CN104744609A - 采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，属于分离提取透明质酸的方法领域。本发明利用膜过滤等现代生物分离手段和方法，选择膜孔为500nm的陶瓷膜，该陶瓷膜可截留分子量为1,000,000道尔顿，可以有效的去除蛋白，截留透明质酸。用本发明提取林蛙皮中的透明质酸，每千克林蛙皮可提取2.8克透明质酸精品，产品经检验葡糖醛酸含量为36％，蛋白质含量为0.58％，达到化妆品级。本发明采用膜过滤的方法除蛋白，对HA进行脱盐、分级和浓缩，收率高、极少破坏多糖的生物活性，又没有传统有机溶剂法的试剂残留问题，是一条经济、简便、有效的提取工艺，适合于工业化生产HA。
Description
技术领域
本发明属于分离提取透明质酸的方法领域，特别是涉及到一种采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid简称HA)是一种国际上公认的生物大分子保湿剂,它是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄糖醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖。经过多年的研究,人们对HA的结构、理化性质及生理功能已有了明确的认识，明确了它具有高度粘弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性等诸多优点。目前，HA被主要用于眼科显微手术、关节炎治疗、高级化妆品、妇产科等领域。天然的透明质酸，分子量在450,000～4,500,000道尔顿范围内。人工所得产品平均分子量在2,000,000～2,500,000道尔顿之间。蛋白质是由许多氨基酸通过肽键相连而成的。分子量一般为数万至数十万。
国内外对透明质酸的研究一般都只注重产品开发，而不注重对生产工艺的改进。目前,制备HA主要有两种方法,一种是从鸡冠、人脐带、动物眼球等动物组织中获得,制得的HA分子量较高,粘度好,保湿性好,但由于受原料资源的限制,不能满足市场对HA的需求；另一种是微生物发酵生产法,是从某些菌属的细菌的英膜中提取HA,其分离、纯化工艺简单,成本低,是今后的发展方向,但国内还处于研究阶段没有成型的工艺,组织提取法仍是目前的主要生产方法。
林蛙(Rana tempoviductus ranaearia chensinensis david)，是一种珍贵的两栖类药用经济动物。具有很高的药用价值。人们对林蛙油的需求连年增长，林蛙养殖业飞速发展，仅就长白山地区每年可回捕林蛙3亿只以上。因此，从林蛙皮中提取透明质酸具有极大的优势，将显著提高我省林蛙产业的经济效益。非专利文献1：沙坤，中国林蛙皮透明质酸提取技术的研究[D]，2004.中提到对林蛙皮HA的制备工艺：1、确定了原料预处理方法，即在低温条件下,对林蛙皮进行高速组织破碎；2、确定了最佳提取工艺，即采用复合酶法提取HA；3、确定了最佳纯化工艺，即采用链霉蛋白酶二次酶解、络合沉淀和超滤结合的方法,对HA中间品进行纯化处理,制得了高纯度的HA精品。该文献中采用的过滤介质是孔径为0.088～0.074mm的尼龙滤布，并且该文献中使用的溶剂中含有有机溶剂。孔径为0.088～0.074mm的尼龙滤布，无法有效的去除蛋白，截留透明质酸；溶剂中含有有机溶剂也会造成试剂残留问题，使安全性降低。如今，人们已经逐渐认识到采用膜过滤等现代生物分离手段和方法制备HA，能有效解决上述问题，但目前却没有提出具体的方法和步骤。
因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：本发明利用膜过滤等现代生物分离手段和方法制备HA精品，本发明选择膜孔为500nm的陶瓷膜，该陶瓷膜可截留分子量为1,000,000道尔顿，可以有效的去除蛋白，截留透明质酸。
采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，其特征是：包括以下步骤
步骤一、选取取油后在-2℃或者-2℃以下冷冻保存的中国林蛙皮1000克，放入玻璃容器中，加中国林蛙皮10倍量的水浸泡20小时～28小时；
步骤二、将步骤一浸泡后的中国林蛙皮及其溶液全部注入高速组织捣碎机，以10000转/分钟～14000转/分钟的转速匀浆2分钟～3分钟，匀浆后成糊状；
步骤三、将步骤二得到的糊状物全部注入恒温磁力搅拌器中，搅拌加热至85℃～95℃后，保温5分钟～15分钟，冷却至45℃～55℃并保温、自溶12小时；
步骤四、将步骤三得到的糊状物全部注入离心机中，以4000转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；
步骤五、分别取离心后的残渣2倍量的水，洗涤离心后的残渣两次，将洗涤后的溶液与离心后的溶液混合；
步骤六、取HCl滴入步骤五得到的溶液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；
步骤七、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣3次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合，得到截留液；
步骤八、取NaOH溶液滴入步骤七得到的截留液中，调PH值至7.5～8.5，取每克含活性蛋白酶40mg～50mg的胃蛋白酶，40克～50克加入到碱性的截留液，保持温度45℃～50℃，酶解小时8小时～12小时，得到酶解液；
步骤九、将步骤八得到的酶解液全部注入离心机中，以3600转/分钟离心，取上清液；
步骤十、取HCl滴入步骤九得到的上清液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；
步骤十一、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣10次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合；
步骤十二、将步骤十一得到的溶液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，滴入HCl调PH值至6.5，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，以3600转/分钟离心，于真空干燥箱中60℃干燥24小时，得到透明质酸HA粗品；
步骤十三、按照HA粗品与水的比例1：30向将步骤十二得到的HA粗品中加水，同时加入溶液体积3％的高岭土，50℃加热30分钟，进行脱色，以3600转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；
步骤十四、按照离心后的残渣与水的比例1：1，加水洗涤步骤十三得到的离心后的残渣，将洗涤后的水以3600转/分钟离心，将离心后的水溶液与步骤十三得到的离心后的溶液混合，放置冷却至0℃～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，以3600转/分钟离心，取上清液；
步骤十五、将步骤十四得到的上清液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇各洗涤一次进行醇沉，得到透明质酸HA精品。
所述步骤一、步骤五、步骤七、步骤十一和步骤十四中使用的水均为无菌蒸馏水。
通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：
1、取油后冷冻保存的中国林蛙皮提取出来的透明质酸产品葡糖醛酸含量较高，能达到36％以上，而取油后风干保存的中国林蛙皮，用本工艺也可以提出相同质量的白色粉末，测定葡糖醛酸含量仅6％。
2、用本发明提取林蛙皮中的透明质酸，每千克林蛙皮可提取2.8克透明质酸精品，产品经检验葡糖醛酸含量为36％，蛋白质含量为0.58％，达到化妆品级。
3、本发明采用膜过滤的方法除蛋白，对HA进行脱盐、分级和浓缩，收率高、极少破坏多糖的生物活性，又没有传统有机溶剂法的试剂残留问题，是一条经济、简便、有效的提取工艺，适合于工业化生产HA。
附图说明
以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明：
图1为本发明采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法的流程框图。
具体实施方式
实施例l、选择取油后的中国林蛙皮，中国林蛙皮含脂肪量较低，容易绞碎，因此，直接加中国林蛙皮8倍量水浸泡20小时。以10000转/分钟的转速匀浆2分钟，匀浆后成糊状，搅拌加热至85℃，保温5min，冷却至45℃，自溶12小时，4000转/分钟离心，4倍量水，分两次洗涤残渣。
HCl调PH1.5，500nm孔径陶瓷膜过滤，9倍量水分3次加入水洗，截留液，碱性条件(pH7.5)，胃蛋白酶(用量：45mg/g干燥组织)于50℃酶解12小时，酶解液离心取清液，HCl调PH1.5，500nm孔径陶瓷膜过滤，30倍量水分10次加入水洗，加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L，HCl调PH6.5，加入3倍体积95％乙醇，静置24小时，离心，干燥得粗品。
HA(粗产品)按照1：30加水，同时加入溶液体积3％的高岭土50℃加热30分钟，离心，少许水洗涤残渣，离心，水液合并，放冷至0～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，离心，清液加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L，3倍量95％乙醇，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤产品，重复醇沉一次。
实施例2、选择取油后的中国林蛙皮，中国林蛙皮含脂肪量较低，容易绞碎，因此，直接加中国林蛙皮10倍量水浸泡24小时。以12000转/分钟的转速匀浆3分钟，匀浆后成糊状，搅拌加热至90℃，保温l0min，冷却至50℃，自溶12小时，4000转/分钟离心，4倍量水，分两次洗涤残渣。
HCl调PH2.0，500nm孔径陶瓷膜过滤，9倍量水分3次加入水洗，截留液，碱性条件(pH8.5)，胃蛋白酶(用量：40mg/g干燥组织)于50℃酶解12小时，酶解液离心取清液，HCl调PH2.0，500nm孔径陶瓷膜过滤，30倍量水分10次加入水洗，加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为0.5mol/L，HCl调PH6.5，加入3倍体积95％乙醇，静置24小时，离心，干燥得粗品。
HA(粗产品)按照1：30加水，同时加入溶液体积3％的高岭土50℃加热30分钟，离心，少许水洗涤残渣，离心，水液合并，放冷至0～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，离心，清液加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为0.5mol/L，3倍量95％乙醇，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤产品，重复醇沉一次。
实施例3、选择取油后的中国林蛙皮，中国林蛙皮含脂肪量较低，容易绞碎，因此，直接加中国林蛙皮12倍量水浸泡28小时。以14000转/分钟的转速匀浆4分钟，匀浆后成糊状，搅拌加热至95℃，保温l5min，冷却至55℃，自溶12小时，4000转/分钟离心，4倍量水，分两次洗涤残渣。
HCl调PH2.5，500nm孔径陶瓷膜过滤，9倍量水分3次加入水洗，截留液，碱性条件(pH8.0)，胃蛋白酶(用量：50mg/g干燥组织)于50℃酶解12小时，酶解液离心取清液，HCl调PH2.5，500nm孔径陶瓷膜过滤，30倍量水分10次加入水洗，加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为1.0mol/L)，HCl调PH6.5，加入3倍体积95％乙醇，静置24小时，离心，干燥得粗品。
HA(粗产品)按照1：30加水，同时加入溶液体积3％的高岭土50℃加热30分钟，离心，少许水洗涤残渣，离心，水液合并，放冷至0～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，离心，清液加入NaCl使溶液中NaCl的浓度为1.0mol/L，3倍量95％乙醇，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤产品各一次，重复醇沉一次。
Claims (2)
1.采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，其特征是：包括以下步骤
步骤一、选取取油后在-2℃或者-2℃以下冷冻保存的中国林蛙皮1000克，放入玻璃容器中，加中国林蛙皮10倍量的水浸泡20小时～28小时；
步骤二、将步骤一浸泡后的中国林蛙皮及其溶液全部注入高速组织捣碎机，以10000转/分钟～14000转/分钟的转速匀浆2分钟～3分钟，匀浆后成糊状；
步骤三、将步骤二得到的糊状物全部注入恒温磁力搅拌器中，搅拌加热至85℃～95℃后，保温5分钟～15分钟，冷却至45℃～55℃并保温、自溶12小时；
步骤四、将步骤三得到的糊状物全部注入离心机中，以4000转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；
步骤五、分别取离心后的残渣2倍量的水，洗涤离心后的残渣两次，将洗涤后的溶液与离心后的溶液混合；
步骤六、取HCl滴入步骤五得到的溶液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；
步骤七、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣3次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合，得到截留液；
步骤八、取NaOH溶液滴入步骤七得到的截留液中，调PH值至7.5～8.5，取每克含活性蛋白酶40mg～50mg的胃蛋白酶，40克～50克加入到碱性的截留液，保持温度45℃～50℃，酶解小时8小时～12小时，得到酶解液；
步骤九、将步骤八得到的酶解液全部注入离心机中，以3600转/分钟离心，取上清液；
步骤十、取HCl滴入步骤九得到的上清液中，调PH值至1.7～3.3，用500nm孔径的陶瓷膜过滤，得到过滤后的溶液和过滤后的残渣；
步骤十一、分别取过滤后的残渣3倍量的水，洗涤过滤后的残渣10次，并将洗涤后的水与过滤后的溶液混合；
步骤十二、将步骤十一得到的溶液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，滴入HCl调PH值至6.5，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，以3600转/分钟离心，于真空干燥箱中60℃干燥24小时，得到透明质酸HA粗品；
步骤十三、按照HA粗品与水的比例1：30向将步骤十二得到的HA粗品中加水，同时加入溶液体积3％的高岭土，50℃加热30分钟，进行脱色，以3600转/分钟离心，得到离心后的溶液和离心后的残渣；
步骤十四、按照离心后的残渣与水的比例1：1，加水洗涤步骤十三得到的离心后的残渣，将洗涤后的水以3600转/分钟离心，将离心后的水溶液与步骤十三得到的离心后的溶液混合，放置冷却至0℃～4℃，加入三氯醋酸饱和溶液，使溶液中三氯醋酸浓度达到8％，静置半小时后，以3600转/分钟离心，取上清液；
步骤十五、将步骤十四得到的上清液，加入NaCl，使溶液中NaCl的浓度为0.1mol/L～1mol/L，加入本溶液体积3倍的95％乙醇进行洗脱，静置24小时，用布氏漏斗抽滤，得到的滤液依次用95％乙醇、无水乙醇各洗涤一次进行醇沉，得到透明质酸HA精品。
2.根据权利要求1所述的采用膜过滤法从中国林蛙皮中分离提取透明质酸的方法，其特征是：所述步骤一、步骤五、步骤七、步骤十一和步骤十四中使用的水均为无菌蒸馏水。
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