CN113354957B - 一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法 - Google Patents

一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将乌骨鸡皮肤、骨膜、肌肉等组织剥离、清洗、绞碎；(2)绞碎后进行酶解、离心得到沉淀物；(3)用2％TritonX‑100的PBS溶液和双蒸水反复冲洗、离心；(4)冷冻干燥，得黑色素。其中，所述酶解方法为先用木瓜蛋白酶进行消化，后用蛋白酶K进行二次消化。本发明相比于目前已公开的其他乌骨鸡黑色素提取方法在提取成本和提取纯度上大大优化，适用于大批量提取；纯度大幅提高；操作简单、安全、高效，并且不会破坏黑色素的形态和化学结构。

Description

一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法
技术领域
本发明是属于生物天然产物提取技术领域，具体涉及一种从乌骨鸡皮肤与骨膜中提取黑色素的方法。
背景技术
乌骨鸡是我国畜禽基因库中具有特殊经济价值的珍禽，兼备药用、肉用，是我国闻名中外的药用家禽。乌骨鸡与其他品种最明显的区别就在于其身体多处呈乌黑色。乌骨鸡的药用价值在于其体内的黑色素，其可以吸收紫外辐射，清除自由基，具有抗氧化功能，从而可以延缓衰老、提高生物体免疫力。乌骨鸡黑色素不同于其他种类黑色素，如乌贼墨黑色素、芝麻黑色素等，是一类独特的复合种类黑色素，研究其结构及生化功能有助于开发乌骨鸡的食用、药用价值，有利于拓展乌骨鸡黑色素在保健品、化妆品、医学等领域的开发利用。由于乌骨鸡体内的黑色素与蛋白质等紧密结合，研究困难，因此开发一种高效提取乌骨鸡黑色素的方法非常重要
目前提取乌骨鸡黑色素的方法主要包括：酸解法，通过盐酸降解配合高温回流后快速冷冻的方法提取乌骨鸡黑色素，此法盐酸浓度过高，会对黑色素外部形态和内部化学结构造成破坏，从而影响生物学化性；酶解酸解混合法，采用“脱脂-酶解-酸解”三步法提取乌骨鸡黑色素，先用乙醇回流脱脂，后用蛋白酶进行酶解，酶解之后盐酸酸化，此法对对黑色素颗粒形态完整影响较小；酶解法，近几年，由于酶解法对黑色素的内部化学结构影响较小，酶解法逐步替代酸解法，酶解法主要包括：双酶水解法结合碱液去除蛋白法，酸性蛋白酶法，碱性蛋白酶法，木瓜蛋白酶法，蛋白酶K法等。酶解法有多种蛋白酶法，但不同酶法对黑色素提取的效果不同，提取时间、成本、提取率和提取纯度均有差异。
发明内容
为了优化现有技术中的流程，本发明提供一种用蛋白酶从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，该法能够有效地去除紧密结合在黑色素周围地蛋白质，并不会破坏黑色素的化学结构。
乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体，本发明的方法中用木瓜蛋白酶和蛋白酶K降解蛋白，通过2％TritonX-100的PBS溶液处理和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来。
一方面，本申请提供了一种从乌骨鸡组织中提取黑色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将皮肤、骨膜、肌肉等组织剥离、清洗、绞碎；
(2)绞碎后进行酶解、高温灭酶、离心得沉淀物；
(3)清洗、离心、干燥得黑色素沉淀物；
其中，所述得酶解方法为先用木瓜蛋白酶消化，再用蛋白酶K进行二次消化。
进一步地，所述酶解为：将绞碎后的组织溶于PBS溶液中，先加入木瓜蛋白酶进行消化反应，后加入蛋白酶K溶液进行消化反应。
进一步地，所述酶解为利用5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液消化7-12h，后利用0.4-1mg/ml的蛋白酶K溶液进行消化4-8h。
进一步地，所述酶解为：将绞碎后的组织与溶液按质量体积比1：5g/ml加入PBS溶液中，加入木瓜蛋白酶，加入量按组织与木瓜蛋白酶质量比100：2.5-3，进行消化反应，消化反应结束后，离心取沉淀，加入PBS溶液中，加入的组织与PBS溶液按照质量与体积比约为1：100g/ml，后加入蛋白酶K，加入量按照组织与蛋白酶K质量比为100：4-10，然后进行第二次消化反应，反应后90℃高温处理，离心，清洗，离心。
进一步地，其特征在于，步骤(3)包括：将沉淀物悬浮于含有2％TritonX-100的PBS溶液中，摇匀，离心得沉淀物。
进一步地，(2)和(3)中所述离心的方法为：转速为10000rpm，时间10min。
进一步地，步骤(1)为：将皮肤、骨膜、肌肉等组织剪成小块，去除污渍后清洗、离心，重复2-3次，将沉淀悬浮与含有2％TritonX-100的PBS溶液中，时间，1-2h，再次离心、清洗得到沉淀，所述离心的方法为：转速为4000rpm，时间为10min；所述清洗的方法为：用双蒸水溶液清洗，清洗4-6遍。
进一步地，所述绞碎的方法为将组织样剪成小块后，用小型绞肉机绞碎。
进一步地，所述干燥的方法为：冷冻干燥机干燥6-12h，干燥温度为-70到-80℃。
附图说明
图1为所提取黑色素的电镜图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或成分比例上做任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围内。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
实施例1从乌骨鸡组织中提取黑色素方法
实验材料：
本实验所采集的组织样来自于中国农业大学动物科技学院家禽遗传资源与育种试验基地的丝羽乌骨鸡。
本实施例中的木瓜蛋白酶溶液为5mg/ml的木瓜蛋白酶PBS溶液，现用现配。
本实施例中的蛋白酶K溶液为20mg/ml的蛋白酶K溶液，常温保存。
本实施例中的2％TritonX-100的PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存。
本实施例中的PBS溶液的pH为7.2-7.4。
黑色素的提取
组织样绞碎：
1)取100g组织样剪成小块，用双蒸水清洗出去血渍和其他污渍，4000rpm离心2次，时间10min；
2)将离心后的沉淀悬浮于500ml 2％TritonX-100的PBS溶液中，常温下摇匀30min，4000rpm离心10min；
3)将离心后的沉淀用500ml双蒸水清洗4-6遍，4000rpm离心10min；
4)沉淀用绞肉机绞碎。
组织样酶解：
1)将绞碎后的沉淀加入500ml配置好的木瓜蛋白酶PBS溶液中，50-55℃下摇匀12h，然后10000rpm离心10min；
2)将沉淀溶于100ml PBS溶液中，加入蛋白酶K溶液2ml，37℃摇匀8h，然后90℃处理30min，降温后，10000rpm离心10min；
3)沉淀悬浮于100ml含有2％TritonX-100的PBS溶液中，室温下摇匀30min，10000rpm离心10min；
4)沉淀用50ml双蒸水清洗6遍，10000rpm，离心10min；
组织样干燥：
将最后得到的黑色素沉淀用冷冻干燥机干燥4-6h，称重后存于-20℃冰箱中。
检测
通过试验分别提取5只丝羽乌骨鸡皮肤、骨膜样的黑色素通过电镜扫描，扫描电镜图如图1所示，图片显示乌骨鸡黑色素是椭圆形或圆形的小颗粒，以椭圆形颗粒结构为主。检测结果显示，提取的物质是乌骨鸡黑色素，通过对比组织样与提取物的质量计算乌骨鸡黑色素提取率皮肤为0.8％，骨膜为2.5％。
提取纯度上，我们做了大量对比实验，通过H2O2氧化-荧光分析法测定提取纯度，本发明提取乌骨鸡黑色素纯度达96％，相比于木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶单酶酶解分别提高4.2％、4％、6％，相比于木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶联用酶解纯度提高3％，相比于复合蛋白酶与酸性蛋白酶联用酶解纯度提高3.3％；在提取成本上，木瓜蛋白酶价格较低，适合大批量提取，而2％的TritonX-100和蛋白酶K有效提高提取纯度。

Claims (1)

1.一种从乌骨鸡组织中提取黑色素的方法，其特征在于，所述方法步骤为：
组织样绞碎：
（1）取100g乌骨鸡组织样剪成小块，用双蒸水清洗除去血渍和其他污渍，4000rpm离心2次，时间10min；
（2）将步骤（1）所得沉淀悬浮于500ml 2% TritonX-100的PBS溶液中，常温下摇匀30min，4000rpm离心10min；所述2% TritonX-100的PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存；
（3）将步骤（2）所得沉淀用500ml双蒸水清洗4-6遍，4000rpm离心10min；
（4）将步骤（3）所得沉淀用绞肉机绞碎；
组织样酶解：
（a）将步骤（4）中所得的绞碎后的沉淀加入500ml配置好的木瓜蛋白酶 PBS溶液中，50-55℃下摇匀12h，然后10000rpm离心10min；所述木瓜蛋白酶PBS溶液为5mg/ml的木瓜蛋白酶PBS溶液，pH为7.2-7.4，现用现配；
（b）将步骤（a）所得沉淀溶于100ml PBS溶液中，加入蛋白酶K溶液2ml，37℃摇匀8h，然后90℃处理30min，降温后，10000rpm离心10min；所述PBS溶液pH为7.2-7.4；所述蛋白酶K溶液为20mg/ml的蛋白酶K溶液，常温保存；
（c）将步骤（b）所得沉淀悬浮于100ml 2% TritonX-100的PBS溶液中，室温下摇匀30min，10000rpm离心10min；所述2% TritonX-100的PBS溶液的pH为7.2-7.4，配置后4℃保存；
（d）将步骤（c）所得沉淀用50ml双蒸水清洗6遍，10000rpm，离心10min；
组织样干燥：
将步骤（d）所得的黑色素沉淀用冷冻干燥机干燥4-6h，称重后存于-20℃冰箱中。
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