysteine，Sigma公司，H4628，-20℃保存)缩写为Hcys硫羟基乙酸(Thioglycolic acid，Sigma公司，T0632，-20℃保存)缩写为TGA半胱氨酸(L-Cycteine，Sigma公司，C4820，室温保存)  缩写Cyc还原型谷胱甘肽(Glutathione，reduced，ICN公司，G6529，4℃保存)  缩写为Glu
半胱-甘氨酸(Cycteinylglycine，Bachem公司，G3755，-20℃保存)缩写为Cys-gly2.标准品溶液
储存液配制，(均为10毫摩尔/升，-20℃或-40℃保存)：
Hcys(同型半胱氨酸)  分子量135.2    13.52毫克/10毫升双蒸水
Cys(半胱氨酸)         分子121.2    12.12毫克/10毫升双蒸水
Glu(还原型谷胱甘肽)  分子量307.33    30.73毫克/10毫升双蒸水
Cys-gly(半胱-甘氨酸)  分子量178.2  17.82毫克/10毫升双蒸水
标准：液配制(ST，各标准品的最终浓度均为25微摩尔/升)：取以上标准品储存液各10微升，加入960微升双蒸水即成100微摩尔/升浓度。然后加3毫升双蒸水即可得25微摩尔/升标准液。分装后与-20℃或-40℃保存。
3.内标准溶液(IS，10毫摩尔/升，-20℃或-40℃保存)：
硫羟基乙酸(TGA，分子量114.1)：称取11.41毫克硫羟基乙酸溶于10毫升双蒸水中。
4.反应缓冲液：(缓冲液缩写为B)
B1：10％(v/v)TBP/DMF溶液：取1毫升三-n-丁基磷化氢(TBP：Tri-n-
    butylphosphine，97％，-20℃保存)加入9毫升N，N-二甲基甲酰胺(N，N-
    Dimethylformamide，99％，室温保存)，混匀并用氮气去氧后密闭保存于
    4℃)。
B2：10％三氯醋酸(Trichloroacetic acid，TCA)，用1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)配制
即加1毫升三氯醋酸到9毫升乙二胺四乙酸二钠中，于4℃保存。
B3：1.55摩尔/升氢氧化钠：称1.24克氢氧化钠钠溶于20毫升双蒸水中，4℃保存。
B4：硼酸钾缓冲液(pH9.4)(0.125摩尔/升硼酸钾+4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠)
称1.9094硼酸钾，0.0744克乙二胺四乙酸二钠溶于50毫升双蒸水，不调pH。此液在试剂盒中用于血浆样品浓度过高时稀释血样用。
B5：7-氟苯-2-氧-1，3-重氮-4-磺胺(7-fluorobenz-2-oxa-1，3-diazole-4-
sulfonamide，缩写为SBD-F)，为荧光染料。
将10毫克SBD-F加入5毫升B4液中，超声振荡5分钟后，储藏于棕色瓶内，置4℃保存。
本发明存在以下优点：
通用性：如上所述，至今世界上尚无用于高效液相荧光分析血同型半胱氨酸的通用测定试剂盒。本试剂盒根据一般实验室测定同型半胱氨酸的需要，设计成一种通用测定试剂盒，使用方便，有高效液相色谱仪及荧光检测仪的实验室都可以使用。精确性：根据报道，以前所采用的几种内标包括二巯基氨脯酸等加入反应后，由于他们与同型半胱氨酸的色谱峰比较接近，影响了其测定的变异系数，使测定的同型半胱氨酸在人群中的离散度增加，其准确度不如不加内标时更好。但如不加内标，其测定则不能标准量化而丧失每次测定之间的可比性。本试剂盒采用了一种新的内标硫羟基乙酸作为质量控制，并保证这种内标与同型半胱氨酸的色谱峰清晰地分离并区隔，从而保证了测定的准确性及质量控制，比其它方法更精确。
实用性：用本试剂盒测试同型半胱氨酸所需样本量少，仅需50微升血浆即可。比英国DRAW公司同型半胱氨酸测定仪所需300微升血浆少了5倍。此外，测定时反应时间短(约1小时10分钟即可)，操作简单，适用于大量检测。
经济性：本试剂盒费用低(约900-1000元/15人次)，比所有其它同型半胱氨酸分析试剂盒所需费用都低。
具体实施方式血样采集及处理：
常规静脉采血2ml，抽血前病人空腹，血液须抗凝(常规肝素或EDTA抗凝均可)。血样离心(3000转/分)5分钟或置冰箱待离心(不超过5小时)。血浆可冷冻保存，向型半胱氨酸及其相关产物可在-20℃保存半年，4℃保存1周。
测定反应：
1.5毫升(ml)硬质塑料离心管(Eppendorf)，用记号笔标上标准管及病人测试管编号。然后，分别于每管内加入内标溶液(IS)3微升(μl)，(注意：请将3μl IS加入离心管底部)
2.加50μl标准溶液(ST)入标准管或50μl病人血浆入测试管(注意试管编号)，
3.分别于每管内加入B1溶液5μl，样品经震荡混匀后，置室温下孵化10分钟，
4.分别于每管内加入B2溶液45μl并混匀，3000转/分离心3分钟，上清将用于以下实验；
5.取1.5ml硬质塑料离心管并按上述顺序标记标准管及病人测试管(注意试管编号)，
6.分别于每管内加入B3溶液8μl，
7.从上述各管中取出40μl上清加入相对应的新离心管内，
8.分别于每管内加入B5溶液20μl，
9.样品混匀后，置60℃孵化60分钟，然后将试管放入冰水终止反应；
10.3000转/分离心3分钟。取上清(20-50μl)作高效液相分析。
加样及反应顺序如下表：
    反应表格 S     S     P1     P2     P3     P4     P5...n
 IS(μl)     3     3     3     3     3     3     3
    ST或血浆(μl)       50       50       50       50       50       50     50
B1(μl)       5       5       5       5       5       5     5
置室温下孵化1 0分钟：
B2(μl)     45     45     45     45     45     45     4 5
3000转/分离心3分钟取新离心管并按上述顺序标记管号后加样
    反应管号     S     S     P1     P2     P3     P4     P5...n
 B3(μl)     8     8     8     8     8     8     8
取各管上清(μl)     40     40     40     40     40     40     40
B5(μl)     20     20     20     20     20     20     20
S为标准管，P1-P5...n表示病人测试管。
ST为标准溶液，B1-B5为反应及测试溶液。如病人血样中Hcys等浓度过高可用B4溶液稀释。高效液相色谱分析：
所有用水必须为去离子双蒸水；
检测所用激发波长为385m，发射波长为515m；
液相流速为每分钟2ml(一个泵即可)；进样量为20-30μl(上清)；
样品色谱分析时间为18分钟，洗柱时间为6分钟。
溶液系统：
磷酸钾溶液：KH2PO4(potassium Phosphate，monobasic，分子量：136.09)
磷酸(用于调整PH，Phospharic acid，分子量)
乙氰(Acetonitrile(CAN)，HPLC grade)
液相溶液配方：0.15mol/L磷酸钾溶液，PH为2.1，
配制方法：将KH2PO4溶于10％ACN中即可(10％ACN为100mlACN+900 ml双蒸去离子水)。
标准反应管一般应做双份，取峰面积平均值计算病人血浓度。如两次差别很大，应重作标准反应管分析。
高效液相色谱分析仪见该仪器说明书。结果计算：
高效液相色谱仪的计算机将打印色谱图并报告各峰的面积，这些峰面积用作浓度计算，其公式如下：
内标回收率＝样品IS面积/标准IS面积×100；(内标主要用于校正各管间因加样或反应等引起的误差)；
血样浓度(μmol/L)＝样品管面积×标准浓度(25μmol/L)÷标准管面积；
用回收率进行校正：血样浓度÷回收率＝校正血样浓度。
附图为标准品及病人血浆同型半脱氨酸及代谢产物的高效液相分析色谱图：
参考值(血浆)：
同型半胱氨酸：男性7.8-11.9μmol/L
              女性5.5-8.4μmol/L
半胱氨酸：    209.8-342.7μmol/L
半胱-甘氨酸： 70-132μmol/L
谷胱甘肽：    2.69-5.31μmol/L临床意义：
1、心血管病危险因子：动脉粥样硬化，高血压，冠心病，脑动脉硬化，外周血管硬化，静脉血栓病等。
2、各种硬化性疾病：肾小球硬化，肝硬化，人体老化等。
3、代谢性疾病(少见)：半胱氨酸合成缺陷，低叶酸或低四氢叶酸血症；低维生素B12血症；低血清胆碱症，高甲胶酸血症。
实施例：
14人血同型半胱氨酸及产物的分析结果见表1。在同一测试组内，同型半胱氨酸反复测定的重复性为99％，其不同测试组内其差异系数小于5％。15人血同型半胱氨酸及产物的分析结果见表1。在同一测试组内，同型半胱氨酸反复测定的重复性为99％，其不同测试组内其差异系数小于5％。
Cyc cycg-gly  Hcy Gluth IS [Cys] [Cys-Gly [Hcys] [Gluth] [Cys/Hcy] Cal-Hcys RR (Cys) (Cys-Gly) (Hcys) (Gluth) (cys/Hcys)
(area) (area) (area) (area) (area) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM)
ST1            41060       784267           321483       403830       189500     20.46043     26.66438     25.06573      25.3541       0.816271 if IS very different，
ST2            59280       686360           319797       392550       185390     29.53957     23.33562     24.93427      24.6459       1.184697
               2            2                2            2            2            2            2            2            2              2
mcan 50170 735313.5 320640 398190 187445 25 25 25 25 1.000484
sd         12883.49      69230.7         1192.182     7976.164     2906.209     6.419915     2.353782     0.092953     0.500776       0.260517
se             9110      48953.5              843         5640         2055     4.539565     1.664375     0.065728     0.354102       0.184213
cy         25.67966     9.415128         0.371813     2.003105     1.550433     25.67966     9.415128     0.371813     2.003105       26.03904
N1           883696       375216           252755        23615       177420     440.3508     12.75701     19.70707     1.482646       22.34481     0.946518     465.2325     13.47783     20.82061       1.566422     22.34481
N2           925350       651825           156235        49590       183435     461.1072     22.16147      12.1815     3.113463       37.85309     0.978607     471.1873     22.64593     12.44779       3.181526     37.85309
N3           568853       444380            63200        21700       190545     283.4627     15.10852     4.927645     1.362415       57.52499     1.016538      278.851     14.86272     4.847476        1.34025     57.52499
N4           947266       607284           152060        29155       185695     472.0281     20.64711     11.85598      1.83047       39.81352     0.990664     476.4765     20.84169     11.96771       1.847721     39.81352
N5           324350       379380            72180        14130       187090     161.6255     12.89858     5.627807     0.887139       28.71909     0.998106     161.9322     12.92305     5.638486       0.888823     28.71909
N6 570080 430060 93700 30175 189670 284.0741 14.62165 7.305701 1.89451 38.8839 1.01187 280.74l7 14.45013 7.219999 1.872286 38.8839
N7           570343       391574           128373        81942       174560     284.2052     13.31317     10.00912     5.144655       28.39462      0.93126     305.1836     14.29587     10.74794       5.524403     28.39462
N8           679772       438408            77610        27070       187130     338.7343     14.90548     6.051179     1.699566       55.97823      0.99832     339.3045     14.93057     6.061365       1.702426     55.97823
N9           358286       510074            73200        29000       189920      178.536     17.34206     5.707335     1.820739       31.28184     1.013204     176.2093     17.11606     5.632958       1.797011     31.28184
N10           602216       383174            85690        40230       184460     300.0877     13.02757     6.681169     2.525804       44.91545     0.984075     304.9438     13.23839     6.789286       2.566678     44.91545
N11 785978 581572 122355 26510 188740 391.6574 19.77293 9.539905 1.664406 41.05464 1.006909 388.9701 19.63726 9.474449 1.652986 41.05464
N12           294305       435470            68090        17610       185560     146.6539     14.80559     5.308913     1.105628       27.62409     0.989944     148.1437     14.95599     5.362844       1.116859     27.62409
N13           228875       594340            53455        93500       177710     114.0497     20.20703     4.167836     5.870313       27.36425     0.948065     120.2974     21.31397     4.396151        6.19l89     27.36425
N14           311610       414480           221550        24740       183750     155.2771     14.09195     17.27405     1.553279       8.989038     0.980288     158.3995     14.37532      7.62141       1.584513     8.989038
附表一

Claims (2)

1、一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及其制备方法，其特征在于：试剂及制备方法配制原料为：
①.标准品名称：
同型半胱氨酸(DL-homocysteine，Sigma公司，H4628，-20℃保存)缩写为Hcys
硫羟基乙酸(Thioglycolic acid，Sigma 公司，T0632，-20℃保存)缩写为TGA
半胱氨酸(L-cycteine，Sigma公司，C4820，室温保存)缩写为Cyc
还原型谷胱甘肽(Glutathione，reduced，ICN公司，G6529，4℃保存)缩写为Glu
半胱-甘氨酸(Cycteinylglycine，Bachem公司，G3755，-20℃保存)缩写为Cys-gly
②.标准品溶液
储存液配制(均为10毫摩尔/升，-20℃或-40℃保存)：
Hcys(同型半胱氨酸)  分子量135.2   13.52毫克/10毫升双蒸水Cys(半胱氨酸)       分子量121.212.12毫克/10毫升双蒸水
Glu(还原型谷胱甘肽)  分子量307.33  30.73毫克/10毫升双蒸水
Cys-gly(半胱-甘氨酸)    分子量    178.2    17.82毫克/10毫升双蒸水
标准：液配制(ST，各标准品的最终浓度均为25微摩尔/升)：取以上标准品储存液各10微升，加入960微升双蒸水即成100微摩尔/升浓度。然后加3毫升双蒸水即可得25微摩尔/升标准液。分装后与-20℃或40℃保存。
③.内标准溶液(IS，10毫摩尔/升，-20℃或0℃保存)：硫羟基乙酸(TGA，分子量114.1)：称取11.41毫克硫羟基乙酸溶于10毫升双蒸水中。
④.反应缓冲液：(缓冲液缩写为B)
B1：10％(v/v)TBP/DMF溶液：取1毫升三-n-丁基磷化氢(TBP：Tri-n-butylphosphine，97％，-20℃保存)加入9毫升N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，99％，室温保存)，混匀并用氮气去氧后密闭保存于4℃)。
B2：10％三氯醋酸(Trichloroacetic acid，TCA)，用1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)配制
即加1毫升三氯醋酸到9毫升乙二胺四乙酸二钠中，于4℃保存。
B3：1.55摩尔/升氢氧化钠：称1.24克氢氧化钠溶于20毫升双蒸水中，4℃保存。
B4：硼酸钾缓冲液(pH9.4)(0.125摩尔/升 硼酸钾+4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠)
称1.9094克硼酸钾，0.0744克乙二胺四乙酸二钠溶于50毫双蒸水，不调pH。
此液在试剂盒中用于血浆样品浓度过高时稀释血样用。
B5：7-氟苯-2-氧-1，3-重氮-4-磺胺(7-fluorobenz-2-oxa-1，3-diazole-4-Sulfonamide，缩写为SBD-F)，为荧光染料。
将10毫克SBD-F加入5毫升B4液中，超声振荡5分钟后，储藏于棕色瓶内，置4℃保存。
2、一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及其应用，其特征在于：试剂的使用方法为：
血样采集及处理：
常规静脉采血2ml，抽血前病人空腹，血液须抗凝(常规肝素或EDTA抗凝均可)。血样离心(3000转/分)5分钟或置冰箱待离心(不超过5小时)。
测定反应：
①、5毫升(ml)硬质塑料离心管(Eppendorf)，用记号笔标上标准管及病人测试管编号。然后，分别于每管内加入内标溶液(IS)3微升(μl)；
②、加50μl标准溶液(ST)入标准管或50μl病人血浆入测试管；
③、分别于每管内加入B1溶液5μl，样品经震荡混匀后，置室温下孵化10分钟；
④、分别于每管内加入B2溶液45μl并混匀，3000转/分离心3分钟，上清将用于以下实验；
⑤、取1.5ml硬质塑料离心管并按上述顺序标记标准管及病人测试管；
⑥、分别于每管内加入B3溶液8μl；
⑦、从上述各管中取出40μl上清加入相对应的新离心管内；
⑧、分别于每管内加入B5溶液20μl；
⑨、样品混匀后，置60℃孵化60分钟，然后将试管放入冰水终止反应；
⑩、3000转/分离心3分钟。取上清(20-50μl)作高效液相分析。
高效液相色谱分析：
所有用水必须为去离子双蒸水；
检测所用激发波长为385m，发射波长为51 5m；
液相流速为每分钟2ml(一个泵即可)；进样量为20-30μl(上清)；
样品色谱分析时间为18分钟，洗柱时间为6分钟。
溶液系统：
磷酸钾溶液：KH2PO4(potassium Phosphate，monobasic，分子量：136.09)
磷酸(用于调整PH，Phospharic acid，分子量)
乙氰(Acetonitrile(CAN)，HPLC grade)
液相溶液配方：0.15mol/L磷酸钾溶液，PH为2.1，
配制方法：将KH2PO4溶于10％ACN中即可(10％ACN为100mlACN+900ml双蒸去离子水)。
标准反应管一般应做双份，取峰面积平均值计算病人血浓度。如两次差别很大，应重作标准反应管分析。结果计算：
高效液相色谱仪的计算机将打印色谱图并报告各峰的面积，这些峰面积用作浓度计算，其公式如下：
内标回收率＝样品IS面积/标准IS面积×100；(内标主要用于校正各管间因加样或反应等引起的误差)；
血样浓度(μmol/L)＝样品管面积×标准浓度(25μmol/L)÷标准管面积；
用回收率进行校正：血样浓度÷回收率＝校正血样浓度。
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