CN113209268B - 鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用，从鲎血清和鲎血细胞中分别得到两种具有抗病毒作用的提取物，组合使用时对病毒具有更加明显的抑制作用；用这两种提取物组合而成的喷剂敷料抗新型冠状病毒的活性高达99.51％，抗甲型流感病毒的活性为42.58％。这两种提取物可从鲎试剂生产所得废料中提取，因此对生产废料实现重复利用，在降低生产成本的同时还能充分利用生物资源；这两种抗病毒提取物可制成敷料，用于鼻腔和皮肤消毒，较传统的化学消毒产品而言，更为安全温和有效，无毒副作用，能避免常规消毒产品耐药性和过敏现象的发生。

Description

鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用
技术领域
本发明属于生物制剂领域，尤其是涉及一种鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用。
背景技术
常用的化学消毒剂，如含氯消毒剂(84消毒液)、醇类消毒剂(75％酒精)等，虽可以杀灭病毒，但其本身是具有一定危险性的化学品，必须严格按照说明选用，使用浓度过高时可刺激、损害皮肤黏膜，腐蚀物品。严重的会导致老年人慢性支气管炎的复发，儿童哮喘发作；并且化学消毒剂过度使用会带来其他风险。长期大量使用同一种消毒剂，会使微生物产生抗药性，灭菌效果大大降低。
病毒的主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播。但有相关技术文件规定，化学消毒剂不可直接大面积喷雾作用于人体。而由生物提取的消毒剂则作用条件温和，对皮肤黏膜无刺激，毒副作用低，可直接用于人体及鼻腔等皮肤黏膜使用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种鲎抗病毒组合提取物、制备方法及其在消毒产品中的应用。
本发明采用的技术方案是：鲎抗病毒组合提取物制备方法，将提取于鲎血细胞的提取物A和提取于鲎血清的蛋白B混合，即得到抗病毒组合提取物。
优选地，制备方法为：
从鲎全血中分离鲎血细胞和鲎血清分别用作原料A和原料B；
以蒸馏水为裂解液将原料A裂解处理，并乳化分离，超声破碎后离心取上清，即为提取物A；
将原料B进行盐析后，用柱层析法提取鲎血清中大分子蛋白质，即为蛋白B；
将提取物A和蛋白B混合得到抗病毒组合提取物。
优选地，原料A为生产鲎试剂时，将乳化物离心后得到的下层沉淀物；
和/或，原料B为生产鲎试剂时，将鲎全血分离所得物。
优选地，
提取物A提取方法为：以蒸馏水为裂解液，将原料A与裂解液按照1：5-10的比例轻摇混匀；反复冻融后进行乳化分离，匀浆时间5-20min；超声破碎后取上清，粗提液即为提取物A；
蛋白B提取方法为：将饱和硫酸铵溶液加入至原料B中分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析，所的物即为抗病毒提取物B。
由鲎抗病毒组合提取物制备方法制备得到的抗病毒组合提取物。
抗病毒组合提取物在消毒产品中的应用。
优选地，抗病毒组合提取物在用作新型冠状病毒、甲型流感病毒或腺病毒消毒抑制产品的中的应用。
一种喷剂敷料，抗病毒组合提取物以冻干粉形式保存，用水或生理盐水复溶后形成喷剂敷料，其中提取物A终浓度为0.1％-10％，蛋白B终浓度为1％-2％。
优选地，喷剂敷料为鼻腔喷剂敷料或皮肤喷剂敷料。
本发明具有的优点和积极效果是：从鲎血清和鲎血细胞中分别得到两种具有抗病毒作用的提取物，组合使用时对病毒具有更加明显的抑制作用，抗病毒组合提取物制成的喷剂敷料抗新型冠状病毒的活性高达99.51％，抗甲型流感病毒的活性为42.58％；另外，这两种提取物可从鲎试剂生产所得废料中提取，因此对生产废料实现重复利用，在降低生产成本的同时还能充分利用生物资源；抗病毒组合提取物制成的敷料可用于鼻腔和皮肤的消毒，较传统的化学消毒产品而言，更为安全温和有效，无毒副作用，能避免常规消毒产品耐药性和过敏现象的发生。
附图说明
图1血细胞提取物A1在病毒灭活试验中的荧光电镜图；
图2血细胞提取物A1的病毒灭活结果；
图3血清蛋白B1在病毒灭活试验中的荧光电镜图；
图4血清蛋白B1的病毒灭活结果；
图5冻干品在病毒灭活试验中的荧光电镜图；
图6冻干品的病毒灭活结果。
具体实施方式
本发明涉及一种鲎抗病毒组合提取物，分别从鲎血清和鲎血细胞中提取得到，具有抗病毒活性的功能。鲎抗病毒组合提取物制备方法为将提取于鲎血细胞的提取物A和提取于鲎血清的蛋白B混合，即得到抗病毒组合提取物，提取物A和蛋白B可任意比例混合。其中原料可从鲎全血中分离得到鲎血细胞和鲎血清分别作为原料A和B；或者以生产鲎试剂时，将乳化物离心后得到的下层沉淀物和分离出的血清分别作为原料A和B。
以蒸馏水为裂解液将原料A裂解处理，并乳化分离，超声破碎后离心取上清，即为抗病毒提取物A，具体为将原料与裂解液按照1：5-10的比例轻摇混匀，反复冻融后进行乳化分离，匀浆时间5-20min，超声破碎后取上清，粗提液即为抗病毒提取物A；再将原料B进行盐析后，用柱层析法提取鲎血清中大分子蛋白质，即为抗病毒提取物B，具体为将饱和硫酸铵溶液缓慢加入至原料B中至饱和度为45～55％，离心分离出的淡蓝色沉淀复溶后经过透析、G-200葡聚糖凝胶分离、超滤管浓缩后，即为抗病毒提取物B。
具体制备方法为：
步骤一收集鲎全血，分离鲎血细胞及血清用作原料A和原料B；鲎血细胞可以先用于鲎试剂生产，也可以与生产中分离出的鲎血清废料一同作为后续原料直接使用；若鲎血细胞用于鲎试剂生产，则将其乳化物离心后的下层沉淀物作为原料A备用，原料B也可采用将鲎全血分离所得物。
步骤二取原料A，用蒸馏水做裂解液，将原料A与裂解液按照1：5-10的比例轻摇混匀，反复冻融后使用高速均浆机进行乳化分离，匀浆时间5-20min；然后再进行超声破碎，破碎条件为：超声波输出功率为500-700W，超声波脉冲作用时间为10s，间歇为10s，累计作用时间10min为一次；如此反复超声3次，共计30min；浑浊液经高速离心后取上清，得到的粗提液即为鲎血细胞中的抗病毒提取物，即为提取物A。
步骤三去原料B，将饱和硫酸铵溶液缓慢加入至鲎血清中至饱和度为45～55％，边加边搅拌，按照8000rpm 10min离心分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mMTris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析；透析液用G-200葡聚糖凝胶分离，平衡液用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液，用0-0.5M NaCL进行洗脱，收集含有高分子量蛋白质片段的洗脱液用超滤管浓缩后即为鲎血清中的抗病毒蛋白，即为蛋白B，本发明某些实施例中，可筛选分子量大小为30-100kDa蛋白质。
步骤四，将提取物A和蛋白B混合即得到鲎抗病毒组合提取物。这两种抗病毒提取物组合后能够用于抗病毒消毒产品；鲎血细胞中的抗病毒提取物与鲎血清中的抗病毒提取物混合后，制成白色冻干粉，用水或生理盐水复溶后即可用做鼻腔或皮肤喷剂敷料，其中鲎血细胞提取物的终浓度为0.1％-10％，鲎血清的终浓度为1％-2％。
本方案两种抗病毒提取物组合后对病毒具有极佳杀灭效果，尤其适合用作新型冠状病毒、甲型流感病毒或腺病毒消毒抑制产品，提取物A和蛋白B均可单独使用，尤其混合使用时对病毒具有明显的抑制杀灭作用，抗病毒活性率高达99.51％，并且本抗病毒组合物源于生物提取，较传统化学消毒产品而言，产品组分更为安全温和，抗病毒效果显著但对机体无刺激，能避免常规消毒产品耐药性和过敏现象的发生，可用于日常消毒护理。鲎血细胞提取物在提取过程中采用了蒸馏水作为裂解液，未使用酸碱或有机溶剂，降低了生产成本，并保证了提取物的天然成分；另外，两种抗病毒提取物皆可从制备鲎试剂所得废料中进行提取，实现对废弃生物材料的二次利用，降低生产成本的同时还能充分利用生物资源。
下面通过具体实施例对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：
收集鲎全血，分离鲎血细胞及血清。
鲎血细胞裂解处理：用蒸馏水做裂解液，将细胞与裂解液按照1：5的比例轻摇混匀。反复冻融后使用高速均浆机进行乳化分离，匀浆时间5min。然后，再进行超声破碎，破碎条件为：超声波输出功率为500W，超声波脉冲作用时间为10s，间歇为10s，累计作用时间10min为一次。如此反复超声3次，共计30min。浑浊液经高速离心后取上清，即得具有抗病毒作用的鲎血细胞粗提液，记作提取物A1。
鲎血清的处理：将饱和硫酸铵溶液缓慢加入至鲎血清中至饱和度为55％，边加边搅拌，按照8000rpm 10min离心分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析；透析液用G-200葡聚糖凝胶分离，平衡液用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液，用0.25M NaCL洗脱，收集洗脱液用30kDa超滤管浓缩后即为具有抗病毒作用的鲎血清提取物，作为蛋白B1。
将提取物A1和蛋白B1混合，制成冻干粉；使用时用7mL生理盐水复溶(前者终浓度为10％，后者终浓度为1.4％)，记作待测物“冻干品1号”。
另将提取物A1和蛋白B1混合，制成冻干粉；使用时用7mL生理盐水复溶(前者终浓度为1％，后者终浓度为1.4％)，记作待测物“冻干品2号”。
抗病毒检测方法如下：
1慢病毒包装质粒经转染后48小时收集细胞上清，经浓缩后用DMEM重悬；
2提前在96孔板中铺板(DMEM+30％FBS+1％双抗)，使其24小时生长到融合率约为50％；
3将病毒十倍稀释，分别取50μL加入到细胞中，用DMEM补液至200μL；
4 48-72小时后计算慢病毒滴度，此次慢病毒滴度约为7×103TU/mL；
5取50μL各种待测物与50μL慢病毒室温孵育4小时后加入到96孔板中进行感染；
6感染72h后，通过荧光显微镜记录细胞病变情况并计算抗病毒活性。
如图1所示，提取物A1经10倍和100倍稀释后与细胞孵育72小时，未出现生长抑制及死亡现象；且两个实验组中，荧光细胞数量均有显著减少(10倍P<0.05，100倍P<0.005)；表明血细胞经10倍和100倍稀释后对病毒有灭活效果，如图2所示，灭活率分别为88.8％和60.2％。如图3所示，蛋白B1经10倍和100倍稀释后与细胞孵育72小时，未出现生长抑制及死亡现象；两个实验组中，荧光细胞数量均有显著减少(P<0.05)，表明血细胞经10倍和100倍稀释后对病毒有灭活效果，如图4所示，灭活率分别为30.4％和25.5％。如图5所示，冻干品1号和2号与细胞孵育72小时，未出现生长抑制及死亡现象；且两个实验组中，荧光细胞数量均有显著减少(P<0.05)，表明两个冻干品对病毒有灭活效果，如图6所示，灭活率分别为98.1％和71.4％。
表1
Figure BDA0003028436840000061
由表1数据可见，鲎血细胞提取得到的提取物A1和鲎血清提取得到的蛋白B1单独使用时对腺病毒皆有抑制作用，尤其是鲎血细胞提取得到的提取物A1杀灭效果更佳；将提取物A1和蛋白B1混合后使用，抗腺病毒效果又有所提高。
实施例2：
收集鲎全血，分离鲎血细胞及血浆。
鲎血细胞裂解处理：用蒸馏水做裂解液，将细胞与裂解液按照1：5的比例轻摇混匀。反复冻融后使用高速均浆机进行乳化分离，匀浆时间5min。然后，再进行超声破碎，破碎条件为：超声波输出功率为500W，超声波脉冲作用时间为10s，间歇为10s，累计作用时间10min为一次。如此反复超声3次，共计30min。浑浊液经高速离心后取上清，即得具有抗病毒作用的提取物A2。
鲎血清的处理：将饱和硫酸铵溶液缓慢加入至鲎血清中至饱和度为55％，边加边搅拌，按照8000rpm 10min离心分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析；透析液用G-200葡聚糖凝胶分离，平衡液用含有0.01M EDTA的50m M Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液，用0.25M NaCL洗脱，收集洗脱液用超滤管浓缩，选择分子量大小为70-80kDa蛋白质，即为具有抗病毒作用的蛋白B2。
将提取物A2和蛋白B2混合，制成冻干粉；使用时用7mL生理盐水复溶(前者终浓度为7％，后者终浓度为1.4％)，即可用做鼻腔或皮肤喷剂敷料。
将所得喷剂敷料送至北京京畿分析测试中心有限公司进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗病毒活性检测，采用ISO 18184:2019Textiles Determination of antiviral检测方法，检测证明所得喷剂敷料的抗新型冠状病毒的活性高达99.51％。具体如表2所示。
表2
Figure BDA0003028436840000071
从上述数据能够看出，由本方案制得的抗病毒提取物制得的喷剂敷料对新型冠状病毒具有极高杀灭效果。
实施例3：
收集鲎全血，分离鲎血细胞及血浆。鲎血细胞先用于鲎试剂生产，将乳化物离心后的下层沉淀物作为原料备用。
鲎试剂废料的裂解处理：用蒸馏水做裂解液，将废料与裂解液按照1：5的比例轻摇混匀，反复冻融后使用高速均浆机进行乳化分离，匀浆时间20min。然后，再进行超声破碎，破碎条件为：超声波输出功率为700W，超声波脉冲作用时间为10s，间歇为10s，累计作用时间10min为一次。如此反复超声3次，共计30min。浑浊液经高速离心后取上清，即得具有抗病毒作用的提取物A3。
鲎血清的处理：将饱和硫酸铵溶液缓慢加入至鲎血清中至饱和度为50％，边加边搅拌，按照8000rpm 10min离心分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析；透析液用G-200葡聚糖凝胶分离，平衡液用含有0.01M EDTA的50m M Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液，用0.25M NaCL洗脱，收集洗脱液用超滤管浓缩后即为具有抗病毒作用的蛋白B3。
将提取物A3和蛋白B3混合，制成冻干粉；使用时用7mL生理盐水复溶(前者终浓度为0.2％，后者终浓度为1.4％)，即可用做鼻腔或皮肤喷剂敷料。
将所得冻干粉送至广东省微生物分析检测中心进行甲型流感病毒H1N1(A/PR/8/34)病毒灭活试验，采用《消毒技术规范》2002年版-2.1.1.10.7检测方法，检测证明所得冻干粉的病毒灭活率为42.58％。具体如表3所示。
表3
Figure BDA0003028436840000081
从上述数据能够看出，由鲎试剂废料制得的抗病毒提取物制得的喷剂敷料对甲型流感病毒同样具有较佳杀灭效果。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.鲎抗病毒组合提取物制备方法，其特征在于：将提取于鲎血细胞的提取物A和提取于鲎血清的蛋白B混合，即得到抗病毒组合提取物；
从鲎全血中分离鲎血细胞和鲎血清分别用作原料A和原料B；
提取物A提取方法为：以蒸馏水为裂解液，将原料A与裂解液按照1：5-10的比例轻摇混匀；反复冻融后进行乳化分离，匀浆时间5-20min；超声破碎后取上清，粗提液即为提取物A；
蛋白B提取方法为：将饱和硫酸铵溶液加入至原料B中分离出淡蓝色沉淀；沉淀用含有0.01M EDTA的50mM Tris-甘氨酸pH 8.9缓冲液溶解后，再用该缓冲液进行透析，筛选分子量大小为30-100kDa蛋白质，所的物即为抗病毒提取物B。
2.根据权利要求1所述的鲎抗病毒组合提取物制备方法，其特征在于：原料A为生产鲎试剂时，将乳化物离心后得到的下层沉淀物；
和/或，原料B为生产鲎试剂时，将鲎全血分离所得物。
3.由权利要求1或2所述的鲎抗病毒组合提取物制备方法制备得到的抗病毒组合提取物。
4.权利要求3所述的抗病毒组合提取物在制备消毒产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的抗病毒组合提取物在制备消毒产品中的应用，其特征在于：抗病毒组合提取物在用作新型冠状病毒、甲型流感病毒或腺病毒消毒抑制产品的中的应用。
6.一种喷剂敷料，其特征在于：权利要求3所述的抗病毒组合提取物以冻干粉形式保存，用水或生理盐水复溶后形成喷剂敷料，其中提取物A终浓度为0.1％-10％，蛋白B终浓度为1％-2％。
7.根据权利要求6所述的喷剂敷料，其特征在于：所述喷剂敷料为鼻腔喷剂敷料或皮肤喷剂敷料。
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