CN105572234A - 一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法 - Google Patents

一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法 Download PDF

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Abstract

一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，属于分析测定技术领域。本研究利用超高效液相色谱（UPLC），对马蔺提取液中半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）进行定性和定量分析：选取VydacC18色谱柱，流动相为0.1%的TFA（A）和100%ACN（B）；柱温30℃，流速为0.5ml·min-1，进样量为1μl；梯度洗脱程序：12%～25%ACN（3min）、25%～100%ACN（0.5min）；洗柱：100%ACN（1.5min）；柱平衡：100%～0%ACN（0.5min）和柱后流动时间1.5min。荧光检测器条件为：λex（激发波长）380nm、λem（发射波长）470nm。以峰面积进行外标法定量，可以在7min内同时对Cys和GSH进行检测分析。本方法与传统高效液相色谱（HPLC）相比，分析过程大大缩短，分离效果良好，极大的提高了检测效率及节省流动相成本。

Description

一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法
技术领域
一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，属于分析测定技术领域。
背景技术
半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）是一类重要的非蛋白巯基化合物，因化合物结构上含有的巯基（-SH）使Cys和GSH在重金属解毒中发挥着重要的作用。马蔺（Irislacteavar.chinensis）为多年生宿根草本，具有适应性广、抗性强、生物量大、栽培管理粗放等特性，目前已被广泛应用于园林绿化、盐碱地改良、水土保持、重金属污染土壤修复等方面。马蔺对重金属具有较强的积累和耐受能力，其中重金属胁迫下非蛋白巯基Cys和GSH的大量合成是其解毒的重要机制。目前，Cys和GSH的测定方法有紫外法，薄层色谱法，高效液相色谱法（HPLC），毛细管电泳法，气相色谱法以及气质、液质联用等。紫外法由于样品中伴随着其他巯基化合物的存在，Cys、GSH和其他巯基化合物在相同波长下均有较强的吸收，因此测定值一般偏高；而薄层色谱法在分离效果、速度、定量准确度等方面存在缺陷；高效液相色谱法仍是目前应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测植物Cys和GSH仍存在因检测时间过长而导致流动相消耗量大、检测物质易变性等缺点。孙琴（土壤Cd、Zn复合污染对小麦根系植物络合素和谷胱甘肽合成的影响，孙琴，王超，农业环境科学学报，2008年第5期）报道，小麦根系Cys和GSH单个样品检测时间长达70min，进样量需要50ul。而利用超高效液相色谱（UPLC）可快速高效的测定植物中Cys和GSH含量，目前利用UPLC检测植物体内Cys和GSH国内外还未见报道。
发明内容
技术问题
本发明为解决现有的Cys和GSH测定方法存在成本高、检测时间长等问题，提供了一种利用超高效液相色谱仪对马蔺Cys和GSH含量进行快速高效定性、定量分析的方法。
技术方案
一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，利用超高效液相色谱快速高效的对马蔺Cys和GSH同时进行定性和定量分析：
（1）标准溶液配置
分别精确称取所述半胱氨酸和谷胱甘肽各0.1g，用1ml0.1%的TFA溶解，作为标准贮备液，-20℃保存备用；使用前，根据实验需要将此标准贮备液用0.1%的TFA稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液；
（2）Cys和GSH提取样品经过0.45μm滤膜过滤，用于进行检测分析；
（3）超高效液相色谱分离检测条件：
所述超高效液相色谱分析是指通过流动相梯度洗脱，进行波长检测，洗脱和检测条件为：
色谱柱：VydacC18色谱柱或同类UPLC反相C18色谱柱。
流动相：流动相A为0.1%的TFA，流动相B为100%ACN。
洗脱程序：12%～25%B（3min）、25%～100%B（0.5min）；洗柱：100%B（1.5min）；柱平衡：100%～0%B（0.5min）和柱后流动时间：1.5min。
流速：0.3～0.8ml·min-1，优选0.5ml·min-1。
柱温：25～35℃，优选30℃。
进样量：1～2μl，优选1μl，以峰面积进行外标法定量。
荧光检测器条件为：λex（激发波长）380nm、λem（发射波长）470nm。
紫外检测器的选择：选用二极管阵列检测器。
（4）定性
对Cys和GSH混合标准品进行色谱检测，得到标准品色谱图；对植物样品进行色谱检测，得到植物样品中Cys和GSH的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折；
（5）定量
制作标准曲线：准确配制1～100ng·μl-1的五个不同浓度的Cys和GSH的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为1μl；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到2条标准曲线；定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
有益效果
本发明提供了一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法。高效液相色谱法是目前测定植物体内Cys和GSH应用最为广泛的一种检测方法，但利用HPLC检测植物Cys和GSH仍存在进样量大、检测时间过长、流动相消耗量大、检测物质易变性等缺陷，而采用UPLC对植物样品Cys和GSH进行检测，可使单个样品进样量由50μl减至1μl，检测时间由70min缩短至7min，极大地提高了检测效率，同时也降低了流动相的消耗成本。
附图说明
图1为Cys标准曲线。
图2为GSH标准曲线。
图3为Cys和GSH标准品混合溶液超高效液相色谱（UPLC）图；其中数字表示物质出峰时间，Cys出峰时间为0.486min，GSH出峰时间为0.675min。
图4为实施例中马蔺样品Cys和GSH超高效液相色谱（UPLC）图；其中数字表示物质出峰时间，Cys出峰时间为0.487min，GSH出峰时间为0.675min。
具体实施方式
实施例1
（1）样品处理及提取：株高15～20cm的马蔺幼苗经0、100、500mg·L-1Pb(NO3)2处理7d后提取马蔺叶片和根系Cys和GSH并进行衍生化。具体如下：称取0.3g马蔺鲜样组织，液氮迅速冷冻后置于研钵中，加入1.75ml0.1%TFA（内含6.3mmol·L-1DTPA，pH<1）和少量石英砂，冰浴上充分研磨离心（4℃，12000g，20min），上清液冷藏用于Cys和GSH分析测定。
（2）标准溶液配置：分别精确称取所述Cys和GSH各0.1g，用1ml0.1%的TFA溶解，作为标准贮备液，-20℃保存备用；使用前，用0.1%TFA稀释成1、5、10、20、100ng·μl-1标准系列，4℃保存。
（3）衍生化：分别取25μl标准液和植物组织上清液，分别依次加入45μl200mmol·L-1HEPPS（内含6.3mmol·L-1DTPA，pH=8.2）和1μl25mmol·L-1mBBr，充分混合45℃反应，30min后加入30μl1mmol·L-1MSA终止反应,摇匀转移至Agilent棕色顶空瓶内，4℃保存，直到UPLC分析测定。
（4）色谱条件：采用二元梯度洗脱系统室温下分离mBBr衍生物。荧光检测器条件为：λex（激发波长）380nm、λem（发射波长）470nm；流动相A为0.1%的TFA，流动相B为100%ACN；流速为0.5ml·min-1；进样量为1μl；梯度洗脱程序：12%～25%B（3min）、25%～100%B（0.5min）；洗柱：100%B（1.5min）；柱平衡：100%～0%B（0.5min）和柱后流动时间：1.5min。
（5）定性：对半胱氨酸和谷胱甘肽混合标准品进行色谱检测，得到标准品色谱图；对植物样品进行色谱检测，得到植物样品中半胱氨酸和谷胱甘肽的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折。
（6）定量：制作标准曲线：准确配制1～100ng·μl-1的五个不同浓度的半胱氨酸和谷胱甘肽的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为1μL；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到2条标准曲线；定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
结果表明，该方法能够成功检测马蔺不同部位Cys和GSH含量，且重现性良好。
表1马蔺根系和叶片Cys和GSH含量（mg/gFW）
实施例2
（1）样品处理及提取：株高15～20cm的马蔺幼苗经0、10、80mg·L-1CdCl2处理7d后提取叶片和根系Cys和GSH并进行衍生化。具体如下：称取0.3g马蔺鲜样组织，液氮迅速冷冻后置于研钵中，加入1.75ml0.1%TFA（内含6.3mmol·L-1DTPA，pH<1）和少量石英砂，冰浴上充分研磨离心（4℃，12000g，20min），上清液冷藏用于Cys和GSH的分析测定。
（2）标准溶液配置：分别精确称取所述Cys和GSH各0.1g，用1ml0.1%的TFA溶解，作为标准贮备液，-20℃保存备用；使用前，用0.1%TFA稀释成1、5、10、20、100ng·μl-1标准系列，4℃保存。
（3）衍生化：分别取25μl标准液和植物组织上清液，分别依次加入45μl200mmol·L-1HEPPS（内含6.3mmol·L-1DTPA，pH=8.2）和1μl25mmol·L-1mBBr，充分混合45℃反应，30min后加入30μl1mmol·L-1MSA终止反应,摇匀转移至Agilent棕色顶空瓶内，4℃保存，直到UPLC分析测定。
（4）色谱条件：采用二元梯度洗脱系统室温下分离mBBr衍生物。荧光检测器条件为：λex（激发波长）380nm、λem（发射波长）470nm；流动相A为0.1%的TFA，流动相B为100%ACN；流速为0.5ml·min-1；进样量为1μl；梯度洗脱程序：12%～25%B（3min）、25%～100%B（0.5min）；洗柱：100%B（1.5min）；柱平衡：100%～0%B（0.5min）和柱后流动时间：1.5min。
（5）定性：对Cys和GSH混合标准品进行色谱检测，得到标准品色谱图；对植物样品进行色谱检测，得到植物样品中半胱氨酸和谷胱甘肽的UPLC色谱图；通过增高法进行定性分折。
（6）定量：制作标准曲线：准确配制1～100ng·μl-1的五个不同浓度的半胱氨酸和谷胱甘肽的混合标样，按照上述液谱条件进样，进样量为1μL；以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，计算得到2条标准曲线；定量：每种待测物质分别对应于外标做标准曲线，经过UPLC检测后将峰面积代入相对应的标准曲线方程计算出待测物质的含量。
表2Cd处理下马蔺根系和叶片Cys和GSH含量（mg/gFW）
镉处理(mg/L) Cys和GSH含量 重复1 重复2 重复3 平均值
0 叶片Cys含量 2.2 1.75 1.86 1.93
根系Cys含量 1.53 1.47 1.254 1.41
叶片GSH含量 8.06 8.38 8.52 8.32
根系GSH含量 3.08 2.91 2.98 2.99
10 叶片Cys含量 2.66 2.27 1.79 2.24
根系Cys含量 2.83 2.74 3.02 2.86
叶片GSH含量 9.66 10.25 10.38 10.09
根系GSH含量 4.01 3.84 3.91 3.92
80 叶片Cys含量 0.67 0.88 0.75 0.76
根系Cys含量 1.33 1.26 1.32 1.30
叶片GSH含量 15.2 16.71 14.55 15.48
根系GSH含量 5.54 3.96 4.12 4.54

Claims (6)

1.一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于所用的色谱柱为VydacC18色谱柱，流动相为TFA-ACN梯度洗脱，柱温30℃，流速0.5ml·min-1；荧光检测器条件为：激发波长380nm、发射波长470nm；1～100ng·μl-1浓度范围内半胱氨酸和谷胱甘肽浓度与峰面积呈良好的线性关系，可用于半胱氨酸和谷胱甘肽的定量测定。
2.根据权利要求1所述的一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于所述的流动相为0.1%的TFA和100%CAN。
3.根据权利要求1所述的一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于所述的梯度洗脱程序为：12%～25%ACN（3min）、25%～100%ACN（0.5min）；洗柱：100%ACN（1.5min）；柱平衡：100%～0%ACN（0.5min）和柱后流动时间：1.5min。
4.根据权利要求1所述的一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于：流动相的流速为0.3～0.8ml/min，优选为0.5ml/min。
5.根据权利要求1所述的一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于：柱温25～35℃，优选为30℃。
6.根据权利要求1所述的一种快速高效测定马蔺半胱氨酸和谷胱甘肽含量的方法，其特征在于所述的梯度洗脱进样量为：1～2μl，优选1μl。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770870A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 北京水木源生物科技有限公司 一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法
CN109342610A (zh) * 2018-12-24 2019-02-15 无锡福祈制药有限公司 谷胱甘肽含量的分析方法
CN110824039A (zh) * 2019-11-04 2020-02-21 北京市结核病胸部肿瘤研究所 一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法
CN111679028A (zh) * 2020-07-24 2020-09-18 上海市食品药品检验所 化妆品中四种胜肽的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN114384194A (zh) * 2021-12-28 2022-04-22 湖南中晟全肽生化有限公司 一种高通量检测多肽的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1435692A (zh) * 2002-01-31 2003-08-13 李勤 一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用
JP5223391B2 (ja) * 2008-03-14 2013-06-26 住友化学株式会社 蛍光システイン誘導体を用いる感作性検定方法及び蛍光システイン誘導体

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1435692A (zh) * 2002-01-31 2003-08-13 李勤 一种检测血同型半胱氨酸荧光分析试剂及制备方法与应用
JP5223391B2 (ja) * 2008-03-14 2013-06-26 住友化学株式会社 蛍光システイン誘導体を用いる感作性検定方法及び蛍光システイン誘導体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONIQUE PIRAUD等: "Ion-pairing reversed-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric analysis of 76 underivatized amino acids of biological interest: a new tool for the diagnosis of inherited disorders of amino acid metabolism", 《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》 *
何俊: "高效液相色谱法同时测定血浆同型半胱氨酸及其相关硫醇物的方法学研究与临床应用", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕医药卫生）科技辑》 *
原海燕等: "Cd胁迫下马蔺根和叶中非蛋白巯基肽含量的变化", 《生态环境学报》 *
张敏等: "超高效液相色谱分析酵母发酵乳清中的游离氨基酸", 《食品科技》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770870A (zh) * 2016-12-06 2017-05-31 北京水木源生物科技有限公司 一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法
CN109342610A (zh) * 2018-12-24 2019-02-15 无锡福祈制药有限公司 谷胱甘肽含量的分析方法
CN110824039A (zh) * 2019-11-04 2020-02-21 北京市结核病胸部肿瘤研究所 一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法
CN110824039B (zh) * 2019-11-04 2022-05-17 北京市结核病胸部肿瘤研究所 一种检测骨结核标本中环丝氨酸浓度的方法
CN111679028A (zh) * 2020-07-24 2020-09-18 上海市食品药品检验所 化妆品中四种胜肽的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN111679028B (zh) * 2020-07-24 2023-03-21 上海市食品药品检验研究院 化妆品中四种胜肽的高效液相色谱串联质谱检测方法
CN114384194A (zh) * 2021-12-28 2022-04-22 湖南中晟全肽生化有限公司 一种高通量检测多肽的方法
CN114384194B (zh) * 2021-12-28 2023-09-22 湖南中晟全肽生化有限公司 一种高通量检测多肽的方法

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