CN108459105B

CN108459105B - 一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法

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Publication number: CN108459105B
Application number: CN201810343204.3A
Authority: CN
Inventors: 周佳; 丁友超; 钱凯; 汤娟; 程月
Original assignee: Nanjing Customs Industrial Product Testing Center
Current assignee: Nanjing Customs Industrial Product Testing Center
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108459105A

Abstract

本发明公开了一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，属于化学分析检测技术领域。它包括建立了适用于皮革中N‑辛基异噻唑啉酮、2‑(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4‑氯‑3‑甲酚、三氯生和邻苯基苯酚5种防腐剂同时检测的合相色谱技术程序，目标化合物经提取、浓缩、过滤后，由超高效合相色谱进行定性定量分析，可适用于皮鞋、皮具等皮革制品中5种防腐剂的同时测定。该方法灵敏度高、稳定好，操作简单、快速、成本低、对环境友好，易于推广应用。

Description

一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，更具体地说，涉及一种超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法。

背景技术

防腐剂主要作用是抑制微生物的生长和繁殖，以延长消费品的保存时间，抑制物质腐败的药剂。禁用的防腐剂对人体有较大的生物毒性，人体吸入或经皮肤吸收可引起多种疾病，而且其还具有蓄积作用，自然降解过程长，对环境有害。

随着科学技术的不断发展，商家为了避开已有的法规规定，使用了一系列新型有毒有害物质，因此，建立相关检测技术并标准化是必要和迫切的。N-辛基异噻唑啉酮(OIT)、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑(TCMTB)、4-氯-3-甲酚(CMK)、三氯生(TCS)、邻苯基苯酚(o-PP)等作为防腐剂广泛应用于皮革加工中，但是这些物质是环境危险和有毒物质，与皮肤接触会产生过敏反应，如作为防腐剂被用于皮革生产过程中的三氯生(TSC)会改变试验动物激素分泌或使细菌产生抗药性，对水生生物有剧毒，并有很强的生物累积作用，对环境造成持久影响。所以欧盟国家的部分企业要求对终端用户，包括纺织品的供应商和经销商在产品进入欧洲市场时必须出示相关的检测报告,现行欧盟对有害物质的分类和限制主要基于67/548/EEC和76/769/EEC指令，受限制物质有CMR－致癌、致畸及生物毒性物质。如德国大型鞋企DEICHMANN明确规定了在鞋子中检测OIT、TCMTB、CMK、TCS、o-PP五种物质的要求，并明确规定了其限量。因此建立皮革中五种物质的检测方法具有重要的现实意义。

目前，国内外展开了食品、化妆品、水、环境和纺织品中防腐剂残留量的检测研究，通常主要研究TCS和o-PP，但同时研究这5种防腐剂检测方法的文章较少。

《中国皮革》2013年第1期公开了《高效液相色谱法检测皮革中3种防腐剂》，其中公开了利用高效液相色谱方法检测4-氯-3,5-二甲基苯酚(PC-MX)和2-(硫氰基甲基硫代)-苯并噻唑(TCMTB)的方法，皮革样品经乙腈超声提取20min，滤液滤膜过滤后进行HPLC-DAD测定。流动相为乙腈/水，柱温40℃，DAD波长为225nm。当标样的浓度为0.5～10mg/L时，线性相关系数R²≥0.99，最高检出限5mg/kg，加标回收率在85％～106％之间。其局限性在于：采用乙腈作为提取溶剂，提取后未对提取液进行浓缩，导致实际进样浓度偏低；且该论文中公开了该方法对于PCMX的测定低限为5.0mg/kg，TCMTB的测定低限为1.5mg/kg，TCS的测定低限为3.0mg/kg；检测限均属于偏高水平，当皮革样品中防腐剂含量较低时难以检出。

BS EN ISO 13365-2011中公开了采用高效液相色谱同时检测N-辛基异噻唑啉酮(OIT)、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑(TCMTB)、4-氯-3-甲酚(CMK)和邻苯基苯酚(o-PP)的方法，该方法采用乙腈为提取剂，流动相A相为水，B相为乙腈，进样量为20μL，在0.8mL/min流速下采用60％B等度洗脱6min；在9min内线性增加至95％B来检测待测的样品的含量。其缺点在于以乙腈做为流动相，色谱峰型偏宽，皮革样品基质复杂，不利用目标物与杂质的分离，并且检测时间长，不利于大批量样品的分析。

超高效合相色谱(Ultra performance convergencechromatography,UPC²)技术源于超临界流体色谱技术，由于其以超临界CO₂为主要的流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析，既能分析不适用于气相色谱的高沸点、低挥发、遇热不稳定的样品，又能提高高效液相色谱的分析速度和柱效；结合2μm填料技术，使其具有更高的分离能力，更高的分析效率，能够通过精确地调节流动相强度、压力和温度，获得所需的系统分辨率和选择性，对待测物的保留和分离进行有效调控，相对于高效液相色谱，超高效合相色谱具有扩散效率更高，传质效果更好，操作温度低，灵敏度高、分离效率高、重复性好、分析速度快以及绿色环保，可有效降低有毒溶剂对试验人员的身体健康的损害等优点。

国标GB/T 20386-2006中邻苯基苯酚的测定中，乙酰化的测定低限为0.05mg/kg，采用高效液相色谱图方法检测限往往难以达到要求。因此，建立一种低检测限的采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法很有必要，目前的公开文献尚未见有此类技术的相关报道。

发明内容

1、要解决的问题

针对现有技术中采用高效液相色谱同时检测N-辛基异噻唑啉酮(OIT)、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑(TCMTB)、4-氯-3-甲酚(CMK)和邻苯基苯酚(o-PP)分析速度慢、分离效果不理想、流动相溶剂毒性大以及检测限高的问题，本发明提供一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，所述防腐剂包括N-辛基异噻唑啉酮、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚；所述的检测方法包括以下步骤：

1)五种防腐剂标准溶液的制备；

2)样品溶液的制备：采用甲醇对皮革样品进行超声提取，浓缩提取液，再将所述提取液过滤，滤液备用；

3)采用超高效合相色谱进行检测：流动相A为超临界CO₂，流动相B为乙腈、甲醇和10mmol/L乙酸铵的混合溶液；

标准溶液的检测：对步骤1)所述五种防腐剂的标准溶液进行超高效合相色谱检测，由标准溶液分别得到五种防腐剂的保留时间和指纹图谱；分别以五种防腐剂标准工作溶液的浓度为横坐标，以各防腐剂的峰面积为纵坐标，绘制五种防腐剂的标准工作曲线；

待测样品溶液的检测：采用超高效合相色谱对步骤2)中所述的滤液进行检测；

4)待测样品中五种防腐剂的定性分析；

5)待测样品中五种防腐剂的定量测定。

优选地，步骤1)所述标准工作液配制具体为，准确称取OIT、TCMTB、CMK、TCS和o-PP五种标准物质(精确至0.01mg)，分别用甲醇为溶剂准确配制得1000mg/L储备液，于-18℃避光保存；吸取1mL上述标准储备液于50mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20mg/L的工作液。从该工作液中分别吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mg/L的系列标准工作溶液。

优选地，步骤2)所述样品溶液的制备具体为：取待测样品，称取1.0g(精确至0.01g)，置于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，放入超声波浴中，超声功率为420W，超声频率为40KHz，提取20min。将提取液倒入带有刻度的浓缩瓶中，残渣再用30mL甲醇超声提取10min，合并滤液，于40℃水浴旋转蒸发仪浓缩至1～2mL，再用氮吹至近干，残留物用甲醇准确定容至2mL，经0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤后，进超高效合相色谱仪分析。

优选地，步骤3)所述采用超高效合相色谱进行检测的参数条件具体为：

色谱柱：ACQUITY UPC²HSS C18SB色谱柱，100mm×3.0mm，1.8μm或相当者；

洗脱梯度：

流速：1.5mL/min；

进样量：1μL；

检测波长：240nm，280nm，305nm；

系统背压：13.10MPa；

色谱柱温度：60℃。

优选地，步骤3)所述五种防腐剂的指纹图谱采用如下方法建立：

A)精密量取1μL样品注入超高效合相色谱仪中，制定五种防腐剂对照指纹图谱；其中，色谱条件与五种防腐剂含量测定中的相同；

B)指纹图谱鉴定：将样品在相同处理方法及色谱条件下测定五种防腐剂指纹图谱，与上述对照指纹图谱相比较，相似度大于0.90的为合格样品。

优选地，步骤4)所述样品中五种防腐剂的定性分析具体为，在步骤3)所述检测条件下，通过比较待测样品溶液与标准工作溶液中被测组分色谱峰的保留时间和指纹图谱进行定性分析，定性确认防腐剂的种类。

优选地，步骤5)所述样品中五种防腐剂的定量测定具体为，根据步骤3)中得到的五种防腐剂的标准工作曲线，由步骤3)中超高效合相色谱得到的待测样品溶液中所含相应防腐剂的峰面积计算待测样品中各防腐剂的浓度。

优选地，采用所述的超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚的含量浓度范围为0.2～5mg/L。

优选地，所述的超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚含量的定量限分别为：0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.05mg/kg、0.03mg/kg、0.02mg/kg。

表1新型防腐剂的基本信息

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明检测的皮革中的五种新型防腐剂，对人体有较大的生物毒性，与皮肤接触会产生过敏反应，欧盟国家的部分企业要求对终端用户，包括纺织品的供应商和经销商在产品进入欧洲市场时必须出示相关的检测报告，DEICHMANN明确规定在鞋子中检测OIT、TCMTB、CMK、TCS、o-PP五种物质的要求，并明确规定了其限量要求(0.5mg/kg)，而国标GB/T20386-2006中邻苯基苯酚的测定中，乙酰化的测定低限为0.05mg/kg，要求更高，采用高效液相色谱图方法检测限往往难以达到要求；本发明针对上述问题，提供了能够一次性同时检测五种防腐剂的方法，采用本发明技术方案，可以在2min之内检测出五种防腐剂的含量，耗时短、效率高；

(2)本发明采用流动相A：超临界CO₂，流动相B：乙腈、甲醇和10mmol/L乙酸铵混合溶液作为流动相B，得到的色谱图峰型较窄，信噪比高，基线平整，同时缩短了五种防腐剂的分析时间，使检出速度提高到2min内完成；有效避免了传统采用乙腈/水流动相时，仪器响应值虽然较强，但峰型较宽的问题；

(3)本发明将皮革样品研磨至粉末，增加了样品与溶剂的接触面积，使溶剂提取效率更高，更充分，检测出的五种防腐剂含量更加趋于实际含量；

(4)本发明采用甲醇作为提取剂，成本较低且毒性较小，且对于五种防腐剂的溶解性更好，使提取效率更充分；

(5)本发明采用的梯度洗脱程序为：0～0.5min内流动相保持95％A，5％B(乙腈：甲醇：10mmol/L NH₄Ac＝3:1:1)；0.5～1.5min内流动相A由95％A线性降低到85％A，流动相B由5％B(乙腈：甲醇：10mmol/L NH₄Ac＝3:1:1)线性增加到15％B(乙腈：甲醇：10mmol/LNH₄Ac＝3:1:1)，此时流动相极性逐渐增大，极性相对居中的o-PP和OIT才被洗脱；为了调节极性相对较小的TCS的洗脱速度，1.5～2.0min内流动相A由85％A线性增加到95％A，流动相B由15％B(乙腈：甲醇：10mmol/L NH₄Ac＝3:1:1)线性降低到5％B(乙腈：甲醇：10mmol/LNH₄Ac＝3:1:1)，即降低流动相的极性，使极性相对较低的TCS在2min内快速被洗脱出，该洗脱梯度根据五种样品的极性大小反复试验得到，既能保证保留时间较短，又能够同时保证各组分之间充分分离，如附图2所示，实施例1中待测样品经此条件测试得到的色谱图峰型窄，信噪比高，基线平整，准确度高；

(6)本发明采用超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚的含量浓度范围为0.2～5mg/L，该范围较宽，适用范围宽，更易于推广应用；

(7)本发明中超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚含量的定量限分别为：0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.05mg/kg、0.03mg/kg、0.02mg/kg，检测限较低，适用于低添加浓度防腐剂的检测，实用性更强。

附图说明

图1为含有五种新型防腐剂的标准溶液的混标溶液超高效合相色谱图；

图2为实施例中皮革样品的超高效合相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述。

主要试剂、仪器设备及待测样品：

试剂N-辛基异噻唑啉酮(OIT)、2-(硫氰酸甲基巯基)苯并噻唑(TCMTB)、4-氯-3-甲酚(CMK)、三氯生(TCS)和邻苯基苯酚(o-PP)(美国Fluka公司，纯度都大于99％)(见表1)，甲醇和乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，乙酸铵(色谱纯，国药集团)，无水硫酸钠、碳酸钾(分析纯，国药集团)，乙酸酐、正己烷(分析纯，南京化学试剂公司)，水为二级去离子水。

仪器超高效合相色谱仪(Waters公司ACQUITY UPC²系统)，SW22型恒温水浴锅(控温沸水状态，优莱博技术有限公司)，KS501型振荡器(振荡频率1～300次/min，IKA公司)，Legend Micro 17型离心机(Thermo公司)，管状玻璃反应器(约15mL)，0.45μm聚四氟乙烯薄膜滤头(津腾公司)。

待测样品：淡绿色阳性皮革样品

(一)采用超高效合相色谱测定样品中五种防腐剂含量

1)标准溶液的制备：

准确称取OIT、TCMTB、CMK、TCS和o-PP五种标准物质(精确至0.01mg)，分别用甲醇为溶剂准确配制得1000mg/L储备液，于-18℃避光保存；吸取1mL上述标准储备液于50mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20mg/L的工作液。从该工作液中分别吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mg/L的系列标准工作溶液。

2)样品溶液的制备：取淡绿色阳性皮革样品，称取1.0g(精确至0.01g)，研磨成为粉末，置于具塞锥形瓶中，加入30mL甲醇，放入超声波浴中，超声功率为420W，超声频率为40KHz，提取20min。将提取液倒入带有刻度的浓缩瓶中，残渣再用30mL甲醇超声提取10min，合并滤液，于40℃水浴旋转蒸发仪浓缩至1～2mL，再用氮吹至近干，残留物用甲醇准确定容至2mL，经0.45μm聚四氟乙烯滤膜过滤后，滤液装至样品瓶中备用。

3)采用超高效合相色谱进行检测：分别取1μL标准样品和步骤1)制备的待测样品注入超高效合相色谱仪，按下述条件测试并分析；

超高效合相色谱分析参数为：

a)色谱柱：ACQUITY UPC²HSS C18SB色谱柱，100mm×3.0mm，1.8μm或相当者；

b)流速：1.5mL/min

c)进样量：1μL；

d)检测波长：240nm，280nm，305nm；

e)系统背压：13.10MPa；

f)色谱柱温度：60℃；

g)检测器：二极管阵列检测器(DAD)；

h)流动相A：超临界CO₂；流动相B：乙腈：甲醇：10mmol/L NH₄Ac混合液；

d)梯度洗脱程序：

对步骤1)所述的标准溶液进行检测，由标准溶液得到五种防腐剂的保留时间和指纹图谱；分别以五种防腐剂标准溶液的浓度为横坐标，以各防腐剂的峰面积为纵坐标，绘制五种防腐剂的标准工作曲线；

在相同条件下，采用超高效合相色谱对步骤2)中所述的滤液进行检测，得到的超高效合相色谱如图2所示；

4)样品中五种防腐剂的定性测定：如图1所示，在上述检测条件下，分别取1μL1.0mg/L的五种标准样品形成混合溶液注入到进样口，由标准溶液得到TCMTB的保留时间为1.450min，CMK的保留时间为1.532min，o-PP的保留时间为1.615min，OIT的保留时间为1.706min，TCS的保留时间为1.910min；并通过不同浓度的每一种防腐剂的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标，以各标准溶液中防腐剂的峰面积为纵坐标，绘制五种防腐剂的标准工作曲线；

通过比较待测样品溶液与标准工作溶液中被测组分色谱峰的保留时间、指纹图谱和紫外可见吸收光谱进行定性分析，定性确认待测样品中所含防腐剂的种类；

5)样品中五种防腐剂的定量测定：根据步骤4)中得到的五种防腐剂的标准工作曲线，由步骤3)中超高效合相色谱得到的待测样品溶液中所含相应防腐剂的峰面积计算得到待测样品中OIT、TCMTB、CMK、TCS和o-PP的浓度分别为2.1mg/kg、1.9mg/kg、1.5mg/kg、2.3mg/kg和3.8mg/kg。

(二)方法测定低限及线性范围

采用10次样品空白试验测得的背景响应值的标准差乘以10作为定量限的估计值，与已知质量浓度的样品进行对照。五种防腐剂的标准工作点为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mg/L，以峰面积为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，建立标准曲线，得到线性回归方程，结果见表3。

表3超高效合相色谱法的五种防腐剂的线性方程及相关参数

结果表明，OIT、TCMTB、CMK、TCS和o-PP的浓度在0.2～5mg/L范围内具有良好的线性(r≥0.999)，它们的定量限分别为0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.05mg/kg、0.03mg/kg、0.02mg/kg。

(三)回收率和精密度

以待测样品为样品基质，将如前所述制备好的样品溶液进行加标回收试验，每种防腐剂分别添加0.5、1、5mg/kg三个水平的标准物质，采用超高效合相色谱仪进行分析，每个水平平行测试10次，平均回收率和相对标准偏差见表4。

表4采用超高效合相色谱测定五种防腐剂的平均回收率及相对标准偏差(n＝10)

结果表明，五种防腐剂的添加水平的平均回收率是在92.8％～102％之间，相对标准偏差均小于8.9％，满足检测要求。

Claims

1.一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，所述防腐剂包括N-辛基异噻唑啉酮、2-（硫氰酸甲基巯基）苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚；所述的方法包括以下步骤：

1）五种防腐剂标准溶液的制备；

2）待测样品溶液的制备：采用甲醇对皮革样品进行超声提取，浓缩提取液，再将所述提取液过滤，滤液备用；

3）采用超高效合相色谱进行检测：流动相A为超临界CO₂，流动相B为乙腈、甲醇以及10mmol/L乙酸铵的混合溶液；

标准溶液的检测：对步骤1）所述五种防腐剂的标准溶液进行超高效合相色谱检测，由标准溶液分别得到五种防腐剂的保留时间和指纹图谱；分别绘制五种防腐剂的标准工作曲线；

待测样品溶液的检测：采用超高效合相色谱对步骤2）中所述的滤液进行检测；

步骤3）所述采用超高效合相色谱进行检测的参数条件具体为：

色谱柱： ACQUITY UPC² HSS C18 SB 色谱柱，100 mm×3.0 mm，1.8 µm；

洗脱梯度：

时间/min 超临界CO₂/A相% 乙腈：甲醇：10 mmol/L NH₄Ac混合液/B相%

0.0 95 5，乙腈：甲醇：10mmol/L NH₄Ac=3:1:1

0.5 95 5，乙腈：甲醇：10 mmol/L NH₄Ac=3:1:1

5 85 15，乙腈：甲醇：10 mmol/L NH₄Ac=3:1:1

0 95 5，乙腈：甲醇：10 mmol/L NH₄Ac=3:1:1

流速：1.5 mL/min；

进样量：1 µL；

检测波长：240 nm，280 nm，305 nm；

系统背压：13.10 MPa；

色谱柱温度：60 ℃；

4）待测样品中五种防腐剂的定性分析；

5）待测样品中五种防腐剂的定量测定。

2.根据权利要求1所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，步骤1）所述标准溶液配制具体为，准确称取OIT、TCMTB、CMK、TCS和o-PP五种标准物质，分别用甲醇为溶剂准确配制得1000 mg/L储备液，于-18 ℃避光保存；吸取1mL上述标准储备液于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 mg/L的工作液，从该工作液中分别吸取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L的系列标准工作溶液。

3.根据权利要求2所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，步骤2）所述样品溶液的制备具体为：取待测样品，称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入30 mL甲醇，放入超声波浴中，超声功率为420 W，超声频率为40 KHz，提取20min；将提取液倒入带有刻度的浓缩瓶中，残渣再用30 mL甲醇超声提取10 min，合并滤液，于40 ℃水浴旋转蒸发仪浓缩至1~2 mL，再用氮吹至近干，残留物用甲醇准确定容至2 mL，经0.45 µm聚四氟乙烯滤膜过滤后，进超高效合相色谱仪分析。

4.根据权利要求1所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，步骤3）所述五种防腐剂的指纹图谱采用如下方法建立：精密量取1 μL标准溶液注入超高效合相色谱仪中，制定五种防腐剂对照指纹图谱；其中，色谱条件与五种防腐剂含量测定中的相同。

5.根据权利要求4所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，步骤4）所述样品中五种防腐剂的定性分析具体为，在步骤3）所述检测的参数条件下，通过比较待测样品溶液与标准工作溶液中被测组分色谱峰的保留时间和指纹图谱进行定性分析，定性确认防腐剂的种类。

6.根据权利要求5所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，步骤5）所述样品中五种防腐剂的定量测定具体为，根据步骤3）中得到的五种防腐剂的标准工作曲线，由步骤3）中超高效合相色谱得到的待测样品溶液中所含相应防腐剂的峰面积计算待测样品中各防腐剂的浓度。

7.根据权利要求6所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，采用所述的超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-（硫氰酸甲基巯基）苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚的含量浓度范围为0.2~5 mg/L。

8.根据权利要求7所述的一种采用超高效合相色谱同时测定皮革中五种防腐剂的方法，其特征在于，所述的超高效合相色谱检测N-辛基异噻唑啉酮、2-（硫氰酸甲基巯基）苯并噻唑、4-氯-3-甲酚、三氯生和邻苯基苯酚含量的定量限分别为： 0.03 mg/kg、0.05 mg/kg、0.05 mg/kg、0.03 mg/kg、0.02 mg/kg。