CN112625462B - 一种从墨鱼汁中提取黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及色素提取工艺领域,具体涉及一种采用酶从墨鱼汁中提取黑色素的方法。具体为将墨鱼汁过滤去除杂质,烘干或冷冻干燥获得粉末,用酶提取黑色素的方法。采用本发明方法所得到的墨黑色素提取率高,纯度好。方法操作简单、环保高效、适合墨鱼汁中提取高纯度黑色素的规模化操作。
Description
技术领域
本发明涉及色素提取工艺领域,具体涉及一种采用酶从墨鱼汁中提取黑色素的方法。
背景技术
黑色素是广泛存在于自然界中的一类重要的天然色素,主要分布于动物、植物和微生物中。黑色素是由多羟基吲哚或多羟基苯酚聚合而成的一类结构复杂多样的大分子物质,常与蛋白质等物质结合,存在于细胞中。自然界中普遍存在着的动物黑色素包括两类,一类是真黑色素,另一类是脱黑色素。不同物种的黑色素具有不同的差异。墨鱼学名也叫乌贼,墨囊墨汁中的黑色素主要是真黑素。真黑素是由酪氨酸氧化形成的两分子吲哚结构,即DHI(5,6-二羟基吲哚)和DHICA(5,6-二羟基吲哚酸),因此黑色素具有水不溶,但碱溶、酸不溶的性质。近年来,墨鱼在加工工程中通常会将墨囊丢弃,从而在资源中造成了浪费,但研究发现墨囊中的墨汁具有抗氧化、抗辐射、吸收紫外线以及减轻糖尿病并发症等活性,对黏膜损伤具有一定修复作用。
我国海洋资源领域中乌贼资源丰富多饶,并且每年加工废弃的墨囊的丢弃和未充分利用在一定程度也对周遭加工环境及生产带来困扰。为此,如何利用黑色素这一资源,变废为宝成为一个热点话题;并且提取和纯化黑色素技术需要广泛应用,以更好对墨黑色素的活性进行更广的探索。
现阶段针对不同对象的提取方法有多种,主要有酸沉提取、碱提酸沉提取、超声提取以及酶提取黑色素。但是酸或碱处理会改变并破坏黑色素的超微结构;超声处理对黑色素产生物理结构的破坏,黑色素微球颗粒会在超声过程中发生爆炸,产生更为细小的碎片和碎末;这些物理结构的变化必然会对后续活性产生重要影响。与之相比,酶法提取能够较好的保证黑色素结构的完整性,采用酶提黑色素的方法时由于酶切位点的对色素识别的特异性和温和性能够最好的保护色素结构不发生变化,从而更好的发挥其生物活性。另一方面,原料对最后获得的提取物质种类(真黑素或脱黑素)也是有重要影响的,这就会影响到后续的区分。因此需要能够获得高完整性、高纯度、且能够获得单一降解产物的提取方法。
发明内容
本发明在于提供一种利用我国丰富墨鱼资源中的墨鱼汁,对其提取黑色素的方法。
所述乌贼墨汁来源的乌贼种类为针乌贼﹑金乌贼﹑枪乌贼﹑无针乌贼中的一种或几种。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种从墨鱼汁中提取黑色素的方法,将墨鱼汁过滤去除杂质,烘干或冷冻干燥获得粉末,用酶提取黑色素的方法。
所述墨鱼汁粉末溶于碱性溶液中,加入酶,放置于40-60℃的水浴锅中浸提3-5h,将酶提产物以6000r·min-1进行离心10min,离心后,去除上清液,沉淀用蒸馏水水洗并离心,重复操作,收集沉淀进行冷冻干燥,获得墨黑色素,4℃冰箱保存;所述酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的一种或几种。
所述墨鱼汁粉末为墨鱼汁在40-60℃烘干干燥或冷冻干燥处理后获得粉末。
所述墨鱼汁粉末与碱性溶液固液比为1-3:100,酶量为6万-18万U/g。所述碱性溶液为pH值9-11的NaOH或KOH的水溶液,浓度为10-5-10-3mol/L。
所述提取后经溶解后通过HPLC进行分析。
所述提取后黑色素溶解于1.0mol/LNaOH水溶液中,并在室温用H2O2充分混合48h后,将混合物用5%Na2S2O4处理,用85%H3PO4调至pH 4,然后通过0.45μm FP30过滤并通过HPLC分析。
所述采用本发明方法对黑色素的提取率为88.3%,纯度为91.15%。
本发明所具有的优点:
1.与传统的酸沉黑色素以及碱提酸沉黑色素提取方法相比,采用本发明方法黑色素提取率高,纯度高。该方法操作简单、环保高效、适合墨鱼汁中提取高纯度黑色素的规模化操作。
2.酸或碱处理会改变并破坏黑色素的超微结构;超声处理对黑色素产生物理结构的破坏,黑色素微球颗粒会在超声过程中发生了爆炸,产生更为细小的碎片和碎末。而采用本发明方法分离出的黑色素颗粒比酸和碱提取的黑色素更均匀完整,保留完整性。
3.本发明从墨汁中提取黑色素时采用具有特定选择性的酶,即黑色素提取具有一定的匹配度,通过不同酶提取黑色素的提取率来看在特定的条件下以及特定碱性蛋白酶,其提取率效果最好。
附图说明
图1为黑色素标准品、酶提黑色素以及碱提黑色素的红外光谱图;其中,图1-1黑色素标准品红外色谱图、图1-2酶解提取黑色素红外色谱图、图1-3碱液提取黑色素红外色谱图。
图2为黑色素标准品、酶提黑色素以及碱提黑色素的紫外最大吸收波长扫描图;其中,图2-1标准品紫外最大吸收波长扫描、图2-2酶提黑色素紫外最大吸收波长扫描、图2-3碱提黑色素紫外最大吸收波长扫描。
图3为黑色素标准品、酶提黑色素以及碱提黑色素的高效液相色谱图;其中,图3-1标准品黑色素HPLC色谱分析、图3-2酶解黑色素HPLC色谱分析、图3-3碱提黑色素HPLC色谱分析图。
图4为黑色素标准品(图4-1)、酶提黑色素(图4-2)以及碱提黑色素(图4-3)产品图。注:酶提黑色素和碱提黑色素的产品图为直接冻干产品,未进行研磨等任何方式处理。
图5为碱性蛋白酶提取的黑色素(图5-1)、中性蛋白酶提取的黑色素(图5-2)以及风味蛋白酶提取的黑色素的红外光谱图(图5-3)。
图6为本发明实施例提供的酶提黑色素所得电镜图(图6-1),碱提黑色素所得电镜图(图6-2)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明,并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
采用碱提酸沉法提取黑色素,称取墨鱼汁粉末5.0g,按照1:10-50(g/mL)的固液比加入0.5-2.5mol/L的NaOH溶液,放置在30-70℃的水浴锅中浸提1-3h后,8000r·min-1离心10min,取上清液,用6.00mol/L的HCl溶液调节pH值为1-3,静置后,10000r·min-1离心15min,取沉淀水洗,15000r·min-1离心5min,重复操作3次,将沉淀冷冻干燥,计算提取率(参见表1-5)。
表1NaOH浓度对黑色素提取率的影响
NaOH浓度(mol/L) | 提取克数(g) | 提取率(%) |
0.5 | 0.8609 | 17.22 |
1.0 | 1.1299 | 22.60 |
1.5 | 0.7293 | 14.59 |
2.0 | 0.6327 | 12.65 |
2.5 | 0.3467 | 6.93 |
注:固液比为1:20,温度50℃,碱提时间2h,pH值1.50
表2温度对黑色素提取率的影响
温度(℃) | 提取克数(g) | 提取率(%) |
30 | 0.9056 | 18.11 |
40 | 0.9527 | 19.05 |
50 | 1.5652 | 31.30 |
60 | 1.4493 | 28.99 |
70 | 1.4472 | 28.94 |
注:NaOH浓度1.0mol/L,固液比为1:20,碱提时间2h,pH值1.50
表3碱提时间对黑色素提取率的影响
碱提时间(h) | 提取克数(g) | 提取率(%) |
1.0 | 0.7438 | 14.88 |
1.5 | 0.8285 | 16.57 |
2.0 | 1.0741 | 21.48 |
2.5 | 0.8925 | 17.85 |
3.0 | 0.8358 | 16.72 |
注:NaOH浓度1.0mol/L,固液比1:20,温度50℃,pH值1.50
表4固液比对黑色素提取率的影响
固液比 | 提取克数(g) | 提取率(%) |
1:10 | 0.1849 | 3.70 |
1:20 | 0.5350 | 10.70 |
1:30 | 0.8884 | 17.77 |
1:40 | 0.5522 | 11.04 |
1:50 | 0.1451 | 2.90 |
注:NaOH浓度1.0mol/L,碱提温度50℃,时间2h,pH值1.50
表5酸沉pH对黑色素提取率的影响
注:NaOH浓度1.0mol/L,固液比1:20,温度50℃,时间2h
根据表1-5,碱提酸沉提取法的单因素最佳条件,进行了碱提酸沉的响应面分析,结果如表6-7。
表6碱提响应面优化因素
因素 | A | B | C |
内容 | NaOH浓度(mol/L) | 碱提固液比 | 碱提时间(h) |
水平值 | 0.5、1.0、1.5 | 1:20、1:30、1:40 | 4、4.5、5 |
表7碱提响应面优化分析结果
试验号 | 因素A | 因素B | 因素C | 提取率% |
1 | -1 | -1 | 0 | 13.77 |
2 | -1 | 0 | -1 | 13.34 |
3 | -1 | 1 | 0 | 13.99 |
4 | 0 | -1 | 1 | 14.96 |
5 | 0 | 1 | -1 | 15.12 |
6 | 1 | 1 | 0 | 15.20 |
7 | -1 | 0 | 1 | 13.80 |
8 | 1 | 0 | 1 | 14.54 |
9 | 1 | 0 | -1 | 14.40 |
10 | 0 | 1 | 1 | 15.56 |
11 | 1 | -1 | 0 | 14.29 |
12 | 0 | -1 | -1 | 14.74 |
13 | 0 | 0 | 0 | 16.76 |
14 | 0 | 0 | 0 | 16.54 |
15 | 0 | 0 | 0 | 16.75 |
16 | 0 | 0 | 0 | 16.87 |
17 | 0 | 0 | 0 | 16.88 |
由表6和7可知响应面优化分析获得最终提取条件为:
固液比为1:32,加入的NaOH浓度为1.065mol/L,于50℃水浴锅内碱提2h后,取上清液进行酸沉,调整pH值为2.05后,10000r·min-1离心15min,取沉淀水洗,15000r·min-1离心5min,重复水洗离心3次,将沉淀冷冻干燥,黑色素的提取率可以达到16.82%。
实施例2
原料预处理与实施例1中相同,获得干燥墨鱼汁粉末。以碱性蛋白酶提取黑色素为例。
墨鱼汁粉末与pH值在9-11的碱性溶液按照固液(g/ml)比1:3-100的比例混合后,加入碱性蛋白酶,加酶量6万-18万U/g,在40-60℃进行酶解3-5h,反应后以6000r·min-1进行离心10min,离心后,去除上清液,沉淀用蒸馏水水洗离心,重复操作3次,得黑色素沉淀放置于-80℃超低温冷冻冰箱中冷冻,置于真空冷冻干燥机中冻干得到黑色素粉末。冻干完成后,计算提取率(参见表8-12),4℃冰箱保存备用。
表8碱性蛋白酶加酶量对黑色素提取率的影响
注:固液比2:100,酶解温度50℃,时间4h,pH值10.3
表9固液比对黑色素提取率的影响
固液比 | 提取克数(g) | 提取率(%) |
1:100 | 0.5804 | 96.73 |
2:100 | 0.5232 | 87.20 |
3:100 | 0.4691 | 78.18 |
4:100 | 0.4381 | 73.02 |
5:100 | 0.4696 | 78.27 |
注:碱性蛋白酶加酶量12万U/g,酶解温度50℃,时间4h,pH值10.3
表10酶解温度对黑色素提取率的影响
酶解温度(℃) | 提取克数(g) | 提取率(%) |
30 | 0.5029 | 83.82 |
40 | 0.4937 | 82.28 |
50 | 0.5413 | 90.22 |
60 | 0.4708 | 78.47 |
70 | 0.4205 | 70.08 |
注:固液比2:100,碱性蛋白酶加酶量12万U/g,时间4h,pH值10.3
表11酶解时间对黑色素提取率的影响
酶解时间(h) | 提取克数(g) | 提取率(%) |
3.0 | 0.4346 | 72.43 |
3.5 | 0.4655 | 77.59 |
4.0 | 0.4974 | 82.90 |
4.5 | 0.5302 | 88.37 |
5.0 | 0.5064 | 84.40 |
注:固液比2:100,碱性蛋白酶加酶量12万U/g,酶解温度50℃,pH值10.3
表12pH值对黑色素提取率的影响
pH值 | 提取克数(g) | 提取率(%) |
9.0(10<sup>-5</sup>mol/L) | 0.4332 | 72.20 |
9.5(10<sup>-4.5</sup>mol/L) | 0.4571 | 76.18 |
10.0(10<sup>-4</sup>mol/L) | 0.4572 | 76.20 |
10.5(10<sup>-3.5</sup>mol/L) | 0.4666 | 77.77 |
11.0(10<sup>-3</sup>mol/L) | 0.4563 | 76.05 |
注:固液比2:100,碱性蛋白酶加酶量12万U/g,酶解温度50℃,时间4h
根据表8-12,酶提黑色素的单因素分析最佳条件,进行了酶提黑色素的响应面分析,如表13-14。
表13酶提响应面优化因素
因素 | A | B | C |
内容 | 碱性蛋白酶量(万U/g) | 酶提固液比 | 酶提时间(h) |
水平值 | 9、12、15 | 0.5:100、1:100、1.5:100 | 4、4.5、5 |
表14酶提黑色素响应面优化分析结果
由上述表13和14可知,响应面优化分析获得最终提取条件为:
固液比为1.55:100,加入碱性蛋白酶含量为12.3万U/g后,调整溶液pH值为10.5,在水浴锅中温度50℃中酶提4.5h。10000r·min-1离心提取10min后水洗重复离心一次,去掉上清液,得到黑色素沉淀放置于-80℃超低温冷冻冰箱中冷冻后,置于真空冷冻干燥机中冻干得到黑色素粉末。在此条件下,黑色素的提取率可以达到88.30%,远远高于碱提(实施例1结果)黑色素的提取率。
由上述不同方式提取获得最佳提取条件确定后,通过HPLC对不同方法提取的黑色素的纯度进行了检测,如表15。
表15不同提取方法对黑色素提取率和纯度的影响
由表15可知,通过实施例2所得黑色素的提取率和纯度都得到了大幅度提高。
实施例3提取的黑色素的验证研究
1、将上述实施例提取所得黑色素以及标准品进行红外光谱分析:
分别称取充分研磨后的购买标准品样品、酶提黑色素样品、以及碱提黑色素样品,置放在清洁的圆盘中央,旋转压紧样品,使用傅里叶变换红外光谱仪分别检测样品红外光谱图。(参见图1-1,1-2,1-3)
2、将上述实施例提取所得黑色素以及标准品进行紫外最大吸收波长扫描:
紫外-可见吸收光谱具有高度的专一性,即一定结构的分子吸收的能量是一定的,通过研究大分子紫外-可见吸收光谱的变化可判断其结构的变化。用100ml的10%NaOH溶解0.01g墨黑色素,以10%NaOH溶液为空白,在190~600nm下进行紫外可见光谱扫描,确定标准品、酶法提取的黑色素以及碱提法提取的黑色素特征吸收峰。(参见图2-1,2-2,2-3)。
3、将上述实施例提取所得黑色素以及标准品进行HPLC分析:
分别对标准品、酶提黑色素、碱提黑色素称取10mg溶解于1.0mol/LNaOH水溶液(2.0mL)中,并在室温用1.5%H2O2(终浓度)充分混合处理来制备合适的样品。48h后,将混合物用5%Na2S2O4(400μL)处理,用85%H3PO4调至pH 4,然后通过0.45μm FP30过滤并通过HPLC分析。使用具有PAD检测器的安捷伦泵,进行190-600nm全波长扫描。使用的分析柱HS C18是250×4,6mm,填充5μm。制备流动相,将1%甲酸水溶液混合至pH 2.8(用NaOH水溶液)和甲醇(97:3)v/v,流速为1.0mL/min;每次分析时间设置为10min。将水/甲醇(80:20)v/v混合物用于柱洗涤。(参见图3-1,3-2,3-3)
4、黑色素标准品、酶提黑色素样品以及碱提黑色素样品干燥后样品图,酶提黑色素和碱提黑色素的样品图未经研磨等任何方式处理。(参见图4-1,4-2,4-3)以及酶提黑色素样品与碱提黑色素样品扫描电镜图(参见图6-1,6-2)。
由上述图1-4可见,黑色素标准品、酶解提取、碱液提取的黑色素都具有典型的吲哚环结构,并且最大吸光值都在210 nm处,证明提取物质为黑色素。相同浓度的不同提取方法的黑色素之间含量有差异,但是降解后经过HPLC分析出峰时间一致,在3.1min左右出峰;以标准品的含量为100%,通过峰面积之间的比值可以得出含量,酶提黑色素的纯度优于碱提黑色素的纯度。从酶提黑色素(图4-2)、碱提黑色素(图4-3)与标准品样品(图4-1)对比来看,酶提方法获得的黑色素更加细腻,而碱提黑色素样品有明显颗粒感。
由图6可见,酶提方法(图6-1)获得的样品表面更加光滑与饱满,证明酶提黑色素方法温和,能够保持黑色素颗粒的完整性;碱提方法(图6-2)获得的样品表面沟壑纵横,受到破坏与结构不完整性。
实施例4其他酶提取黑色素的效果
参照实施例3的提取技术,对墨鱼汁粉末选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶酶提黑色素进行了研究,通过响应面分析后最佳提取率见表16。通过红外光谱对三种酶提取黑色素的结构进行了比对,发现所提取产物均为黑色素,红外光谱中有典型的吲哚环结构,见附图5-1,5-2,5-3。
表16不同酶对黑色素的提取率
酶种类 | 碱性蛋白酶 | 中性蛋白酶 | 风味蛋白酶 |
提取率(%) | 88.30 | 64.70 | 73.80 |
由表16可知,碱性蛋白酶提取效果最佳,其次为风味蛋白酶,中性蛋白酶较弱,但提取效果均显著优于碱提酸沉的方法。
Claims (5)
1.一种从墨鱼汁中提取黑色素的方法,其特征在于:将墨鱼汁过滤去除杂质,烘干或冷冻干燥获得粉末,用酶提取黑色素的方法;
具体为墨鱼汁粉末溶于碱性溶液中,加入酶,放置于40-60℃的水浴锅中浸提3-5h,将酶提产物以6000 r·min-1进行离心10min,离心后,去除上清液,沉淀用蒸馏水水洗并离心,重复操作,收集沉淀进行冷冻干燥,获得墨黑色素,4℃冰箱保存;所述酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶的一种或几种;
碱性溶液为NaOH或KOH的水溶液,浓度10-5-10-3mol/L。
2.按权利要求1所述的墨鱼汁中提取黑色素的方法,其特征在于:所述墨鱼汁粉末为墨鱼汁在40-60℃烘干干燥或冷冻干燥处理后获得粉末。
3.按权利要求1所述的墨鱼汁中提取黑色素的方法,其特征在于:墨鱼汁粉末与碱性溶液固液比为1-3:100,酶量为6万-18万U/g。
4.按照权利要求1所述的墨鱼汁中提取黑色素的方法,其特征在于:所述提取后经溶解后通过HPLC进行分析。
5.按照权利要求4所述的墨鱼汁中提取黑色素的方法,其特征在于:所述提取后黑色素溶解于1.0mol/L NaOH水溶液中,并在室温用H2O2充分混合48 h后,将混合物用5%Na2S2O4处理,用85%H3PO4调至pH 4,然后通过0.45 μm FP30过滤并通过HPLC分析。
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