CN108982716A - 一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法 - Google Patents

一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，包括如下步骤：S1、样品前处理：通过皮肤角质细胞贴片进行采样后，将贴片进行前处理，得到滤液；S2、将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定样本中的天然保湿因子的含量；S3、绘制标准曲线，计算样品中天然保湿因子的含量。所述高效液相色谱法的流动相为：体积比为95:5的20mmol/L磷酸氢二钾溶液和乙腈，等度洗脱。与现有技术相比，本发明测定方法结果准确可靠、精密度高且重现性好。

Description

一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法
技术领域
本发明涉及多种化学物质的检测技术领域，具体涉及一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法。
背景技术
吡咯烷酮羧酸(pyrrolidone carboxylic acid，PCA)是皮肤角质层中的天然保湿因子之一，是皮肤自身内源性生水功能的重要参与者，能够增加皮肤持水率，保持皮肤弹性和水润度，是肌肤供水之源。尿刊酸(urocanic acid，UCA)是组氨酸的代谢产物，尿刊酸含量的降低与皮肤干燥、色斑沉积、皮肤表面的pH值有直接关系，天然尿刊酸以t-UCA形式存在于皮肤角质层中，经紫外线照射转变为c-UCA。
检测皮肤角质层中的天然保湿因子，可以有效地帮助消费者了解自己的皮肤健康状态，并为化妆品企业开发更有针对性的产品提供科学检测数据支持。其中，c-UCA对于皮肤角质层pH值维持弱酸性的微环境也有一定作用。然而目前，国内外对皮肤角质层中的PCA和UCA的检测方法未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够快速、准确测定皮肤角质层中天然保湿因子的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，包括如下步骤：
S1、样品前处理：通过皮肤角质细胞贴片进行采样后，将贴片进行前处理，得到滤液；
S2、将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定样本中的天然保湿因子的含量；
S3、绘制标准曲线，计算样品中天然保湿因子的含量。
进一步地，所述高效液相色谱法的流动相条件为：体积比为95:5的20mmol/L磷酸氢二钾溶液和乙腈，等度洗脱。
进一步地，所述天然保湿因子为吡咯烷酮羧酸、顺式尿刊酸和反式尿刊酸中一种或多种。
优选地，所述天然保湿因子为吡咯烷酮羧酸时，所述步骤S2中的高效液相色谱条件为：
色谱柱：XTerra-C18柱，(4.6mm×250mm，5μm)；
流速：0.8mL/min；
检测波长：205nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL。
优选地，所述天然保湿因子为顺式尿刊酸和反式尿刊酸中的一种或两种时，所述步骤S2中的高效液相色谱条件为：
色谱柱：XTerra-C18柱，(4.6mm×250mm，5μm)；
流速：0.8mL/min；检测波长：265nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL。
进一步地，所述20mmol/L磷酸氢二钾溶液含有5mmol/L的庚烷磺酸钠。
进一步地，所述20mmol/L磷酸氢二钾溶液pH值为3～7，优选为3.7。
进一步地，所述步骤S1中贴片前处理方法为：
将贴片剪碎，置于5mL比色管中，加入甲醇溶液(所述甲醇溶液优选为甲醇体积含量为10％的甲醇水溶液)至刻度，超声震荡提取30min以上，将上清液浓缩(优选浓缩方式为转移置于氮吹管中通过氮吹进行浓缩)至1mL以下，优选为0.5mL，加入水至体积为1mL，经过滤膜得到滤液，所述滤膜优选为0.45μm或0.22μm。
本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法采用高效液相色谱法测定皮肤角质层中的天然保湿因子，方法准确、快速、灵敏度高，本发明方案中的检测限、加标回收率和精密度均符合要求，对于监测皮肤角质层中天然保湿因子的含量，评估皮肤状况有重要意义。通过本发明方案实现对皮肤角质层中天然保湿因子的测定，可以帮助消费者了解自己的皮肤健康状态，并为化妆品企业开发更有针对性的产品提供科学检测数据支持。
附图说明
图1为本发明实施例的流动相优化实验中磷酸氢二钾溶液-甲醇体积比为70:30时的色谱图；
图2为本发明实施例的流动相优化实验中磷酸氢二钾溶液-甲醇体积比为95:5时的色谱图；
图3为本发明实施例的流动相优化实验中磷酸氢二钾溶液-乙腈体积比为95:5时的色谱图；
图4为本发明实施例的流动相优化实验中流动相未加入庚烷磺酸钠时的色谱图；
图5为本发明实施例的流动相优化实验中流动相加入庚烷磺酸钠时的色谱图；
图6为本发明实施例中吡咯烷酮羧酸标准品色谱图；
图7为本发明实施例中皮肤角质层样品中吡咯烷酮羧酸色谱图；
图8为本发明实施例中顺式尿刊酸标准品色谱图；
图9为本发明实施例中反式尿刊酸标准品色谱图；
图10为本发明实施例中皮肤角质层样品中顺式尿刊酸和反式尿刊酸的样品加标色谱图；
图11为本发明实施例的PCA、t-UCA和c-UCA的标准工作曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明实施例为：一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，包括如下步骤：
S1、样品前处理：通过皮肤角质细胞贴片进行采样后，将贴片进行前处理，得到滤液；
S2、将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定样本中的天然保湿因子(包括吡咯烷酮羧酸、顺式尿刊酸及反式尿刊酸)的含量；
S3、绘制吡咯烷酮羧酸、顺式尿刊酸及反式尿刊酸的标准曲线，计算样品中天然保湿因子的含量。
试验过程中，所用试剂和材料情况如下：
甲醇：色谱纯。
乙腈：色谱纯。
庚烷磺酸钠：离子对试剂。
磷酸氢二钾：分析纯。
磷酸：分析纯。
吡咯烷酮羧酸:标准品。CAS号：98-79-3
顺式尿刊酸：标准品。CAS号：7699-35-6
反式尿刊酸：标准品。CAS号：3465-72-3
使用的仪器设备及其参数信息如下：
高效液相色谱仪：Agilent 1260，安捷伦科技有限公司。
分析天平：ESJ182-4，天津津梁仪器设备有限公司。
超声波清洗器：BG-12C，深圳市和科达超声设备有限公司。
氮吹仪：N-EVAP-24，南京铭奥仪器设备有限公司。
pH仪：雷磁PHS-3C，上海荣宣仪器有限公司。
微孔滤膜：0.45μm有机系滤膜，天津市津腾实验设备有限公司。
皮肤角质细胞贴片：2cm×2cm，美国3M公司。
一、样品信息：
1、标准曲线的绘制
吡咯烷酮羧酸和顺式尿刊酸、反式尿刊酸混标工作液按测定条件依次由高到低进样测定，以峰面积-浓度作图，得到标准回归方程，绘制标准工作曲线。
2、测定
对处理好的待测样品进行测定，用外标法定量。待测样液中吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸含量应在标准曲线之内，超出线性范围则应稀释或者浓缩后再进行分析。
3、空白试验
除不称取样品外，按上述测定条件和步骤进行。
结果计算
式中：W为对目标物含量，mg/kg；
C0为标准曲线上查出的试样溶液中目标物质的浓度，mg/L；
V为样品最终定容体积，mL；
m为样品质量，g。
二、检测条件筛选与分析
1、检测波长的选择
测定吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸的最大吸收波长，扫描范围为200～400nm。经测定，吡咯烷酮羧酸在205nm左右处有最大吸收波长，顺、反式尿刊酸在265nm左右处有最大吸收波长。因此，同时测定吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸需要设定2个检测波长。
2、流动相优化
首先筛选流动相比例，采用不同体积比的甲醇-磷酸氢二钾溶液作为流动相，考察磷酸氢二钾溶液-甲醇＝70:30(如图1所示)、磷酸氢二钾溶液-甲醇＝90:10、磷酸氢二钾溶液-甲醇＝95:5(如图2所示)、磷酸氢二钾溶液-甲醇＝98:2，比较流动相不同体积比对吡咯烷酮羧酸色谱图的影响。结果表明，甲醇体积比过高时，样品峰和溶剂峰分离不开，甲醇体积比过低时，对色谱柱伤害较大，因此选择磷酸氢二钾溶液-甲醇＝95:5(V:V)作为流动相参考比例。
考察甲醇和乙腈(磷酸氢二钾溶液-乙腈＝95:5，色谱图如图3所示)作为流动相中有机相对色谱图的干扰。对比图2和图3可以看出，甲醇作为有机相时，色谱图中干扰较大，因此，选择乙腈作为流动相的有机相。
考察离子试剂对色谱图的影响，发现酸氢二钾溶液中加入庚烷磺酸钠时，顺、反式尿刊酸分离度高、峰形良好。流动相中未加入庚烷磺酸钠和加入庚烷磺酸钠后的色谱图分别如图4和图5所示。
采用磷酸氢二钾溶液作为流动相水相，考察磷酸氢二钾溶液pH值为3.7和4.7时，流动相对色谱图的影响，结果发现pH值为3.7时，吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸保留时间更好。
3、柱温优化
考察色谱柱温度对吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸出峰的影响。分别选择20℃、25℃、30℃、35℃条件下，以XTerra-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱为分析柱，以20mmol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝95:5(V:V)为流动相等度洗脱，其中磷酸氢二钾溶液含有5mmol/L庚烷磺酸钠。结果表明，在各柱温条件下，吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸分离度和峰形无明显差别，25℃接近室温，操作更简便，因此柱温选择25℃。
4、前处理过程优化
比较不同比例的甲醇溶液对吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸的提取效果。发现用甲醇作为提取液时，杂质峰较多，吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸峰形较差。以10％甲醇溶液为提取溶液时，样品中目标物检出含量较低。因此，最终选择以甲醇为提取溶剂，经过氮吹至0.5mL后，加入0.5mL水，从而使峰形更好。
综上所述，测定过程中，使用以下条件为最优方案：
1、高效液相色谱的条件如下：
色谱柱：XTerra-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流速：0.8mL/min；流动相：20mmol/L磷酸氢二钾溶液：乙腈＝95:5(V:V)，等度洗脱；其中磷酸氢二钾溶液含有5mmol/L庚烷磺酸钠，磷酸氢二钾溶液pH＝3.7。
检测波长：205nm、265nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL。
2、前处理方法为：
用皮肤角质细胞贴片对受试者进行样本提取，将贴片剪碎，置于5mL比色管中，加入甲醇至刻度，超声震荡提取30min，将上清液转移置于氮吹管中，氮吹至0.5mL，加入0.5mL水，经过0.45μm滤膜得到滤液。
取吡咯烷酮羧酸标准品溶液，按上述液相色谱条件进行测试(检测波长为205nm)，结果如图6所示，从图6中可以看出，吡咯烷酮羧酸的保留时间为2.507min。
取待测样本按上述前处理方法进行预处理后，得到待测滤液，测定结果如图7所示，检测波长为205nm，从图7中可以看出，实际样本中测得的皮肤角质层中吡咯酮羧酸的保留时间为2.519min，与标准品基本一致，说明本发明前处理方法，对样本中吡咯酮羧酸提取效果好。
取反式尿刊酸和顺式尿刊酸标准品分别按上述液相色谱条件进行测试(检测波长为265nm)，结果如图8和9所示，从图8中可以看出，反式尿刊酸的保留时间为18.148min；从图9中可以看出，顺式尿刊酸的保留时间为12.667min。
取待测样本按上述前处理方法进行预处理后，得到待测滤液，在待测滤液中加入顺、反式尿刊酸样品标准品，加标色谱测定结果如图10所示，检测波长为265nm，从图10中可以看出，实际样本中测得的皮肤角质层中顺式尿刊酸的保留时间为12.838min，反式尿刊酸的保留时间为18.255min；与标准品基本一致，说明本发明前处理方法，对样本中顺、反式尿刊酸提取效果好。
三、检测结果与分析
1、方法的线性关系和定量限
1)线性关系
在本发明方法所确定的实验条件下，配制100mg/L的吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸标准储备液。以50％的甲醇将其稀释至1、2、5、8、10mg/L；以峰面积为纵坐标，相应吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸浓度为横坐标作图绘制相应的标准工作曲线，如图11所示。经拟合后得知，在以上浓度范围内吡咯烷酮羧酸的线性方程为：y＝14.779x-5.7915；顺式尿刊酸的线性方程为：y＝23.412x-2.4417；反式尿刊酸的线性方程为：y＝80.677x-7.3995，相关系数R2均大于0.999，均呈良好的线性关系。
2)方法的检出限和定量限
经过测定基线噪音，计算方法的检出限(S/N＝3)为0.2mg/kg，定量限(S/N＝10)为0.5mg/kg。
2、回收率及精密度分析：
在本发明方法中，对吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸回收实验设定了1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg三个添加浓度。待测样液中吡咯烷酮羧酸和顺、反式尿刊酸含量应该在标准曲线之内，超出线性范围则应稀释或者浓缩后再进行分析。按本检测方法确定的实验条件，对每个添加浓度在皮肤角质细层样品均进行3次试验，实验结果如表1所示：
表1皮肤角质样品回收率和精密度试验结果表
从表1可以看出，本发明方案的测得回收率95.0％～102.7％，精密度相对标准偏差为0.24％～2.47％。
此外，还对本发明方案的重现性进行了验证，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10％。
综上所述，本发明测定方法结果准确可靠、精密度高且重现性好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、样品前处理：通过皮肤角质细胞贴片进行采样后，将贴片进行前处理，得到滤液；
S2、将得到的滤液采用高效液相色谱法进行测定样本中的天然保湿因子的含量；
S3、绘制标准曲线，计算样品中天然保湿因子的含量。
2.根据权利要求1所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述高效液相色谱法的流动相条件为：体积比为95:5的20mmol/L磷酸氢二钾溶液和乙腈，等度洗脱。
3.根据权利要求2所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述天然保湿因子为吡咯烷酮羧酸、顺式尿刊酸和反式尿刊酸中一种或多种。
4.根据权利要求3所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述天然保湿因子为吡咯烷酮羧酸时，所述步骤S2中的高效液相色谱条件为：
色谱柱：XTerra-C18柱，4.6mm×250mm，5μm；
流速：0.8mL/min；
检测波长：205nm；
柱温：25℃；
进样量：10μL；
所述天然保湿因子为顺式尿刊酸和反式尿刊酸中的一种或两种时，所述步骤S2中的高效液相色谱条件与吡咯烷酮羧酸的高效液相色谱条件区别仅在于：检测波长为265nm。
5.根据权利要求2所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述20mmol/L磷酸氢二钾溶液含有5mmol/L的庚烷磺酸钠。
6.根据权利要求2所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述20mmol/L磷酸氢二钾溶液pH值为3～7。
7.根据权利要求6所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述磷酸氢二钾溶液为3.7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述步骤S1中贴片前处理方法为：
将贴片剪碎，置于5mL比色管中，加入甲醇溶液至刻度，超声震荡提取30min以上，将上清液体积浓缩至1mL以下，加入水至体积为1mL，经过滤膜得到滤液，所述滤膜为0.45μm或0.22μm孔径滤膜。
9.根据权利要求8所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述甲醇溶液为甲醇体积含量为10％的甲醇水溶液。
10.根据权利要求8所述的皮肤角质层中天然保湿因子的测定方法，其特征在于：所述将上清液体积浓缩的操作为：将上清液转移置于氮吹管中，氮吹至1mL以下。
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