CN105158372A - 一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，包括如下步骤：(1)样品前处理：对化妆品样品进行前处理，得到滤液；(2)将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定；(3)绘制标准曲线，计算样品中尿刊酸及其乙酯的含量。本发明化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法采用高效液相色谱法测定化妆品中尿刊酸及其乙酯，对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证。方法准确、快速、灵敏度高，检测限、回收率和精密度均符合要求，对于化妆品的安全监测具有重要意义。

Description

一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法

技术领域

本发明涉及一种化学物质的检测方法，特别是涉及一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法。

背景技术

尿刊酸相对分子质量：138.12，分子式：C₆H₆N₂O₂，溶于甲醇和水，不溶于乙腈。结构式如下：

尿刊酸乙酯相对分子质量：166.17，分子式：C₈H₁₀N₂O₂，溶解性为醇溶性。结构式如下：

尿刊酸及其乙酯作为一种抗紫外线的吸收剂，广泛应用于化妆品及其它透光防日晒工业品中。但尿刊酸及其乙酯会减低生物的免疫力，引发过敏反应，而且可能是致癌物质，我国《化妆品卫生规范》(2007年版)中明确规定化妆品中不得添加尿刊酸及其乙酯，国内外对化妆品中尿刊酸及其乙酯的检测方法未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种方法准确、快速、灵敏度高的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法。

一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，包括如下步骤：

(1)样品前处理：对化妆品样品进行前处理，得到滤液；

(2)将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定；

(3)绘制标准曲线，计算样品中尿刊酸及其乙酯的含量；

(4)对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证。

本发明所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其中，步骤(2)中的高效液相色谱条件为：

色谱柱：XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流速：1.0mL/min；

流动相：体积比为7:3的甲醇和5mmol/L四丁基溴化铵溶液，等度洗脱；

检测波长：285nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

本发明所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其中，所述步骤(4)中的高效液相色谱-质谱/质谱法条件如下：

高效液相色谱条件：

色谱柱：HSST3色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)；

流动相：体积比为95:5的0.1％甲酸水溶液和甲醇；

流速：0.4mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；

离子化模式：正离子模式；

毛细管电压：0.6kV；

萃取电压：2.9V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气温度：350℃；

数据采集方式：选择离子监测；

确证原则：

进行试样测定时，将样液适当稀释，按高效液相色谱-质谱/质谱法条件测定样液和标准工作溶液，如果所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准物质的相对丰度一致，允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中含有尿刊酸及其乙酯。

表1尿刊酸及其乙酯质谱分析参数

本发明所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其中，所述化妆品为膏霜类、水剂类、散粉类及香波类化妆品，样品前处理包括如下步骤：取0.2g样品置于10mL比色管中，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。

所述化妆品为唇膏类化妆品，样品前处理包括如下步骤：取0.2g样品置于10mL比色管中，加入0.5mL四氢呋喃，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。

本发明化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法与现有技术不同之处在于：本发明化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法采用高效液相色谱法测定化妆品中尿刊酸及其乙酯，方法准确、快速、灵敏度高，检测限、回收率和精密度均符合要求，对于化妆品的安全监测具有重要意义。

下面结合附图对本发明的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中尿刊酸及其乙酯紫外吸收光谱图；其中：1为尿刊酸，2为尿刊酸乙酯；

图2为本发明中尿刊酸及其乙酯的高效液相色谱图；其中：1为尿刊酸，2为尿刊酸乙酯；

图3为本发明确证试验中尿刊酸及其乙酯高效液相色谱-质谱/质谱图；其中1为尿刊酸，2为尿刊酸乙酯。

本发明附图中出现的所有的英文的中文对照如下：

Abs：吸收度；wavelength/nm:波长/纳米；mAU：毫吸收度；Time/min：时间/分钟；Response：响应值。

具体实施方式

一、试剂和材料

甲醇：色谱纯。

四氢呋喃：色谱纯。

氯化钠。

四丁基溴化铵：离子对试剂。

尿刊酸标准品。

尿刊酸乙酯标准品。

10％甲醇溶液：取10mL甲醇和90mL水，混合后备用。

5mmol/L四丁基溴化铵溶液：准确称取0.805g四丁基溴化铵，溶于500mL水中。

尿刊酸及其乙酯混合标准储备液：分别称取适量尿刊酸及尿刊酸乙酯标准品(精确至0.0001g)，用10％甲醇水溶液配制成含1000mg/L的单标储备液，再用10％甲醇水溶液配制成100mg/L的混合标准储备液。

尿刊酸及其乙酯混合标准工作溶液：用10％甲醇水溶液将尿刊酸及其乙酯混合标准储备液配制成浓度为0.2、0.5、1、2、5、10mg/L混合标准工作溶液。

二、仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器。

分析天平：感量为0.0001g。

离心机：转速不低于8000r/min。

超声波水浴。

氮吹仪。

微孔滤膜：0.45μm，有机系滤膜。

高效液相色谱-质谱/质谱仪。

三、分析步骤

1、样品处理

(1)膏霜类、水剂类、散粉类及香波类化妆品样品前处理

取0.2g样品置于10mL比色管中，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。

(2)唇膏类样品前处理。

取0.2g样品置于10mL比色管中，加入0.5mL四氢呋喃，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。

2、测定条件

高效液相色谱参考条件：

色谱柱：XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；

流速：1.0mL/min；

流动相：甲醇+5mmol/L四丁基溴化铵溶液＝70+30(V+V)，等度洗脱；

检测波长：285nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

3、标准曲线的绘制

尿刊酸及其乙酯混合标准工作液按测定条件依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，得到标准回归方程，绘制标准工作曲线。

4、测定

对待测样品进行测定，用外标法定量。待测样液中尿刊酸及其乙酯含量应该标准曲线之内，超出线性范围则应稀释后在进行分析。对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证。

5、空白试验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。

6、结果计算

$W=\frac{c\×V}{m}\mathrm{...}\left(1\right)$

式中：

W———样品中尿刊酸及其乙酯的含量，mg/kg；

c———从标准工作曲线上查出的试样溶液中尿刊酸及其乙酯的浓度，mg/L；

V———样液最终定容体积，mL；

m———试样的质量，g。

7、检出限和定量限

尿刊酸及其乙酯的检出限为2mg/kg，定量限为5mg/kg。

8、回收率

在添加浓度5mg/kg～250mg/kg浓度范围内，测得回收率80.1％～103.8％，相对标准偏差为1.26％～6.96％。

9、允许差

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％。

10、确证试验

对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证。

高效液相色谱-质谱/质谱法条件如下：

高效液相色谱条件：

色谱柱：HSST3色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)；

流动相：体积比为95:5的0.1％甲酸水溶液和甲醇；

流速：0.4mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；

离子化模式：正离子模式；

毛细管电压：0.6kV；

萃取电压：2.9V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气温度：350℃；

数据采集方式：选择离子监测。

确证原则：

进行试样测定时，将样液适当稀释，按高效液相色谱-质谱/质谱法条件测定样液和标准工作溶液，如果所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准物质的相对丰度一致，允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中含有尿刊酸及其乙酯。

表1尿刊酸及其乙酯质谱分析参数

四、结果与分析

1、检测波长的选择

测定尿刊酸及其乙酯的最大吸收波长，扫描范围为200～400nm。经测定，尿刊酸及其乙酯分别在284和286nm处有最大吸收，因此设定它们的最大吸收波长为285nm，测量结果如图1所示。

2、色谱柱的选择

分别考察了ElipesXDBC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、PromosilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、SymmetryC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、KromasilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)和AlantisT3(4.6mm×250mm,5μm)不同极性色谱柱对尿刊酸及其乙酯峰形及保留时间的影响。结果表明，无论流动相的比例如何调整，尿刊酸均在2min左右出峰，其在C₁₈反相色谱柱上没有任何保留，可见其极性较强，因此，在常规色谱条件下，采用C₁₈色谱柱不合适对尿刊酸及其乙酯的分析。

鉴于尿刊酸极性很强，我们考虑采用亲水相互作用色谱进行分析。在亲水相互作用色谱模式下，尿刊酸及其乙酯保留时间不稳定，容易发生漂移，并且峰形较差。因此亲水相互作用色谱模式不适合尿刊酸及其乙酯的分析。

3、离子对试剂的优化

鉴于之前的实验结果，我们选择不同离子对试剂对尿刊酸及其乙酯进行分析。分别选择具有离子对试剂作用的三氟乙酸、辛烷磺酸钠离子对试剂和四丁基溴化铵离子对试剂，考察不同离子对试剂在XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱下对尿刊酸及其乙酯保留时间的影响。结果表明，采用具有离子对试剂作用的三氟乙酸时，杂质峰对目标物质有干扰，因此不合适本方法。以pH＝3.2的柠檬酸盐作为缓冲溶剂，以3mM的辛烷磺酸钠-甲醇作为流动相等度洗脱，峰形对称性较差，并且出现拖尾现象。尿刊酸属于强极性酸性化合物，因此选择酸性离子对试剂四丁基溴化铵。与三氟乙酸、辛烷磺酸钠离子对试剂相比，采用四丁基溴化铵离子对试剂基线平稳，保留时间更好，且峰形较好，因此，我们最终选择采用四丁基溴化铵离子对试剂。

4、离子对试剂浓度的优化

分别选择3mM、5mM、10mM、15mM四丁基溴化铵离子对试剂，考察不同离子对试剂浓度对尿刊酸及其乙酯保留时间及峰形的影响。结果表明，选择5mM离子对试剂浓度对尿刊酸及其乙酯分离最好。因此，最终选择流动相中含有5mM的四丁基溴化铵离子对试剂。

5、色谱柱的优化

分别考察了ElipesXDBC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)、PromosilC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)和SymmetryC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)不同色谱柱对尿刊酸及其乙酯峰形及保留时间的影响。结果表明，在5mM的四丁基溴化铵离子对试剂离子对条件下，各色谱柱对尿刊酸及其乙酯保留时间无明显差异，峰形对称性均不理想，而XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)峰形最好，因此选择XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)为本方法所选色谱柱。

6、流动相的优化

分别选择体积分数为50％、60％、70％和80％的5mM四丁基溴化铵不同梯度流动相比例等度洗脱，以及不同比例梯度洗脱优化尿刊酸及其乙酯保留时间。结果表明，在梯度洗脱条件下，色谱图基线不稳定，因此选择等度洗脱。在以70％5mM四丁基溴化铵-30％甲醇作为流动相时，尿刊酸及其乙酯保留时间最为理想。因此，流动相最终优化结果为。

7、标准品配制溶剂的优化

在70％5mM四丁基溴化铵-甲醇等度洗脱条件下，尿刊酸峰形较差，这可能由于用纯甲醇溶液配制标准品，在进样瞬时具有较强的溶剂效应。鉴于尿刊酸强酸强极性，加酸会破坏其与离子对试剂的结合，对峰形无改善，因此分别选择50％甲醇、30％甲醇、20％甲醇和10％甲醇溶液配制标准溶液。在以10％甲醇溶液配制标准溶液时，峰形最好。因此选择10％甲醇溶液配制标准溶液。

8、色谱柱温度优化

考察色谱柱温度对尿刊酸及其乙酯出峰的影响。分别选择25℃、30℃、35℃、40℃条件下，以甲醇：5mM四丁基溴化铵溶液＝30:70为流动相，XTerraC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱为分析柱。结果表明，在柱温35℃条件下，尿刊酸及其乙酯峰形最好，尿刊酸乙酯保留时间最为理想，因此柱温选择35℃。

9、前处理过程的优化

比较甲醇和10％甲醇溶液对尿刊酸及其乙酯提取效果的影响。筛选经测定不含尿刊酸及其乙酯的膏霜类、水剂类、散粉类、唇膏类和香波类化妆品样品作为空白样品，向其中加入一定量尿刊酸及其乙酯标准溶液，充分混匀后，提取尿刊酸及其乙酯。结果表明，以10％甲醇溶液为提取溶液时，其与样品完全溶解，不利于后期过膜，且回收率较低。甲醇为提取溶液时，峰形不理想。因此，前处理过程中，我们选择甲醇为提取溶剂，经过离心及氮吹后，加入一定量水，从而使峰形更好。

五、方法的线性关系和定量限

1、线性关系

在本标准方法所确定的实验条件下，配制1000mg/L的尿刊酸及其乙酯标准储备液，之后配制100mg/L混合标准储备液。以10％甲醇将其稀释至0.2、0.5、1、2、5、10mg/L；以峰面积为纵坐标，相应尿刊酸及其乙酯浓度为横坐标作图，在以上浓度范围内尿刊酸的线性方程为y＝54.331x+0.2216，相关系数r²为0.9999；尿刊酸乙酯的线性方程为y＝59.369x-1.8391，相关系数r²为0.9999，均呈良好的线性关系。

2、方法的检出限和定量限

经过检验方法的室内实验，结果表明，方法的检出限(S/N＝3)为2mg/kg，定量限(S/N＝10)为5mg/kg。

六、方法的回收率和精密度

本标准方法对于尿刊酸及其乙酯加标回收实验设定了5mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三个添加浓度。待测样液中尿刊酸及其乙酯含量应该标准曲线之内，超出线性范围则应稀释后在进行分析。按本检测方法所确定的实验条件，对每个添加浓度在膏霜类、水剂类、唇膏类、粉类和香波类样品均进行了6次试验，测得回收率80.1％～103.8％，精密度试验测得相对标准偏差为1.26～6.96％。结果汇总于表2-表6。

表2膏霜类样品回收率和精密度试验结果

表3水剂类样品回收率和精密度试验结果

表4唇膏类样品回收率和精密度试验结果

表5散粉类样品回收率和精密度试验结果

表6香波类样品回收率和精密度试验结果

七、确证试验

对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证，结果如图3所示。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)样品前处理：对化妆品样品进行前处理，得到滤液；

(2)将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定；

(3)绘制标准曲线，计算样品中尿刊酸及其乙酯的含量；

(4)对于采用高效液相色谱法检出阳性的样品，进一步采用高效液相色谱-质谱/质谱法进行确证。

2.根据权利要求1所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其特征在于：步骤(2)中的高效液相色谱条件为：

色谱柱：XTerraC₁₈，4.6mm×250mm,5μm；

流速：1.0mL/min；

流动相：体积比为7:3的甲醇和5mmol/L四丁基溴化铵溶液，等度洗脱；

检测波长：285nm；

柱温：35℃；

进样量：10μL。

3.根据权利要求2所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其特征在于：所述步骤(4)中的高效液相色谱-质谱/质谱法条件如下：

高效液相色谱条件：

色谱柱：HSST3色谱柱，100mm×2.1mm,1.8μm；

流动相：体积比为95:5的0.1％甲酸水溶液和甲醇；

流速：0.4mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；

离子化模式：正离子模式；

毛细管电压：0.6kV；

萃取电压：2.9V；

离子源温度：150℃；

脱溶剂气温度：350℃；

数据采集方式：选择离子监测；

确证原则：

进行试样测定时，将样液适当稀释，按高效液相色谱-质谱/质谱条件测定样液和标准工作溶液，如果所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准物质的相对丰度一致，允许偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中含有尿刊酸及其乙酯。

表1尿刊酸及其乙酯质谱分析参数

4.根据权利要求1所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其特征在于：所述化妆品为膏霜类、水剂类、散粉类及香波类化妆品，样品前处理包括如下步骤：取0.2g样品置于10mL比色管中，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。

5.根据权利要求1所述的化妆品中尿刊酸及其乙酯的测定方法，其特征在于：所述化妆品为唇膏类化妆品，样品前处理包括如下步骤：取0.2g样品置于10mL比色管中，加入0.5mL四氢呋喃，加入甲醇至刻度，充分混匀，超声辅助提取20min，将其转移至离心管中，以8000r/min转速离心15min后，取上清液置于氮吹管中，氮吹至1mL，加入9mL水，经0.45μm微孔滤膜，滤液上机测定。