CN100487064C

CN100487064C - 鱿鱼墨黑色素的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN100487064C
Application number: CNB2006101462910A
Authority: CN
Inventors: 王静凤; 薛长湖; 陈士国; 李兆杰; 王玉明; 薛勇; 逄龙; 雷敏
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2006-12-22
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2026-12-22
Also published as: CN100999616A

Abstract

一种鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于取鱿鱼墨汁，加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调pH至5.0-10.0；在搅拌下，加酶水解12-24h，酶解温度为35-70℃，90-100℃加热终止反应；用酸液调pH至1.0-5.0，3000-5000xg室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。制得的产品纯度为30%-99%，提取率为6%-19.9%。本发明所用的原料丰富易得，黑色素含量极高，工艺步骤简单，设备投资少，无环境污染，产品得率高。该物质可用于制备抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂的保健食品或药品。

Description

鱿鱼墨黑色素的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种鱿鱼墨黑色素的制备方法及其应用。

背景技术

黑色食品正走俏全球。黑色素是目前所知的唯一保护生物体免受辐射伤害的天然内源生物聚合体，具有抗氧化、促进免疫功能、促进骨髓造血和防止衰老等功能。目前，天然黑色素主要来源于植物的黑色叶子和果实、乌骨鸡和动物毛发以及产黑色素的微生物。不同来源的黑色素，其生理功效存有差异。动、植物来源的黑色素制备工艺主要是采用浓酸水解方法，此法存在水解条件剧烈，易损伤黑色素形态和化学结构，且产品得率较低等缺点。尤其是，近年来疯牛病、禽流感等疾病的不断出现，动物来源的黑色素在应用方面受到了极大限制，寻找其它黑色素原料成为当务之急。

鱿鱼为软体动物门、头足纲、枪乌贼科海产动物。据报道，全世界鱿鱼的年捕捞量达400万吨，我国是全世界捕捞量最高的国家之一。在鱿鱼的加工过程中，大多数加工厂将鱿鱼墨囊废弃，造成环境污染。鱿鱼墨囊主要成分为黑色素和蛋白多糖复合体，鲜墨汁中黑色素的含量约为20％，属于真黑色素，是一类吲哚醌的聚合体。九十年代伊始，日本学者发现鱿鱼墨具有高效抗肿瘤活性(Sasaki J，etal，J Nutr Sci Vitaminol，1997，43(4)：455)，并从中分离出有效成分肽聚糖(Takaya Y，et al，Biol Pharm，1994，17(6)：846)。目前，对鱿鱼墨蛋白多糖、肽聚糖等活性物质的提取方法和应用已进行了大量研究，并已申请发明专利(CN1672691A)，但尚未见鱿鱼墨黑色素的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鱿鱼墨黑色素的制备方法，克服现有制备方法和所用原料的上述缺点；制得的鱿鱼墨黑色素在生产抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂保健食品、或功能食品或药品中的能得到应用。

一种鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于取鱿鱼墨汁，加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调pH至5.0—10.0；在搅拌下，加酶水解12—24h，酶解温度为35—70℃，90—100℃加热终止反应；用酸液调pH至1.0—5.0，3000-5000×g室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。

本发明以海洋鱿鱼墨汁为原料，利用酶解结合离心的方法除去与黑色素结合的蛋白质、粘多糖和脂类物质，制备出高纯度的鱿鱼墨黑色素，采用的原料丰富易得，黑色素含量极高，并具有步骤简单、设备投资少、无环境污染、产品得率高等优点，适于工业化生产。

具体实施方式

将冻藏的北太平洋鱿鱼墨囊在室温下解冻，用清水洗4次，除去表面杂物，挤压墨囊，取鱿鱼墨汁。称取1Kg鱿鱼墨汁，加入2Kg蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布过滤，除去墨腺和墨囊内膜等杂质。用NaOH水溶液调pH至7.2，在搅拌下，加入10g木瓜蛋白酶，于60℃水浴摇床酶解20h。90-100℃下加热10min终止反应，用酸液调pH至4，3300×g室温下离心20min，收集沉淀。将沉淀物用10倍重量的蒸馏水反复洗涤、4500×g离心，至洗涤液呈中性后，真空冷冻干燥，得鱿鱼墨黑色素182g。经分析，纯度为86.2％。

本实施例中，所述的北太平洋鱿鱼可改为秘鲁鱿鱼、赤鱿、阿根廷鱿鱼或新西兰鱿鱼，均能得到类似的效果。通过本发明制备的黑色素纯度为30％—99％，提取率为鱿鱼墨汁的6％—19％。

本发明制备方法中所述的NaOH可改用NaHCO₃或KOH，调pH值为5—10；所述木瓜蛋白可改用碱性蛋白酶或中性蛋白酶，酶用量为鱿鱼墨汁重量的0.5—5.0％，酶解时间为12-24h，酶解温度为35—70℃；所述的用酸调节pH为1.0—5.0，所述的酸为盐酸或醋酸；所述的离心力为3000-5000×g。

本发明制得的鱿鱼墨黑色素可作为抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂的保健食品及相关药物的活性成份，根据保健及治疗需要，与食用及药用辅料制成各种制剂。

下面对本发明制得的鱿鱼墨黑色素的抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂作用作进一步描述：

一.鱿鱼墨黑色素的药效学研究：

1.通过体外、体内实验证明，制得的鱿鱼墨黑色素具有显著的抗氧化、降血脂活性。体外实验采用鲁米诺发光系统测定了黑色素对羟基自由基与超氧阴离子自由基的清除活性。结果表明，上述鱿鱼墨黑色素能够显著清除羟基自由基与超氧阴离子自由基，其IC₅₀分别为0.015mg/mL和0.2mg/mL；体内实验采用高脂饲料建立的高脂血症模型大鼠证明。将Wistar大鼠随机分为6组，第1—2组分别为正常和模型对照组，均灌胃生理盐水(0.1ml/10g.bw)；第3组为阳性对照组，灌胃烟酸肌醇酯100mg/kg；第4—6组为鱿鱼墨黑色素组，分别灌胃50、100、200mg/kg，1次/d，连续30d；末次灌胃后24h，腹动脉收集血液，分离血清。剥离肝脏，制备肝匀浆。分别测定血清血脂水平、血清和肝脏中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)。结果见表1、表2，鱿鱼墨黑色素能显著预防高脂饲料诱导的脂质代谢紊乱和高过氧化水平，显著降低大鼠血清总胆固醇TC、甘油三酯TG和低密度脂蛋白胆固醇LDL-c含量，升高高密度脂蛋白胆固醇HDL-c含量，显著减少血清及肝组织中MDA含量，提高抗氧化酶SOD活性。表明鱿鱼墨黑色素具有抗氧化、降血脂和预防动脉粥样硬化形成的作用。

表1 鱿鱼墨黑色素对对高脂血症大鼠血脂水平的影响(n＝8，x±s)

注：^△P<0.01与正常对照组比较；^*P<0.01与模型对照组比较

表2 鱿鱼墨黑色素对高脂血症大鼠血清和肝脏MDA含量，SOD活性的影响(n＝8，x±s)

注：^△P<0.01与正常对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型对照组比较：

2.采用免疫低下模型小鼠证明，鱿鱼墨黑色素具有显著的免疫调节作用。将雄性Balb/c小鼠随机分为6组，第1—2组分别为正常和模型对照组，均灌胃生理盐水(0.1ml/10g.bw)；第3组为阳性对照组，灌胃左旋咪唑20mg/kg；第4—6组为鱿鱼墨黑色素组，分别灌胃25、50、100mg/kg；1次/d，连续30d，末次灌胃后24h，进行免疫指标测定，结果见表3。表中数据表明，鱿鱼墨黑色素能够显著促进免疫低下小鼠的抗体生成水平、迟发性变态反应和巨噬细胞吞噬能力，能广泛激活机体的特异性和非特异性免疫机能。100mg/kg鱿鱼墨黑色素的作用与20mg/kg剂量左旋咪唑的作用相当。

表3 鱿鱼墨黑色素对小鼠的特异性和非特异性免疫机能的调节作用(n＝10，x±s)

注：^△P<0.01与正常对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型对照组比较

3.采用骨髓造血损伤模型小鼠证明，鱿鱼墨黑色素具有显著的促进骨髓造血功能。用100、300和900mg/kg鱿鱼墨黑色素分别灌胃环磷酰胺和γ⁶⁰Co辐射所致骨髓造血损伤模型小鼠，结果见表4、表5。结果表明，鱿鱼墨黑色素对骨髓损伤模型小鼠的骨髓有核细胞(BMNC)、造血干细胞(CFU-S)、粒单系祖细胞(CFU-GM)和外周血WBC数量的减少具有显著的拮抗和促进恢复作用。其作用途径与增强机体抗氧化能力、调节机体的免疫机能、促进小鼠的粒系造血有关。

表4 鱿鱼墨黑色素对环磷酰胺所致骨髓造血损伤模型小鼠的作用结果(n＝10，x±s)

表5 鱿鱼墨黑色素对γ⁶⁰Co辐射所致骨髓造血损伤模型小鼠的作用结果(n＝10，x±s)

注：^△P<0.01与正常对照组比较；^*P<0.05，^**P<0.01与模型对照组比

二.鱿鱼墨黑色素的安全性实验

ICR小鼠一次性灌服不同剂量的鱿鱼墨黑色素(0.464、1.00、2.15、4.64g/kg)，14d后，各剂量组动物均无死亡，且无任何行为异常，体重无明显增长，血常规、肝、肾功各项检查，无明显差别，动物脏器的病理组织学检查无异常，表明鱿鱼墨黑色素无毒副作用和无累积毒性。

三.鱿鱼墨黑色素的稳定性

本发明制备的鱿鱼墨黑色素在常温下保存12-18个月，其生物活性无明显降低。

在动物的药效学、安全性及稳定性实验的基础上，对本发明制备的鱿鱼墨黑色素又进一步作了人体试验。

四.鱿鱼墨黑色素的人体试验

分别将干海参、鲍鱼粉粹，粒径大小为80—120目，将按本发明制备的鱿鱼墨黑色素与海参、鲍鱼粉粒混合，其中，鱿鱼墨黑色素所占重量百分比为50％—99％，在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。

1)鱿鱼墨黑色素制品具有调节免疫和促进造血作用

选取免疫低下(易患感冒、感染)并伴随外周白血细胞数量低下的患者30人，男女各半，年龄分布在18至69岁。其中，15人食用上述鱿鱼墨黑色素胶囊，另15人食用安慰剂(淀粉)作为对照组。食用方法：饭后服用，每次服用量为1—3g，2次/d，连续服用30d。效果如下表所示：

该应用结果初步证明，本发明的鱿鱼墨黑色素具有机体调节免疫和促进骨髓的粒系造血作用。

2)鱿鱼墨黑色素制品具有辅助降血脂作用

选取高血脂患者40人，男女各半，年龄分布在35至75岁，血清总胆固醇水平为6.8—10.2mmol/L，血清甘油三酯水平为2.5—9.6mmol/L。患者口服鱿鱼墨黑色素胶囊，服用方法为饭后服用，每次服用量为1—3g，3次/d。经30d连续服用后，受试人群的血清总胆固醇含量为5.5—8.0mmol/L，血清甘油三酯水平为1.94—5.8mmol/L。该应用结果证明，本发明制得的鱿鱼墨黑色素具有辅助降血脂作用。

Claims

1.一种鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于取鱿鱼墨汁，加入蒸馏水搅拌、洗涤，用粗滤布除去杂物后，用碱液调pH至5.0—10.0；在搅拌下，加酶水解12—24h，酶解温度为35—70℃，90—100℃加热终止反应；用酸液调pH至1.0—5.0，3000-5000×g室温下离心收集沉淀；所得沉淀物经蒸馏水反复洗涤、离心，至洗涤水为中性，真空冷冻干燥。

2.按权利要求1所述鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于所述的鱿鱼为北太平洋鱿鱼、秘鲁鱿鱼、赤鱿、阿根廷鱿鱼或新西兰鱿鱼。

3.按权利要求1所述鱿鱼墨黑色素的制备方法，其特征在于所述的酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶，酶用量为鱿鱼墨汁重量的0.5—5.0％。

4.权利要求1所述的鱿鱼墨黑色素在制备抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂的保健食品中的应用。

5.权利要求1所述的鱿鱼墨黑色素在制备抗氧化、免疫调节、促进造血或降血脂的药物中的应用。