CN108929891B - 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 - Google Patents
一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108929891B CN108929891B CN201810842565.2A CN201810842565A CN108929891B CN 108929891 B CN108929891 B CN 108929891B CN 201810842565 A CN201810842565 A CN 201810842565A CN 108929891 B CN108929891 B CN 108929891B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- limulus
- temperature
- active peptide
- hemocyte
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000239218 Limulus Species 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 claims abstract description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 15
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 claims abstract 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract 1
- -1 hydroxyl free radical Chemical class 0.000 abstract 1
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical compound O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N galanthamine Chemical compound O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CC[C@]23[C@@H]1C[C@@H](O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N Huperzine A Natural products N1C(=O)C=CC2=C1C[C@H]1/C(=C/C)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N Rivastigmine Chemical compound CCN(C)C(=O)OC1=CC=CC([C@H](C)N(C)C)=C1 XSVMFMHYUFZWBK-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N Shuangyiping Natural products N1C(=O)C=CC2=C1CC1C(=CC)C2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001986 anti-endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229960003530 donepezil Drugs 0.000 description 1
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 229960003980 galantamine Drugs 0.000 description 1
- ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N galanthamine hydrochloride Natural products O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CCC23C1CC(O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-YQEJDHNASA-N huperzine A Chemical compound N1C(=O)C=CC2=C1C[C@H]1\C(=C/C)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-YQEJDHNASA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-BMIGLBTASA-N rac-huperzine A Natural products N1C(=O)C=CC2=C1C[C@@H]1C(=CC)[C@@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-BMIGLBTASA-N 0.000 description 1
- 229960004136 rivastigmine Drugs 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：将鲎血血细胞置于低温‑18℃冷冻12h，4℃融化，反复三次后，在4℃下磁力搅拌10 min，至血细胞破裂；4℃低温离心，速率4000rpm，得到固体沉淀，再用蒸馏水反复冲洗，得到鲎血细胞膜组织；用酶活4000 u/g的胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，60℃～80℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h；将酶解液低温离心分离得到上清液，冷冻干燥上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。本发明以制备鲎试剂残留的废血细胞膜组织为原料，不仅提高原料利用率、还扩大了鲎血的应用范围，能有效抑制乙酰胆碱酯酶，并有效清除羟自由基，可用于阿尔茨海默病人的治疗和保健。本发明属于天然活性物质提取技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法。
背景技术
随着人口的老龄化，阿尔茨海默病(AD)的发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。阿尔茨海默病(AD)的确切致病机制目前尚未十分清楚，基于“胆减能假说”已开发出的胆碱酯酶抑制剂（多奈呢齐、加兰他敏和利伐司替明）是当前治疗的重要药物，是AD药物治疗的主要手段，用于治疗阿尔兹海默症的药物目前国内也常用石杉碱甲。临床证实这些抑制刻对轻度至中度的患者有效但是对于中重度的疗效不佳，而且伴有一定的副作用以及耐药性等问题。另一方面，本身病情的复杂性，仅针对一种病理现象或靶标设计研发的药物已不能满足广大患者的实际治疗需要。因此寻找和发现具有全新作用机制的治疗药物具有重要的科学意义和应用价值。
研究生物活性肽是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。其中，鲎血资源珍贵，蛋白含量高，含有人体所必须的8种必须氨基酸以及多种微量元素，存在着多种具有抗菌抗内毒素的小分子活性多肽。而提取鲎血分离变形细胞后剩余的鲎血浆，由于铜含量超出人类食用标准，一般作为废物被丢弃，造成了极大的浪费。因此研究鲎血血细胞蛋白活性肽及其制备方法意义重大。
将鲎血浆制备成活性肽，充分利用了废弃的鲎血浆，又可制备成各种有效药物或保健品，具有较大的推广应用价值。对比文件CN106148465A公开了一种具有抗氧化活性的鲎血浆蛋白水解肽及其制备方法和应用，将鲎血浆于70～100℃条件下恒温水浴2～4小时，然后将鲎血浆抽滤并用水洗涤，备用；使用蛋白酶水解所得鲎血浆，然后将鲎血浆水解液离心分离得上清液备用；将所得上清液过SephadexG-50葡聚糖凝胶柱，收集在波长230nm处吸光度最大的组分即得鲎血浆蛋白水解肽。该方法得到的鲎血蛋白水解肽，具有较高的DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力，但没能产生乙酰胆碱酯酶或没能提供对乙酰胆碱酯酶的抑制率实验数据，也没有提供具体的肽得率，因此无法具体实施应用到阿尔茨海默病的药物和保健品或具体的某些药物应用方面。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，该方法从废弃的鲎血细胞膜组织中制备得到的鲎血血细胞蛋白活性肽，能有效抑制乙酰胆碱酯酶，并有效清除羟自由基，还可作为阿尔茨海默病的药物和保健品，实现了鲎血细胞膜组织的充分利用。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的鲎血血细胞蛋白活性肽。
一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：
1. 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
S1：将鲎血细胞置于冷冻管，按已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1℃～3℃至低温-15℃～-20℃间，冷冻11h～13h，然后至0℃～4℃解冻，完全融化，如此反复冻融三次；
S2：温度保持在0℃～4℃间，将S1所得鲎血血细胞磁力搅拌8min～13min，致鲎血细胞完全破裂；
S3：温度保持在0℃～4℃间，将S2所得破裂鲎血血细胞进行低温离心处理，速率3500rpm～4500rpm，15 min～25 min，然后收集固体沉淀，用蒸馏水冲洗3～5次，至得到鲎血细胞膜组织；
S4：用酶活3800u/g～4200u/g的胰酶粉酶解S3所得鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，60℃～80℃，酶浓度1.8mg/mL～2.4mg/mL，底物浓度2.0mg/mL～6.0mg/mL，酶解4h～6h；
S5：将S4所得酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在0℃～4℃间，速率3500rpm～4500rpm离心分离15min～25min，得到上清液；
S6：温度保持在-50℃，将S5所得上清液冷冻至干燥完全为止，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。
优先地，步骤S1的冷冻温度为-18℃，融化温度为4℃。
优先地，步骤S2的温度保持在4℃，磁力搅拌10 min。
优先地，步骤S3的温度保持在4℃，离心速率4000rpm，20min。
优先地，步骤S4的胰酶粉，酶活为4000u/g，酶解条件，pH7.0，温度70℃，酶浓度2.2mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
优先地，步骤S5的离心分离，温度4℃，4000rpm，20min。
上述制备方法得到的鲎血血细胞蛋白活性肽，能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，可用于阿尔茨海默病人的治疗和保健，当浓度为0.12 mg/mL时，羟自由基的清除率达到97.3%，和0.05 mg/mL维生素C的清除率为97.1%相当；当浓度为0.20 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0%；肽得率36.50%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备方法工艺简单，易于操作，具有较大的推广应用价值。
2、本发明用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶种单一不复杂，且只需在一定的pH、温度和溶度条件下，将酶液与样品混合，操作条件温和，步骤不繁琐，生产效率高，易于大规模生产。
3、本发明是一种生物蛋白活性肽，易吸收，无副作用，能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，可用于阿尔茨海默病人的治疗和保健，当浓度为0.12 mg/mL时，羟自由基的清除率达到97.3%和0.05 mg/mL维生素C的清除率为97.1%相当；当浓度为0.20 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0 %；肽得率36.50%；不仅能有效抑制乙酰胆碱酯酶还可以清除羟自由基，还可作为阿尔茨海默病的药物和保健品。
附图说明
图1对实施例1~6进行统计，得出不同条件下各肽得率、对乙酰胆碱酯酶抑制率、对羟自由基的清除率的数据的示意图，其中“--”表明没有测试数据。
图2对实施例1~6进行统计，得出实施后各元素含量示意图。
具体实施方式
实施例一
1. 鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻12h，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10 min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4000rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用酶活为4000u/g的胰酶粉酶解上述得到的鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4000rpm低温离心20min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。
7. 鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12 mg/mL时，羟自由基的清除率达到97.3%，和0.05 mg/mL维生素C的清除率（97.1%）相当；当浓度为0.20 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到97.0%；肽得率36.50%。
实施例二
1. 鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻11h，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10 min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4500rpm低温离心18min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用木瓜蛋白酶酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4500rpm/min低温离心18min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。
7. 鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12 mg/mL时，羟自由基的清除率达到2.4%；当浓度为0.20 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到21.7%；肽得率8.17%。
实施例三
1. 鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率3800rpm低温离心25min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用胰蛋白酶酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率3800rpm低温离心25min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。
7. 鲎血血细胞蛋白活性肽能有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶，当浓度为0.12 mg/mL时，羟自由基的清除率达到0.5%；当浓度为0.20 mg/mL时对乙酰胆碱酯酶抑制率达到14.6%；肽得率7.67%。
实施例四
1. 鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌10 min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4000 rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH6.5，70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4000 rpm低温离心20min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率17.25%。
实施例五
1. 鲎血血细胞置于低温-20℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌8 min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4200 rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH8.0，70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4200 rpm低温离心20min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率13.67%。
实施例六
1. 鲎血血细胞置于低温-18℃下冷冻，然后至4℃融化，如此反复冻融三次。
2. 温度在4℃下将冻融三次后的鲎血血细胞磁力搅拌12 min，致鲎血细胞破裂。
3. 温度保持在4℃，将破裂的鲎血血细胞以速率4500 rpm低温离心20min，收集固体沉淀，并用蒸馏水多次冲洗，即得到鲎血细胞膜组织。
4. 用胰酶粉酶解鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH6.5，75℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
5. 将上述酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在4℃，以速率4500 rpm低温离心20min，得到上清液。
6. 温度保持在-50℃冷冻干燥得到的上清液，获得鲎血血细胞蛋白活性肽；肽得率17.38%。
Claims (7)
1.一种鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，所述鲎血血细胞蛋白活性肽制备方法具体包括如下步骤：
S1：将鲎血细胞置于冷冻管，按已设定程序的可程序降温机中每分钟降 1℃～3℃至低温-15℃～-20℃间，冷冻11h～13h，然后至0℃～4℃解冻，完全融化，如此反复冻融三次；
S2：温度保持在0℃～4℃间，将S1所得鲎血血细胞磁力搅拌8min～13min，致鲎血细胞完全破裂；
S3：温度保持在0℃～4℃间，将S2所得破裂鲎血血细胞进行低温离心处理，速率3500rpm～4500rpm，15 min～25 min，然后收集固体沉淀，用蒸馏水冲洗3～5次，至得到鲎血细胞膜组织；
S4：用酶活3800u/g～4200u/g的胰酶粉酶解S3所得鲎血细胞膜组织，酶解条件：pH7.0，70℃，酶浓度1.8mg/mL～2.4mg/mL，底物浓度2.0mg/mL～6.0mg/mL，酶解4h～6h；
S5：将S4所得酶解液置于低温冷冻离心机中，温度保持在0℃～4℃间, 速率3500rpm～4500rpm离心分离15min～25min，得到上清液；
S6：温度保持在-50℃，将S5所得上清液冷冻至干燥完全为止，获得鲎血血细胞蛋白活性肽。
2.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，步骤S1的冷冻温度为-18℃，融化温度为4℃。
3.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，步骤S2的温度保持在4℃，磁力搅拌10 min。
4.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，步骤S3的温度保持在4℃，离心速率4000 rpm，20min。
5.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，步骤S4的胰酶粉，酶活为4000u/g，酶解条件，pH7.0，温度70℃，酶浓度2.2 mg/mL，底物浓度4.0 mg/mL，酶解5h。
6.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，其特征在于，步骤S5的离心分离，温度4℃, 4000rpm，20min离心分离得到上清液。
7.根据权利要求1所述鲎血血细胞蛋白活性肽在制备阿尔茨海默症药物中的用途，所述的鲎血血细胞蛋白活性肽能够有效抑制清除羟自由基和乙酰胆碱酯酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810842565.2A CN108929891B (zh) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810842565.2A CN108929891B (zh) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108929891A CN108929891A (zh) | 2018-12-04 |
| CN108929891B true CN108929891B (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=64445056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810842565.2A Active CN108929891B (zh) | 2018-07-27 | 2018-07-27 | 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108929891B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110898080B (zh) * | 2019-11-01 | 2021-07-06 | 广西中医药大学 | 鲎血浆在促生长发育中的应用 |
| CN112898410B (zh) * | 2021-01-27 | 2023-06-23 | 上海海洋大学 | 一种中国鲎血蓝蛋白及其制备方法和应用 |
| CN113209268B (zh) * | 2021-01-29 | 2023-05-09 | 天津喜诺生物医药有限公司 | 鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用 |
| CN113980123B (zh) * | 2021-11-26 | 2022-06-17 | 广东海洋大学 | 一种鲎血蓝蛋白脱铜的方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106191188A (zh) * | 2016-08-09 | 2016-12-07 | 广东海洋大学 | 一种鲎血浆蛋白的水解方法 |
| CN107529554A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-02 | 湖北瑞邦生物科技有限公司 | 一种猪血球肽的生产工艺 |
-
2018
- 2018-07-27 CN CN201810842565.2A patent/CN108929891B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106191188A (zh) * | 2016-08-09 | 2016-12-07 | 广东海洋大学 | 一种鲎血浆蛋白的水解方法 |
| CN107529554A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-02 | 湖北瑞邦生物科技有限公司 | 一种猪血球肽的生产工艺 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 鲎血细胞蛋白营养学评价及其水解肽体外活性;邓春梅等;《食品工业科技》;20180515;第252-257页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108929891A (zh) | 2018-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108929891B (zh) | 一种鲎血血细胞蛋白活性肽的制备方法 | |
| CN104004813B (zh) | 一种香菇生物活性肽的制备 | |
| CN104745663B (zh) | 一种猪血红蛋白综合利用的方法 | |
| CN106282287B (zh) | 一种提取白果生物活性多肽的方法 | |
| CN107164447A (zh) | 一种利用鳕鱼加工副产物制备抗氧化肽的方法 | |
| CN101979532A (zh) | 一种综合利用猪血的方法 | |
| CN103565839A (zh) | 一种猪胎盘素的分离提取方法 | |
| CN102268101A (zh) | 一种高纯度紫菜多糖的酶辅助提取方法 | |
| CN107188990A (zh) | 鲟鱼骨中提取硫酸软骨素的方法 | |
| CN104382953A (zh) | 一种黑木耳黑色素的提取方法 | |
| CN107114793A (zh) | 一种综合利用鲟鱼骨制备钙和硫酸软骨素的方法 | |
| CN102499967B (zh) | 一种超声辅助制备大蒜降血压功能因子的方法 | |
| CN103099248A (zh) | 一种制备牡蛎活性成份的方法 | |
| CN117129291A (zh) | 高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备及应用 | |
| CN107529554A (zh) | 一种猪血球肽的生产工艺 | |
| KR20040055931A (ko) | 콜라겐펩타이드의 제조방법 및 이를 이용한식품·의약품·화장품 | |
| CN103478403B (zh) | 一种花生多肽及其制备方法 | |
| CN106723081A (zh) | 全桑叶肽营养品及其制备方法 | |
| CN112898447B (zh) | 一种白首乌多糖的提取方法 | |
| CN106366184A (zh) | 一种水蛭素粗提液的制备方法 | |
| CN102787154A (zh) | 一种乌鸡低聚肽的制备及其活性肽段分离、鉴定方法 | |
| CN108486201B (zh) | 一种白果生物活性多肽的提取方法 | |
| CN114426998A (zh) | 鳄鱼肽的制备方法及制备的鳄鱼肽 | |
| CN108866135B (zh) | 一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的鲎血蛋白水解肽的制备方法 | |
| CN111264677A (zh) | 一种牡蛎小分子肽的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230630 Address after: 524003 Ruiyun South Road, Mazhang District, Zhanjiang City, Guangdong Province Patentee after: Zhanjiang Bokang ocean Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 524000 1 Hai Da Road, Mazhang District, Zhanjiang, Guangdong Patentee before: Guangdong Ocean University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |