CN101503721A - 一种蚌肉多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蚌肉多糖的提取方法，所述方法是以蚌肉斧足部分为原料，经碱提-离心-酶解-离心-超滤-活性炭去色素-醇沉-干燥，得到较高纯度的蚌肉多糖。本发明的有益效果主要体现在：利用本发明方法，加工而成的蚌肉多糖不仅外观漂亮而且纯度高，具有较好的保健功能和一定的药用功能，无毒性，安全性高，而且制备工艺成熟，设备投资少，利于工业化生产，在食品、药品和保健品领域具有广阔前景。

Description

一种蚌肉多糖的提取方法

(一)技术领域

本发明目的是提供一种蚌肉多糖的提取方法。

(二)背景技术

珍珠的价值高贵，给山下湖人民带来了巨大的财富。而生产珍珠的蚌在育完珍珠后却顿时失色，被人抛弃。除了一小部分被利用起来外，大部分被废弃后造成了环境污染。其实，蚌肉有很高的利用价值，如果可以将其利用起来，不仅可以解决环境污染问题，而且可以转化为一笔财富，形成良性循环。

蚌肉多糖，作为蚌肉的提取物，它具有蚌肉特有的清热、解毒、护肝的功效。另外蚌肉多糖是一种生物活性大分子，是人体皮肤真皮层重要组成成分，许多多糖在皮肤新陈代谢过程中具有突出的调节作用，还有其优异保湿功能可作为一种理想的天然保湿因子，适合于不同肤质、气候、环境下使用。蚌肉多糖还能改善皮肤生理条件，为真皮胶原蛋白和弹性纤维合成提供优越的外部环境，加强营养物质供给，起到护肤养颜的效果。另外，蚌肉多糖还可阻止细胞中一些酶的产生，减少自由基形成，在防止自由基破坏细胞结构和引起肌肤衰老方面起着重要作用。因此，如果蚌肉多糖作为食品使用，不仅有清热、解毒、护肝等方面的作用，另外还可以达到增湿保湿、嫩肤抗衰老和抗皱消炎等功效。另外近年来随着人们对蚌肉多糖的深入研究发现，蚌肉多糖在人体生命医学方面也有着广泛的前景。

目前市场只有少量蚌肉多糖产品，但其纯度较低，外观较差，市场占有率不高。其提取工艺主要包括水提醇沉等物理化学处理方法，此类工艺多应用于中药提取等方面，工艺设备都比较成熟，但由于对蚌肉多糖的性质不够了解，在工艺方面缺乏合理有效的组织运用，以及未能将合适的高新技术应用于蚌肉多糖的提取，故未能生产出高质量的蚌肉多糖产品。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高纯度、安全、卫生的蚌肉多糖的提取方法。

本发明采用的技术方案是：

一种蚌肉多糖的提取方法，所述方法是以蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣为原料，在pH8.0～9.0、60～90℃条件下于碱水环境(所述碱水环境，是指本领域常规的碱水溶液，如NaOH，KOH，NH₄OH等的水溶液)中提取2～5小时，冷却，离心，取上清液加入0.15～1.5AU/kg肉渣的碱性蛋白酶或复合蛋白酶并调节pH7～8，于50～60℃水浴中酶解10～18小时，酶解结束后离心，取上清液超滤、活性炭脱色、浓缩、醇沉、沉淀干燥，即得到所述蚌肉多糖。中国专利CN200810060318.3已有蚌肉多糖的提取方法介绍，本发明与之最大的区别点在于：本发明只采用了富含蚌肉多糖的斧足部分，并采用碱提而非热水抽提，从根本上提高了提取率，降低了生产成本，且引入了超滤、脱色等手段进一步提高了产品的纯度。

具体的，所述方法包括如下顺序步骤：

(1)取蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣，加入质量为肉渣质量2～5倍的水，调pH至8.0～9.0，置于60～90℃水浴中加热2～5小时，冷却，离心，取上清液1进行下一步操作；经实验发现，蚌肉斧足部分多糖含量高，而其他部分多糖含量少，因此考虑提取成本，本发明选用斧足部分作为原料；本发明于60～90℃下进行碱提，有利于防止多糖分解，进一步提高了提取率；另外，采用离心分离，进一步提高了固液分离效果且有利于产业化；

(2)上清液1于50～60℃水浴中加入0.15～1.5AU/kg肉渣的碱性蛋白酶或复合蛋白酶于pH7～8条件下酶解10～18小时后，调节pH至等电点，离心，取上清液2进行下一步操作；超滤膜孔径为0.001～0.02μm，用于分离大分子溶质，所述超滤流出液排放，截留液可以重复进行超滤操作，最后得到截留液为浓缩液。

(3)上清液2超滤，取浓缩液于50～60℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.1～1.0％的活性炭，保温搅拌10～30分钟，离心去除活性炭；

(4)经活性炭处理的浓缩液加入体积为经活性炭处理的浓缩液体积1～4倍的体积浓度70～95％的乙醇溶液醇沉10～24小时，取沉淀干燥、粉碎，即为所述蚌肉多糖。

优选的，所述步骤(1)中，以质量浓度1～10％的NaOH或KOH溶液调pH值为8.0～9.0。所述步骤(2)中，以质量浓度1～10％的HCl或NaOH溶液调pH值。

具体的，所述方法按如下顺序步骤进行：

(1)取蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣，加入质量为肉渣质量4倍的水，以质量浓度5％的NaOH溶液调pH至9.0，置于90℃水浴中加热3小时，冷却，离心，取上清液1进行下一步操作；

(2)上清液1于55℃水浴中加入0.5AU/kg肉渣的复合蛋白酶于pH＝7的条件下酶解15小时后，调节pH至等电点，离心，取上清液2进行下一步操作；

(3)上清液2超滤，取截留液重复超滤1～3次，得到浓缩液于55℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.3％的活性炭，保温搅拌20分钟，离心去除活性炭；

(4)经活性炭处理的浓缩液加入体积为经活性炭处理的浓缩液体积3倍的体积浓度95％的乙醇溶液醇沉12小时，取沉淀干燥、粉碎，即为所述蚌肉多糖。

优选的，所述蚌肉来自三角帆蚌(Hyriopsis cum ingii)。

按本发明方法，得到蚌肉多糖产品的多糖含量为90％以上，蛋白质含量≤3％，灰份≤1％，性状为白色无异味粉末，分子量范围130万～270万。

本发明的有益效果主要体现在：利用本发明方法，加工而成蚌肉多糖不仅外观漂亮而且纯度高，具有较好的保健功能和一定的药用功能，无毒性，安全性高，而且制备工艺成熟，设备投资少，利于工业化生产，在食品、药品和保健品领域具有广阔前景。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)将冷冻后的三角帆蚌蚌肉置于蒸煮锅内蒸煮解冻，10分钟后斧足部分即可与内脏团分离，取斧足部分绞碎，得到肉渣；

(2)取肉渣1kg添加4kg的水，以质量浓度5％的NaOH溶液调pH至9，置于90℃水浴锅内加热3小时，冷却后离心除去肉渣，留上清液；

(3)上清液在温度55℃左右的水浴锅内，加入0.5AU碱性蛋白酶(酶活2.5AU/g，诺维信生物技术有限公司)于pH＝7的条件下酶解15小时后，调节pH至等电点；

(4)离心除去部分蛋白质；将离心后的上清液通过孔径0.02μm的超滤膜，透过液排放，收集截留液，截留液重复超滤2次，得到浓缩液；

(5)浓缩液于55℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.3％的活性炭，保温搅拌20分钟，离心去除活性炭；

(6)经活性炭处理的浓缩液0.2L用0.6L的95％乙醇于冷藏箱(5℃)中醇沉12小时、沉淀烘干、粉碎，即得蚌肉多糖，为纯白色无异味粉末，经检测，其多糖含量为92.8％，蛋白质含量1.6％，灰份0.5％。

实施例2：

(1)将冷冻后的三角帆蚌蚌肉置于蒸煮锅内蒸煮解冻，10分钟后斧足部分即可与内脏团分离，取斧足部分绞碎，得到肉渣；

(2)取肉渣0.5kg添加1.5kg的水，以质量浓度3％的KOH溶液调pH至8.5，置于85℃水浴锅内加热4小时，冷却后离心除去肉渣，留上清液；

(3)上清液在温度60℃左右的水浴锅内，加入0.2AU碱性蛋白酶(酶活2AU/g，诺维信生物技术有限公司)于pH＝7.5的条件下酶解12小时后，调节等电点。

(4)离心除去部分蛋白质；将离心后的上清液通过孔径0.01μm的超滤膜，透过液排放，收集截留液，截留液重复超滤4次，得到浓缩液；

(5)浓缩液于50℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.5％的活性炭，保温搅拌30分钟，离心去除活性炭；

(6)经活性炭处理的浓缩液0.1L用0.4L的85％乙醇于冷藏箱(5℃)中醇沉15小时、沉淀烘干、粉碎，即得蚌肉多糖，为纯白色无异味粉末，经检测，其多糖含量为90.3％，蛋白质含量2.5％，灰份0.8％。。

实施例3：毒理性实验研究

将实施例1和实施例2得到的蚌肉多糖委托有关机构进行毒理安全性检测，结果如下：

1)、急性毒性：蚌肉多糖对雌、雄，大、小鼠经口MTD均大于20g/kg体重，属无毒性。

2)、微核试验：蚌肉多糖对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验检测为阴性。

3)、Ames试验：蚌肉多糖Ames试验检测结果为阴性。

4)、小鼠精子畸形试验：蚌肉多糖对小鼠精子畸形试验检测结果为阴性。

5)、90天喂养试验：试验期间未见动物出现中毒症状和体征，大体解剖及组织学观察也未见异常病理改变，对大鼠体重、进食量、食物利用率、血象、血生化等均无明显损害性影响。蚌肉多糖的大鼠90天喂养试验未观察到有害作用剂量为10.0g/kg体重。

通过以上试验结果可以看出，该工艺提取的蚌肉多糖无毒性、安全性高。

实施例4：生物活性实验研究

1)小鼠肝自发性脂质过氧化实验：小白鼠禁食18h，引颈法处死，迅速取出肝脏，用4℃下预冷的0.01mol/L PBS(pH为7.4)洗去表面残血，滤纸吸干。用玻璃匀浆器将肝脏制成10％的肝匀浆。取该匀浆1mL，加不同浓度的蚌肉多糖溶液(实施例1蚌肉多糖加去离子水配制)600uL，对照管不加样品，用PBS作空白，于37℃温育2h，加入20％三氯乙酸1mL终止反应，3500r/min离心10min，取上清液2mL加入0.67％硫代巴比妥酸(TBA)1mL，90℃水浴15min，取出后流水冷却。于532nm处测A值，以不加肝匀浆和样液为比色空白样(A0)，以加肝匀浆不加样品为对照样(Ai)，按下式计算脂质过氧化物(LPO)的清除率：LPO的清除率(％)＝(A0-Ai)/A0×100，实验结果见表1：

表1

 

蚌肉多糖浓度(mg/ml)	抑制率
		0	44％
1	52％
		2	61％
4	72％

小鼠肝自发性脂质过氧化实验结果表明：随着蚌肉多糖浓度的增加其抗脂质过氧化能力逐渐增强，且在一定浓度范围内呈现剂量效应关系，当蚌肉多糖浓度达到2mg/mL时抑制率达到61％，显示了较强的抗氧化能力，这对于细胞免受过氧化损伤，维持细胞正常生理功能具有积极意义。

2)多糖保肝活性试验：取50只健康小鼠(昆明种，体重18～22g)，雌雄各半，随机分为5组，每组10只。1～2组为给药高低剂量组(实施例2制得的蚌肉多糖)(给药按临床成人50g/50kg量折算为小鼠给药量，600mg/kg，800mg/kg体重)，3组为联苯双酯阳性对照组(200mg/kg，每丸1.5mg)，4组为CCl₄模型组，5组为空白组。正式实验前，所有动物禁食不禁水12h。从第二天开始，每天1次，连续灌药15天，空白组和模型组灌0.6mL的生理盐水，给药组灌同等体积的多糖，在最后一次灌药后1h，除空白组外，其余四组皮下注射0.5％的四氯化碳-花生油溶液(0.1mL/10g)，禁食12h后立即摘除眼球采血。3500r/min离心，取上清液。测定血清AST活力，结果见表2。

表2

 

组别	剂量(mg/kg)	AST	含量P
				空白对照组	/	140.0±36.93	/
CCl4组	/	852.0±182.00	<0.04△
				阳性对照组	200	321.0±66.1	<0.04▲
低剂量组	600	353.2±167.5	<0.04▲
				高剂量组	800	284.5±101.3	<0.04▲

注：△指与正常对照组比较；▲指与四氯化碳组比较

蚌肉多糖保肝活性实验结果表明：蚌肉多糖能够显著降低CCl₄诱导的肝损伤小鼠中升高的AST活性，其作用可能与抑制膜脂质的过氧化，维持肝细胞膜的完整性，从而产生保肝作用有关。

Claims (5)

1.一种蚌肉多糖的提取方法，所述方法是以蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣为原料，在pH8.0～9.0、60～90℃条件下于碱水环境中提取2～5小时，冷却，离心，取上清液加入0.15～1.5AU/kg肉渣的碱性蛋白酶或复合蛋白酶并调节pH7～8，于50～60℃水浴中酶解10～18小时，酶解结束后离心，取上清液超滤、活性炭脱色、浓缩、醇沉、沉淀干燥，即得到所述蚌肉多糖。

2.一种蚌肉多糖的提取方法，所述方法包括如下顺序步骤：

(1)取蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣，加入质量为肉渣质量2～5倍的水，调pH至8.0～9.0，置于60～90℃水浴中加热2～5小时，冷却，离心，取上清液1进行下一步操作；

(2)上清液1于50～60℃水浴中加入0.15～1.5AU/kg肉渣的碱性蛋白酶或复合蛋白酶于pH7～8条件下酶解10～18小时后，调节pH至等电点，离心，取上清液2进行下一步操作；

(3)上清液2超滤，取浓缩液于40～60℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.1～1.0％的活性炭，保温搅拌10～30分钟，离心去除活性炭；

(4)取步骤(3)所得经活性炭处理的浓缩液加入体积为经活性炭处理的浓缩液体积1～4倍的体积浓度70～95％的乙醇溶液醇沉10～24小时，取沉淀干燥、粉碎，即为所述蚌肉多糖。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，以质量浓度1～10％的NaOH或KOH溶液调pH值为8.0～9.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行：

(1)取蚌肉斧足部分绞碎后的肉渣，加入质量为肉渣质量4倍的水，以质量浓度5％的NaOH溶液调pH至9.0，置于90℃水浴中加热3小时，冷却，离心，取上清液1进行下一步操作；

(2)上清液1于55℃水浴中加入0.5AU/kg肉渣的复合蛋白酶于pH＝7的条件下酶解15小时后，调节pH至等电点，离心，取上清液2进行下一步操作；

(3)上清液2超滤，取截留液重复超滤1～3次，得到浓缩液于55℃水浴中加入质量为浓缩液质量0.3％的活性炭，保温搅拌20分钟，离心去除活性炭；

(4)取经活性炭处理的浓缩液加入体积为经活性炭处理的浓缩液体积3倍的体积浓度95％的乙醇溶液醇沉12小时，取沉淀干燥、粉碎，即为所述蚌肉多糖。

5.如权利要求1～4之一所述的方法，其特征在于所述蚌肉来自三角帆蚌(Hyriopsis cum ingii)。