CN104138393A - 一种增强免疫功能的林蛙卵提取物制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种林蛙卵多糖提取物的制备方法及其在增强免疫方面的应用。其特征是以林蛙卵为原料，用酶解法提取林蛙卵多糖，过滤或离心后的溶液，用3倍体积无水乙醇进行醇沉后，得到沉淀为多糖提取物，将其冷冻干燥或者烘干，制成浸膏或干粉。而乙醇液在40℃以下回收。林蛙卵多糖对离体小鼠脾脏具有不同程度促进小鼠淋巴细胞转化的作用，且呈现较好的量效关系，在浓度为0.001μg/mL仍有较强的促进淋巴细胞转化作用。在小鼠体内实验中，林蛙卵多糖样品在促淋巴细胞转化方面效果较明显。在对小鼠血清中细胞因子影响方面，林蛙卵多糖对血清中TNF-α和IL-1β产生量的影响具有显著变化。可用于制备免疫性药物，也可作为食品添加剂使用。本发明的提取方法以及提取物溶剂不限制于实验例和实施例中所提到的。

Description

一种增强免疫功能的林蛙卵提取物制备方法

技术领域

本发明涉及一种林蛙卵提取物，属于中药技术和医药应用领域，涉及林蛙卵提取物的制备方法及其对免疫机能的作用。 

背景技术

中国林蛙^[1]（R. t. chensinensis），按分类学来讲，属两栖纲、无尾目、蛙科、林蛙属。地方上俗称田鸡、哈什蟆，我们从形态上观察中国林蛙，它头部扁平，可看到是黑褐色和黑色的体色，体表粗糙，60-80mm为其普遍身体长度，个别个体存在不同。另一特点呈现“背褶在额部呈折状”，可观察到背褶有多处黑色斑点,背部扰上也有此特点，另外观察鼓膜发现，存在大的三角形黑色斑点，黑色横条纹体现在肢体背面，我国东北是林蛙的主产区。Li Ang等人^[2]得出结论，认为林蛙主要分布在我国北方。产自长白山的林蛙在质量最优，与其他林蛙相比，无论是营养价值还是药用价值,均占首位。林蛙是我国特有的药食两用的经济动物之一,并且保健功能卓越^[3] 。并且在美容方面功效较好，带动了林蛙产业发展。中国林蛙被认为是R．temporaria 的亚种^[4]。后来吴政安(1981)提升为种^[5]。谢锋等(1999)^[6]用分类学方法和数质分类学方法相结合。研究结果是：北方人们所称的哈士蟆，原来是生活在东北的居群——中国林蛙，是我国的蛙类的一新记录，称为东北林蛙R. dybowskii。但是，《中华人民共和国药典》（2010版）仍然标注为R. t. chensinensis。分类学上的争议虽没有结束，但是，并不影响林蛙的开发和利用。林蛙专门以昆虫类为其主要食物。林蛙产品是"纯绿色食品"，是具有滋阴补肾、健脑益智、平肝养胃、延缓衰老、 滋补健壮和提高免疫力等的最佳进补良药之一。中国林蛙的蛋白质含量最多，还存在糖类、18种氨基酸以及多种维生素和激素类^[7][8]等。山哈，收录于《本草纲目》中，就是如今的中国林蛙。 

多糖在我们的生活环境中起到很大的作用，在陆地上普遍存在于动物、菌物和植物中，在海洋生物中存在也较为普遍，植物多糖最贴近于我们得生活（如人参多糖、石斛多糖、刺五加多糖等）。动物多糖则主要分为四类，其中以肝素为主，其余分别为硫酸软骨素、透明质酸、甲壳质（如林蛙油多糖、鹿茸多糖、鲍鱼多糖、壳聚糖等）。总之多糖是构成生命不可或缺的重要组成部分，多糖是一类由多个单糖组成，是高分子化合物。自从上世纪50年代多糖受到医药界的广泛关注，经过众多的临床实验和药理实验证明，多糖拥有较高的药用价值和较好的药理活性作用，并被广泛的应用到保健食品药品中去。无论是动、植物多糖还是微生物多糖，基本都拥有提高机体免疫力、抗氧化和抗衰老、抗疲劳、降血脂、抗肿瘤和保肝等药理作用。 

提到林蛙卵，多数人会想起林蛙卵油，它是林蛙卵重要的研究成分，目前研究较广，而林蛙卵多糖却少有研究。林蛙卵多为剖取林蛙油后的副产品，产量也较大。因此，对林蛙卵的活性成分进行深入研究具有一定的资源学意义。林蛙卵成分复杂，含有水分、多糖、蛋白质、磷脂类、氨基酸、脂肪酸、多种微量元素等基本成分。碱法作为提取多糖的方法之一。刘晓丹^[54]等得出了减法的提取工艺，得到林蛙卵团胶状物粗多糖，其含量可达24.01mg/g。张小勇等^[55]运用ICP-MS法，测定出林蛙卵中含有多种丰富的微量元素。这对今后的开发具有重要的应用价值。从林蛙卵中检测到的 脂肪酸主要是，有硬脂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸和亚油酸。有报道称而油酸和亚油酸^[56]则是降血脂的主要基础物质。刘磊^[57]和李政^[58]等学者，分别采用HPLC法测定林蛙卵中磷脂含量和等离子光谱法测定林蛙卵中微量元素的含量。结果显示：林蛙卵中含有多种人体必须微量元素以及磷脂，可能起到防治高血压的作用。 

近年来经研究发现，林蛙卵具有在医药、保健品领域开发的潜力，是又一新型原料，更可充分提高林蛙资源的利用率。林蛙卵在抗肿瘤、抗惊厥、抗疲劳、抗氧化，降血脂和治疗肝损伤等方面具有显著效果。有关学者^[59]将林蛙卵酶解后，进行了体内药理实验，证明林蛙卵可以缓解疲劳症状。张肃等^[60],将林蛙卵蛋白分为三个剂量组别，高剂量组效果明显，抗疲劳效果最好。芦红艳等^[61]的研究表明，林蛙卵酶解液对去卵巢大鼠的高血脂症状有改善作用，并能很好的抑制肝细胞损伤，因此林蛙卵在预防心脑血管疾病方面有待开发。还有学者^[62]-[63]通过大鼠（高脂模型）的血清进行TC、TG、HDL-C和LDL-C的测定，也说明了林蛙卵具有调节血脂的效果。在对肝损伤模型小鼠的肝脏和血清等指标的测定中，林蛙卵油可降低肝损伤效果。林蛙卵油有保护肝脏的效果^[64]。有研究认为林蛙卵核糖核酸酶具有免疫调节的能力^[65]。由此可见林蛙卵具有很好的开发价值，并为保健食品药品的研发提供了基础。 

基于以上研究，本实验研究林蛙卵多糖提取物对小鼠免疫功能的影响，发现林蛙卵多糖在免疫调节方面具有很好的疗效。因此，林蛙卵在增强机体免疫力方面有着重要的开发和应用价值。 

发明内容

本发明提供了该林蛙卵多糖提取物的制备方法，其特征在于： 

准确称取林蛙卵干粉分别加入一定量的蒸馏水放入摇床中100r/min浸泡2h后取出,调节所需pH值。加入酶试剂,放到摇床中，100r/min，在55℃下酶解,之后在沸水浴中加热 10min灭酶活性,5000r/min离心10min，去除沉淀，取其上清液，用Sevage法除蛋白,倒入分液漏斗中充分震荡20-30min，静置,待其分层后，将其上下层分别进行9000r/min离心15min，取其上清液混合，加入3倍体积无水乙醇进行醇沉，低温静置过夜,第二天9000r/min离心15min,取沉淀干燥, 即得林蛙卵多糖提取物。 

本发明的积极效果在于：本发明提供了一种具有增强机体免疫力的林蛙卵提取物。该提取物具有显著的调节机体免疫力的作用。 

本发明提供了该林蛙卵提取物的提取制备方法，适用于工业化生产。 

本发明可以以单一或组合物的形式通过口服给药方式施用于免疫力低下的患者。也可以制备成片剂、软胶囊剂、胶囊剂等。 

本发明的施药量可根据给药途径及组合情况，患者年龄、体重、疾病和患病程度等而变化。 

实验例 1 林蛙卵提取物中多糖含量的测定 

1 材料 

中国林蛙将林蛙处死后，剖取林蛙卵烘干，粉碎过80目筛，存于干燥处。林蛙卵提取物（实验室自制）。其他化学试剂（分析纯）：北京化工厂。 

2．仪器 

3 方法 

精确称取葡萄糖10mg,定容到100mL容量瓶当中，分别取1mL，2mL，3mL，4mL, 5mL，6mL,7mL,8mL标品，依次定容到10mL容量瓶中,分别吸取2mL于试管中，加入6%苯酚1mL,再加入5mL浓硫酸,摇匀,加热30min（沸水浴上），取出待冷却后。在490nm处测量吸光度值。计算回归方程, Y=14.998X+0.0009   R2=0.9987。 

多糖提取率=(提取物中所含多糖质量/原料质量)×100% 。                        

式中：提取物中所含多糖质量由标准曲线计算得出。 

4 结果 

本次试验采用酶解法对林蛙卵进行处理，其最佳提取工艺条件是:料液比1:20（g/mL）,木瓜蛋白酶加酶量为7%，pH6.0,酶解时间为2.5 h, 在此条件下多糖提取率为2.67%。 

实验例 2 林蛙卵提取物的免疫活性测定 

1 实验材料 

林蛙卵多糖样品，ICR 小鼠（20 ± 2 g，吉林大学实验动物中心提供），RPMI 1640培养基（GIBCO），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），刀豆蛋白A（ConA，SIGMA），脂多糖（LPS，SIGMA），噻唑蓝（MTT，SIGMA），DMSO（SIGMA），96孔板（GREINER），IL-1β、TNF-α试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂均为分析纯。 

2 方法 

2.1淋巴细胞转化实验方法 

2.1样品溶液制备：精密称取20mg样品，PBS溶解，配制浓度为5mg /mL，低温保存，备用。用前以培养液稀释至所需浓度，0.22μm滤膜过滤除菌。 

2.2 淋巴细胞转化实验：BALB/C 小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次（离心1000rpm，5min），置于RPMI 1640完全培养液中，配成浓度为2×10⁶的细胞悬液，加入96孔培养板中，设定空白组、阴性对照组、阳性对照组、样品组（6个浓度，分别为0.001、0.01、0.1、1.0、10、100 μg/mL），每组3个复孔，除空白组外每孔加100μL细胞悬液，空白组加入培养液，置培养箱中1h后取出。阴性对照组和阳性对照组加培养液100μL，样品组加不同浓度样品溶液100μL，阳性对照组加50μg/ml ConA 10μL，置37℃，5% CO₂孵箱中培养48h，加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h，取出培养板，2000rpm，离心10min，小心吸去上清液，加入150μL  

DMSO，充分溶解结晶，酶标仪490nm测定各孔OD值。结果用转化率表示， 

计算公式如下：   

转化率 =（样品孔OD值－空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。 

2.2 林蛙卵多糖对正常小鼠免疫功能影响的试验方法 

2.1 动物实验  雄性ICR小鼠70只，体重18-22g，根据体重随机分为7组，每组10只，按照0.1mL/10g体重给药，对照组灌胃0.1%CMC溶液，给药组的高中低剂量组分别灌胃给予林蛙卵多糖春、秋样品80、40、20mg/kg，连续灌胃给药14天，每周称量体重，期间小鼠自由进食和饮水。 

在给药后第7天和第14天每组各处理一半数量的小鼠，摘除眼球取血，分离血清，低温保存备用，先摘取脾脏，然后取胸腺，分别称重，其中取脾需无菌操作：颈椎脱臼法处死小鼠，喷75%乙醇消毒，置超净台内无菌纸上，左腹侧朝上。在小鼠左腹侧中部剪开小口，剪开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏。在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子轻提起脾脏，分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏，称重后放入盛有Hanks 液的培养皿中，Hanks 液洗两次，置RPMI 1640完全培养液中。轻轻研压脾脏，用镊子梳刮，尽量避免将脾脏弄成碎片，待脾细胞全部游离出来后，将细胞悬液吸出，200目筛网滤过至离心管中。镜下细胞计数，稀释至浓度为2×10⁶的脾细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔100μl，设3个复孔。空白孔和自然转化孔加培养液100μl，ConA刺激孔加入浓度为5.0μg/mL ConA 100μL，LPS刺激孔加入浓度为10.0μg/mLLPS 100μL。置 37℃，5% CO₂饱和湿度二氧化碳培养箱中培养48h，加入5.0mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h，取出培养板，2000rpm，离心10min，小心吸去上清液，加入150μl DMSO，震荡，充分溶解结晶，酶标仪比色，490nm测定各孔OD值。结果用转化率表示，计算公式如下：  

转化率 =（样品孔OD值－对照孔OD值）/（对照孔OD值－空白孔OD值）×100%。 

2.2  ELISA法测定血清中IL-1β、TNF-α  按照ELISA试剂盒说明书操作  

2.2.1 配液 按倍比稀释法将试剂盒中原倍标准品溶液用标准品稀释液稀释成浓度为80、40、20、10、5ng/L的标准品溶液，备用；将浓缩洗涤液按倍数用蒸馏水稀释成1×稀释液，用作孔板洗涤液。 

2.2.2 加样 空白对照孔只加入显色剂A、显色剂B和终止液，其余操作步骤与其他孔相同；标准品孔加入各不同浓度的标准品溶液 50 μL，链霉亲和素-HRP 50μL（标准品中已事先整合好生物素抗体，所以不需要加入）；样品孔加入样本40 μL，抗IL-1β抗体 10 μL，链霉亲和素-HRP 50μL。  

2.2.3 温育 将加好样品及试剂的孔板盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育 

60分钟。 

2.2.4 洗涤 取出孔板，小心揭掉封板膜，弃去液体，在滤纸上拍干，每孔加 

满洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。 

2.2.5 显色 每孔先加入显色剂 A 50μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色 10分钟。 

2.2.6 终止 每孔加入终止液 50 μL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。 

2.2.7 测定  酶标仪450nm 测定各孔吸光度（OD值），测定应在加终止液 

后10分钟内进行。 

2.2.8 计算  根据标准品溶液的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线 

回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。  

    测定TNF-α与IL-1β操作方法基本相同，只是相关试剂不同。 

3 结果 

3.2.1 离体小鼠脾淋巴细胞转化率 

春、秋季节林蛙卵多糖具有不同程度促进小鼠淋巴细胞转化的作用，且呈现较好的量效关系，秋季林蛙卵多糖在浓度为0.001μg/mL时，仍有较强的促进淋巴细胞转化作用，提示上述两种样品均可能具有促进机体免疫功能的作用，两组之间并无显著性影响。见附图1， 

3.2.2 林蛙卵多糖对小鼠体重及脏器系数等的影响  

给小鼠灌服林蛙卵多糖2周，各组体重增加，与对照组相比并没有显著的变化。而脾脏和胸腺重量及脏器系数都有明显升高趋势，但与对照组比较并无显著性变化（p>0.05），结果见附图2,表1,2。 

表1. 林蛙卵多糖对小鼠脾脏系数的影响（ ） 

注：与对照组比较，^* p<0.05    相同给药剂量，春秋样品比较，  p>0.05 

表2. 林蛙卵多糖对小鼠胸腺系数的影响（ ） 

注：与对照组比较，^* p<0.05  

    相同给药剂量，春秋样品比较， p>0.05 

3.2.3 林蛙卵多糖对小鼠淋巴细胞转化的影响  

对淋巴细胞转化的影响实验分三组进行：第一组脾细胞自然转化，不加刺激剂；第二组加入ConA刺激T细胞转化；第三组加入LPS刺激B细胞转化。结果表明，小鼠灌胃林蛙卵多糖1-2周，能明显促进脾淋巴细胞 的转化，在不加刺激剂的情况下，各给药组的细胞转化率与对照组比较，均具有极显著性差异（表4，p<0.001），加入刺激后，转化率大幅度增加，各组与未加刺激剂对照组比较均具有极显著性差异（p<0.001，表格中未标注），与各组未加入刺激剂孔比较，仍具有不同程度的显著性差异，见附图3,4,5。 

3.2.4 林蛙卵多糖对小鼠血清中细胞因子IL-1β及TNF-α的影响   

ELISA法测定血清中IL-1β及TNF-α，结果表明，春季林蛙卵多糖样品给药1周时，血清中两种细胞因子的含量与对照组比较没有显著性差异，给药2周时，血清中细胞因子含量与对照组比较具有极显著性差异，提示春季林蛙卵多糖样品在小鼠体内经过1周以上的时间，对细胞因子的生成产生显著影响。与春季林蛙卵多糖样品比较，秋季林蛙卵多糖样品发挥作用时间较早，在给药1周时，即对细胞因子的生成产生显著影响，结果见附图6,7。 

4 附图说明 

附图1小鼠脾淋巴细胞在不同浓度作用下的转化率 

（林蛙卵多糖对离体小鼠脾淋巴细胞转化率的影响） 

注：与阴性对照组比较* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001 

附图2  林蛙卵多糖对小鼠体重的影响 

注：与对照组比较 p>0.05    

附图3  林蛙卵多糖对小鼠脾细胞自然转化的影响 

注：与对照组比较 ^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001 

附图4  林蛙卵多糖对小鼠T淋巴细胞转化的影响 

注：与各组未加刺激剂比较， ^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001 

附图5  林蛙卵多糖对小鼠B淋巴细胞转化的影响 

注：与各组未加刺激剂比较， ^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001 

附图6  林蛙卵多糖对小鼠血清中IL-1β的影响 

注：与对照组比较， ^*p<0.05，^**p<0.01 

附图7  林蛙卵多糖对小鼠血清中TNF-α的影响 

注：与对照组比较， ^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001 

5 具体实施例 

实施例1  林蛙卵多糖的制作方法：准确称取林蛙卵干粉分别加入一定量的蒸馏水放入摇床中100r/min浸泡2h后取出,调节所需pH值。加入酶试剂,放到摇床中，100r/min，在55^。C下酶解,之后在沸水浴中加热 10min灭酶活性,5000r/min离心10min，去除沉淀，取其上清液，用Sevage法除蛋白,倒入分液漏斗中充分震荡20-30min，静置,待其分层后，将其上下层分别进行9000r/min离心15min，取其上清液混合，加入3倍体积无水乙醇进行醇沉，低温静置过夜,第二天9000r/min离心15min,取沉淀干燥, 即得林蛙卵多糖，通过苯酚硫酸法测定多糖含量为2.67%. 

实施例2林蛙卵多糖胶囊 

取实施例1林蛙卵多糖粉末（过80-200目筛），装入胶囊，每粒含林蛙卵多糖一定比例。其他要求符合《中华人民共和国药典》2010版有关胶囊剂的相关规定。 

实施例3林蛙卵多糖片剂 

取实施例1林蛙卵多糖粉末（过80-200目筛）一定量，环糊精20g，干燥淀粉适量，羧甲基纤维素适量，混匀，制粒压片，制得片剂重0.50g。其他要求符合《中华人民共和国药典》2010版有关片剂的相关规定。 

实施例4林蛙卵多糖泡腾片剂 

取实施例1林蛙卵多糖（过80-200目筛）一定量，加入赋形剂适量，混合均匀，造粒压片，制成泡腾片。其他项目符合《中华人民共和国药典》 2010版有关泡腾片的相关应用。 

实施例5林蛙卵多糖浓缩丸剂 

取实施例1林蛙卵多糖粉末（过80-200目筛）一定量，环糊精20g，羧甲基纤维素适量，混匀，粉碎，纯净水，泛制成丸。其他要求符合《中华人民共和国药典》2010版有关丸剂的相关规定。 

实施例6林蛙卵多糖颗粒剂 

取实施例1林蛙卵多糖粉末（过80-200目筛）一定量，可溶性淀粉200g，糖粉适量，硬脂酸镁3g，混匀，制颗粒，复合铝塑袋分装，装量5.0g/袋。其他要求符合《中华人民共和国药典》2010版有关颗粒剂的相关规定。 

Claims (4)

1.一种增强免疫功能的林蛙卵多糖提取物及其制备方法具体方法：称取林蛙卵干粉分别加入一定量的蒸馏水放入摇床中100r/min浸泡2h后取出,调节所需pH值。加入酶试剂,放到摇床中，100r/min，在55℃下酶解,之后在沸水浴中加热10min灭酶活性,5000r/min离心10min，去除沉淀，取其上清液，用Sevage法除蛋白,倒入分液漏斗中充分震荡20-30min，静置,待其分层后，将其上下层分别进行9000r/min离心15min，取其上清液混合，加入3倍体积无水乙醇进行醇沉，低温静置过夜,第二天9000r/min离心15min,取沉淀干燥,即得林蛙卵多糖提取物。 

2.根据权利要求1，林蛙卵多糖提取物中含有多糖含量为2.67%。 

3.根据权利要求1，林蛙卵多糖对离体小鼠脾脏具有不同程度促进小鼠淋巴细胞转化的作用，且呈现较好的量效关系，在浓度为0.001μg/mL仍有较强的促进淋巴细胞转化作用。在小鼠体内实验中，林蛙卵多糖样品在促淋巴细胞转化方面效果较明显。在对小鼠血清中细胞因子影响方面，林蛙卵多糖对血清中TNF-α和IL-1β产生量的影响具有显著变化。 

4.根据权利要求1，所得的林蛙卵多糖具有增强机体免疫力的效果。林蛙卵多糖可用于制作增强免疫力的药物。