CN109307723A - 一种栀子与水栀子的uplc检测方法及其鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种栀子与水栀子的UPLC检测方法，其特征在于：它是以京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷‑Ⅰ、西红花苷‑Ⅱ为对照品，利用超高效液相色谱仪进行检测。本发明的栀子与水栀子的UPLC检测方法，可用于京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷‑Ⅰ、西红花苷‑Ⅱ的检测，还可用于栀子与水栀子的质量检测，能反应出栀子及水栀子多成分的整体面貌，同时也可用于栀子与水栀子的鉴别，结果可靠，为栀子及水栀子的质量控制提供了新方法，具有良好的应用前景。

Description

一种栀子与水栀子的UPLC检测方法及其鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种栀子与水栀子的UPLC检测方法及其鉴别方法。

背景技术

栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，列为中品，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效，用于热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡，外治用于挫伤痛。目前商品市场上的栀子除此之外，时常出现同属植物水栀子Gardenia jasminoides Elli,f.logicarpa的干燥成熟果实作为栀子药用。而水栀子主要是作为染料和食用色素，两者在功效、药理作用、毒性以及临床应用等方面都不尽相同，故栀子和水栀子不能同等入药。

目前，关于栀子与水栀子主要是通过性状和显微特征等外观形貌的差异来鉴别，鉴别准确度不高。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种栀子与水栀子的UPLC检测方法，其特征在于：它的操作步骤如下：

1)对照品溶液的制备：分别称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品，加低级醇溶解，制成混合对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：取待测样品粉末，用低级醇提取，过滤得供试品溶液；

3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

进一步地，步骤1)所述对照品京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ浓度分别为每1ml含69.6μg、164.0μg、83.2μg、43.6μg的溶液。

进一步地，步骤2)所述提取为超声提取或回流提取。

更进一步地，所述提取的时间为30min。

进一步地，步骤2)所述待测样品与低级醇的重量体积比为1:400～600，优选为1:500。

进一步地，步骤1)和步骤2)所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇；优选为甲醇。

更进一步地，所述低级醇的浓度为30-70％V/V；优选50％V/V。

进一步地，步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪的量为1μL。

进一步地，步骤3)所述色谱条件的色谱柱是Waters BEH C18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温为30℃，流速为0.3mL/min，波长为：0-10min时间段238nm，10-14min时间段为440nm。

本发明还提供了一种栀子与水栀子的鉴别方法，其特征在于，它的操作步骤如下：

a、取待检栀子或水栀子；

b、按前述UPLC法检测；

c、分析指纹谱图。

进一步地，所述指纹图谱显示为栀子在10-11min有独有的特征峰；显示为水栀子在2-4min有独有的特征峰。

本发明的栀子与水栀子的UPLC检测方法，可以同时检测京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ，可用于栀子与水栀子的质量检测，能反应出栀子及水栀子多成分的整体面貌，同时也可用于栀子与水栀子的鉴别，结果可靠，为栀子及水栀子的质量控制提供了新方法，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1栀子混合对照品色谱图(1.京尼平龙胆双糖苷；2.栀子苷；3.西红花苷-Ⅰ；4.西红花苷-Ⅱ)

图2栀子样品色谱图(4.京尼平龙胆双糖苷；5.栀子苷；7.西红花苷-Ⅰ；8.西红花苷-Ⅱ)

图3水栀子样品色谱图(5.京尼平龙胆双糖苷；6.栀子苷；8.西红花苷-Ⅰ；9.西红花苷-Ⅱ)

图4 50％甲醇提取的栀子样品色谱图

图5精密度实验色谱图

图6稳定性实验色谱图

图7重复性实验色谱图

具体实施方式

仪器与试药

仪器：美国Waters ACQUITY UPLCH-Class System(包括四元高压泵系统、柱温箱、自动进样器、TUV检测器、Empower软件色谱工作站)；BP-121s精密电子天平(十万分之一，浙江精密仪器有限公司)；BS-200S-WEI精密电子天平(千分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂(磷酸等)均为分析纯，水为超纯水。

对照品：京尼平龙胆双糖苷对照品(批号：wkq16021804)、栀子苷对照品(批号：wkq16052902)、西红花苷-Ⅰ对照品(批号：wkq16030701)、西红花苷-Ⅱ对照品(批号：wkq16030602)等均购买自四川省维克奇生物科技有限公司(纯度均≥98％)。

样品：栀子来源于江西省抚州市、四川省泸州市；水栀子来源于江西省抚州市；均于2015年10月果实成熟时采收，按《中国药典》2015版规定进行加工。

实施例1本发明栀子UPLC检测

1)对照品溶液的制备：分别精密称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液，其浓度分别为69.6μg·mL^-1、164.0μg·mL^-1、83.2μg·mL^-1、43.6μg·mL^-1；

2)供试品溶液的制备：精密称取栀子干燥样品粉末(过4号筛)0.1g放入100mL具塞的锥形瓶中，然后精密加入50％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，再称定重量，用50％的甲醇补足损失重量，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，即得；

3)分别吸取1μL参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；检测波长238nm(0-10min)，440nm(10-14min)；流速0.3mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序如下：

对混合对照品、栀子样品进行UPLC图谱测定，记录图谱。混合对照品结果见图1、栀子样品结果图2。

实施例2本发明水栀子UPLC检测

1)对照品溶液的制备：分别精密称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液，其浓度分别为69.6μg·mL^-1、164.0μg·mL^-1、83.2μg·mL^-1、43.6μg·mL^-1；

2)供试品溶液的制备：精密称取水栀子干燥样品粉末(过4号筛)0.1g放入100mL具塞的锥形瓶中，然后精密加入50％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，再称定重量，用50％的甲醇补足损失重量，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，即得；

3)分别吸取1μL参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：Waters BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；检测波长238nm(0-10min)，440nm(10-14min)；流速0.3mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序如下：

对混合对照品、水栀子样品进行UPLC图谱测定，记录图谱。混合对照品结果同图1，水栀子样品结果见图3。

实施例3本发明栀子与水栀子UPLC鉴别

将实施例1中栀子色谱图(图2)与实施例2中水栀子色谱图(图3)相比较得出：栀子在10-11min有特征峰9号峰，水栀子在2-4min有特征峰3号峰，栀子的9号峰和水栀子的3号峰分别是其独有的特征峰，可作为鉴别峰。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1检测方法工艺参数筛选

1样品提取方法考察

考察了纯水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇5种不同提取溶剂的提取效果。

分别精密称取栀子样品粉末0.1g，放入具塞锥形瓶中，然后精密加入不同提取溶剂(纯水、30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇)50mL，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，用提取溶剂补足减失重量，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得供试样品。

通过对5种提取溶剂的考察发现，采用50％甲醇提取效果最好，峰形最好，峰面积最大，见图4，故选用50％甲醇作为提取溶剂。

在提取溶剂确定后，又针对超声提取时间进行优化，最终确定栀子供试样品制备方法：精密称取样品粉末约0.1g，放入具塞的锥形瓶中，然后精密量取50％甲醇50mL加入具塞锥形瓶，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，再称定重量，用50％的甲醇补足失重，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜过滤，即得。

2色谱条件考察

流动相筛选：通过对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％磷酸水等多个流动相进行筛选比较，结果显示乙腈-0.1％磷酸水的分离效果较好，故选择乙腈-0.1％磷酸水。

洗脱程序考察：通过样品在238nm和440nm上的色谱图，以及在流动相变化梯度上有最大吸收的梯度变化时间，最终优化确定洗脱程序如下表1：

表1色谱条件洗脱程序

综合以上实验结果，确定色谱条件如下，即Waters BEH C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈(A)和0.1％磷酸水(B)，梯度洗脱程序见表1；检测波长238nm(0-10min)，440nm(10-14min)；流速0.3mL·min^-1；柱温30℃；进样体积1μL。

3对照品溶液制备

分别精密称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品适量，加甲醇溶解，制成混合对照品溶液，其浓度分别为69.6μg·mL^-1、164.0μg·mL^-1、83.2μg·mL^-1、43.6μg·mL^-1。

4供试品溶液制备

精密称取干燥样品粉末(过4号筛)约0.1g放入100mL具塞的锥形瓶中，然后精密加入50％甲醇50mL，称定重量，超声处理30min，冷却至室温，再称定重量，用50％的甲醇补足损失重量，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，即得。每个样品3份，按“2”项下色谱条件进行测定。

5方法学考察

5.1精密度试验

取同一份供试品溶液，按照“2”项下色谱条件连续进样6次，记录20min图谱，见图5。以栀子苷峰为参照峰,计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值为0.12％-0.6％，相对峰面积的RSD为0.38％-2.49％，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。

5.2稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24h按“2”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图6。结果表明各共有峰的相对保留时间RSD值为0.09％-0.49％，相对峰面积的RSD为1.01％-2.78％，说明供试品溶液在24h内较稳定。

5.3重复性试验

取同一样品5份，按“4”项下方法制备供试品溶液，并按“2”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图7，结果各共有峰的相对保留时间RSD值为0.04％-0.38％，相对峰面积的RSD为0.87％-2.94％，表明该方法重复性良好，可用于指纹图谱分析。

通过特征图谱方法学考察，确认了该检测方法能用于栀子与水栀子的质量检测，并通过该方法能有效鉴别栀子与水栀子。

Claims (10)

1.一种栀子与水栀子的UPLC检测方法，其特征在于：它的操作步骤如下：

1)对照品溶液的制备：分别称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品，加低级醇溶解，制成混合对照品溶液；

2)供试品溶液的制备：取待测样品粉末，用低级醇提取，过滤得供试品溶液；

3)分别吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪，色谱条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B梯度洗脱；梯度洗脱程序如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述混合对照品溶液中京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的浓度分别为每1ml含69.6μg、164.0μg、83.2μg、43.6μg。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述提取为超声提取或回流提取，提取时间为30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述待测样品与低级醇的重量体积比为1:400～600，优选为1:500。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)和步骤2)所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇；优选为甲醇。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述低级醇的浓度为30-70％V/V；优选50％V/V。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪的量为1μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)所述色谱条件的色谱柱是WatersBEH C18柱2.1×50mm，1.7μm；柱温为30℃，流速为0.3mL/min，波长为：0-10min时间段238nm，10-14min时间段为440nm。

9.一种栀子与水栀子的鉴别方法，其特征在于，它的操作步骤如下：

a、取待检栀子或水栀子；

b、按权利要求1-8所述的UPLC法检测；

c、分析指纹谱图。

10.根据权利要求9所述的鉴别方法，其特征在于，所述指纹图谱显示为栀子在10-11min有独有的特征峰；显示为水栀子在2-4min有独有的特征峰。