JP6383877B2 - 医療用材料として用いるための高濃度コラーゲンの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、医療用材料に適合するようにした高濃度コラーゲンの製造方法に関し、より詳しくは、コラーゲンを医療用材料として用いるために様々な濃度で製造することができるようにしたものであって、特に高濃度コラーゲンは当該目的に対して性能が優れるうえ、低濃度に比べて保管が容易であるという利点がある。さらに、製品の品質及び信頼性を向上させることができることにより、需要者の多様なニーズを満たして非常に有用な発明である。

コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）とは、動物の様々な組織に分布し、膠原質ともいい、全重量の３０％程度を占めているタンパク質である。

一般に、コラーゲンは、線維状のタンパク質であって、皮膚や骨、腱を構成するタンパク質の一つである。これらは、身体の結合組織に特に多く分布しており、体中にはタンパク質が約２０％含まれているが、その中でもコラーゲンが約３０％を占めている。前記コラーゲンの分子構造は、３つのポリペプチド鎖が巻かれて水素結合で互いに結合された三重螺旋型構造を有する。このような構造を有するコラーゲンは、細胞の接着、体と臓器の支持、細胞機能の活性化、細胞増殖作用、止血、免疫力などの機能を持っており、身体を形成するとともに有機的機能を付与するので、体内で必ず必要とするタンパク質である。

このような特性を有するコラーゲンは、現在、美容、健康飲料、健康食品、医薬品及び化粧品分野を含めて様々な分野で原料または添加剤として使用されており、その機能的特性により漸次その活用分野が拡大している傾向にある。

このように、コラーゲンは、一般的に牛や豚の骨と皮を収集した後、コラーゲンを組織から分離するために有機溶媒抽出、酸／塩基処理の後、トリプシン、ヒアルロニダーゼを作用させて不溶性物質としてコラーゲンを得ることができるが、これらの分子量が高いため、人体での消化吸収が困難で、原料に含まれている様々な不純物により純度が低下するので、その使用分野が制限されるという問題がある。

コラーゲンは、現在、２０余種として知られているが、コラーゲンI型が大部分を占めており、形態的には線繊維状固体として存在し、３本のポリペプチドが水素結合で撚り合わせられた構造を有し、約３００ｋＤａの分子量を有する。

コラーゲンは、希薄酸や希アルカリに溶解して液状に製造することができ、濃度が高くなるほど粘度が高くなる。

コラーゲンは、生体組織に適した生分解性物質であって、組織修復剤、皮膚移植剤、骨移植剤、細胞培養などの医療用材料の一つとして広く用いられる。

一方、様々な原料から抽出して液状に製造されたコラーゲンを、異物と微生物を除去して医療用材料として製造するためには、通常、伝統的な濾過を行う。

伝統的な濾過方式は、濾過膜に対して垂直方向に圧力と流体流れを形成させ、濾過膜の孔隙（ｐｏｒｅ）径よりも大きな物質は濾別し、小さな物質は通過させる。このような濾過方法は、濾過対象を一度に透過させ、通過していない物質は濾過膜に積もり、濾過量が累積するほど濾過効率が低下し、最終的に濾過膜が詰まってしまうという現象が発生する
。これにより、伝統的な濾過方式は、ろ過対象の容量と膜面積に依存的であり、濾過できる濃度が低いという限界がある。

このような限界により、高分子タンパク質であるコラーゲンを濾過するためには低濃度の液状に製造しなければならず、特に微生物を除去するための除菌濾過の場合、０．２２〜０．４５μｍの小さな孔隙を有する濾過膜を透過させるために、約５ｍｇ／ｍｌ以下の濃度で製造しなければならない。

低濃度で製造されたコラーゲン溶液を高濃度に濃縮する方法において、一般的な蒸発濃縮は、コラーゲンの熱変性のおそれがあり、製造に長時間がかかって適用し難く、揮発性溶媒を用いて濃縮する方法も残留溶媒を別途除去しなければならないので、医療用材料を製造する方法として適さない。

特開２００１−２０００００号公報［海洋生物由来コラーゲンの製造方法であって、海洋生物の皮膚組織を洗浄し、有機酸を用いてコラーゲンを抽出して得た溶液を精製膜を通過させて不純物を除去し、タンパク質分解酵素を用いて抽出した溶液を、精製膜を通過させる濾過工程、濃縮縮膜を通過させる工程、滅菌濾過工程によって濃縮されたコラーゲンを製造する方法が公開されている。］ 韓国公開特許第２０１４−００９１４３５号明細書［接線流濾過装置を用いて濃縮する段階と、前記濃縮されたコラーゲンを遠心分離機を用いて濃縮する段階と、前記濃縮されたコラーゲンを凍結乾燥機を用いて濃縮する段階とを含む、コラーゲンの製造方法が公開されている。］ 米国特許第４８９４４４１号明細書［動物の皮膚から有機酸を用いて生物組織を抽出する工程、前記抽出物に塩化ナトリウムを加えてコラーゲンを抽出する工程、及びタンジェント濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程によってコラーゲンを製造する方法が公開されている。］ 日本特開２０１１−２０１８３７公報［疎水性高分子と親水性高分子のブレンド物から管壁が構成されている多孔質中空糸漠を用いた、コラーゲン加水分解物の製造方法が公開されている。］ （国際特許文献５）［クロスフロー濾過方法によってコラーゲンを濃縮した後、遠心分離してコラーゲンを精製する過程を含む、三重螺旋構造を有するタンパク質の製造方法が公開されている。］

本発明は、かかる従来技術の諸般問題点を解消するために提案されたものである。コラーゲンは、低抗原性をもって生体分解される生体分解適合性のタンパク質であって、このようなコラーゲンを得るために様々な動物の組織から抽出され、医療機器と医薬品などの医療用材料だけでなく、化粧品、食品の原料として広く用いられる。

コラーゲンを医療用材料として用いるためには、生物学的な安全性が確保されなければならない。特に動物の組織（ｔｉｓｓｕｅ）からコラーゲンを抽出する際に、動物由来のウイルスが転移されることを防ぐために、ウイルスが除去または不活性化されなければならず、微生物が適切に除去されなければならない。

一般に、ウイルスは、温度を上げて死滅させるか、或いはナノメートルレベルの孔隙径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）を有するフィルターによって濾過してウイルスを除去する。しかし、コラーゲンは、３７℃以上の高温で変性し、三重螺旋鎖をなす構造が三つの一本鎖に
解けてゼラチン化されることにより、コラーゲンの基本的な特性を失ってしまい、３００ナノメートルに及ぶ高分子タンパク質であってウイルス除去用フィルターを通過させることが非常に難しい。

また、コラーゲン抽出過程において広く使用される酵素や塩化ナトリウムなどの低分子物質が、医療用として適したレベルに除去されなければならない。

通常、コラーゲンを医療用材料として液状の剤形で用いるとき、コラーゲンの残存期間を増やし或いは体積を維持するために、３０〜６０ｍｇ／ｍＬの高濃度のコラーゲンが要求され、凍結乾燥によって固形の剤形に製造するときも、凍結乾燥機の容量及び稼働時間を減らすために高濃度のコラーゲンが要求される。このような医療用材料として消費者のニーズを満たすために、コラーゲンは６０ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度に製造される必要がある。

また、高濃度の液状の医療用コラーゲン製品を製造するためにコラーゲン粉末を用いると、コラーゲンの固有の性質と構造を維持しながら粉末状態で滅菌することは不可能であり、さらに液状に溶かした後で滅菌および濃縮する過程で無菌的な設備及び長時間の時間がかかる。

哺乳動物の組織を７０％エチルアルコールで２４時間、酸性溶液で７２時間以上処理してウイルスを不活性化し、孔隙径０．２２μｍのフィルターで濾過することにより微生物を除去して安全性を確保する。

ペプシンを用いたコラーゲン抽出、塩化ナトリウム、フィルター、接線流濾過装置、ｐＨ中性化などを用いて純度の高いコラーゲンを製造する。

また、接線流動濾過、ｐＨ中性化、遠心分離を利用した濃縮過程によって１２０ｍｇ／ｍＬの高濃度に濃縮し、これを均質に混合して液状、スポンジ状、粉末状の様々な製品を製造することができる。

上述したように、哺乳動物の組織に対してウイルスを不活性化し、接線流濾過によって、以前の工程で使用された酵素、塩化ナトリウムなどの低分子物質を除去した後、孔隙径０．２２μｍのフィルターで濾過することにより、医療用に適した無菌の液状コラーゲンを製造することができる。また、接線流濾過膜、ｐＨ中性化、遠心分離によって１２０ｍｇ／ｍＬの高濃度の液状コラーゲンに濃縮して液状と無菌性を維持しながら、様々な医療用コラーゲン製品に原料として使用できる。
以下では、このような効果を達成するために、本発明の好適な実施例を添付図面に基づいて詳細に説明する。

本発明の方法において接線流濾過装置（ＴＦＦ）でコラーゲンを濾過する方法を説明するための模式図である。 本発明の方法における接線流濾過過程を説明するための模式図である。 本発明の方法において、中性化処理過程で用いる中性化反応タンクの構造図である。 本発明の方法において、遠心分離により濃縮されたコラーゲンを入れる混合器の構造図である。

本発明は、医療用材料として用いるために哺乳動物の組織を原料として生物学的安全性
を確保し、純度の高い高濃度の液状コラーゲンを抽出することを特徴とする。

まず、哺乳動物の組織をクリーンな水とアルコールなどで綺麗に洗浄した後、冷凍保管する。この際、水としては微生物とイオンなどの除去された精製水を使用することが望ましく、アルコールとしては消毒効果のために７０％エチルアルコールを使用することが望ましい。

動物の組織は、抽出過程に先立ち、粉砕機を用いて細かく粉砕した後、７０％エチルアルコールに２４時間浸漬して前処理過程を行う。

前処理過程を行った動物の組織を精製水で洗った後、抽出過程を行う。

第一の抽出過程である酵素処理では、ｐＨ１．５〜２．５に滴定された精製水に組織とタンパク質分解酵素を入れ、７２時間以上攪拌して反応させる。

この際、ｐＨ滴定にはリン酸、塩酸などの様々な酸性溶液を使用することができ、タンパク質分解酵素は、コラーゲンの三重螺旋構造を損なうことなく、人体に免疫反応を引き起こすおそれのある末端部分を除去することが可能なペプシンを使用することが望ましい。

酵素処理のｐＨが１．５未満である場合には、後続の濾過工程時に使用されるフィルターの化学的耐性に適さないおそれがあり、ｐＨ２．５を超える場合または反応時間が７２時間未満である場合には、ウイルス不活性化効果が低下するおそれがある。

前記エチルアルコールに７２時間以上浸漬させる前処理過程、及びｐＨ２．５以下に７２時間以上酵素処理する過程で、動物組織から混入できるウイルスを不活性化して生物学的安全性を確保することができる。

第二の抽出及び精製過程として、酵素処理済みの溶液に塩化ナトリウムを０．５〜０．９Ｍの濃度となるように添加して反応させる塩処理を行う。各タンパク質は特定の塩濃度で凝集する性質を持っており、コラーゲンは前記塩濃度で凝集して浮遊する特性を持っているが、前記塩処理過程は、これらの特性を利用した過程であって、その他の凝集していない不純物は廃棄して、コラーゲンの純度を高めることができる。

凝集しているコラーゲンは、濾過工程を行えるように、再び精製水で溶解する。

第三の精製過程として、一次的に孔隙径２．０〜０．５μｍのフィルターを用いて濾過し、接線流濾過装置（ＴＦＦ：Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて溶液内のペプシン、塩化ナトリウムなどの低分子物質を除去する。

この際、接線流濾過装置１０は分画分子量（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの濾
過膜２３を用いることが好ましく、これは、分画分子量（ＭＷＣＯ）１５０ｋＤａ以下の
濾過膜２３を用いることにより約３００ｋＤａのコラーゲンの消失を防止し、分画分子量
（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａ以上の濾過膜２３を通して約３５ｋＤａのペプシンを除去するた
めである。

接線流濾過装置を用いた濾過過程は、貯蔵タンク１１、ポンプ１２、濾過膜装置１３、
圧力計１５、及びバルブ１４によって行われる。貯蔵タンク１１の溶液をポンプ１２で濾
過膜装置１３へ移送して、溶液の流れ方向２１に対する圧力方向２２の圧力によって濾過
膜２３の孔隙よりも大きいコラーゲンは透過せずに非透過物質２４として非透過物質の回
収ライン１６を介して貯蔵タンク１１内に回収されるようにし、孔隙よりも小さい不純物
は孔隙を透過する透過物質２５として透過物質の廃棄ライン１７を介して除去されるよう
にする。濾過膜の孔隙を介して除去された容量だけ精製水１８を貯蔵タンク１１に添加し
、これを繰り返し行うと、貯蔵タンク内のコラーゲン溶液の流動性を確保しながら純度を
高めることができる（図１及び図２）。接線流濾過装置１０を用いた精製の結果は様々な
方法で確認することができ、その中でも、塩化ナトリウムの除去は浸透圧測定によって確
認することができる（実施例３参照）。

前記接線流濾過装置を用いた過程は、精製の他にも、濃縮の目的で使用される。不純物除去が完了した時点で、精製水を添加することなく濾過を繰り返し行うと、孔隙を介して水分が除去されて貯蔵タンク内のコラーゲンの含有量は増加することになる。これを利用してコラーゲンの含有量が１０ｍｇ／ｍＬとなるまで濃縮可能であり、当該工程を経て得られたコラーゲンは、 高濃度を必要としない例えば化粧品原料などの分野で使用可能である。

しかし、濃度が高くなるほど粘度が高くなるコラーゲンの特性上、１０ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮する場合、濾過膜にコラーゲンが積る現象が発生し、コラーゲン溶液の流動性が大きく低下して収率が低下し、長期間の工程時間が必要とされる。医療用コラーゲンを製造するためには、５ｍｇ／ｍＬ以下の濃度に濃縮して、滅菌濾過が可能な流動性及び粘度を確保する。

接線流濾過装置１０を用いた精製及び濃縮が完了した溶液は、孔隙径０．２２μｍのフ
ィルターを通過して濾過した後、中性化反応タンク３０へ移送する。この際、滅菌フィル
ターと中性化反応タンク３０は滅菌が先行されるべきであるのはもとより、特に中性化反
応タンク３０は適切なガスケット３１、締付装置３２などで密封可能な構造でなければな
らず、ｐＨ滴定溶液投入口３３や、ｐＨ測定のための電極３４及び溶液の温度調節のため
のジャケットなどの装備が備えられていなければならない（図３）。

滅菌濾過によって微生物が除去されたコラーゲン溶液は、中性化過程を介して再び精製及び濃縮を行う。中性化過程は、水酸化ナトリウム、塩酸などのｐＨ滴定溶液を添加してコラーゲン溶液のｐＨを６．０〜８．０に調節し、溶液の温度を２５〜３５℃に調節してコラーゲンを凝集させる。

前記中性化過程で提示したｐＨの範囲を外れるか或いは溶液の温度が低い場合には、コラーゲンの凝集が十分に行われないおそれがあり、溶液の温度が高い場合には、熱による変性が起こって三重螺旋構造が解けるおそれがある。

中性化過程を介してコラーゲンを凝集させることにより、凝集していない溶液を除去し、これにより後続の遠心分離を用いた濃縮前の濃縮対象の容量を減らすことができ、水分とコラーゲンの分離を容易にして低遠心力で短時間内に濃縮を行うことができるので、相対的に低いコストで量産可能な設備を構築することができる。

中性化を介して凝集したコラーゲンを滅菌可能な遠心分離容器に入れた後、遠心分離機を用いて４，０００〜６，０００ｇの重力加速度で５分間濃縮を行う。

前記遠心力よりも低いか或いは短い時間を適用する場合には、コラーゲンの収量が低下したり最終濃度が低くなったりする問題が発生するおそれがあり、より高い重力加速度と時間を適用する場合には、このための高性能の高価な遠心分離機が要求され、製造時間が増加するおそれがある。

濃縮過程を経たコラーゲンは、ガスケットａ、締付け装置ｂ、回転軸密封装置ｃ、羽根
の回転軸ｄからなる密閉構造を備えた混合器（図４）に入れた後、均質に混合すると、医
療用材料として用いるための高濃度のコラーゲンを得ることができる。この際、コラーゲ
ンの濃度は、適用しようとする目的に応じて、微生物及び発熱性物質の除去された水を添
加して調節することができ、上記の条件下で１２０ｍｇ／ｍＬの高濃度コラーゲンを得る
ことができる。

また、前記混合過程において塩酸などの酸性溶液をｐＨ滴定溶液として添加してｐＨ１．５〜５．５に滴定して保管すると、均質な状態で長期間安定的に保管することができる。ｐＨがあまり低い場合には、後に医療用に製品を製造するためにｐＨを中性に滴定することが難しく、ｐＨが５．５よりも高い場合には、コラーゲンが再び凝集して均一な濃度を維持することが難しい。

前記抽出、精製、濃縮および混合過程を経て得られたコラーゲンは、使用用途に応じて水、等張液、多血小板血漿（ＰＲＰ）、ヒアルロン酸などの混合溶媒と混合し、希釈して液状の製品を生産することができ、濃縮されたコラーゲンから凍結乾燥によって固形の製品を生産することができる。

特に、液状の製品は、混合、充填及び包装空間などの最小限のクリーンルーム設備内でウイルス、微生物などを除去した生物学的安全性が確保された状態を維持しながら製品を生産することができる。
［実施例１］

豚の皮膚組織を用いた医療用コラーゲンの製造及び活用
１）豚の皮膚組織を精製水とアルコールなどできれいに洗浄した後、−２０℃以下で冷凍保管する。
２）豚の皮膚組織を細かく粉砕する。
３）粉砕された皮膚組織を７０％エチルアルコールに２４時間浸漬させる。
（ウイルス不活性化工程ステップ１）
４）組織を精製水で濯いで、リン酸を用いて酸性（ｐＨ１．５〜２．５）に滴定された精製水に入れた後、ペプシンを入れ、７２時間以上攪拌して反応させる。（ウイルス不活性化工程ステップ２）
この際、ペプシンの量は皮膚組織の重量の１／４〜１／１０が好ましい。
５）塩化ナトリウムを０．５〜０．９Ｍの濃度となるように添加し、撹拌してコラーゲンが凝集するようにした後、凝集していない溶液を除去する。
６）凝集したコラーゲンを、ｐＨ１．５〜４．０に滴定された用水で溶解した後、孔隙径２．０〜０．５μｍのフィルターを用いて濾過する。
７）コラーゲンが医療用への使用に適するように、接線流濾過装置（ＴＦＦ：Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて溶液内のペプシンなどの低分子物質と塩化ナトリウムを除去する。
この際、接線流濾過装置は、分画分子量（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの濾過膜を用いることが好ましく、濾過膜の孔隙から抜け出た容量だけ精製水を添加して貯蔵タンク内のコラーゲン溶液の容量を維持することにより、流動性を確保する。
８）塩化ナトリウム、ペプシンなどの低分子物質の除去が完了すると、精製水の供給を停止し、接線流濾過は維持して濃縮を行う。この際、コラーゲンの濃度は、孔隙径０．２２μｍのフィルターに通過できるようにコラーゲンの濃度を５ｍｇ／ｍＬ以下に調節する。９）微生物を除去するために、孔隙径０．２２μｍのフィルターで濾過する。
１０）微生物の除去された溶液は、滅菌した中性化タンクへ移送されるようにする。中性化タンクは、滅菌が可能で、滅菌状態を維持することができる密封構造でなければならず、ｐＨ滴定溶液投入口とｐＨ測定電極が備えられていなければならない。
１１）コラーゲンを凝集させるために、塩酸（ＨＣｌ）と水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）を用いてｐＨを中性（ｐＨ６．０〜８．０）に近くなるように滴定し、コラーゲン溶液の温度が２５〜３５℃となるように調節して４時間〜１日間静置する。
１２）凝集していない溶液は廃棄し、凝集しているコラーゲン層を遠心分離容器に入れて遠心分離機に仕込み、４，０００〜６，０００ｇの重力加速度で遠心分離してコラーゲン
を濃縮する。
１３）遠心分離容器内から水を除去し、水分と分離されて濃縮されたコラーゲンを混合器に入れた後、攪拌すると、濃度約１２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを得ることができる。
この際、塩酸などの酸性溶液と混合してｐＨを１．５〜５．５に調節すると、濃度が均質な状態で保管することができる。
１４）上記の方法によって、コラーゲンは、微生物が除去され、純度が高く且つコラーゲンの性質を維持した状態に製造されて医療用への使用に適し、１２０ｍｇ／ｍＬの高濃度で製造されて様々な製品に適用できる。
一例として、前記コラーゲンが液状を維持し且つ人体内の塩分と同じ組成を持つように添加剤を混合した後、フリーフィールドシリンジに充填して、人体に注入可能な形態の製品を作ることができる。
［実施例２］

ウイルス不活性化の検証
実施例１の製造過程のうち、ウイルス不活性化過程を３回にわたる模擬実験によって検証した。

指標ウイルスは、遺伝子型、脂質外皮の有無、抵抗性の程度を考慮して、ＰＥＤＶ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ）、ＰＲＶ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ＰＰＶ（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）を選定した。

選定された４種のウイルスを粉砕された豚に接種した後、実際の製造方法の前処理過程と酵素処理過程を再現するために、７０％エチルアルコールに２４時間、リン酸を用いてｐＨ２．５に滴定した酸性溶液に７２時間反応させる。

ウイルス不活性化過程を再現したサンプルを、ウイルス定量分析によって処理前と処理後を比較する。

同じ条件下での３回の模擬実験結果は同じであった。すべてのウイルスが検出限界以下に検出された。また、各ウイルス不活性化過程別の対数減少因子(ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ)値は、ウイルス不活性化に有効であるという一般的な基準である２対数減少因子(ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ)以上であると確認された。各過程別のＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＰＶ、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ
ｖｉｒｕｓ）の対数減少因子の最大累積値（Ｍａｘｉｍｕｍ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）は、それぞれ≧６．７５、≧９．７５、≧８．７５、≧８．７５であって、強力なウイルス不活性化効果を示すと評価される。

［実施例３］

接線流濾過を用いた塩化ナトリウム除去
実施例１で酵素処理、塩化ナトリウム処理、孔隙径２．０〜０．５μｍのフィルターを用いて濾過した後、分画分子量（ＭＷＣＯ）１００ｋＤａの濾過膜を用いて接線流濾過を行った。

この際、濾過膜の孔隙を介して除去された容量だけ精製水を添加し、これを繰り返し行うと、貯蔵タンク内のコラーゲン溶液の流動性を確保しながら塩化ナトリウム、ペプシンなどの低分子物質を除去した。添加された精製水の総容量は初期コラーゲン溶液の容量の５倍であった。

前記接線流濾過過程を３回繰り返し行って低分子物質を除去した結果を、塩化ナトリウムを代表物質として選定して浸透圧を測定して検証した。

その結果、除去比率がそれぞれ９６．２％、９６．１％、９６．４％であり、平均除去率は９６．２％であることを確認した。このことから、接線流濾過を用いた低分子物質除去が効果的であることが分かる。特に、塩化ナトリウムは血漿浸透圧である２８５ｍＯｓｍよりも低い３１〜３３ｍＯｓｍの浸透圧を示し、必要に応じて等張溶液と混合して医療用材料として用いることができる。

［実施例４］

段階別濃縮によるコラーゲン濃度
実施例１の製造方法に基づいて、豚皮膚を５ｋｇ、ペプシンを１ｋｇ使用し、接線流濾過段階で初期容量比１／２の容量に濃縮を進めたときの各段階のコラーゲン濃度を分析した。

酵素処理過程から孔隙径２．０〜０．５μｍのフィルターを用いた濾過過程までの濃度は事例別に１．６〜２．４ｍｇ／ｍＬであり、接線流濾過過程で低分子物質を除去した後、３．２〜４．８ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。

これは接線流濾過の後、孔隙径０．２２μｍの滅菌濾過フィルターを通過させるためであり、２ｍｇ／ｍＬ以下の濃度に調節する場合には、コラーゲン溶液が増大して中性化反応タンクの容量が大きくなり、中性化過程の後、遠心分離を利用した濃縮に多くの時間がかかり、結果としてコスト上昇をもたらすおそれがある。逆に、５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度に調節される場合には、粘度が上昇して孔隙径０．２２μｍの滅菌フィルターを通過し難いため、早期に滅菌フィルターが詰まってコラーゲンが消失し且つ多くのフィルターを使用しなければならないという問題が発生する。このような理由から、滅菌濾過前の濃度を２〜５ｍｇ／ｍＬに調節することが好ましい。

中性化過程で凝集していない水分を１次的に除去することにより、コラーゲンの濃度を３．２〜４．８ｍｇ／ｍＬから５．６〜６．７ｍｇ／ｍＬに濃縮することができることを確認した。これにより、中性化過程前の濃度に比べて約１．４〜１．８倍に濃縮し、遠心分離を利用した濃縮の際に初期容量を減らすことができるため、遠心分離機の容量及び処理時間を減らすことができるという産業的利用の利点がある。

最終的に、中性化過程の後に凝集しているコラーゲン溶液を遠心分離を用いて濃縮するとき、各事例別に１１４．６〜１２２．３ｍｇ／ｍＬの高濃度コラーゲンを得ることができた。これは、通常３０〜６０ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される液状の医療用コラーゲン製品の原料としての使用に適するうえ、凍結乾燥を利用した固形の製剤を製造する上で凍結乾燥機の容量及び稼働時間を減らすことができるという利点を確保することができる。

＊注）Ａ：酵素処理過程〜濾過（孔隙径２．０〜０．５μｍ）過程
Ｂ：接線流濾過過程（低分子物質除去後の濃縮過程）
Ｃ：中性化処理過程（未凝集溶液除去後）
Ｄ：遠心分離を利用した濃縮過程

本発明は、上述した詳細な説明に記載されている特別な形態に限定されるものではないと理解されるべきであり、請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲内にある全ての変形物、均等物及び代替物を含むものと理解されるべきである。

１０ 接線流濾過装置
１１ 貯蔵タンク
１２ ポンプ
１３ 接線流濾過膜装置
１４ バルブ
１５ 圧力計
１６ 非透過物質の回収ライン
１７ 透過物質の廃棄ライン
１８ 精製水
２１ 溶液の流れ方向
２２ 圧力方向
２３ 接線流濾過膜
２４ 非透過物質
２５ 透過物質
３１、ａ ガスケット
３２、ｂ 締付装置
３３ ｐＨ滴定溶液投入口
３４ ｐＨ測定のための電極
ｃ 回転軸密封装置
ｄ 羽根の回転軸

Claims (4)

1. 前処理過程として、哺乳動物の組織を洗浄する段階と、洗浄された哺乳動物の組織を粉砕
   してエチルアルコールに浸漬する段階と、
   第一の抽出過程として、前記哺乳動物の粉砕された組織に対して、リン酸でｐＨ１．５〜
   ２．５に滴定された溶液中でペプシンと反応させて酵素処理しウイルスを不活性化すると
   ともに、コラーゲンを抽出する段階と、
   第二の抽出及び精製過程として、前記酵素処理済みの溶液に塩化ナトリウムを０．５〜０
   ．９Ｍの濃度となるように添加して攪拌した後、コラーゲンが凝集するようにする段階と
   、
   第三の精製過程として、前記凝集しているコラーゲンを精製水に溶解してコラーゲン濃度
   を１．６〜２．４ｍｇ／ｍＬとした後、孔隙径２．０〜０．５μｍのフィルターを用いて
   濾過し、接線流濾過装置を用いて溶液内のペプシン、塩化ナトリウムを除去して純度を高
   めた後、コラーゲン濃度を２〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮する段階と、
   中性化処理過程として、前記接線流濾過装置を用いて濃縮されたコラーゲン溶液を孔隙径
   ０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過して微生物が除去されたコラーゲン溶液を、中性化
   反応タンク中において、ｐＨ滴定溶液を用いて中性化してコラーゲンを凝集させ、未凝集
   溶液を除去し、コラーゲン濃度を５．６〜６．７ｍｇ／ｍＬに濃縮する段階と、
   遠心分離を利用した濃縮過程として、前記濃縮されたコラーゲンを遠心分離機を用いてコ
   ラーゲン濃度を１１４．６〜１２２．３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、濃縮されたコラーゲンを混
   合器に入れた後、攪拌する段階と、
   を含んでなる、医療用材料として用いるための高濃度コラーゲンの製造方法。
2. 前記第三の精製過程において、前記接線流濾過装置は、分画分子量５０ｋＤａ〜１５０ｋ
   Ｄａの濾過膜を使用し、濾過膜の孔隙を介して除去された容量分だけ精製水を溶液に添加
   して流動性を維持することを特徴とする、請求項１に記載の医療用材料として用いるため
   の高濃度コラーゲンの製造方法。
3. 前記中性化処理過程において、前記接線流濾過装置を用いて濃縮されたコラーゲンを、ｐ
   Ｈが中性（６．０〜８．０）に近い値を持つようにし、その温度が２５〜３５℃を保つよ
   うにして４時間〜２４時間静置し、コラーゲンを濃縮することを特徴とする、請求項１に
   記載の医療用材料として用いるための高濃度コラーゲンの製造方法。
4. 前記遠心分離を利用した濃縮過程において、前記中性化処理過程により濃縮されたコラー
   ゲンを４，０００〜６，０００ｇの重力加速度で遠心分離して濃縮し、混合器に入れて撹
   拌することで、１２０ｍｇ／ｍＬの高濃度コラーゲンを得ることを特徴とする、請求項１
   に記載の医療用材料として用いるための高濃度コラーゲンの製造方法。