CN107091892A - 采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品的检测方法技术领域，尤其涉及一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：标准系列工作溶液的制备；待测液的制备；待测液净化：采用混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样、淋洗和洗脱，将洗脱液氮吹至近干，定容，过滤得到净化后的待测液；以及检测。本发明采用弱阴离子交换萃取柱，可以在酸性环境下通过其携带的哌嗪基团特定的吸附合成着色剂中的苯磺酸基团，同步萃取8种合成着色剂，提高萃取效果的同时排除杂质干扰。同时，本发明通过优化参数并在各合成着色剂保留时间内检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可进一步排除干扰，并获得更低的检出限。

Description

采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法

技术领域

本发明属于食品的检测方法技术领域，尤其涉及一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其中的合成着色剂包括柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红。

背景技术

合成着色剂是人工合成的使食品着色和改善食品色泽的物质，具有色泽鲜艳、性质稳定、使用成本低等优点，但具有一定毒性，长期大量使用会对人体造成损害。目前，我国已批准使用的合成着色剂有22种，常用合成着色剂有柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红等，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定了使用原则、使用范围和最大使用量。

现有检测合成着色剂的方法有两种，一种是通过聚酰胺吸附法萃取出样品中的色素，另一种是通过液-液分配法萃取。两者都不能同时萃取常用的多种合成着色剂，且难以排除杂质干扰。固体样品前处理过程中，用水直接提取难以将合成着色剂全部提取出来，造成回收率低，测试结果不准确。

本发明旨在提供一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，本发明采用弱阴离子交换萃取柱，可以在酸性环境下通过其携带的哌嗪基团特定的吸附合成着色剂(柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红)中的苯磺酸基团，可以同步萃取8种合成着色剂，提高萃取效果的同时排除杂质干扰。在固体样品的前处理阶段，采用氨水、无水乙醇、水混合溶液可以更快更完全的将合成着色剂提取出来。同时，本发明通过优化HPLC及DAD检测器的参数并在各合成着色剂保留时间内检测其特征吸收光谱所对应的色谱峰峰面积可以进一步排除干扰，并获得更低的检出限。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，本发明采用混合型弱阴离子交换萃取柱，可以在酸性环境下通过自身携带的哌嗪基团特定的吸附合成着色剂(柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红)中的苯磺酸基团，同步萃取8种合成着色剂，提高萃取效果的同时排除杂质干扰。在固体样品的前处理阶段，采用提取剂可以更快更完全的将合成着色剂提取出来。同时，本发明通过优化HPLC及DAD检测器的参数并在各合成着色剂的保留时间内检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可以进一步排除干扰，并获得更低的检出限。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红，并将其一起转移至容量瓶中，加水和甲醇的混合溶液定容至刻度，得到标准混合溶液；经逐级稀释后得到标准系列工作溶液。

2)待测液的制备：液体样品加水稀释，再加柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液；固体样品加入氨水、无水乙醇和水的混合溶液，经两次重复提取后，将得到的上清液合并，氮吹除去上清液中的氨水和乙醇，加柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。

3)待测液净化：采用混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样、淋洗和洗脱，此为合成着色剂的萃取过程，将洗脱液氮吹至近干，转移至容量瓶中定容，过滤，得到净化后的待测液；

4)检测：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液。以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰的峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。采用DAD检测器灵敏度高、噪音低、线性范围宽，适用于梯度洗脱，而且可得到任意吸收波长对应的色谱图。采用高效液相色谱及DAD检测器检测，优化了色谱条件和流动相配比，根据各合成着色剂保留时间选择其特征吸收波长所对应的色谱峰检测，得到更低的检出限同时排除杂质组分的干扰。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，步骤1)中水和甲醇的体积比为(0.5-2):1，其可以使8种合成着色剂标准物质完全溶解。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，若样品为液体样品，步骤2)具体为：对样品加水稀释后，加质量浓度为10％-30％柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。此处调节待测液的pH值至3-4，可以使其中的合成着色剂携带的苯磺酸基团呈带负电荷的解离子形态，从而被固相萃取柱中的阴离子交换剂吸附。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，若样品为固体样品，则步骤2)为：将称取的样品加入离心管中，并向离心管中加入氨水、无水乙醇、水的混合溶液，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为(1.5-3):(6-8.5):1，涡旋混匀，超声提取，离心后将上清液过滤，重复提取两次后合并上清液；氮吹除去上清液中的氨水和乙醇，再加柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。采用氨水、无水乙醇、水的混合溶液可以尽可能地将固体样品中的合成着色剂提取出来，其效果明显优于用水直接提取固体样品中的合成着色剂，从而提高检测的准确度。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，步骤3)中，采用DiKMAProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱净化待测液，活化所使用的溶剂为甲醇，平衡所用的溶剂为去离子水，淋洗所用的溶剂为体积比分别为1：(0.5-2)：(2-5)的甲醇、甲酸和水的混合溶剂，洗脱所用的溶剂为体积比分别为(1-3)：(5-9)：1的氨水、无水乙醇和水的混合溶剂。其中淋洗过程加甲酸保持酸性环境，使合成着色剂组分被萃取柱吸附的同时，其他不能吸附的杂质被淋洗出来；洗脱过程加氨水保持碱性环境，使合成着色剂成分解吸附后被洗脱出来。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，步骤3)中上样时待测液的流速不超过1滴/s。保证样品中合成着色剂成分被固相萃取柱中的阴离子交换剂充分吸附。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，步骤3)中，定容所用的溶剂为体积比为(0.5-2)：1的甲醇和水的混合溶液，可以完全溶解样品中难溶于水的组分，如赤藓红，避免了待测组分的流失；过滤是将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜。这种材质的滤膜可以有效的滤出杂质，且不会吸附待测的合成着色剂，其本身也不会溶解到有机液体成分中去。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，高效液相色谱仪的色谱柱为C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，梯度洗脱的程序如下表：

梯度洗脱时的柱温为35℃，混合液的流速为1.0mL/min。按此程序梯度洗脱可以增加各组分色谱峰之间的分离度，从而得到更准确的检测结果。

作为本发明采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法的一种改进，变波长的程序如下表：

T(min)	0	4.6	5.4	6.3	10.5	13.0
							波长(nm)	440	510	615	510	630	535

根据各组分色谱峰的保留时间，检测其最佳特征吸收波长所对应的峰面积，不仅可以排除杂质干扰，还可以得到更低的检出限。

相对于现有技术，本发明至少具有如下优点：

第一，本发明采用的前处理萃取方式(采用混合型弱阴离子交换柱)能够将样品中8种合成着色剂(柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红)一次性完全萃取出来，这是因为混合型弱阴离子交换柱可以在酸性环境下通过其携带的哌嗪基团特定的吸附合成着色剂中的苯磺酸基团，显著提升了萃取效率和萃取效果，并且整个前处理过程能尽量做到方便快捷、重复性好、成本低。即本发明通过改进优化前处理方法，可以提高萃取效率，使检测结果更准确。本发明克服了国标方法不能同时提取8中合成着色剂的不足，因为在国标方法中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝采用聚酰胺吸附法提取，赤藓红用液-液分配法提取。

第二，本发明通过优化样品前处理方法，排除了其他物质的干扰，显著的改善了合成着色剂的提取效果，提高了测试结果的准确度。

第三，本发明通过优化仪器分析条件，优化梯度洗脱参数，改善各种合成着色剂色谱峰的分离度，使各组分得到更好的分离，减少其它杂质的干扰，使得测试数据更加准确，以快速准确的同时检测出各种合成着色剂的含量。

第四，根据各种合成着色剂组分保留时间的不同，检测其特征吸收波长所对应的色谱峰峰面积，可以获得更低的检出限，并进一步排除杂质的干扰。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明。

图1为本发明中实施例1的各组分分离图谱。

图2至图9分别为8种合成着色剂的标准曲线。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100ml容量瓶中，加体积比为1:1的水和甲醇的混合溶剂定容至刻度，得到标准混合溶液，然后用体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液将标准混合溶液逐级稀释成多个不同浓度的合成着色剂标准系列工作溶液，浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL。

2)待测液的制备：取市售橙汁作为样品，称取市售果汁2g(精确到0.0001g)，将称取的样品加入容器中，加10mL水溶解，再加入质量浓度为20％的柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液；

3)待测液净化：采用DiKMA ProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样，经淋洗和洗脱后，洗脱液氮吹至近干，转移至5mL容量瓶中定容至刻度，定容所用的溶剂为体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中，得到净化后的待测液；具体的：活化所用溶剂为5mL甲醇；平衡所用溶剂为5mL去离子水；待测液上样时的流速不超过1滴/s；淋洗时所用的溶剂为5mL甲醇、甲酸、水的混合溶剂，其中，甲醇、甲酸、水的体积比为2:2:6，洗脱时所用的溶剂为10mL氨水、无水乙醇、水的混合溶剂，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为2:7:1。

4)用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L的乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液。

其中，高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm，柱温为35℃；流速为1.0mL/min；梯度洗脱的程序如下表：

变波长的程序如下表：

T(min)	0	4.6	5.4	6.3	10.5	13.0
							波长(nm)	440	510	615	510	630	535

以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，其中，8种合成着色剂的标准曲线分别如图2至图9所示；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。

采用本实施例得到的各组分分离图谱如图1所示，由图1可以看出：本发明的方法可以对食品中的合成着色剂同时检测出，检测的准确度和灵敏度高，而且该检测方法稳定，受杂质峰干扰小。

实施例2

本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，加体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液定容至刻度，得到标准混合溶液，然后用体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液将标准混合溶液逐级稀释成多个不同浓度的合成着色剂标准系列工作溶液，浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL。

2)待测液的制备：取市售绿茶饮料作为样品，称取市售绿茶饮料2g(精确到0.0001g)，将称取的样品加入容器中，加10mL水溶解，再加入质量浓度为28％的柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液；

3)待测液净化：采用DiKMA ProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样，经淋洗和洗脱后，将洗脱液氮吹至近干，转移至5mL容量瓶中定容，定容所用的溶剂为体积比为2:1的水和甲醇的混合溶剂，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中，得到净化后的待测液；具体的：活化所用溶剂为5mL甲醇；平衡所用溶剂为5mL去离子水；待测液上样时的流速不超过1滴/s；淋洗时所用的溶剂为5mL甲醇、甲酸、水的混合溶剂，其中，甲醇、甲酸、水的体积比为2:3:5，洗脱时所用的溶剂为10mL氨水、无水乙醇、水的混合溶剂，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为3:6:1。

4)用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L的乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液。

其中，高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm，柱温为35℃；流速为1.0mL/min；梯度洗脱的程序如下表：

变波长的程序如下表：

T(min)	0	4.6	5.4	6.3	10.5	13.0
							波长(nm)	440	510	615	510	630	535

以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。

实施例3

本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，加体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液定容至刻度，得到标准混合溶液，然后用体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液将标准混合溶液逐级稀释成多个不同浓度的合成着色剂标准系列工作溶液，浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL。

2)待测液的制备：取市售蜜饯作为样品，称取市售蜜饯1g(精确到0.0001g)，将称取的样品加入50mL的离心管中，并向离心管中加入氨水、无水乙醇、水的混合溶液10mL，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为2:7:1，涡旋30s混匀，超声提取20min，4000r/min离心5min后将上清液过滤，重复以上提取步骤两次，合并上清液，氮吹上清液除去其中氨水和乙醇，再加入质量比为15％的柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。3)待测液净化：采用DiKMA ProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样、经淋洗和洗脱后，洗脱液氮吹至近干，再转移至5mL容量瓶中定容，定容所用的溶剂为体积比为1.5:1的水和甲醇的混合溶剂，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中，得到净化后的待测液；具体的：活化所用溶剂为5mL甲醇；平衡所用溶剂为5mL去离子水；待测液上样时的流速不超过1滴/s；淋洗时所用的溶剂为5mL甲醇、甲酸、水的混合溶剂，其中，甲醇、甲酸、水的体积比为2:2.5:5.5，洗脱时所用的溶剂为10mL氨水、无水乙醇、水的混合溶剂，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为3:6:1。

4)用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L的乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液。

其中，高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm，柱温为35℃；流速为1.0mL/min；梯度洗脱的程序如下表：

变波长的程序如下表：

T(min)	0	4.6	5.4	6.3	10.5	13.0
							波长(nm)	440	510	615	510	630	535

以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。

实施例4

本实施例提供了一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红0.1g(精确至0.00001g)，并将其一起转移至100mL容量瓶中，加体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液定容至刻度，得到标准混合溶液，然后用体积比为1:1的水和甲醇的混合溶液将标准混合溶液逐级稀释成多个不同浓度的合成着色剂标准系列工作溶液，浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL。

2)待测液的制备：取市售硬糖作为样品，称取市售硬糖1g(精确到0.0001g)，将称取的样品加入50mL的离心管中，并向离心管中加入氨水、无水乙醇、水的混合溶液10mL，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为1.7:7.3:1，涡旋60s混匀，超声提取30min，6000r/min离心5min后将上清液过滤，重复以上提取步骤两次，合并上清液，氮吹上清液除去其中氨水和乙醇，再加入质量比为18％的柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。

3)待测液净化：采用DiKMA ProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样、经淋洗和洗脱后，将洗脱液氮吹至近干，再转移至5mL容量瓶中定容，定容所用的溶剂为体积比为1.5:1的水和甲醇的混合溶剂，将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中，得到净化后的待测液；具体的：活化所用溶剂为5mL甲醇；平衡所用溶剂为5mL去离子水；待测液上样时的流速不超过1滴/s；淋洗时所用的溶剂为5mL甲醇、甲酸、水的混合溶剂，其中，甲醇、甲酸、水的体积比为2:3.2:4.8，洗脱时所用的溶剂为10mL氨水、无水乙醇、水的混合溶剂，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为2.5:6.5:1。

4)用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为0.02mol/L的乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液。

其中，高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，色谱柱为Phenomenex C18柱，250mm×4.6mm(即色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm)，色谱柱内的填料的粒径为5μm，柱温为35℃；流速为1.0mL/min；梯度洗脱的程序如下表：

变波长的程序如下表：

T(min)	0	4.6	5.4	6.3	10.5	13.0
							波长(nm)	440	510	615	510	630	535

以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。

总之，本发明采用DiKMAProElut PWA混合型弱阴离子交换萃取柱，可以在酸性环境下通过其携带的哌嗪基团特定的结合合成着色剂(柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红)中的苯磺酸基团，同步萃取8种合成着色剂，提高萃取效果的同时排除杂质干扰。在固体样品的前处理阶段，采用体积比为2:7:1的氨水、无水乙醇、水混合溶液可以更快更完全的将合成着色剂提取出来。同时，本发明通过优化HPLC及DAD检测器的参数将保留时间与检测最佳特征吸收光谱相对应，可以进一步排除干扰，并获得更低的检出限。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)标准系列工作溶液的制备：分别称取标准物质柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、赤藓红，并将其一起转移至容量瓶中，加水和甲醇的混合溶液定容至刻度，得到标准混合溶液；经逐级稀释后得到混合标准系列工作溶液；

2)待测液的制备：液体样品加水稀释，再加入柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液；固体样品加入氨水、无水乙醇和水的混合溶液，经两次重复提取后，将得到的上清液合并，氮吹除去其中氨水和乙醇，加入柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液；

3)待测液净化：采用DiKMAProElut PWA混合型弱阴离子交换固相萃取柱，并对该萃取柱进行活化和平衡，然后将待测液上样，经淋洗和洗脱后，将洗脱液氮吹至近干，再转移至容量瓶中定容，过滤，得到净化后的待测液；

4)检测：用带有DAD检测器的高效液相色谱仪对混合标准系列工作溶液和净化后的待测液进行测试，采用梯度洗脱，并在变波长下进行检测，其中，高效液相色谱仪的流动相为乙酸铵溶液与甲醇梯度混合的混合液；以混合标准系列工作溶液的浓度为横坐标，8种合成着色剂对应的色谱峰的峰面积为纵坐标绘制标准曲线；测定待测液的色谱峰的峰面积，根据标准曲线得到待测液中8种合成着色剂的质量浓度。

2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，步骤1)中水和甲醇的体积比为(0.5-2):1。

3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，步骤2)中柠檬酸溶液的质量浓度为10％-30％。

4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，若样品为固体样品，则步骤2)具体为：将称取的样品加入离心管中，并向离心管中加入氨水、无水乙醇、水的混合溶液，其中氨水、无水乙醇、水的体积比为(1.5-3):(6-8.5):1，涡旋混匀，超声提取，离心后将上清液过滤，重复两次提取后合并上清液，氮吹除去上清液中的氨水和乙醇，再加入柠檬酸溶液调节pH值至3-4，得到待固相萃取柱净化的待测液。

5.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，步骤3)中，活化所使用的溶剂为甲醇，平衡所用的溶剂为去离子水，淋洗所用的溶剂为体积比分别为1：(0.5-2)：(2-5)的甲醇、甲酸和水的混合溶剂，洗脱所用的溶剂为体积比分别为(1-3)：(5-9)：1的氨水、无水乙醇和水的混合溶剂。

6.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于：步骤3)中上样时待测液的流速不超过1滴/s。

7.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，步骤3)中，定容所用的溶剂为体积比为(0.5-2)：1的甲醇和水的混合溶剂，过滤是将定容后的溶液通过直径为0.22μm的聚四氟乙烯滤膜过滤到样品瓶中。

8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，高效液相色谱仪的色谱柱为C18柱，250mm×4.6mm，色谱柱内的填料的粒径为5μm。

9.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序如下表：

梯度洗脱时的柱温为35℃，混合液的流速为1.0mL/min，乙酸铵溶液的浓度为0.02mol/L。

10.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测试食品中合成着色剂的含量的方法，其特征在于，变波长的程序如下表：