CN1678631A - 骨诱导性生物材料 - Google Patents

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Abstract

在从骨骼中分离成骨蛋白的方法中，含有片断的成骨蛋白从骨骼中被提取，并且通过选自超滤和层析的富集步骤的顺序被富集。本发明的改进在于在富集步骤之前从含有片断的成骨蛋白中去除较高的分子量组分。该较高分子量组分具有约100～300kDa的分子量，并且选自胶原、胶原片断、胶原聚集体及其混合物。

Description

骨诱导性生物材料
技术领域
本发明涉及骨诱导性生物材料(osteoinductive biomaterial)。尤其，本发明涉及一种成骨组合物，及该成骨组合物在治疗中的应用
背景技术
本发明的成骨组合物尤其被用于人或哺乳动物的组织再生，并且被用于促进或诱导骨骼生长。出于本说明的目的，术语“成骨蛋白”指通过分离哺乳动物的总骨骼蛋白而获得的，并且能够诱导骨形成的物质。术语“成骨的”和“骨诱导的”被认为是同义词。骨发生是被用于描述成年哺乳动物中的骨骼重新形成的术语，并且在成年个体的骨折的再生过程中被证实。该过程通过与胚胎时期的骨生成极其类似过程而进行。在其它未鉴定的蛋白中的成骨蛋白含有骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein BMPs)。此类蛋白为被分类为形态发生蛋白中较大的转化生长因子-β超家族(transforming growthfactor-beta superfamily)中的一部分的特征蛋白家族。BMP家族包括多于12种的已知能够在哺乳动物中诱导骨骼形成的个体成员。
发明内容
根据本发明的第一个方面，提供了对从骨骼中分离成骨蛋白的方法的改进，在该方法中含有片断的成骨蛋白从骨骼中被提取，并且通过选自超滤和层析的富集步骤的顺序被富集，所述改进在于在富集步骤之前从含有片断的成骨蛋白中去除较高分子量组分。
所述较高分子量组分可以具有约100～300kDa的分子量。所述较高分子量组分典型地包括胶原、胶原片断、胶原聚集体及其混合物。
该方法可以包括通过超滤去除所述较高分子量的组分。例如，可通过经过100～300kDa标准分子量膜(nominal molecular weightmembrane)，如100～300kDa标准分子量的聚砜薄膜的超滤而去除所述组分。
可以使用离液序列高的溶液(chaotropic solution)从骨骼中提取含有片断的成骨蛋白。所述离液序列高的溶液可以含有脲、氯化胍或其组合。
所述富集步骤可以包括通过逐渐减小的标准分子量膜的含有片断的成骨蛋白的连续超滤，随后或交替进行层析富集步骤。因此富集步骤可以包括一步或多步层析步骤。
含有片断的成骨蛋白可以通过连续的超滤步骤而被浓缩并被去盐。所述片断可以通过10kDA和5kDA的超滤步骤而被浓缩和去盐。
所述层析富集步骤可以选自一种或多种肝磷脂-琼脂糖凝胶层析(heparin-sepharose chromatography)、羟磷灰石层析(hydroxyapatitechromatography)、反向硅胶层析和其中任意两种或多种的组合。
根据本发明的第二方面，提供了包括成骨蛋白、不溶性骨基质(ICBM)和明胶的诱导骨生长的组合物。
所述组合物可以为水合性粉末形式。
所述不溶性骨基质可以通过以下步骤制备：用酸去除全骨粉末中的矿质以产生酸性去矿质的全骨粉末或基质，用如尿素水溶液或胍盐溶液的离液剂(chaotropic agent)从去矿质的骨粉或基质中提取可溶性组分，水洗残留物，然后干燥该残留物从而制备不溶性骨基质。
可以通过提取不溶性骨基质以制备富含可溶性I型胶原的片断、沉淀该可溶性I型胶原并真空干燥该沉淀物，从而获得明胶。
可以用纯的沸水进行提取，并且可以用乙醇进行沉淀。
所述不溶性胶原骨基质可以为哺乳动物的。也可以为非人体的或人体的不溶性胶原骨基质。优选为人的不溶性胶原骨基质，或hICBM。相应地，明胶可以为人的明胶。
可以通过上述方法制备成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人明胶之间的质量比约为0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，诱导骨生长的组合物中成骨蛋白的含量可以约为400～600μg，hICBM的含量约为800～1200mg，人明胶的含量约为100～1000mg。在优选实施例中，所述诱导骨生长的组合物中成骨蛋白的含量约为500μg，hICBM的含量约为1000mg，人明胶的含量约为200mg。
本发明延及如上所述的诱导骨生长的组合物，其中通过上述改进方法制备成骨蛋白。
根据本发明的另一方面，提供了制备诱导骨生长的组合物的方法，该方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基质和明胶的步骤。
所述不溶性胶原骨基质可以为哺乳动物的，并且可以选自非人体的或人体的不溶性胶原骨基质。优选为人体的不溶性胶原骨基质或hICBM。明胶可以为人的明胶。
可以通过上述方法制备成骨蛋白。
成骨蛋白、hICBM和人的明胶之间的质量比可以为0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
因此，该方法可以包含混合约400～600μg的成骨蛋白、约800～1200mg的hICBM、约100～1000mg的人明胶。在优选实施例中，该方法可以包含混合约500μg的成骨蛋白、约1000mg的hICBM、约200mg的人明胶。
该方法可以包括将成骨蛋白与hICBM在稀酸性水溶液中混合、冻干所得混合物，以制备干粉末，并将该粉末与人的明胶混合，以制备水合材料。
根据本发明的另一方面，提供了用于诱导哺乳动物骨骼生长的设备，该设备包括含有成骨蛋白、不溶性骨基质和明胶的诱导骨骼生长的组合物，和用于向治疗部位输送所述组合物的输送装置。
所述成骨蛋白、不溶性骨基质和明胶可以为上述类型。所述输送装置可以为注射器。
尤其，该组合物可以为上述的可以被容纳在注射器中的水合性的干粉。因此，通过向注射器中注入盐水溶液，所述材料可以被水合，以注入到输送部位内。
根据本发明的另一方面，提供了一种在具有骨骼缺陷的哺乳动物中诱导骨骼形成的方法，该方法包括向哺乳动物的骨骼缺陷处注入上述诱导骨骼的组合物的步骤。
根据本发明的另一方面，提供了诱导哺乳动物中异位骨生长的方法，该方法包括向哺乳动物的非骨质部位注入上述诱导骨骼的组合物的步骤。
根据本发明的另一方面，提供了一种加速哺乳动物中异源骨愈合的方法，该方法包括将异源骨物质与上述诱导骨骼的组合物一起注入哺乳动物中需要异源骨愈合的位置的步骤。
该异源骨材料可以为组织库的骨，包括人的皮层骨片、松质骨块、松质骨粉、全骨或脱矿骨基质。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于加速哺乳动物中自体骨移植愈合的方法，该方法包括将自体骨材料与上述诱导骨的组合物一起注入哺乳动物中需要自体骨移植愈合的位置。
所述自体骨材料可以为髂嵴自体骨。
根据本发明的另一方面，提供了用于诱导具有骨骼缺陷的哺乳动物中骨骼形成的方法中的物质或组合物，所述物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物，并且该方法包括将所述组合物注入哺乳动物的骨骼缺陷处。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用于诱导哺乳动物中异位骨生长的方法中的物质或组合物，该物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物，并且所述方法包括将所述组合物注入哺乳动物的非骨质部位的步骤。
根据本发明的另一方面，提供了用于加速哺乳动物中异源骨愈合的物质或组合物，该物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物，并且所述方法包括将异源骨材料与所述组合物一起注入到哺乳动物中需要异源骨愈合的位置的步骤。
所述异源骨材料可以为选自人的皮层骨片、松质骨块、松质骨粉、全颗粒骨或脱矿质骨基质的组织库的骨骼。
根据本发明的另一方面，提供了用于加速哺乳动物中自体骨移植愈合的物质或组合物，该物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物，并且所述方法包括将自体骨材料与所述组合物一起注入到哺乳动物中需要自体骨移植愈合的位置的步骤。
所述自体骨材料可以为碎的髂嵴自体骨。
根据本发明的另一方面，提供了物质或组合物在制备用于诱导具有骨骼缺陷的哺乳动物中骨骼形成的方法的药物的应用，所述物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了物质或组合物在制备用于诱导哺乳动物中异位骨生长的方法的药物的应用，所述物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物。
根据本发明的另一方面，提供了物质或组合物在制备用于加速哺乳动物中异源骨愈合的药物中的应用，所述物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物和异源骨材料。
所述异源骨材料可以为选自人的皮层骨片、松质骨块、松质骨粉、全骨或脱矿质骨基质的组织库的骨骼。
根据本发明的另一方面，提供了物质或组合物在制备用于加速哺乳动物中自体骨移植愈合的药物中的应用，所述物质或组合物包括上述诱导骨骼生长的组合物和自体骨材料。
所述自体骨材料可以为碎髂嵴自体骨。
本发明相应地涉及由哺乳动物的骨制备成骨蛋白，及其在骨修复中与基质相结合的应用。
                           讨论
哺乳动物的骨组织为被称作骨形态发生蛋白(BMPs)的蛋白生长和分化因子的家族的宿主。当这些蛋白被注射到青年或成年哺乳动物中时，其能够诱导新骨形成。
BMPs在成年个体中被调遣以通过与胚胎分化极其类似的机制产生骨的再生。骨分化的发育过程包括间质细胞的趋化作用、祖细胞的繁殖、软骨的分化、血管侵入、骨形成、重新成型和最终的骨髓分化(Reddi，(1981)Collagen Rel.Res，1：209-226)。已发现骨基质的天然软骨内骨分化活性可以分离地被获取，并且可以用无活性的残余基质再构建，从而恢复全骨诱导活性(Sampath and Reddi，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7599-7603)。Sampath等(1987)公开了成骨素，即来自哺乳动物骨骼的成骨蛋白的纯化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。Urist等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：371-375)公开了具有酸性多肽的特性、并具有约18kD分子量的牛的骨形态发生蛋白提取物。该作者报道了该蛋白存在于通过羟磷灰石层析分离的片断，并且该蛋白诱导小鼠后腿肌肉中的骨骼形成，及在大鼠和狗的头骨内的环钻损伤处的骨再生。
1985年10月7日出版的欧洲专利申请No.148,155公开了源自牛、猪和人的成骨蛋白。其中一种被发明人命名为P3蛋白，并具有22～24kD分子量的蛋白质，被报道已经被纯化至基本均质态。据报道，当该材料被注入动物体内时，能够诱导骨形成。
本发明的目的是提供一种以高产率由哺乳动物骨组织制备成骨蛋白的方法。另一目的是提供一种含有被吸附到基质上的成骨蛋白的骨骼诱导的设备作为所述骨形态发生蛋白的输送系统。
本发明提供了成骨设备，当在哺乳动物的骨骼缺陷处植入时，它能够在植入处诱导骨骼的完全再生，和随后的缺陷愈合。该设备包括下述基质载体材料，和成骨蛋白，即含有骨形态发生蛋白(BMPs)的总提取骨蛋白的一部分。
成骨蛋白需要适当的输送材料的存在，以实现其骨再生作用。从去矿质骨基质中纯化的基质为这种适合的材料，并在以下进行更详细的描述。
用于分离成骨蛋白的方法部分采用了Sampath等(1987)公开的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7109-7113)。该方法利用了BMP’s对被固定在层析载体颗粒上的羟磷灰石和肝磷脂的亲和性，以实现富BMP片断的分离。该方法使用了在肝磷脂层析柱上的去矿质骨的尿素提取物的层析，随后使用羟磷灰石柱，最后使用凝胶排阻层析，以去除重分子量污染物。尽管该方法取得了对具有成骨能力的片断的有效分离，但是使用本发明的方法成骨蛋白的产量、产率和纯化速度都极大地被提高。
本发明的成骨蛋白的制备是基于Sampath等的方法(1987)，但是包括了新颖的和创造性的改进。关键的改进涉及在层析之前，在纯化过程开始时，将总骨蛋白提取物分为高、低的分子量部分。骨形态发生蛋白具有约30kDa的分子量，并且出于本说明的目的，被分类为低分子量的多肽。对本说明来说，高分子量的多肽包括分子量大于100kDa并且尤其大于300kDa的多肽。所述高分子量片断包括胶原和胶原片断(约100kDa)，以及胶原聚集物(200kDa，或更高)，和其它的未识别的多肽，其中一些被认为是形态发生素诱导的成骨作用的抑制剂。对本说明来说，注意到在肝磷脂亲和层析步骤之前，在此方法的开始时，从低分子量片断中分离胶原是很重要的。
出于以下原因，胶原的分离是重要的。首先，I型胶原被认为具有BMPs亲和性(Reddi AH(1995)Cartilage morphogenesis：role of boneand cartilage morphogenetic proteins，homeobox genes andextracellular matrix.Matrix Biol.Oct 14(8)：599-606.；Winn SR，Uludag H，Hollinger JO.(1999) Carrier systems for bonemorphogenetic proteins.Clin Orthop 1999 Oct(367Suppl)：S95-106)。其次，肽为经常阻塞柱子、并且以阻碍结合的方式来改变BMP与肝磷脂分子上的结合位点的交换动力学的大MW肽。此外，似乎可能存在在总提取骨蛋白的高分子量片断中残留骨形态发生蛋白，即成骨蛋白的活性组分，的抑制因子。这表明在I型胶原和肝磷脂之间存在对BMPs的竞争性结合。这种竞争性结合的阻扰看来导致BMPs在肝磷脂柱上的层析纯化过程中的产率损失。本发明的方法在总成骨活性的回收方面取得了超过现有技术方法的显著进步。
现在，通过参考以下实施例和附图的方式描述本发明。
附图说明
图1表示不同时间的被治疗的骨折不愈合(non-union)的X射线测定值；
图2表示常规方法治疗后的患者的骨骼中的骨折不愈合。
图3表示经过根据本发明的方法的治疗后，图2中的患者的骨骼的完全愈合。
具体实施方式
                         实施例1
          含有骨形态发生蛋白的人成骨蛋白的纯化
1. 去矿质骨的制备
无软组织粘附的人长骨骨干被去骨髓，然后切成1～4cm的片。该材料在含有体积比为50∶50的甲醇和氯仿的溶剂体系中，在4～8℃下被脱脂16～24小时。然后，在4～8℃下此骨在纯乙醇中被脱水48小时。倒出乙醇，并且该骨在通风橱中被空气干燥48～96小时。然后，用锤式粉碎机磨碎骨头，以使颗粒直径范围为10～425微米。
在室温下通过连续加入4～5体积的0.5M HCl，直至通过一段时间内的pH变化的减缓而判断骨骼中的羟磷灰石和盐酸之间的酸碱反应已经接近完成，从而去除该微粒材料的矿质。用稀释的碳酸氢钠溶液中和该去矿质骨，然后用纯化的水清洗，以制备去矿质的骨基质。
2. 去除矿质的骨基质的不连续提取
由以上步骤制备的去矿质骨基质(DBM)用3～4体积的8M尿素，pH7.4，含有蛋白酶抑制剂(5mM盐酸苯甲脒，0.1M 6-氨基己酸，5mMN-乙基马来酰亚胺和0.5mM苯基甲磺酰氟)的50mM Tris-HCl在4～8℃下24小时提取2次。通过经过多孔聚丙稀玻璃料的过滤收集上清，然后通过3微米标准尺寸的筒式过滤器(Polygard，MilliporeCorporation，美国)过滤。
3. 高分子量组分的超滤分离
通过将步骤2中的上清液通过300kDa标准分子量膜(Millipore，Cat.No.CDUF006TM)进行超滤从而去除重分子量蛋白和胶原。可以任选使用具有稍低的总BMP活性的产率、但具有较高特异活性的100kDa标准分子量膜。该方法去除去除在较低离子强度的条件下结合BMPs的胶原，尤其I型胶原。渗余物用6M尿素缓冲液、pH7.4的50mMTris-HCL(缓冲液A)液清洗几次，然后收集含有成骨活性的渗滤物。
4.通过超滤缓冲液交换的浓缩和去盐
步骤3中的含有成骨蛋白(分子量约为30kDa)的渗滤物通过在10kDa PLGC膜(Millipore，Cat.No.SK1P003W4)上的超滤被去盐并浓缩。该步骤有效地去除了盐和其它的低分子量组分，从达到以下层析步骤所需的条件。浓缩后，相继量的含有上述浓度的酶抑制剂、但是除了n-乙基马来酰亚胺外的缓冲液A被加入到渗余物中，直至该渗余物的传导率达到5.0～6.0毫西门子。
5. 肝磷脂-琼脂糖层析
步骤4中的渗余物在已用含0.15M NaCl的缓冲液A平衡的肝磷脂-琼脂糖CL6b(Pharmacia-Amersham)上被层析。该柱子用3柱体积的含有0.15M NaCl的缓冲液A清洗，然后用含有0.5M NaCl的缓冲液A洗脱。收集在280nm处具有吸收的洗脱峰，并在4℃保存。
6.肝磷脂-琼脂糖亲和性片断的超滤交换
步骤5中的肝磷脂-琼脂糖亲和性片断通过在PLCC 5kDa膜(Millipore，Cat.No.CDUF001LC)上的超滤被去盐并被浓缩。该步骤有效地去除盐和其它的低分子量组分，以达到下一层析步骤所需的条件。浓缩后，相继量的含有10mM磷酸钠的缓冲液A被加到渗余物中，直至该渗余物的传导率达到5.0～6.0毫西门子。
7. 羟磷灰石(HA)层析
步骤6中得到的渗余物在已被含10mM磷酸钠的缓冲液A平衡的羟磷灰石柱(Hydroxyapatite Ultrogel，Biosepra，法国)上被层析。该柱子用3柱体积的含有10mM磷酸钠的缓冲液A清洗。用含有150mM磷酸钠的缓冲液A洗脱富含成骨蛋白的片断。收集在280nm处具有吸收的洗脱峰，并在4℃保存。
8.将HA亲和性片断交换到10mM HCl中
使用负载有3kDa截留值的纤维素膜(YM3，76mm再生纤维素，Millipore Corporation，美国)的Amicon搅拌式超滤器(MilliporeCorporation，美国)将步骤7中的HA亲和性的片断交换到10mM HCl溶液中。
在本发明的一个实施例中，HA亲和性片断被改为负载到C-18Vydac硅基HPLC柱(颗粒直径为5μm，孔尺寸为300)上。用10柱体积的0.1％的三氟乙酸、10％乙腈洗柱子，并用70％乙腈、0.1％三氟乙酸逐步洗脱结合蛋白。冻干该材料，并在10mM HCl中被重组。
在表1中列出具有蛋白值的方法流程图。
                        表1
步骤                程序 总蛋白(mg)
1   5kg人骨粉被脱水、脱脂 未测定
2   用含有脲或氯化胍的离液序列高的溶液提取 17703
3   通过具有3.0微米标准孔尺寸、商品编号为CR0301006的Millipore Polygard CR筒式滤器进行过滤 未测定
4   使用具有300kD的标准孔尺寸的膜超滤 15069
5   使用具有10kD的标准孔尺寸的膜进行超滤和缓冲液交换 8881
6   肝磷脂亲和性分离 211.43
7   羟磷灰石亲和性分离 62.99
8   超滤交换或HPLC 40～60
被加载在1.2g基质上的500μg的实施例1中步骤8的材料，诱导人的顽固性长骨不结合处的新骨形成。通过S-200凝胶过滤层析(Pharmacia)分析步骤8中的材料，并发现含有20％质量的高分子量组分。这些组分可以通过使用S-200基质(Pharmacia)上的凝胶排阻层析和用8M脲，1M NaCl，50mM pH7.4的Tris-HCl洗脱的“纯化”步骤被任选地去除。最终的产率范围为30mg～50mg的成骨蛋白。这些产率比那些已报道的使用相当的起始骨材料和基于羟磷灰石亲和性、肝磷脂亲和性和在S-200基质(Pharmacia)上的凝胶排阻层析的方法的狒狒骨提取(Ripamonti U，Ma SS，Cunningham NS，Yeates L，Reddi AH(1993)Reconstruction of the bone-bone marrow organ by osteogenin，abone morphogenetic protein，and demineralised bone matrix in calvarialdefects of adult primates(Plastic and Reconstructive Surgery 91(1)：27-36))的产率高4倍。在人和狒狒的髂嵴骨活组织切片检查之间的对比组织形态研究已经表明在两个物种之间具有显著程度的相似性(SchnitzlerCM，Ripamonti U，and Mesquita JM(1993)Histomorphometry of iliaccrest trabecular bone in adult male baboons in captivity，Calcif，Tiss.Int.，52，447-454)。
                         实施例2
                成骨蛋白的成骨活性的测定
大鼠的生物鉴定
成骨活性的生物试验如Sampath和Reddi(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：6591-6595)所述。该试验包括在被醚麻醉的受体鼠的皮下植入含有不溶性骨基质和人成骨蛋白的测试样品。在无菌条件下在胸部区域的皮肤上切开垂直的切口(1cm)，并且通过钝器解剖制成对称的小袋。植入物包括25mg的大鼠ICBM，50mg溶于0.5M乙酸中的鼠尾I型胶原，和可变量的成骨蛋白。测试样品被对称植入到各小袋中，并且缝合切口。异向的位点使能够进行骨诱导的研究，而无由于使用骨质位点而导致的可能的混淆。
在植入后的第12天取出再生组织，并且如所述的(Reddi andSullivan 1980 Endocrinology 107：1291-1299)进行骨形成标记的碱性磷酸酶活性的试验。结果和数据如表2所示。
                           表2
          鼠生物测定重复实验     4
  每份植入物中被化验的成骨蛋白的微克量   100μg
  碱性磷酸酶活性单位/mg蛋白(4个重复试验的平均值)   8.82U/mg(sd＝3.8)
*hICBM-人不溶性骨基质
大鼠植入模型显示了通过成骨蛋白诱导的软骨内骨发育的阶段的可控制的进展。该后胚胎骨生成可以被认为概要重现了正常的胚胎骨发育过程中的活动。新骨的形成经过局部间叶细胞浓缩、软骨阶段和细胞外基质形成、血管侵入和矿质化，以及最后经由骨原细胞系分化的新骨的形成。
使用甲苯胺蓝或苏木精/伊红(hemotoxylin/eosin)染色的组织学分析清晰地表明软骨的发育。十二天的植入通常足以确定是否该植入物具有骨诱导活性。
碱性磷酸酶活性可以作为骨生成的标记。在植入物均质化和在碱性条件下以p-磷酸硝基苯做底物进行酶活性试验后，可以通过分光光度测定酶活性。在组织学上不显示骨发育的植入物在这些试验条件下应该不具有碱性磷酸酶活性(Reddi AH and Sullivan NE(1980)Endocrinology 107，1291-1299)。该试验对于碱性磷酸酶的特异的和总活性的定量是有用的，并且这可能与所述被制备的成骨蛋白的骨诱导能力相关。
根据Reddi和Sullivan(1980，Endocrinology 107，1291-1299)的方法测定碱性磷酸酶活性。鼠植入物诱导的1单位或更多的碱性磷酸酶说明了有效的性生成。
                         实施例3
                      人明胶的制备
在硼硅酸盐玻璃瓶中混合一定量的ICBM和5～10体积的水，并在高压锅中加热1小时。用Whatman No.1滤纸或20微米的不锈钢筛过滤上清。将明胶溶液冷却到25℃，并向胶原沉淀物中加入5体积冷乙醇(-20℃)。在真空中干燥沉淀物，并且被研磨至75～425微米的尺寸范围。
                        实施例4
                    成骨设备的制造
人ICBM被用作制备骨诱导性的组合生物材料的可吸附性的载体基质。当足够量的成骨蛋白与ICBM混合时，无活性的ICBM被恢复生物活性。ICBM的颗粒尺寸影响新骨的量反应。75～420μm的颗粒引起最大反应。一定量的ICBM与成骨蛋白在10mM HCl中混合，并且用无菌调药刀彻底混合。所得材料被冻干干燥。
然后，将该材料与人ICBM源的明胶混合。将各组分充分干燥混合到一起，以获得均质分布的混合物。人明胶发挥使生物材料可被挤压的易水合性材料的作用。该组合物被装载到注射器中。当使用时，该骨诱导性组合物被再水合。当将一定量的无菌盐水或水吸入到注射器中时，再水合作用被实现，并且需要约10分钟以使再水合作用发生。然后，可以通过推动活塞而容易地将所述物质排出注射器。这使在手术时能够将精确量的植入物置入缺陷部位。植入物可以通过使用标准的明胶海绵如Spongostan(Johnson and Johnson Medical Limited，U.K.)而进一步在原位被施用。
载体可以被可生物降解的合成物或合成的无机基质(如，HAP、胶原、磷酸三钙、或聚乳酸、聚乙醇酸及其各种共聚物)替代。
表3中列出成骨组合物的典型配方。
        表3
    物质    含量
  成骨蛋白  500μg
 hICBM*   1000mg
 人明胶   200mg’
 总量   1200mg
*hICBM-人不溶性骨基质
                         实施例5
                人体中成骨组合物的测试
制备含有500微克被吸附在包括1g不溶性骨基质的复合基质上的人成骨蛋白，和200mg冻干的人明胶的植入物。使用该成骨组合物治疗34位患有包括部分和全部节段性缺损(segmental defects)的难治性骨不连合(resistant nonunions)的患者。这些患者包括11位女性患者和23位男性患者。平均年龄为36岁。所有的患者以前已经经历过各种内部或外部固定、切除和/或自体骨移植的治疗，并且没能实现骨愈合。手术前的症状平均为26个月(范围为1～228个月)。在手术时，通过向缺陷部位注射水合植入物而将该植入物置于体内，并且进一步通过内部和外部固定而被稳定。平均每位患者被使用2.4g组合物。17位患者额外地接受了包括松质骨颗粒和块构成的松质骨的附助骨。根据在手术后的1、8、16和24周的随访阶段中的负重能力来估测功能性结果。无负重的定为0分，需双拐辅助的负重定为1分，用1个拐杖的轻微负重定为2分，用1个拐杖的完全负重定为3分，不用拐杖辅助的完全负重定为4分。在手术后平均17周(范围为8～32周)的随访时间的平均分为3.25。该数值高于2.22的手术前值和0.5的手术后值(1周)。在5位患有复发性感染的患者中，2位患者没有在18.5周的平均术后阶段内达到高于2的分值。由受过训练的临床医生根据1～5的标准通过放射线照相来估测桥变(bridging)，其中1＝骨未连合/无骨痂，2＝无桥变的骨痂，3＝中等桥变，4＝良好的桥变，5＝完全结合。与1.44的治疗前值相比，治疗组在20周的术后阶段时的平均值为2.80。该结果说明本发明的成骨组合植入物对难治性骨不连具有有效治疗作用。图1中列出了在不同术后阶段所测定的值。
本发明的优点在于由本发明的成骨生物材料组合物诱导的骨骼的多步发育阶段包括纤维蛋白和纤维结合蛋白与生物材料的结合、细胞的趋化现象、纤维原细胞的繁殖、间叶细胞的浓缩、分化为成软骨细胞、软骨发生、血管侵入、骨骼形成、再成型和骨髓分化。
本发明的可注射的生物材料具有很多优点。它可以在室温下被储存很长时间，而没有明显的生物活性下降。当手术时，本发明的可注射的生物材料可以容易地被再水合，并且易于操作，仅需要推动注射器的活塞以推出所需量的成骨物质。
由临床观察来看，该成骨生物材料组合物具有以下优点。它具有在植入位点诱导骨骼的成骨性。它避免了在患者的髋部进行再次手术以获得自体骨的需要，并且避免使用组织库的骨的需要。这样降低了传染疾病的危险。
ICBM结合成骨蛋白，并且起到缓慢释放运送系统的作用，以活化植入位点处的祖细胞。本发明的复合生物材料适应骨骼发育过程中细胞应答的各步骤。该组合生物材料是可生物相容的，并且在成骨过程中可以被再吸收，并被宿主自身的骨骼替代。
由其颗粒尺寸所测定的所述生物材料几何形状对于进行细胞渗透和分化是最优的。

Claims (16)

1、对从骨骼中分离成骨蛋白的方法的改进，在该方法中，含有片断的成骨蛋白从骨骼中被提取，并且通过选自超滤和层析的富集步骤的顺序被富集，所述改进在于在富集步骤之前去除含有片断的成骨蛋白中的较高分子量组分。
2、如权利要求1所述的改进，其中该较高分子量组分具有约100～300kDa的分子量。
3、如权利要求1或2所述的改进，其中该较高分子量组分选自胶原、胶原片断、胶原聚集体及其混合物。
4、如权利要求1或2所述的改进，其中通过超滤去除较高分子量组分。
5、如权利要求3所述的改进，其中通过经100～300kDa标准分子量的聚砜薄膜的超滤而去除所述较高分子量组分。
6、如权利要求8～10中任意一项所述的改进，其中含有片断的成骨蛋白通过连续的超滤步骤被浓缩并被去盐。
7、一种包括成骨蛋白、不溶性骨基质(ICBM)和明胶的诱导骨骼生长的组合物。
8、根据权利要求7所述的诱导骨骼生长的组合物，其中通过如权利要求1～6中任意一项所述的改进方法制备成骨蛋白。
9、根据权利要求8所述的诱导骨骼生长的组合物，该诱导骨骼生长的组合物为水合性粉末形式。
10、如权利要求7～9中任意一项所述的诱导骨骼生长的组合物，其中成骨蛋白、hICBM和明胶之间的质量比为0.4～0.6∶800～1200∶100～1000。
11、一种制备诱导骨骼生长的组合物的方法，该方法包括混合成骨蛋白、不溶性骨基质和明胶的步骤。
12、如权利要求11所述的步骤，其中通过如权利要求1～6中任意一项所述的改进方法制备成骨蛋白。
13、一种用于诱导哺乳动物骨骼生长的设备，该设备包括含有成骨蛋白、不溶性骨基质和明胶的诱导骨骼生长的组合物，和用于向治疗部位输送所述组合物的输送装置。
14、如权利要求13所述的设备，其中通过如权利要求1～6中任意一项所述的改进方法获得成骨蛋白。
15、如权利要求13或14所述的设备，其中该输送装置为注射器。
16、如权利要求13～15中任意一项所述的设备，其中所述组合物为水合性粉末。
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