CN115060839A - 一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境检测技术领域，特别是涉及一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，具体包括以下步骤：配制标准品储备液；稀释配成不同浓度的标准溶液，测定并绘制标准曲线；用质液联用仪测定样本溶液，得到样本溶液的响应值，并将其代入标准曲线中，计算得到样本中代谢物的含量。本发明采用液质联用仪对双唑草腈代谢物1‑(3‑氯‑4,5,6,7‑四氢吡唑并[1,5‑a]吡啶‑2‑基)‑5‑[甲基(丙‑2‑烯基)氨基]吡唑‑4‑腈进行检测，根据检测结果与标准品对照得到代谢物的具体含量。本发明检测限低，检测效率及测定结果的准确性高，能够实现对水或土壤中代谢物残留量的快速检测，避免农药残留危害水生生物和自然环境。
Description
技术领域
本发明涉及环境检测技术领域，特别是涉及一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法。
背景技术
随着农业的发展，使用农药进行除杂和防治病害必不可少，农药化合物能够在大气、水体和土壤中迁移，并可通过多种途径进入生物体内富集，农药残留会严重污染农产品，危害水生生物和自然环境，因此，研究建立水体或土壤中农药残留检测方法具有重要的意义。
双唑草腈是一种具有吡唑并吡啶环结构的水稻田用除草剂，其化学名称为1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-炔基)氨基]吡唑-4-腈，其结构式如下：
双唑草腈属原卟林原氧化酶(PPO)抑制剂，当PPO活性被抑制后，原卟啉原Ⅸ无法氧化生成原卟啉Ⅸ，叶绿素合成受阻，从而导致植物死亡。目前有关双唑草腈的研究主要侧重于合成开发、制剂分析、大田应用、环境迁移及对有益动物的毒性等方面，常规的检测方法是直接检测水体或土壤中的双唑草腈含量。由于双唑草腈在水田土壤中会逐渐降解形成代谢物，上述检测方法的检测限较高，直接检测双唑草腈将无法检测到双唑草腈代谢的情况，现有技术缺乏对双唑草腈代谢物的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，代谢物为1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈，其结构式为
具体包括以下步骤：
S1、称取代谢物的标准样品，用乙腈配制成浓度为985mg a.i./L的标准品储备液；
S2、取S1配制得到的标准品储备液，分别用乙腈稀释配成0.000500、0.00100、0.00200、0.00400、0.00800mg a.i./L的代谢物低浓度标准溶液和0.512、1.02、2.05、4.10、8.19mg a.i./L的代谢物高浓度标准溶液，分别用液质联用仪对不同浓度的标准溶液进行测定，根据测定结果绘制得到代谢物的标准曲线，其中标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性响应范围即标准溶液的浓度范围；
S3、取含代谢物的样本于离心管中，加入试剂摇匀，并涡旋振荡30min，静置分层，再取上层清液于离心管中，重复萃取3次，向合并的上层清液中加入无水硫酸镁，涡旋后离心，取上层清液于氮吹瓶中，氮吹浓缩至近干，再加入乙腈定容至1mL，过滤后得到待测的样本溶液；
S4、取S3得到的样本溶液，用质液联用仪测定样本溶液的响应值，并将其代入S2得到的标准曲线中，计算得到样本中代谢物的含量。
优选的，所述样本为水样或土壤样。
作为本发明的进一步方案，样本为水样时，步骤S3中加入的试剂为氯化钠和乙酸乙酯溶液。
作为本发明的进一步方案，样本为土壤样时，步骤S3中加入的试剂为二氯甲烷-丙酮混合溶液。
优选的，二氯甲烷和丙酮的体积比为1：1。
优选的，步骤S3中，过滤时采用孔径为0.22μm的有机滤膜。
作为本发明的进一步方案，液质联用仪的色谱条件设置如下：色谱柱选用EclipsePlus C18(2.1×50mm，1.8μm)，以乙腈和0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.200mL/min，柱温40℃，进样体积为5μL。
作为本发明的进一步方案，液质联用仪的质谱条件设置如下：质谱检测选用AJS-ESI离子源，离子化方式为正离子模式，干燥气温度设置为200℃，干燥气流量为14L/min，毛细管电压3.00kV，雾化气压力20psi，喷嘴电压1.50kV，鞘气体温度250℃，鞘气体流量11L/min，采集方式为多反应监测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用液质联用仪对双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈进行检测，根据检测结果与标准品对照得到代谢物的具体含量。本发明检测限低，检测效率及测定结果的准确性高，能够实现对水或土壤中1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈残留量的快速检测，避免农药残留危害水生生物和自然环境。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明水样中代谢物的低浓度标准曲线示意图；
图2为本发明水样中代谢物的高浓度标准曲线示意图；
图3为本发明土壤中代谢物的低浓度标准曲线示意图；
图4为本发明土壤中代谢物的高浓度标准曲线示意图；
图5为本发明水样中低浓度代谢物的检测数据汇总图；
图6为本发明水样中高浓度代谢物的检测数据汇总图；
图7为本发明土壤样中低浓度代谢物的检测数据汇总图；
图8为本发明土壤样中高浓度代谢物的检测数据汇总图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
若如无特别说明，实施例中所使用的材料均可容易地从商业公司获取，所用1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈标准品的纯度为98.5％，所用乙腈、二氯甲烷均为色谱纯试剂，所用无水硫酸镁、甲酸、乙酸乙酯和丙酮均为分析纯试剂，所用氯化钠纯度为99.5％。在相同的操作条件下，同一物质的保留时间相同，质谱各质荷比相对峰强度也一致。
实施例1：
本实施例提供了一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈的方法，代谢物的结构式为
本实施例中的样本选用水样，具体包括以下步骤：
S1、称取20.01mg代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈标准品于20mL容量瓶中，用乙腈完全溶解并定容至刻度线，摇匀配制成浓度为985mg a.i./L的标准品储备液；
S2、取S1配制得到的标准品储备液，分别用乙腈稀释配成0.000500、0.00100、0.00200、0.00400、0.00800mg a.i./L的代谢物低浓度标准溶液和0.512、1.02、2.05、4.10、8.19mg a.i./L的代谢物高浓度标准溶液，分别用液质联用仪对不同浓度的标准溶液进行测定，平行测定2次，根据测定结果绘制得到代谢物的标准曲线，线性相关性试验结果如表1-2和图1-2、图5-6所示。图1-2中，标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性响应范围即标准溶液的浓度范围。
表1：低浓度代谢物的标准曲线线性相关性试验结果
表2：高浓度代谢物的标准曲线线性相关性试验结果
S3、取水样25mL于50mL离心管中，加入2.5g氯化钠摇匀溶解，再加入5mL乙酸乙酯摇匀，涡旋振荡30min，静置分层，再取上层清液于50mL离心管中，重复萃取3次，合并上层清液，向合并后的上层清液中加入2g无水硫酸镁，涡旋1min，5000r/min离心5min，取上层清液于氮吹瓶中，氮吹浓缩至近干，用乙腈定容至1mL，过0.22μm有机滤膜，得到待测的样本溶液；
S4、取S3得到的样本溶液，用质液联用仪测定样本溶液，得到样本溶液的响应值，并将其代入S2得到的标准曲线中，计算得到样本中代谢物的含量。
液质联用仪的色谱条件设置如下：色谱柱选用Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)，柱温40℃，进样体积为5μL，流动相梯度洗脱参数见表3。
表3：
| 时间min | 流速mL/min | 0.1％甲酸-超纯水％ | 乙腈％ |
| 0.00 | 0.200 | 80 | 20 |
| 0.50 | 0.200 | 80 | 20 |
| 1.00 | 0.200 | 20 | 80 |
| 4.50 | 0.200 | 20 | 80 |
| 5.00 | 0.200 | 80 | 20 |
液质联用仪的质谱条件设置如下：质谱检测选用AJS-ESI离子源，离子化方式为正离子模式，干燥气温度设置为200℃，干燥气流量为14L/min，毛细管电压3.00kV，雾化气压力20psi，喷嘴电压1.50kV，鞘气体温度250℃，鞘气体流量11L/min，采集方式为多反应监测(MRM)，MRM的监测条件见表4。
表4：
实施例2：
本实施例提供了一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈的方法，本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的样本选用土壤样，所述土壤样选自吉林省农业科学院试验地的黑土，其土壤特性如表5所示。
表5：
本实施例提供的检测方法具体包括以下步骤：
S1、配制浓度为985mg a.i./L的标准品储备液，步骤与实施例1一致；
S2、取S1配制得到的标准品储备液，分别用乙腈稀释配成0.00100、0.00200、0.00400、0.00800、0.0100mg a.i./L的代谢物低浓度标准溶液和0.102、0.205、0.410、0.614、0.819mg a.i./L的代谢物高浓度标准溶液，分别用液质联用仪对不同浓度的标准溶液进行测定，根据测定结果绘制得到代谢物的标准曲线，线性相关性试验结果如表6-7和图3-4、图7-8所示。图3-4中，标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性响应范围即标准溶液的浓度范围。
表6：低浓度代谢物的标准曲线线性相关性试验结果
表7：高浓度代谢物的标准曲线线性相关性试验结果
S3、取5.0000g土壤样于50mL离心管中，土壤较干时加入适量水使土壤充分润湿，再加入5mL二氯甲烷-丙酮混合溶液(二氯甲烷和丙酮的体积比为1：1)摇匀，涡旋振荡30min，静置分层，再取上层清液于50mL离心管中，重复萃取3次，合并上层清液，向合并后的上层清液中加入3g无水硫酸镁，涡旋1min，5000r/min离心5min，取上层清液于氮吹瓶中，氮吹浓缩至近干，用乙腈定容至1mL，过0.22μm有机滤膜，得到待测的样本溶液；
S4、取S3得到的样本溶液，用质液联用仪测定样本溶液，得到样本溶液的响应值，并将其代入S2得到的标准曲线中，计算得到样本中代谢物的含量。
液质联用仪的色谱、质谱条件设置与实施例1相同。
实施例3：
本实施例对实施例1和实施例2提供的基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈的方法进行回收率和精密度的验证。
以曝气自来水为基质，向水中添加标准品1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈，配制成浓度为0.000100mg a.i./L和0.0500mg a.i./L的标准溶液，按实施例1提供的检测方法分别测定其回收率，平行测定5次，并将测得的响应值带入表1-2、图1-2所示的标准曲线线性回归方程，计算得到样品中代谢物的含量，检测结果如表8所示。表中，回收率为实测值和理论值浓度的百分比，精密度为5个平行样添加回收率的相对标准偏差(RSD)。
表8：
由表8可知，双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈在曝气自来水中的定量限LOQ为0.000100mg a.i./L。当标准品在曝气自来水中添加浓度为0.000100和0.0500mg a.i./L时，平均回收率分别为95.6％和98.8％，相对标准偏差分别为4.09％和3.63％，回收率均符合70～110％的要求，精密度(RSD)均小于10％，即符合表9中土壤和水中化学农药分析方法建立和验证指南(NY/T 3151-2017)的要求。
表9：
| 添加浓度C | 平均回收率 | 相对标准偏差(RSD) |
| C>1mg/kg | 70～110％ | 10％ |
| 0.1mg/kg＜C≤1mg/kg | 70～110％ | 15％ |
| 0.01mg/kg＜C≤0.1mg/kg | 70～110％ | 20％ |
| 0.001mg/kg＜C≤0.01mg/kg | 60～120％ | 30％ |
| C≤0.001mg/kg | 50～120％ | 35％ |
以土壤为基质，向土壤中添加标准品1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈，设定其浓度为0.00100mg a.i./L和0.100mga.i./L，按实施例1提供的检测方法分别测定其回收率，平行测定5次，并将测得的响应值带入表1-2、图1-2所示的标准曲线线性回归方程，计算得到样品中代谢物的含量，检测结果如表8所示。表中，回收率为实测值和理论值浓度的百分比，精密度为5个平行样添加回收率的相对标准偏差(RSD)。
表10：
由表10可知，双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈在土壤中的定量限LOQ为0.00100mg a.i./L。当标准品在土壤中添加浓度为0.00100和0.100mg a.i./L时，平均回收率分别为99.0％和80.0％，相对标准偏差分别为3.47％和1.98％，回收率均符合70～110％的要求，精密度(RSD)均小于10％，同样符合表9中土壤和水中化学农药分析方法建立和验证指南(NY/T 3151-2017)的要求。
本发明采用液质联用仪对双唑草腈代谢物1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈进行检测，根据检测结果与标准品对照得到代谢物的具体含量。本发明检测限低，检测效率及测定结果的准确性高，能够实现对水或土壤中1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈残留量的快速检测，避免农药残留危害水生生物和自然环境。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (8)
1.一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，代谢物为1-(3-氯-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-5-[甲基(丙-2-烯基)氨基]吡唑-4-腈，具体包括以下步骤：
S1、称取代谢物的标准样品，用乙腈配制成浓度为985mg a.i./L的标准品储备液；
S2、取S1配制得到的标准品储备液，用乙腈稀释成不同浓度的标准溶液，分别用液质联用仪对不同浓度的标准溶液进行测定，根据测定结果绘制得到代谢物的标准曲线；
S3、取含代谢物的样本于离心管中，加入试剂摇匀，并涡旋振荡30min，静置分层，再取上层清液于离心管中，重复萃取3次，向合并的上层清液中加入无水硫酸镁，涡旋后离心，取上层清液于氮吹瓶中，氮吹浓缩至近干，再加入乙腈定容至1mL，过滤后得到待测的样本溶液；
S4、取S3得到的样本溶液，用质液联用仪测定样本溶液的响应值，并将其代入S2得到的标准曲线中，计算得到样本中代谢物的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，所述样本为水样或土壤样。
3.根据权利要求2所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，样本为水样时，步骤S3中加入的试剂为氯化钠和乙酸乙酯溶液。
4.根据权利要求2所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，样本为土壤样时，步骤S3中加入的试剂为二氯甲烷-丙酮混合溶液。
5.根据权利要求4所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，二氯甲烷和丙酮的体积比为1：1。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，步骤S3中，过滤时采用孔径为0.22μm的有机滤膜。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，液质联用仪的色谱条件设置如下：色谱柱选用Eclipse Plus C18(2.1×50mm，1.8μm)，以乙腈和0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.200mL/min，柱温40℃，进样体积为5μL。
8.根据权利要求1-5中任意一项所述的一种基于液相色谱质谱法测定双唑草腈代谢物的方法，其特征在于，液质联用仪的质谱条件设置如下：质谱检测选用AJS-ESI离子源，离子化方式为正离子模式，干燥气温度设置为200℃，干燥气流量为14L/min，毛细管电压3.00kV，雾化气压力20psi，喷嘴电压1.50kV，鞘气体温度250℃，鞘气体流量11L/min，采集方式为多反应监测。
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