CN105254779A - 一种大分子量透明质酸的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，它是从高原鼢鼠中提取纯化得到，该透明质酸的平均分子量为2.6×106-3.1×106Da。本方法提取的透明质酸属于高分子透明质酸，其较好的保水功能具有较高的经济价值。高原鼢鼠是青藏高原上一种严重破坏草地的动物，本方法能将有害生物转化为具有高市场价值的产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，具体涉及从高原鼢鼠中提取纯化透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronicacid，HA)，是一种独特的线性大分子酸性粘多糖，实则为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸。对不同组织来源的HA进行的结构测定表明，其结构均一致，没有种属差异，只存在相对分子量的不同。HA广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高。HA是理想的天然保湿因子，广泛用于化妆品中，对防止皮肤老化和保护皮肤的触觉和外观都具有重要作用。由于生物相容性好，HA还是现代眼科手术中的理想原料。此外，HA还可以作为透皮保湿成分，用于关节炎的治疗。
现代研究也发现，不同分子量的透明质酸渗入肌肤的能力不同，所带来的功效也有所不同：如，大分子量1800000～2200000防止脱水，组织细胞再生，紧致肌肤；中分子量1000000～1800000紧致肌肤，长久保湿；小分子量400000～1000000快速与细胞发生水合作用，保持细胞水分含量。相对于中小分子量的透明质酸而言，大分子量的透明质酸对肌肤的保护能力更佳，其市场价值也相对较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大分子量透明质酸的提取纯化方法。天然的大分子量透明质酸存在于哪些动物体内，目前还未有系统的研究，因此，若希望能够提取纯化大分子量透明质酸，则需要找到含有此类透明质酸的动物。发明人意外地发现，高原鼢鼠所含透明质酸满足本发明的发明目的，可以作为本发明的原料。目前还未见有对高原鼢鼠中透明质酸分离鉴定和提取纯化的研究。
基于发明人的上述发现，本发明提供了一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，它包括如下操作步骤：
(1)粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料；以液料比(3.5～4.5)∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.0～2.0％EDTA-Na2和10.0～12.0％NaCl，在组织捣碎机内以10000～12000r/min捣5-10min后，4000～8000r/min离心10-15min，上述操作重复2～4次，合并各次离心上清液，静置1.5～2h，其中，组织捣碎机内温度控制在20～30℃；在上清液中加入乙醇使其乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于4000～8000r/min离心10-15min，沉淀为HA粗提物；
(2)酶解：配制0.05～0.1mol/L的NaHCO3水溶液和0.05～0.1mol/L的Na2CO3水溶液，以NaHCO3水溶液：Na2CO3水溶液＝8～9∶1v/v进行混合至混合酶解液pH＝8.3～9.1，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，酶比活力为1∶250，加酶量为原料质量的0.4～0.8％，于31～39℃，120r/min搅拌5～25h，得酶解液；
(3)除脂及非水溶性杂质：向酶解液中加入其体积10～50％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌20～30min，再于4000～8000r/min离心10～15min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.1～0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀；
(4)除多肽
向1次初级HA沉淀中加入5.6g/L～11.2g/LNaCl水溶液∶0.5～0.6g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.05～0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，其中，原料∶缓冲液＝1∶1g/ml；搅拌直至完全溶解，向溶液中加2～4倍95％乙醇，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀；
(5)除核酸及小分子多肽
向2次初级HA沉淀中加入11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加原料质量6-10％的活性炭，再加入活性炭1～2倍质量的高岭土，以60～80r/min搅拌15～30min，然后于4000～8000r/min离心10～15min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液；
(6)透析
将HA初级水溶液移入50000～100000Da的透析袋中，于去离子水中透析1～5h，原料∶去离子水＝1∶8～20g/ml，袋内保留液即为HA精制水溶液；向HA精制水溶液中加入氯化钠使保留液NaCl终浓度达到0.1～0.2mol/L，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得纯化了的HA沉淀；
(7)干燥
取HA沉淀，经冷冻干燥，即得透明质酸纯品。
本发明中的乙醇浓度为体积分数。
虽然单因素实验中确定的粗体过程中，最佳温度为25℃，静置时间为1.5h，然而，本发明进一步研究发现，蒸馏水的使用量、温度和静置时间三者之间存在一定的相互影响，最终根据多次实验总结分析，确认了最佳条件与单因素有一定偏差，即为：液料比4∶1ml/g加入蒸馏水，温度控制在26℃，静置时间为1.6h。因此，本发明确定最佳的粗提工艺操作如下：
以液料比4∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.6％EDTA-Na2和11.2％NaCl，在组织捣碎机内以10000r/min捣5～10min后，5000r/min离心10min，上述操作重复3次，合并各次离心上清液，静置1.6h，其中，组织捣碎机内温度控制在26℃。
进一步地，步骤(2)具体操作如下：
配制0.05mol/L的NaHCO3水溶液和0.05mol/L的Na2CO3水溶液，以NaHCO3水溶液∶Na2CO3水溶液＝45∶5v/v进行混合，调节pH＝8.7，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，加酶量为胴体质量的0.7％，于37℃，120r/min搅拌20h，得酶解液。
进一步地，步骤(3)具体操作如下：
向酶解液中加入其体积20％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌30min，再于5000r/min离心20min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀。
进一步地，步骤(4)具体操作如下：
向1次初级HA沉淀中加11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加3倍95％乙醇，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀。
进一步地，步骤(5)具体操作如下：
向2次初级HA沉淀中加入11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加原料质量7％的活性炭，再加入活性炭2倍质量的高岭土，以60～80r/min搅拌30min，然后于5000r/min离心20min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液。
进一步地，步骤(6)具体操作如下：将HA初级水溶液移入50000Da的透析袋中，于原料∶去离子水＝1∶8g/ml的去离子水中透析3h，袋内保留液即为HA精制水溶液；向HA精制水溶液中加入0.3g氯化钠，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得纯化了的HA沉淀。
在工业生产中透析袋可以采用超滤装置代替。
本发明还提供了一种大分子量透明质酸，所述透明质酸的平均分子量为2.6×106～3.1×106Da。
本发明优势在于：
(1)本提取方法的优点在于过程简捷、条件易于控制、操作简单，对仪器设备要求不高，易于放大。
(2)发明人针对高原鼢鼠组织的特性，做了一些技术改进和工艺优化，使整个方法更加简便易于操作，且能实现更高的得率和最高的纯度，例如，若纯化步骤中的离心转速为2500～3000r/min，则鼢鼠组织提取HA的过程中不能有效的离心，HA提取率较低，本专利优选的离心转速为4000～8000r/min；又如在鼢鼠组织提取HA过程中，发明人根据单因素实验发现在25℃之前，随着温度的升高，透明质酸取得率逐渐增加，且增幅较明显，25℃时达到最大，之后略显下降，；又如当活性炭加入量低于7％时，随着用量的升高，HA提取率也逐渐升高，但超过7％后HA的提取率开始下降。
(3)本方法提取的透明质酸属于大分子透明质酸，相对于中、小分子透明质酸而言，其较好的保水功能具有较高的经济价值。高原鼢鼠是青藏高原上一种严重破坏草地的动物，本发明意外地发现，该动物体内的透明质酸符合本发明的研究需求，因此，研究此动物中透明质酸的提取纯化方法，可以将有害动物转化为具有高市场价值的产品。
附图说明
图1粗提工艺不同条件下粗提物中HA含量比较；(A)不同提取温度下的透明质酸得率；(B)不同液料比下的透明质酸得率；(C)不同静置时间下的透明质酸得率；(D)不同提取次数下的透明质酸得率
图2粗提工艺Y＝f(A，B)的相应面与等高线
图3粗提工艺Y＝f(A.C)的相应面与等高线
图4粗提工艺Y＝f(B，C)的相应面与等高线
图5不同酶解条件下酶解物中HA含量比较；(A)酶解温度对透明质酸得率的影响；(B)pH值对透明质酸得率的影响；(C)加酶量对透明质酸得率的影响；(D)酶解时间对透明质酸得率的影响
图6酶解工艺Y＝f(A，B)的相应面与等高线
图7酶解工艺Y＝f(A，C)的相应面与等高线
图8酶解工艺Y＝f(B，C)的相应面与等高线
图9氯苯加入量对HA得率的影响
图10醇沉倍数对HA得率及蛋白含量的影响；(A)透明质酸得率；(B)蛋白含量
图11活性炭加入量对初提水溶液中HA含量的影响
图12透析时间对HA精制水溶液中蛋白含量的影响
图13高原鼢鼠组织中提取的HA紫外光谱
图14高原鼢鼠组织中提取的HA红外光谱
图15粘度法表征HA分子量结果
图16高原鼢鼠肝脏提取HA的SEC-MALL图
图17高原鼢鼠骨骼肌提取HA的SEC-MALL图
图18高原鼢鼠肺组织提取HA的SEC-MALL图
具体实施方式
实施例1：透明质酸的提取纯化方法
①粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料(500g)，加2000ml蒸馏水，8gEDTA-Na2，56gNaCl，在组织捣碎机内以10000r/min捣5～10min后(温度保持在26℃)，5000r/min离心10min，上述操作重复3次，合并各次上清液，静置1.6h。取上述提取液加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于5000r/min离心15min，沉淀为HA粗提物。
②酶解：配制c(NaHCO3)＝0.05mol/L，c(Na2CO3)＝0.05mol/L，V(NaHCO3)∶V(Na2CO3)＝45∶5，pH＝8.7。取上述碱性缓冲水溶液500mL加入HA提取物中，再加3.5g胰蛋白酶(1∶250)，于37℃，120r/min搅拌20h，得酶解液。
③除脂及非水溶性杂质：向水解液中加入100mL氯苯并以800～1000r/min搅拌30min，再于5000r/min离心20min，抽取上清液。
向上清液中加氯化钠至0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀。
④除多肽
向沉淀中加ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L的含盐缓冲水溶液各500mL，搅拌直至完全溶解，得HA水溶液。
向HA水溶液中加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，即得除多肽的2次初级HA沉淀。
⑤除核酸及小分子多肽
向HA沉淀中加入250mL缓冲液[ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L；V(NaCl)∶V(Na2HPO4·12H2O)∶V(NaH2PO4·2H2O)＝1∶1∶1]，搅拌直至完全溶解，得HA溶液。
向HA溶液中加35g经稀酸稀碱处理并用水洗至中性的活性炭和70g经稀碱溶液处理并用水洗至中性的高岭土，以60-80r/min搅拌30min，然后于5000r/min离心20min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液。
⑥透析
将HA水溶液移入50000Da的透析袋中，于4000mL去离子水中透析3h。袋内保留液即为纯化终了的HA精制水溶液。
向纯化终了的HA水溶液中加入3g氯化钠，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，获得纯化了的HA沉淀。
⑦冷冻干燥
HA沉淀经少量丙酮脱水后，放入冷冻干燥机干燥40h，得HA白色粉末状纯化品。
在此优化工艺下，每500g原料分别得到148mg，143mg和141mg透明质酸粉末。
实施例2本发明提取纯化方法条件的考察
一、实验材料与方法
1.1仪器与试剂
组织捣碎机(DS-1，上海生物标本厂)；冷冻干燥机(FD-1A-50，上海比朗仪器有限公司)；大型台式冷冻离心机(HitachiCR-21G，Japan)；万分之一分析天平(Satorious，USA)；万用电炉(河北鹏远建筑仪器厂)；WZH8401-60型多功能电动搅拌器(天津市威化实验仪器厂)；3号砂芯漏斗；透析袋(50KD，北京索莱宝生物科技有限公司)，0.22μm滤器(MerckMillipore，USA)；葡萄糖醛酸标准品(北京索莱宝生物科技有限公司)；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程有限公司)；四硼酸钠(杭州恒龙化工有限公司)；胰蛋白酶(1∶250，北京索莱宝生物科技有限公司)；浓硫酸(AR，北京恒力达化工厂)；咔唑(Sigma，USA)；浓盐酸(AR，北京化工厂)；氢氧化钠(烟台市双双化工有限公司)：无水乙醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司)；氯苯(AR，北京索莱宝生物科技有限公司)，丙酮(AR，天津市星月化工有限公司)，NaCl(天津百世化工有限公司)；EDTA-Na2(上海生工生物工程有限公司)；活性炭(烟台市双双化工有限公司)；高岭土(北京索莱宝生物科技有限公司)；碳酸钠(烟台双双化工有限公司)；碳酸氢钠(烟台双双化工有限公司)；Na2HPO4·12H2O(天津市恒兴化学试剂有限公司)；NaH2PO4·2H2O(天津市恒兴化学试剂有限公司)；试剂配置用水均为超纯水。
1.2原料处理
高原鼢鼠处死后，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分洗净，绞碎，即为原料。
1.3HA提取工艺
高原鼢鼠胴体处理→HA粗提→HA酶解→除脂→除多肽→除核酸→透析精制→冷冻干燥
1.3.1粗提工艺的优化
高原鼢鼠原料每份80g，加入蒸馏水及0.3gEDTA-Na2、2gNaCl，在组织捣碎机内以10000r/min捣5～10min后，2500r/min离心10min，收集上清液。向上清液中补加0.6gNaCl。取上述提取液加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于5000r/min离心15min，沉淀为HA粗提物。
选取提取液料比(2.5、3、3.5、4、4.5mL/g)，提取温度(15、20、25、30、35℃)，静置时间(0.5、1、1.5、2、2.5h)，提取次数(1、2、3、4、5次)做为参考因素考察HA粗提工艺的单因素分析。在单因素试验的基础上，筛选主要影响的单因素，应用Design-Expert8.0软件设计响应面试验，利用响应面试验结果，反映多个因素之间相互作用的影响，确定原料中HA粗提工艺的最佳提取条件。试验因素与水平见表1
表1HA相提工艺的响应面试验因素与水平表
1.3.2酶解工艺的优化
配制c(NaHCO3)＝0.05mol/L，c(Na2CO3)＝0.05mol/L，V(NaHCO3)∶V(Na2CO3)＝45∶5，pH＝8.7。将粗提工艺得到的提取物按照原料(g)∶碱性缓冲液(mL)＝1∶1的比例加入上述缓冲液，溶解粗提物后进行酶解。
选取酶解温度(31、33、35、37、39℃)、酶解pH值(8.3、8.5、8.7、8.9、9.1)、酶解时间(5、10、15、20、25h)、加酶量(1∶250)(加酶量∶原料量＝0.4、0.5、0.6、0.7、0.8％)作为参考因素考察HA酶解的单因素分析。在单因素试验的基础上，筛选主要影响的单因素，应用Design-Expert8.0软件设计响应面试验，利用响应面试验结果，反映多个因素之间相互作用的影响，确定原料中HA粗提工艺的最佳提取条件。试验因素与水平见表2
表2HA酶解工艺的响应面试验因素与水平表
1.3.3除杂工艺的优化
1.3.3.1除脂及非水溶性杂质
向酶解液中加入占酶解液体积10％、20％、30％、40％、50％的氯苯，考察加入不同氯苯加入量对HA得率的影响，以800-1000r/min搅拌30min，再于2500r/min离心20min，抽取上清液。上清液中加入氯化钠至终浓度为0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于2500r/min离心10min，倾弃上清液，即得1次初级HA沉淀。
1.3.3.2除多肽
向1次初级沉淀中加入原料(g)∶配比缓冲液(mL)＝1∶3的[ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L，V(NaCl)∶V(Na2HPO4·12H2O)∶V(NaH2PO4·2H2O)＝1∶1∶1]的三种含盐缓冲水溶液，搅拌至充分溶解，得HA水溶液。考察HA水溶液中加入不同体积倍数(1、2、3、4、5)的(C2H5OH)＝95％的乙醇对HA得率的影响，搅拌，静置1h，于2500r/min离心10min，倾弃上清液，得到除多肽后的2次初级HA沉淀。
1.3.3.3除核酸及小分子多肽
向2次初级沉淀中HA水溶液中加入原料(g)∶配比缓冲液(mL)＝2∶1的缓冲溶液[ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L，V(NaCl)∶V(Na2HPO4·12H2O)∶V(NaH2PO4·2H2O)＝1∶1∶1]，得HA水溶液。考察在此溶液中加入不同质量的经稀酸稀碱处理并水洗至中性的活性炭(活性炭量/原料＝6％、7％、8％、9％、10％的活性炭和活性炭2倍质量的经稀碱溶液处理并水洗至中性的高岭土，以60-80r/min搅拌30min，然后于3000r/min离心20min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的初级HA水溶液。
1.3.3.4透析精制工艺的优化
将初级HA水溶液移入50000Da的透析袋中，于400mL去离子水中透析，考察不同透析时间(1、2、3、4、5h)对HA水溶液中蛋白含量的影响。抽取袋内保留液即为透析后精制的HA水溶液。
1.4扩试
分别取原料3份各500g，采用优化后的工艺流程，考察此工艺流程下高原鼢鼠组织中HA的提取率。
1.5数据分析
所有数据采用3次实验平均测量值。所有工艺均按照Bitter-Muir咔唑法测定各步骤提取物中的葡萄糖醛酸的含量并计算HA的提取量。透明质酸提取率＝HA提取量/原料湿重，单位mg/g。蛋白含量按照考马斯亮蓝法检测(南京建成生物工程有限公司)，单位g/L。响应曲面模型的回归方程式和显著性统计通过Statistic7.0软件进行计算和分析处理，系数的显著性通过t检验和P值进行分析。
二实验结果
2.1粗提工艺
2.1.1单因素分析结果见图1
当固定其它条件不变(提取液料比为4mL/g，静置时间1.5h，提取次数为3次)，考察提取温度(15、20、25、30、35℃)对HA提取物透明质酸得率的影响。图1A结果显示，在25℃之前，随着温度的升高，透明质酸取得率逐渐增加，且增幅较明显，25℃时达到最大，之后略显下降。在工业生产中，过高的提取温度耗能较大且不易操作，因此选择温度为25℃为宜。
当固定其它条件不变(提取时间1.5h，提取温度25℃，提取次数为3次)，考察液料比(2.5、3、3.5、4、4.5mL/g)对HA提取物透明质酸得率的影响。图1B结果显示，在2.5-4mL/g液料比范围内，透明质酸提取率随液料比的增加呈上升趋势，这是因为溶剂用量越大对成分的溶解能力越强，有利于扩散的进行。在液料比为4mL/g时，透明质酸提取得率达到最大，说明一定比例的溶剂已将有效成分溶出完全。因此，从成本和耗能方面考虑，液料比选择4mL/g为宜。
当固定其它条件不变(提取液料比为4mL/g，提取温度25℃，提取次数为3次)，考察静置时间(0.5、1、1.5、2、2.5h)对HA提取物透明质酸得率的影响。图1C结果显示，透明质酸提取率随提取时间的增加呈上升趋势，之后趋于平缓，说明提取液内的HA已达到平衡。在静置时间为1.5h时，透明质酸提取得率达到最大，说明提取液内有效成分已达到平衡。为减少能耗，节约时间，静置时间选择1.5h为宜。
当固定其它条件不变(提取液料比为4mL/g，静置时间1.5h，提取温度25℃)，考察提取次数(1、2、3、4、5次)对HA提取物透明质酸得率的影响。图1D结果显示，在提取3次之前，随着提取次数的增加，透明质酸取得率显著增加，提取次数达到3次时达到最大，之后略显下降，趋于平缓。在工业生产中，过多的提取次数不易操作且耗时耗能，因此选择3次为宜。
2.1.2响应面法优化HA粗提工艺
2.1.2.1响应面分析方案与结果
通过上述的单因素分析，发明人筛选了提取温度、液料比、静置时间三个主要因素，采用Box-Behnken设计结合相应面法，以HA提取得率为相应值，对HA粗提工艺进行优化，试验结果如下：
表3粗提工艺的分析方案与结果
采用Design-Expert8.0软件对各因素进行回归拟合得回归方程，HA提取得率＝0.34+0.0077A+0.011B+0.010C+0.0059AB-0.0047AC+0.0073BC-0.062A2-0.030B2-0.046C2
表4粗提工艺的方差分析结果
注：*差异显著，P＜0.05；**：差异极显著，P＜0.01
表中的回归方差分析的结果表明：A，B，C，A2，B2，C2(P＜0.01)为极显著项；AB，BC(P＜0.05)为显著项；AC项不显著。R2＝0.9900，r＝0.9950表明该二次回归方程得到的HA提取得率模型与实际拟合较好，符合度为99.50％，说明该使用方程模拟实际是可行的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，三个因素对HA取得率的影响顺序为液料比(B)＞静置时间(C)＞提取温度(A)
2.1.2.2因素间的交互影响
根据拟合模型绘制HA提取率响应面的三维图与等高线，可直观看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最佳粗提工艺参数范围。Design-Expert8.0软件处理后三维相应面和等高线图见图2～4：
分析3组图可知，提取液料比和静置时间对HA提取得率的影响较为显著，表现为曲线较陡，随着液料比和静置时间的增加或减少，相应值变化较大；提取温度对HA提取率的影响不大，表现为曲线较为平滑，即随温度增加或减少，相应值变化较小。
2.1.2.3HA粗提工艺条件的确定
通过软件Design-Expert8.0求解方程，得出了最优提取工艺条件为最佳工艺为液料比4.03ml/g，温度26.04℃，提取时间1.56h。在此工艺下原料中HA提取率为0.338mg/g。
2.1.2.4粗提工艺验证
综合考虑时间，成本等因素，对工艺参数进行了一定的修正，确定适宜的提取工艺条件为：液料比为4ml/g、提取温度为26℃，提取时间为1.6h。在此条件下，进行了三次平行的重复实验，结果显示粗提工艺的平均得率为0.335mg/g。
2.2酶解工艺
2.2.1单因素分析结果见图5
当固定其它条件不变(pH值8.7，酶解温度37℃，加酶量0.6％)，考察提取温度(31、33、35、37、39℃)对酶解物HA提取率的影响。结果显示，结果如图5A，温度在31-35℃时透明质酸提取率随温度的变化影响不大，当温度上升到37℃之后达到最大值，之后缓慢下降，说明在此工艺过程中37℃时胰蛋白酶能达到其最优酶解效果。综合考虑HA得率、工艺成本，能耗，酶解温度选择37℃为最佳。
当固定其它条件不变(酶解温度37℃，加酶量0.6％，酶解时间为20h)，考察pH值(8.3、8.5、8.7、8.9、9.1)对酶解物HA提取率的影响。结果如图5B，当酶解pH值＝8.7时，酶解得到的HA提取率最高，因此选择pH值为8.7为宜。
当固定其它条件不变(pH值8.7，酶解温度37℃，酶解时间为20h)，考察加酶量(胰蛋白酶(1∶250)加酶量分别为原料质量的0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％)对酶解物HA提取率的影响。结果如图5C，透明质酸提取率随酶量的增大呈上升趋势，当增大到0.6％之后逐步趋于平缓，0.7％后达到顶峰后几乎不再变化，说明酶浓度已趋于饱和，HA完全被释放出来。HA的提取率不会随酶量的增大而增加。为节约成本，减少能耗，综合考虑加酶量选择0.7％为最佳。
当固定其它条件不变(pH值8.7，酶解温度37℃，加酶量0.6％)，考察酶解时间(5、10、15、20、25h)对酶解物HA提取率的影响。结果如图5D，在5-20h范围内，HA提取率随时间的增加呈上升趋势，20h之后平稳不变，说明当酶解时间达到20h时，HA已完全提出。HA的提取率不会随着酶解时间的延长而增加。为节约时间，减少能耗，酶解时间选择20h为宜。
2.2.2响应面分析方案与结果
通过上述的单因素分析，发明人筛选了酶解温度、酶解pH值、加酶量三个主要因素，采用Box-Behnken设计结合响应面法，以HA提取率为响应值，对HA粗提工艺进行优化，试验结果如下：
表5酶解工艺的分析方案与结果
采用Design-Expert8.0软件对各因素进行回归拟合得回归方程，酶解工艺下HA提取得率＝0.33-0.0039A+0.0073B+0.0038C-0.0077AB+0.015AC-0.0079BC-0.034A2-0.030B2-0.021C2
表6酶解工艺的方差分析结果
注：*差异显著，P＜0.05；**：差异极显著，P＜0.01
表6中的回归方差分析的结果表明：B、AB、BC、AC、A2、B2、C2(P＜0.01)为极显著项；A、C(P＜0.05)为显著项。R2＝0.9805，r＝0.9902表明该二次回归方程得到的HA提取得率模型与实际拟合较好，符合度为99.02％说明该使用方程模拟实际是可行的。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，三个因素对HA取得率的影响顺序为pH值(B)＞加酶量(A)＞酶解温度(C)
2.2.3因素间的交互影响
根据拟合模型绘制HA酶解条件响应面的三维图与等高线，可直观看出响应面的最高点，即参数范围内的极值以及因素间的相互作用对响应值的影响，依次可以确定最佳酶解工艺参数范围。Design-Expert8.0软件处理后三维相应面和等高线图见图6～8：
分析3组图可知，酶解pH值和加酶量对HA提取率的影响较为显著，表现为曲线较陡，随着pH值和加酶量的增加或减少，相应值变化较大；酶解温度对HA提取率的影响不大，表现为曲线较为平滑，即随温度增加或减少，相应值变化较小。
2.2.4HA酶解工艺条件的确定
通过软件Design-Expert8.0求解方程，得出了最优酶解工艺条件为最佳工艺为酶解温度36.88℃，pH值8.72，加酶量为0.7％。在此工艺下原料中HA提取率为0.326mg/g原料。
2.2.5酶解工艺验证
综合考虑时间，成本等因素，对工艺参数进行了一定的修正，确定适宜的酶解工艺条件为：酶解温度37℃，pH值8.7，加酶量为0.7％。在此条件下，进行了三次平行的重复实验，结果显示粗提工艺的平均得率为0.318mg/g。
2.3纯化工艺
2.3.1除脂的单因素分析
当氯苯的加入量分别为酶解液体积的10％-20％时，透明质酸的得率逐渐增加，到20％时达到顶峰，之后随着氯苯量的增加出现先少量下降，后保持不变的状态(图9)。说明当氯苯加入量达到20％时，能将HA水溶液中的脂类和非极性物质完全去除，当氯苯量继续加大时，HA的提取率不再增大。为节约成本，减少工业污染，氯苯加入的体积数为酶解液的20％为最佳。
2.3.2除多肽的单因素分析
当加入2-4倍HA水溶液体积数的95％乙醇除多肽时，表现为加入2-3倍95％乙醇醇沉时，HA提取率缓慢上升，蛋白含量显著下降；3倍95％乙醇时达到顶峰，蛋白含量达到最小值；3-4倍95％乙醇时HA提取率逐渐下降，蛋白含量上升(图10)。3倍95％乙醇醇沉能达到最大的HA提取率和最小的蛋白含量。因此，为保证产品质量，提高产品得率，除多肽时选择3倍乙醇量为最佳。
2.3.3除核酸的单因素分析
当加入6％-7％活性炭除核酸时，HA的提取率基本保持不变，7％时提取率略高，在此活性炭加入量下HA不会被活性炭吸附；当活性炭加入量超过7％时，HA提取率逐渐下降，说明在此加入量下活性炭已将HA吸附，造成一定的HA损失(图11)。为提高产品质量，减少损失，活性炭的加入量以7％为宜。
2.3.4透析的单因素分析
当透析时间在1-3h时，HA水溶液中的蛋白浓度显著下降，直至3h后保持稳定不变，说明3h的透析时间已将绝大部分蛋白质去除(图12)。为节约时间，减少能耗，透析时间选择3h为宜。
2.4优化的总工艺方案(以500g原料为例)
①粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料(500g)，加2000ml蒸馏水，8gEDTA-Na2，56gNaCl，在组织捣碎机内以10000r/min捣5-10min后(温度保持在26℃)，5000r/min离心10min，上述操作重复3次，合并各次上清液，静置1.6h。取上述提取液加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，静置至沉淀析出，于5000r/min离心15min，沉淀为HA粗提物。
②酶解：配制c(NaHCO3)＝0.05mol/L，c(Na2CO3)＝0.05mol/L，V(NaHCO3)∶V(Na2CO3)＝45∶5，pH＝8.7。取上述碱性缓冲水溶液500mL加入HA提取物中，再加3.5g胰蛋白酶(1∶250)，于37℃，120r/min搅拌20h，得酶解液。
③除脂及非水溶性杂质：向水解液中加入100mL氯苯并以800-1000r/min搅拌30min，再于5000r/min离心20min，抽取上清液。
向上清液中加氯化钠至0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀。
④除多肽
向沉淀中加ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L的含盐缓冲水溶液各500mL，搅拌直至完全溶解，得HA水溶液。
向HA水溶液中加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，即得除多肽的2次初级HA沉淀。。
⑤除核酸及小分子多肽
向HA沉淀中加入250mL缓冲液[ρ(NaCl)＝11.6g/L，ρ(Na2HPO4·12H2O)＝0.55g/L，ρ(NaH2PO4·2H2O)＝0.06g/L；V(NaCl)∶V(Na2HPO4·12H2O)∶V(NaH2PO4·2H2O)＝1∶1∶1]，搅拌直至完全溶解，得HA溶液。
向HA溶液中加35g经稀酸稀碱处理并用水洗至中性的活性炭和70g经稀碱溶液处理并用水洗至中性的高岭土，以60-80r/min搅拌30min，然后于5000r/min离心20min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液。
⑥透析
将HA水溶液移入50000Da的透析袋中，于4000mL去离子水中透析3h。袋内保留液即为纯化终了的HA精制水溶液。
向纯化终了的HA水溶液中加入3g氯化钠，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％-75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，倾弃上清液，获得纯化了的HA沉淀。
⑦冷冻干燥
HA沉淀经少量丙酮脱水后，放入冷冻干燥机干燥40h，得HA白色粉末状纯化品。
实施例3透明质酸的鉴定及分子表征
1.材料与方法
1.1仪器与试剂
乌氏粘度计(上海启航玻璃仪器厂，内径0.6mm-0.7mm)；万用电炉(DL-1，河北鹏远建筑仪器厂)；万分之一分析天平(Satorious，USA)；WZH8401-60型多功能电动搅拌器(天津市威化实验仪器厂)；3号砂芯漏斗；ThermoNicoletiS50(USA)型傅立叶变换红外光谱仪；ShimadzuUV-2550(Japan)紫外分光光度仪。Waters2690D型液相色谱系统(WatersTechnologyCorporation，USA)；Waters2410示差折光检测器(WatersTechnologyCorporation，USA)；DAWNEOS型多角度激光光散射仪(WyattTechnologyCorporation，USA)；Astra4.90.08软件系统。葡萄糖醛酸标准品(北京索莱宝生物科技有限公司)；考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程有限公司)；四硼酸钠(杭州恒龙化工有限公司)；胰蛋白酶(北京索莱宝生物科技有限公司)；浓硫酸(AR，北京恒力达化工厂)；氯化钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；咔唑(Sigma，USA)；浓盐酸(AR，北京化工厂)；氢氧化钠(烟台市双双化工有限公司)；无水乙醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司)；0.22μm滤膜(MerckMillipore，USA)；0.45μm滤头(MerckMillipore，USA)试剂配置用水均为超纯水。
1.2红外光谱鉴定
采用ThermoNicoletiS50(USA)型傅立叶变换红外光谱仪。取2mg样品，溴化钾压片，在4000-400cm-1范围内扫描，分辨率为4cm-1，扫描速度64次/s。
1.3紫外光谱鉴定
采用ShimadzuUV-2550(Japan)紫外分光光度仪检测。取25mg透明质酸样品加双蒸水溶解定容至50mL。每次取3mL在波长190nm-400nm范围内进行扫描，速度为100nm/min
1.4HA分子量表征
1.4.1粘度法测定HA分子量
配制0.2mol/LNaCl溶液500mL，称取干燥HA样品溶解于0.2mol/LNaCl溶液，待24h后HA充分溶胀并溶解后定容至100mL容量瓶，分别配成0.15g/L、0.1g/L、0.075g/L、0.06g/L、0.05g/L的HA-NaCl样品液各100mL。0.2mol/LNaCl溶液即为空白溶剂。使用0.2mol/LNaCl溶液作为参比液，测定温度为(25±0.05)℃，采用多点测定，每个浓度测定3次取平均值，以浓度为横坐标，以比浓粘度为纵坐标建立回归直线，外推计算截距得出特性粘度η，并按η＝3.6×10-4Mr0.78计算平均相对分子量。
1.4.2SEC-MALLS法测定HA分子量
色谱条件：色谱柱：ShodexSB-806MHQ：13μmparticlesize，15000poresize和ShodexSB-807HQ：35μmparticlesize，30000poresize(ShowaDenko，Japan)串联使用。流动相：0.1mol/L的氯化钠溶液，0.22μm滤膜过滤，待用；流速0.6mL/min；柱温25℃；进样量500μL。检测器：Waters2410示差折光检测器、DAWNEOS型多角度激光光散射仪(激光波长为690nm，25℃条件下进行)串联在线检测。折光指数增量dn/dc设为0.15mL。
用于溶解透明质酸样品的溶剂采用0.1mol/LNaCl溶液，经0.22μm滤膜过滤后备用。取透明质酸样品加入溶剂配制成0.1mg/mL的HA-NaCl溶液，置于混合器上混合放置24h，直至样品完全溶解。所有待测样品均用0.45μm的滤头进行过滤后进样检测，待进行温度平衡10分钟后即可进行实验。系统控制和实验数据采集软件为ASTRAV4.90.08。
1.5HA纯度测定
1.5.1葡萄糖醛酸含量的测定
参照Bitter-Muir咔唑法，以葡萄糖醛酸为标准品。葡萄糖醛酸标准溶液：精密称取经60℃干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品60mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀；精密量取10mL，置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为60μg/mL。硫酸硼砂溶液：称取四硼酸钠4.77g，溶于浓硫酸(AR)500mL中即得。0.125％的咔唑试剂：称取咔唑0.125g，溶于100mL无水乙醇(AR)中，置于棕色瓶中于冰箱内保存。
精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置25mL具塞试管中，各加水至1.0mL，混匀，冰浴中冷却，并在不断振摇下缓缓滴加0.025mol/L硼砂硫酸溶液5.0mL，密塞，沸水浴加热10min(中间振摇一次)，迅速冷却，加0.125％咔唑的无水乙醇溶液0.2mL，摇匀，沸水浴中加热15min(中间振摇一次)，冷却至室温。按紫外-可见光光度法，以0管为空白，在530nm的波长处测定吸光度，以葡萄糖醛酸的μg数对相应的吸光度计算回归方程。
精密称取完全干燥样品约60mg(冷冻干燥后水分约占样品质量的4％-5％)，置100mL容量瓶中，用水溶解，并稀释至刻度，摇匀；用内容量移液管量取10mL，置100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取供试品溶液1.0mL，置25mL具塞试管中，自“冰浴中冷却”起照标准曲线制备项下的方法测定。
由回归方程计算葡萄糖醛酸的含量，除以供试品的质量，乘以2.1549，再乘以100％即得到HA的质量分数。计算公式：HA(％)＝2.1594×y(HA)×100％。式中：2.1594-葡萄糖醛酸相对HA的质量换算系数；y(HA)-每mLHA水溶液试样中葡萄糖醛酸的质量分数。
1.5.2HA产品中蛋白质含量的测定
蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。取10mgHA样品溶于500μl双蒸水制成HA水溶液。每次取50μl加入3mL配好的考马斯亮蓝显色液，以双蒸水调0，紫外分光光度计595nm波长检测，计算得出蛋白浓度。平行测定三份样品，计算平均值，通过HA水溶液中蛋白浓度与HA浓度的比值计算HA中的蛋白含量。
2.结果
2.1原料提取的HA主要质量指标
表7原料提取的HA的主要指标
表7所示为原料中提取的HA(实施例1制备)的各项检测指标。提取的透明质酸外观呈乳白色的粉末；经Bitter-Muir咔唑法法检测，葡萄糖醛酸的质量分数为45.60％，经换算HA浓度为98.47％；其蛋白质含量为0.11％，符合瑞典Healon产品质量要求(＜0.5％)，达到了化妆品及食品级标准；经粘度法和体积排阻法检测，其平均分子量达到3×106，属高分子量透明质酸。
2.2葡萄糖醛酸标准曲线
以葡萄糖醛酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为y＝0.013x-0.007，相关系数R2＝0.998。
2.3高原鼢鼠HA提取率
HA在各组织中的提取率依次为：肝脏：0.73mg/g；肺：0.41mg/g；骨肉：0.25mg/g。
2.4高原鼢鼠HA产物鉴定
2.4.1紫外光谱检测
利用紫外分光光度计对原料中提取并纯化的HA在190nm-400nm波长内扫描，结果显示在波长196nm左右处出现多糖特征吸收峰，在260nm和280nm未见有核酸和蛋白质的特征吸收峰(图13)，说明纯化得到的透明质酸不含蛋白质、核酸类杂质。
2.4.2红外光谱检测
将本发明提取和纯化的原料中的HA进行红外吸收光谱分析(图14)，HA的红外吸收图谱在3400cm-1附近有强烈的-OH伸缩振动的特征吸收峰，表明存在着多糖羟基结构。1654cm-1及1560cm-1处有-C＝O和-C-N伸缩振动及N-H弯曲振动的特征吸收峰，表明存在着乙酰氨基结构。1412cm-1和1384cm-1有O＝C-O-伸缩振动-OH弯曲振动偶合产生的两个吸收峰，表明存在着糖醛酸上的解离羧基和多羟基结构。以上吸收情况与美国Sigma公司的HA标准品的红外图谱一致，两者在特征区与指纹区的各主要吸收峰的波长和各吸收峰间的相互强度关系相同。红外光谱结果证明提取物为透明质酸。
2.5分子量表征
2.5.1粘度法表征
根据公式η＝3.6×10-4Mr0.78，粘度法计算结果显示，高原鼢鼠HA的分子量为3.05×106(图15)
2.5.2SEC-MALL法表征
表8高原鼢鼠各组织的HA分子量
经体积排阻色谱(SEC-MALL)鉴定，高原鼢鼠各组织HA分子量分布于2.671×106～3.015×106之间(表8)，略小于粘度法测定结果。骨骼肌、肝脏、肺等组织中HA的分子量基本一致(图16～18)。
Claims (8)
1.一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：
(1)粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料；以液料比(3.5～4.5)∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.0～2.0％EDTA-Na2和10.0～12.0％NaCl，在组织捣碎机内以10000～120000r/min捣5～10min后，4000-8000r/min离心10～15min，上述操作重复2～4次，合并各次离心上清液，静置1.5～2h，其中，组织捣碎机内温度控制在20～30℃；在上清液中加入乙醇使其乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于4000～8000r/min离心10～15min，沉淀为HA粗提物；
(2)酶解：配制0.05～0.1mol/L的NaHCO3水溶液和0.05～0.1mol/L的Na2CO3水溶液，以NaHCO3水溶液∶Na2CO3水溶液＝8～9∶1v/v进行混合至混合酶解液pH＝8.3～9.1，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，酶比活力为1∶250，加酶量为原料质量的0.4～0.8％，于31～39℃，120r/min搅拌5～25h，得酶解液；
(3)除脂及非水溶性杂质：向酶解液中加入其体积10～50％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌20～30min，再于4000～8000r/min离心10～15min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.1～0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀；
(4)除多肽
向1次初级HA沉淀中加入5.6g/L～11.2g/LNaCl水溶液∶0.5～0.6g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.05～0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，其中，原料∶缓冲液＝1∶1g/ml；搅拌直至完全溶解，向溶液中加2～4倍95％乙醇，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀；
(5)除核酸及小分子多肽
向2次初级HA沉淀中加入11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加原料质量6～10％的活性炭，再加入活性炭1～2倍质量的高岭土，以60-80r/min搅拌15～30min，然后于4000～8000r/min离心10～15min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液；
(6)透析
将HA初级水溶液移入50000～100000Da的透析袋中，于去离子水中透析1～5h，原料∶去离子水＝1∶8～20g/ml，袋内保留液即为HA精制水溶液：向HA精制水溶液中加入氯化钠使保留液NaCl终浓度达到0.1～0.2mol/L，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得纯化了的HA沉淀；
(7)干燥
取HA沉淀，经冷冻干燥，即得透明质酸纯品。
2.根据权利要求1所述的粗提方法，其特征在于：步骤(1)具体操作如下：
以液料比4∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.6％EDTA-Na2和11.2％NaCl，在组织捣碎机内以10000r/min捣5～10min后，5000r/min离心10min，上述操作重复3次，合并各次离心上清液，静置1.6h，其中，组织捣碎机内温度控制在26℃。
3.根据权利要求1所述的酶解方法，其特征在于：步骤(2)具体操作如下：
配制0.05mol/L的NaHCO3水溶液和0.05mol/L的Na2CO3水溶液，以NaHCO3水溶液∶Na2CO3水溶液＝45∶5v/v进行混合，调节pH＝8.7，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，加酶量为酮体质量的0.7％，于37℃，120r/min搅拌20h，得酶解液。
4.根据权利要求1所述的除脂及非水溶性杂质方法，其特征在于：步骤(3)具体操作如下：
向酶解液中加入其体积20％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌30min，再于5000r/min离心20min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀。
5.根据权利要求1所述的除多肽方法，其特征在于：步骤(4)具体操作如下：
向1次初级HA沉淀中加11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加3倍95％乙醇，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀。
6.根据权利要求1所述的除核酸及小分子多肽方法，其特征在于：步骤(5)具体操作如下：
向2次初级HA沉淀中加入11.6g/LNaCl水溶液∶0.55g/LNa2HPO4·12H2O水溶液∶0.06g/LNaH2PO4·2H2O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加原料质量7％的活性炭，再加入活性炭2倍质量的高岭土，以60～80r/min搅拌30min，然后于5000r/min离心20min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液。
7.根据权利要求1所述的透析方法，其特征在于：步骤(6)具体操作如下：将HA初级水溶液移入50000Da的透析袋中，于原料∶去离子水＝1∶8g/ml的去离子水中透析3h，袋内保留液即为HA精制水溶液；向HA精制水溶液中加入0.3g氯化钠，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置1h，于5000r/min离心10min，取固形物即得纯化了的HA沉淀。
8.一种大分子量透明质酸，其特征在于：所述透明质酸的平均分子量为2.6×106～3.1×106Da。
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