CN109054435B - 一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，所述方法，包括如下步骤：(1)将骨膜组织粉碎、清洗、研磨；(2)研磨后进行酶解、离心得沉淀物；其中，所述的酶解方法为用蛋白酶K和DTT进行消化。本发明的方法能够从乌骨鸡骨膜中提取黑色素，并且提取率高于2.5％，其利用蛋白酶K和DTT降解蛋白、通过2％TritonX‑100溶液，通过PBS溶液和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来；操作简单，安全，耗时短，工作量小，提取率远远高于盐酸水解法，并且不会破坏黑色素的形态和化学结构。

Description

一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法

技术领域

本发明是属于生物提取技术领域，具体涉及一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法。

背景技术

乌骨鸡是我国特有药用鸡种，同时也是一种营养丰富的滋补食品。乌骨鸡区别于其他品种鸡的显著特征是其体内富含黑色。乌骨鸡的食用价值和药用价值在于体内的黑色素，其可以抵抗紫外线照射而引起皮肤的病变，具有清除自由基、抗氧化的功能，从而预防癌症、延缓衰老、提高生物体免疫力。提取乌骨鸡中的黑色素、研究其结构及生化功能有利于开发乌骨鸡的食用价值和药用价值，推动“黑色食品”的发展，对保健品、化妆品的开发利用具有理论指导作用。由于乌骨鸡中的黑色素常与蛋白质紧密结合，研究较难。因此采用一种提取乌骨鸡中黑色素的方法非常重要。

目前提取乌骨鸡黑色素的方法主要有：盐酸水解法以及双酶水解结合碱液去除蛋白酶法。目前的方法，主要是从乌骨鸡皮肤或者肌肉中提取黑色素。其中，盐酸水解法是通过用盐酸浸泡组织样、乙醚水浴脱脂，然后在抽滤装置上蒸馏水反复洗涤提取黑色素。盐酸水解法使用的盐酸浓度较高，酸解时间较长，会对黑色素外部形态和内部化学结构造成破坏，从而影响黑色素的生物学活性。而双酶水解结合碱液去除蛋白酶法步骤繁琐，所用的碱液对黑色素的生物学活性也有一定的影响。除此之外，鸡皮中因含大量的脂肪，且皮肤与肌肉黑色素沉积较少，因此皮肤和肌肉黑色素的提取量往往不多。

Bowers等(1988)的研究表明：黑素体的形成是两条控制路径相互协调的结果：即前黑素体的合成与分布以及酪氨酸与酪氨酸酶复合物相互作用的结果。前黑素体产生于细胞的滑面内质网,而粗面内质网合成酪氨酸酶，前黑素体在高尔基体完成组装后,包上一层囊泡运到黑色素体的复合物中，当囊泡接触到前黑素体膜时，酪氨酸酶起作用，黑色素聚合物即形成。因此，禽类的黑色素常与蛋白质牢固结合。Oetting W等(1985)发现这些蛋白质包括9种TPA(12-o-tetradecanoyl phorbol-13-acetate)敏感性的蛋白及酪氨酸酶。Muroya(2000)研究表明，乌骨鸡各组织中黑色素的沉积差异显著，依次为：骨膜>性腺(卵巢或睾丸)＝气管≥心脏、肝脏、腺胃、盲肠、肌肉(大胸肌和鸟喙骨)和皮肤。刘望夷(1982)、袁缨等(1993)对乌骨鸡黑色素的基本结构和特征研究表明，黑色素是一种以吲哚环为主体，其周围连接其他一些芳香或烯烃类及羧基等基团的化合物，乌骨鸡黑色素的EPR波谱为轻微不对称的典型的单线一次微商波谱，无超细结构。其报道与Reedy M V等(1998)、MuroyaS等(2000)的研究结果基本一致。Liu等研究利用扫描电镜观察到乌贼的黑色素的形态结构为圆形颗粒。盐酸水解法和双酶水解结合碱液除蛋白酶法都会多少破坏黑色素的形态和化学结构，并且对于黑色素的活性有影响，所以研究新的乌骨鸡黑色素的方法十分必要。

发明内容

为了克服现有技术中的问题，本发明提供一种用蛋白酶从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，该法能够有效地去除紧密结合在黑色素周围的蛋白质，并不会破坏黑色素的化学结构。

为此本发明的技术方案如下：

一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，包括如下步骤：

(1)将骨膜组织粉碎、清洗、研磨；

(2)研磨后进行酶解、离心得沉淀物；

其中，所述酶解的方法为用蛋白酶K和DTT(二硫苏糖醇)进行消化。

上述方法中，所述消化为利用1-5mg/ml的蛋白酶K溶液和100-200mg/ml的DTT溶液进行消化，所述消化的时间为7-12min。

上述方法中，所述消化方法中，例如可以选择1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml的蛋白酶K溶液；例如可以选择100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml、200mg/ml的DTT溶液进行消化。

上述方法中，所述消化的方法为：将研磨后的组织溶于PBS溶液中，加入DTT溶液，摇匀后加入蛋白酶K溶液和DTT溶液进行消化反应。

上述方法中，优选的，所述酶解的方法为用蛋白酶K和DTT消化两次。

上述方法中，所述酶解的方法为：将研磨后的组织溶按质量体积比1:10-30g/μl加入于PBS溶液中，然后加入DTT溶液，加入量按组织与DTT溶液的质量体积比为2.5-5:1g/μl计算；摇匀后加入蛋白酶K溶液以及DTT溶液，蛋白酶K溶液的加入量按组织与与蛋白酶K溶液的质量体积比为12.5-25:1g/μl计算，DTT溶液的加入量按组织与DTT溶液的质量体积比为2-5:1g/μl计算，然后进行消化反应，反应后离心、清洗、离心、沉淀重悬后加入蛋白酶K溶液和DTT溶液进行第二次消化反应。

上述方法中，所述方法还包括，酶解、离心后，将沉淀再次进行清洗和离心，方法为：将沉淀物悬浮于含有2％TritonX-100的PBS溶液中，摇匀，离心，清洗。

上述方法中，所述离心的方法为：转速为10000-15000rpm，时间为10-20min。

上述方法中，所述将骨膜组织粉碎、清洗的具体方法为：将骨膜组织剪成小块，除去污渍后离心，沉淀清洗后离心，得沉淀后再次清洗、离心，将沉淀悬浮于含有2％TritonX-100的PBS溶液中，再次离心、清洗得到沉淀，所述离心的方法为：转速为10000-15000rpm，时间为7-12min；所述清洗的方法为：用双蒸水和/或PBS溶液清洗，清洗1-6遍。

上述方法中，所述研磨的方法为在液氮中研磨至粉末状。

上述方法中，所述干燥的方法为：冷冻型干燥器干燥2-6h，干燥温度为-20到-70℃。

上述方法中，所述PBS溶液为pH为7.2-7.4的缓冲溶液。

与现有技术相比，本发明的方法具有以下优点：

(1)本发明的方法能够从乌骨鸡骨膜中提取黑色素，并且提取率高于2.5％，其利用蛋白酶K和DTT降解蛋白、2％TritonX-100溶液溶，通过PBS溶液和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来；操作简单，安全，耗时短，工作量小，提取率远远高于盐酸水解法(约0.3％)，并且不会破坏黑色素的形态和化学结构。

(2)本发明的方法与双酶水解结合碱液除蛋白酶法相比，只使用一种蛋白酶，步骤简单，操作容易，所用试剂温和，不会影响黑色素的生物学活性。

附图说明：

图1为乌骨鸡黑色素的高倍扫描电镜图像，图片的标尺为2um。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

实施例1从乌骨鸡骨膜中提取黑色素方法

乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体。用蛋白酶K和DTT降解蛋白，通过2％TritonX-100、PBS溶液和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来。

1、本实施例中所述使用的溶液：

本实施例中的蛋白酶K溶液为1mg/ml的蛋白酶K溶液，配置后分装，-20℃保存。

本实施例中的DTT溶液为100mg/ml DTT溶液，配置后，分装贮存于-20℃。

本实施例中的2％Triton X-100的PBS溶液中，PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存。

本实施例中所述PBS溶液的pH为7.2-7.4。

2、黑色素的提取

组织样的粉碎：

1)取50g的组织样剪成小块，用1500μl PBS溶液清洗除去血渍和其他污渍，13000rpm离心10min；

2)将离心后的沉淀物分别用1000μl双蒸水，1000μl PBS溶液清洗，13000rpm，离心10min；

3)重复上面2)的步骤；

4)将离心后的沉淀悬浮于500μl PBS溶液中，加入800μl 2％TritonX-100PBS溶液,13000rpm，离心10min，

5)沉淀用1300μl双蒸水清洗6遍，13000rpm，离心10min；

6)沉淀在液氮中用研钵研磨组织样至粉状。

组织样酶解：

1)将研磨后的沉淀溶于1500μl PBS溶液中，加入10μl DTT溶液，溶液室温下摇匀30min，然后加入2μl蛋白酶K溶液和15μl DTT溶液，50℃下反应5min，13000rpm，离心15min；

2)沉淀用1200μl双蒸水清洗4遍，13000rpm，离心15min；

3)沉淀悬浮于100μl PBS溶液中，加入2μl蛋白酶K溶液，15μl DTT溶液，50℃下反应2min，13000rpm，离心20min；

4)沉淀悬浮于100μl含有2％TritonX-100的PBS溶液中，室温下摇匀10min13000rpm，离心20min；

5)沉淀用1200μl双蒸水清洗6遍,13000rpm，离心20min；

组织样干燥：

将最后得到的黑色素沉淀用冷冻型干燥器干燥2h，称重后存于-20℃冰箱中。

3、检测

采集乌骨鸡骨膜样5份，利用上述的方法提取其黑色素，通过扫描电镜和透射电镜对其形态进行观察，并计算其提取率，检验该黑色素提取法的可靠性。本实验所采集的骨膜样来自于中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的乌骨鸡。

通过实验提取5只丝羽乌骨鸡5份骨膜样的黑色素，通过电镜扫描，扫描电镜图如图1所示，图片显示乌骨鸡黑色素是椭圆形或圆形的小颗粒，以椭圆形颗粒结构为主。检测结果显示，提取的物质是黑色素，计算提取率均在2.5％以上。

实施例2从乌骨鸡骨膜中提取黑色素方法

乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体。用蛋白酶K和DTT降解蛋白，通过2％TritonX-100、PBS溶液和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来。

1、本实施例中所述使用的溶液：

本实施例中的蛋白酶K溶液为5mg/ml的蛋白酶K溶液，配置后分装，-20℃保存。

本实施例中的DTT溶液为200mg/ml DTT溶液，配置后，分装贮存于-20℃。

本实施例中的2％Triton X-100的PBS溶液中，PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存。

本实施例中所述PBS溶液的pH为7.2-7.4。

2、黑色素的提取

组织样的粉碎：

1)取50g的组织样剪成小块，用1500μl PBS溶液清洗除去血渍和其他污渍，13000rpm离心10min；

2)将离心后的沉淀物分别用1000μl双蒸水，1000μl PBS溶液清洗，13000rpm，离心10min；

3)重复上面2)的步骤；

4)将离心后的沉淀悬浮于500μl PBS中，加入800μl 2％TritonX-100PBS溶液,13000rpm，离心10min，

5)沉淀用1300μl双蒸水清洗6遍，13000rpm，离心10min；

6)沉淀在液氮中用研钵研磨组织样至粉状。

组织样酶解：

1)将研磨后的沉淀溶于500μl PBS溶液中，加入20μl DTT溶液，溶液室温下摇匀30min，然后加入4μl蛋白酶K溶液和25μl DTT溶液，50℃下反应5min，13000rpm，离心15min；

2)沉淀用1200μl双蒸水清洗4遍，13000rpm，离心15min；

3)沉淀悬浮于100μl PBS溶液中，加入4μl蛋白酶K溶液，25μlDTT溶液，50℃下反应2min，13000rpm，离心20min；

4)沉淀悬浮于100μl含有2％TritonX-100的PBS溶液中，室温下摇匀10min13000rpm，离心20min；

5)沉淀用1200μl双蒸水清洗6遍,13000rpm，离心20min；

组织样干燥：

将最后得到的黑色素沉淀用冷冻型干燥器干燥2h，称重后存于-20℃冰箱中。

本实验所采集的骨膜样来自于中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的乌骨鸡。通过上述实验提取的黑色素，经检测，提取的物质是黑色素，计算提取率均在2.5％以上。

实施例3从乌骨鸡骨膜中提取黑色素方法

乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体。用蛋白酶K和DTT降解蛋白，通过2％TritonX-100、PBS溶液和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来。

1、本实施例中所述使用的溶液：

本实施例中的蛋白酶K溶液为2.5mg/ml的蛋白酶K溶液，配置后分装，-20℃保存。

本实施例中的DTT溶液为150mg/ml DTT溶液，配置后，分装贮存于-20℃。

本实施例中的2％Triton X-100的PBS溶液中，PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存。

本实施例中所述PBS溶液的pH为7.2-7.4。

2、黑色素的提取

组织样的粉碎：

1)取50g的组织样剪成小块，用1500μl PBS溶液清洗除去血渍和其他污渍，13000rpm离心10min；

2)将离心后的沉淀物分别用1000μl双蒸水，1000μl PBS溶液清洗，13000rpm，离心10min；

3)重复上面2)的步骤；

4)将离心后的沉淀悬浮于500μl PBS中，加入800μl 2％TritonX-100PBS溶液,13000rpm，离心10min，

5)沉淀用1300μl双蒸水清洗6遍，13000rpm，离心10min；

6)沉淀在液氮中用研钵研磨组织样至粉状。

组织样酶解：

1)将研磨后的沉淀溶于1000μl PBS溶液中，加入15μl DTT溶液，溶液室温下摇匀30min，然后加入3μl蛋白酶K溶液和5μl DTT溶液，50℃下反应5min，13000rpm，离心15min；

2)沉淀用1200μl双蒸水清洗4遍，13000rpm，离心15min；

3)沉淀悬浮于100μl PBS溶液中，加入3μl蛋白酶K溶液，5μlDTT溶液，50℃下反应2min，13000rpm，离心20min；

4)沉淀悬浮于100μl含有2％TritonX-100的PBS溶液中，室温下摇匀10min13000rpm，离心20min；

5)沉淀用1200μl双蒸水清洗6遍,13000rpm，离心20min；

组织样干燥：

将最后得到的黑色素沉淀用冷冻型干燥器干燥2h，称重后存于-20℃冰箱中。

本实验所采集的骨膜样来自于中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的乌骨鸡。通过上述实验提取的黑色素，经检测，提取的物质是黑色素，计算提取率均在2.5％以上。

Claims (4)

1.一种从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将骨膜组织粉碎、清洗、研磨；

(2)研磨后进行酶解、离心得沉淀物；

其中，所述酶解的方法为：

将研磨后的组织溶按质量体积比1:10-30g/μl加入于PBS溶液中，然后加入DTT溶液，加入量按组织与DTT溶液的质量体积比为2.5-5:1g/μl计算；

摇匀后，加入蛋白酶K溶液以及DTT溶液；其中，蛋白酶K溶液的加入量按组织与与蛋白酶K溶液的质量体积比为12.5-25:1g/μl计算，DTT溶液的加入量按组织与DTT溶液的质量体积比为2-5:1g/μl计算，然后进行消化反应；

反应后离心、清洗、离心、沉淀重悬后再次加入蛋白酶K溶液和DTT溶液进行第二次消化反应；

所述蛋白酶K溶液为1-5mg/ml的蛋白酶K溶液；所述DTT溶液为100-200mg/ml的DTT溶液，

每次所述消化反应的时间为7-12min；

所述清洗的方法为：将沉淀物悬浮于含有2％TritonX-100的PBS溶液中，摇匀。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，每次所述离心的方法为：转速为10000-15000rpm，时间为10-20min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将骨膜组织粉碎、清洗的具体方法为：将骨膜组织剪成小块，除去污渍后离心，沉淀清洗后离心，得沉淀后再次清洗、离心，将沉淀悬浮于含有2％TritonX-100的PBS溶液中，再次离心、清洗得到沉淀；每次所述离心的方法为：转速为10000-15000rpm，时间为7-12min；所述清洗的方法为：用双蒸水和/或PBS溶液清洗，清洗1-6遍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述研磨的方法为在液氮中研磨至粉末状。

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