CN101698683A - 从林蛙油中提取多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从林蛙油中提取多糖的方法，通过林蛙油用水发制、Co60辐照、乙醇醇沉、有机脱肽液脱多肽和DEAE层析柱层析纯化；这样有利于多糖的提取，有利于多糖与蛋白质之间连接断开，有利于肽段与多糖的分离，有利于提高多糖的纯度，且提取过程对多糖的生物活性影响较少，多糖提取率可以达到34％，多糖的纯度可以达到98.26％；因此本发明是一种多糖提取率较高，提取的多糖纯度较高、生物活性较好的从林蛙油中提取多糖的方法。

Description

从林蛙油中提取多糖的方法
技术领域
本发明涉及多糖的提取，具体涉及从林蛙油中提取多糖的方法。
背景技术
林蛙油俗称田鸡油、哈什蟆油、蛤蚂油，系蛙科动物中国林蛙雌蛙的输卵管经采制干燥得到。主要含有蛋白质、水分、糖类(包括多糖)、脂肪，还有蛙醇、胆固醇、磷脂、维生素、脂肪酸、人体必需的10种氨基酸、微量元素及激素等，多糖是林蛙油的重要成分之一，具有抗衰老、抗氧化、提高免疫及抗肿瘤等多种生物功效。目前，提取多糖的常用方法有热水浸提法、稀酸浸提法、稀碱浸提法和酶解法等。热水浸提法提取效率不高；用稀酸浸提时，要求时间短、温度低，条件控制不好易使多糖发生降解；稀碱提取，虽然可以提高多糖的得率，但对多糖的生物活性有很大影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种多糖提取率较高，提取的多糖纯度较高、生物活性较好的从林蛙油中提取多糖的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：从林蛙油中提取多糖的方法，包括下述步骤：
1)发制：在每克林蛙油中加入100～150ml去离子水，搅拌后在40～55℃温度条件下发制9～12小时，得到发制液；发制后糖蛋白被水包围，有利于提取，使多糖的提取率得到提高；
2)辐照：将上述发制液装入塑料袋中并封口，然后用照射剂量为10～15Kgy的Co60辐照该塑料袋，得到辐照液；用10Kgy以上辐照基本上可以使糖与蛋白质之间连接断开，让蛋白质分子断裂为肽段，断链效果优于酶解法、酸或碱浸提法，且对多糖的生物活性影响较小；
3)醇沉：按体积比2∶1在上述辐照液中加入浓度为95％的乙醇醇沉，离心过滤得到沉淀物；
4)脱肽：按重量比1∶50在上述沉淀物中加水溶解配成水溶液，按体积比4∶1比例由氯仿和正丁醇配成有机脱肽液，脱多肽方法为按体积比5∶2在所述水溶液中加入所述有机脱肽液，振荡20～40min，静置让水溶液与有机脱肽液分层，取上层的水溶液重复上述用有机脱肽液脱多肽方法，脱多肽4～5次后脱肽完毕，最后取得上层的水溶液为多糖溶液；用该有机脱肽液经4～5次脱肽，一般能把断开的肽段与多糖分离，使多糖纯度提高；
5)纯化：将上述多糖溶液用二乙氨乙基纤维素(DEAE)-52层析柱层析，层析后用水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/L的NaCl溶液依次梯度洗脱，混合各次洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩后，用去离子水透析36小时除去洗脱液中NaCl，然后真空干燥洗脱液得到多糖；纯化使多糖的杂质降低，多糖的纯度较离。
与现有技术相比，本发明的优点在于从林蛙油中提取多糖的方法，通过林蛙油用水发制、Co60辐照、乙醇醇沉、有机脱肽液脱多肽和DEAE层析柱层析纯化；这样有利于多糖的提取，有利于多糖与蛋白质之间连接断开，有利于肽段与多糖的分离，有利于提高多糖的纯度，且提取过程对多糖的生物活性影响较少，多糖提取率可以达到34％，多糖的纯度可以达到98.26％。因此本发明是一种多糖提取率较高，提取的多糖纯度较高、生物活性较好的从林蛙油中提取多糖的方法。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例
从林蛙油中提取多糖的方法，在每克林蛙油中加入100～150ml去离子水，搅拌后在40～55℃温度条件下发制9～12小时，得到发制液，将发制液装入塑料袋中并封口，然后用照射剂量为10～15Kgy的Co60辐照该塑料袋，得到辐照液，对辐照液进行光谱分析，只有-OH的官能团的特征峰，说明蛋白质断链效果明显，按体积比2∶1在辐照液中加入浓度为95％的乙醇醇沉，离心过滤得到沉淀物，按重量比1∶50在沉淀物中加水溶解配成水溶液，然后按体积比5∶2在水溶液加入有机脱肽液(4氯仿∶1正丁醇配制)，振荡20～40min，静置让水溶液与有机脱肽液分层，取上层的水溶液重复用有机脱肽液脱多肽，脱多肽4～5次后脱肽完毕，最后取得上层的水溶液为多糖溶液，多糖溶液用色谱或核磁分析，有三个组份的多糖，主要组份由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖和半乳糖组成；将多糖溶液用DEAE-52层析柱层析，层析后用水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/L的NaCl溶液依次梯度洗脱，混合各次洗脱液，洗脱液用旋转蒸发仪减压浓缩后，浓缩程度可以根据各技术人员习惯，以目测到合适的透析浓度即可，用去离子水透析36小时除去洗脱液中NaCl，然后真空干燥洗脱液得到多糖；用蒽酮-硫酸法检测多糖含量，多糖提取率可以达到34％，多糖的纯度可以达到98.26％。

Claims (1)

1.从林蛙油中提取多糖的方法，其特征在于包括下述步骤：
1)发制：在每克林蛙油中加入100～150ml去离子水，搅拌后在40～55℃温度条件下发制9～12小时，得到发制液；
2)辐照：将上述发制液装入塑料袋中并封口，然后用照射剂量为10～15Kgy的Co60辐照该塑料袋，得到辐照液；
3)醇沉：按体积比2∶1在上述辐照液中加入浓度为95％的乙醇醇沉，离心过滤得到沉淀物；
4)脱肽：按重量比1∶50在上述沉淀物中加水溶解配成水溶液，按体积比4∶1比例由氯仿和正丁醇配成有机脱肽液，脱多肽方法为按体积比5∶2在所述水溶液中加入所述有机脱肽液，振荡20～40min，静置让水溶液与有机脱肽液分层，取上层的水溶液重复上述用有机脱肽液脱多肽方法，脱多肽4～5次后脱肽完毕，最后取得上层的水溶液为多糖溶液；
5)纯化：将上述多糖溶液用二乙氨乙基纤维素(DEAE)-52层析柱层析，层析后用水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/L的NaCl溶液依次梯度洗脱，混合各次洗脱液，洗脱液减压浓缩后用去离子水透析36小时除去洗脱液中NaCl，然后真空干燥洗脱液得到多糖。
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