JPS6365872A - 骨形成用注入材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 この発明は、骨形成に用いる材料に関する。

〔背景技術〕

従来、生体における骨欠損部を補填する場合、主に、患
者自身から自家骨を採取して自家骨移植していた。これ
は、他人から移植骨の提供を受ける同種骨移植や、大以
外の他の動物の骨を移植する異種骨移植より骨形成がよ
り早（、確実だからである。しかし、自家骨移植には、
以下のような欠点がある。■自家骨の採取量は自ずと限
られる。■自家骨の採取は、同じ患者に付加的な外科処
置が必要で、感染の危険が増し、手術時間が長くなり、
患者に苦痛を与える。このため、骨欠損部が大きいと、
セラミックや金属などの人工生体材料が、骨移植に用い
られてきた。しかしながら、上記人工生体材料を用いた
骨移植も移植のだめの手術が必要である。骨欠損部を補
填してもらう患者は、前記いずれの骨移植を選択しても
、手術による苦痛を避けることはできない。

また、上記人工生体材料は、たやすく周囲の骨組織に取
り込まれない。なぜなら、充分な量の骨が生体材料の周
囲に形成されないからである。

この問題を解決するためにコラーゲンに骨形成因子を複
合させた骨誘導性生体材料や、さらに所要の形状のセラ
ミックなどの組織規相性を持った材料に前記複合体を付
着させた生体材料を骨欠損部の補填および固定に用いる
ことが、発明者らにより考えられた（特開昭６０−２５
３４５５号。

アメリ刀特許出願第７３７３８６号）。

しかし、これらの骨誘導性生体材料はいずれも固体であ
るので、これらの生体材料を用いて骨欠損部などの治療
を行う場合にも、外科的手術を行う必要がある。このた
め、患者に手術による苦痛を与える。

〔発明の目的〕

この発明の目的は、外科的手術を行わずに、所望の部位
に骨形成を行わせることができる骨形成用の材料を提供
することにある。

〔発明の開示〕

この発明は、上記の目的を達成するために、骨形成因子
およびコラーゲンを含む骨形成用注入材料を要旨とする
。

以下に、この発明の詳細な説明する。

この発明の骨形成用注入材料は固体ではなく、溶液（ま
たは分散液）で用いられるので、患者に外科的侵聾を加
えることなしに、骨形成を行わせたい部位へ注入するこ
とができ、その部位で骨形成を行わせることができる。

このため、骨形成のための処置に際して、患者に外科的
手術による苦痛を与えずにすむ。なお、この発明の骨形
成用注入材料は主として人を対象にしているが、他の生
物に用いることも可能である。

この発明に用いる骨形成因子（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏ
−ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　　：以下、ｒＢＭ
ＰＪと記す）とは、未分化な間葉系細胞に細胞外から作
用して、その遺伝形質を軟骨細胞や骨芽細胞へと誘導（
軟骨誘導、骨誘導）し、局所に骨組織を形成させる物質
である。次にその製法の例を示すが、これに限るもので
はない。

（ＢＭＰの製法の一例） Ｄｕｎｎ骨肉腫をホモジナイズし、アセトン、メチルエ
ーテルで脱脂乾燥する。次に、脱脂乾燥粉末を４Ｍ塩酸
グアニジンで抽出し、５％酢酸を含むエタノールによっ
てエタノール分画を行い、分画した上澄みを１０ｍＭｔ
ｉ酸ナトリウム緩衝液（ｐ１１７．４）に対して透析す
る。透析を十分に行うと、チューブ内に沈澱が生じる。

この沈澱を遠沈（１００００Ｇ、１５分間）で回収し、
上澄みは捨てる。回収した沈澱分画は、塩酸グアニジン
で再び溶解する。次に、ゲル濾過などによってクロマト
グラフィを行う。第７図は５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−
２００ゲル（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社）
によってクロマトグラフィを行った場合の溶出曲線であ
る。図において縦軸は吸光度ＡＨ０、横軸は溶出液量〔
−〕である。吸光度は２８０ｎｍの紫外部吸収で測定し
た。第７図に示す分画すを回収し、１０ｍＭ燐酸ナトリ
ウム緩衝液に対して透析を行い、析出物を遠沈（１００
ＯＧ、１５分間）で回収し、精製し、凍結乾燥してＢＭ
Ｐが得られる。

ところで、発明者らは、このようにして得られたＢＭＰ
をマウスに移植した場合、ＢＭＰ単独では大量に移植し
ても骨形成が不十分であり、コラーゲンを担体して用い
ると、少量のＢＭＰで極めて効率良く骨形成が誘導され
ることを見出した（特願昭６１−１４５６８０号）。

この発明においても同様で、ＢＭＰ単独の溶液をマウス
に注入しても骨形成は認められず、同量のＢＭＰをコラ
ーゲン溶液と混合して用いると、骨形成が観察され、Ｂ
ＭＰの担体としてのコラーゲンの有用性が認められる。

コラーゲンの作用は充分明らかではないが、生体内に注
入されたコラーゲンがＢＭＰを担持し、骨形成に必要な
期間（２〜３週間程度）溶解吸収されないでＢＭＰを保
持し、骨形成を誘導させるもの□と考えられる。このこ
とは、注入後、骨形成が誘導される間保持されていたコ
ラーゲンの形状の骨が形成されていることからも明らか
である。したがって、この発明で用いられるコラーゲン
は、生体内に注入された後、骨形成が誘導される間、溶
解吸収されないで必要な形状を保持するものであり、よ
り抗原性が少ないものが好ましい。

コラーゲンは、動物の骨や皮膚などの結合組織を構成し
ている主要なタンパク質で、その分子は分子量約１０万
のポリペプチド鎖が３本望まってコラーゲン特有のらせ
ん構造を形成しており、長さ約３０００人、太さ約１５
人の棒状をなしている。この分子の両末端にらせん構造
をとらないペプチド鎖（テロペプチド）が付いており、
コラーゲンの免疫活性の大部分は、このテロペプチドに
存在している。コラゲナーゼを除くタンパク分解酵素、
たとえば、ペプシンはコラーゲンのらせλ構造の部分に
は作用せず、テロペプチドのみを這択的に消化すること
が知られている。したがって、一般に知られている可溶
化コラーゲンを得る方法、すなわち、原料の不溶性コラ
ーゲンをペプシンなどのタンパク分解酵素で処理する方
法により得られる酵素可溶化コラーゲン（アテロコラー
ゲン）が、この発明に用いるコラーゲンとして適当であ
、るが、骨形成をより効率良く起こさせるためには、抗
原性に関与するテロペプチドをより十分に除去したもの
が好ましい。より詳細には、テロペプチドの量の目安と
なるチロシン含ｆｆｉカ１０００残基あたり２残基未満
含有するコラーゲンが好ましい。このようなコラーゲン
は、抗原性が小さく、良好な組織親和性を有し、ＢＭＰ
の担体として用いると、骨形成が再現性良く誘導され、
少量のＢＭＰで効率良く骨形成が誘導されることが、発
明者らによって見出された（特願昭６１−１４５６８０
号）。このようなコラーゲンを、この発明の骨形成用注
入材料に用いても同様に骨形成が順調に起こる。もちろ
ん、１０００残基あたり２残基以上のチロシン含量を有
するコラーゲンを用いてもよい。

１０００残基あたり２残基未満のチロシン含量を有する
可溶性コラーゲンは、どんな方法によって得てもよい。

このような方法として、一般に、適当なタンパク分解酵
素を用いて、充分に、コラーゲンに作用させる方法、ま
たは、硫酸ソーダの存在下で苛性ソーダで処理する（得
られたコラーゲンは、アルカリ可溶化コラーゲンと呼ば
れる）方法などが知られている。前記可溶性コラーゲン
としては、アルカリ可溶化したものよりもタンパク分解
酵素可溶化したものの方が好ましい。アルカリ可溶化コ
ラーゲンは、抗原性は充分に低いが、生体内に注入した
場合、溶解吸収が早いために骨形成に必要な期間ＢＭＰ
を保持することができないおそれがあるのに対し、酵素
可溶化コラーゲンは、生体内で早く溶解吸収されるとい
うことがないからである。

この発明の骨形成用注入材料は、液状態とじたときに、
液１＠１に対する割合でコラーゲンを２■〜２０■含ん
でいることが好ましい。コラーゲンがこれより少ないと
、生体内での溶解吸収が早く、必要な形状を必要な期間
保持することができないことがある。コラーゲンの量の
上限は特に限定されないが、注射器による注入が可能な
範囲であればよい。

上記の方法で得たＢＭＰをコラーゲンと混合してマウス
に注入し、３週間後゛に骨形成量を測定したところ骨形
成に必要なりＭＰの最低量は、液１−に対し、約０．１
■であり、骨形成量はＢＭＰの注入量とほぼ比例するが
、０．３■を上回ると、それ以下の場合とほとんど同じ
であった。したがって、この発明の骨形成用注入材料は
、液１　ｍｌに対し、０．１〜０．３■含んでいること
が好ましい。ただし、この壁範囲は、上記の方法で得た
ＢＭＰの場合であって、ＢＭＰの精製度（純度）が上が
れば、前記最低濃度が０．１■／−よりも少なくてすむ
し、精製度が下がれば、０．３■／ａ／より多く用いて
も骨形成量が高まる。

なお、この発明の骨形成用注入材料は、造影剤を含んで
いることが好ましい。造影剤を含んでいると、注入材料
をモニターしながら注入できるので、注入したい部位へ
注入しやすくなる。造影剤としては、たとえば、イオタ
ラム酸メグルミン注射液（第一製薬物製品：コンレイ、
ＤＩＰコンレイなど）、メトラザミド（ｍｅｔｒｉｚａ
ｍｉｄｅ　）　　（日本シエーリング例製品：アミバー
ク）などが挙げられるが、これらに限定されない。モニ
ターを行う装置としては、たとえば、Ｘ線透視装置が使
用できる。この発明の骨形成用注入材料は、造影剤を含
む場合、造影剤それぞれの使用基準濃度で使用して差支
えない。

この発明の骨形成用注入材料は、所定濃度のコラーゲン
溶液、ＢＭＰ溶液および必要に応じて造影剤の溶液を混
合し、必要に応じ中和して調製することができる。溶媒
には水を用いればよいが、生理食塩水など生体に影響を
及ぼさない範囲で他の物質が含まれていてもよい。また
、適当な造影剤の溶液にコラーゲンおよびＢＭＰの乾燥
物を溶解させて調製することもできる。一般に、注射液
は、中性（ｐｌ＋　７．４　＜らい）であることが好ま
しいが、この発明の骨形成用注入材料を溶液状態にした
ものを中和すると、溶存していたコラーゲンやＢＭＰが
析出してくることがある。しかし、このようにコラーゲ
ンやＢＭＰが析出した骨形成用注入材料を生体に注入し
ても、骨形成には悪影響を及ぼさない。

なお、この発明の骨形成用注入材料は、保存や流通など
に際して、あらかじめコラーゲンやＢＭＰが溶解されて
いる溶液のままであってもよいが、溶解されていなくて
もよく、凍結乾燥されていてもよい。コラーゲンおよび
ＢＭＰが液に溶解しておらず、分散されていてもよい。

また、ＢＭＰおよびコラーゲンが固形であり、これらを
溶解させる水（単なる水でなくてもよい）と２Ｍｉ合わ
されていてもよい。

この発明の骨形成用注入材料は、たとえば、形成外科領
域などで使用され、耳の形成、鼻の形成、顎の形成など
を行う。しかし、用途は前記のものに限定されない。

つぎに、実施例および比較例を示すが、この発明は実施
例に限定されない。

（実施例） 新鮮な子牛の真皮層を脱毛して細断した後よく洗浄精製
し、ＨＣｌ溶液に加えてｐＨ３，０に調節して、ペプシ
ンを加え（コラーゲンに対するペプシンの割合はおよそ
４／１００）、混合液を時々かき回して２０℃で２４時
間保持した。ついで処理液をグラスフィルタで濾過し、
さらに、ポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ
で濾過した。この濾液を、さらに２０℃で２４時間保持
したのち、ＮａＯＨでｐｕｌｏ、ｏに調整してペプシン
を失活させた。

ペプシンを失活させた溶液をＨＣＮでｐＨ７，０に調節
し、生じたコラーゲン沈澱物を遠心分離により回収し、
ｐＨ３，０のＨＣ６溶液に溶解した。つぎに、その液量
の１１５の３０％ＮａＣ１溶液を加え、得られた沈澱物
を回収し、ｐｌ＋３．０のＨＯｆｆ溶液に溶解した。こ
の溶液を、ｐＨ３，０のＨＣｌ溶液に対して透析したの
ち、ＮａＯＨでｐｉ（７，４に調整した。生じたコラー
ゲン沈澱物を回収して、再びｐＨ３，０（ＤＨＣＩＨＣ
ｌ溶液解したあと、０．４５ｔｎｎのメンブランフィル
タ−で濾過滅菌を行い、さらに、無菌的に凍結乾燥させ
、コラーゲンの凍結乾燥物を得た。このコラーゲンのチ
ロシン含量は１０００残基あたり］、２残基で、等電点
は、７以上であった。

造影剤ＤＩＰコンレイ　（イオタラム酸メグルミン注射
液：第−製薬ａ句製品）に、前記凍結乾燥したコラーゲ
ンを６■／　ｍ／の濃度になるように溶解させた。この
コラーゲン・造影剤溶液を、以下、コラーゲン溶液（Ａ
）と称する。

他方、上記の方法によって得られた精製されたＢＭＰを
ｐｉ（３，０のＨＣ７！溶液に溶解し、０．４５　ａｍ
のメンブランフィルタ−で濾過滅菌した。濃度は、５ｍ
ｇ／ｍ！であった。この溶液１００μｌをコラーゲン溶
液（Ａ）９００μｌとよく混ぜ、コラーゲン・ＢＭＰ・
造影剤混合液を調製し、骨形成用注入材料を得た。

（実験１） 実施例で得た骨形成用注入材料を第１図の写真にみるよ
うに皮膚上から、マウスの背部筋膜下に２００μｌ注射
した。３週間後に、マウスの皮膚を開いたところ、第２
図（ａ）の写真にみるように、筋膜下に骨（矢印で示す
）が誘導されていた。第２図（ｂ）に、取り出した移植
物の一部拡大写真を示した。図中、Ｂは骨組織、Ｍは筋
肉、Ｒは肋骨をあられす。

（実験２） 実施例で得た骨形成用注入材料を第１図の写真にみるよ
うに皮膚上から、マウスの皮下に２００μｌ注射した。

３週間後に、マウスの皮膚を開いたところ、第３図（ａ
ｌの写真にみるように、皮下に骨（矢印で示す）が誘導
されていた。第３図（＋）ｌに、取り出した移植物の一
部拡大写真を示した。図中、Ｓは皮膚、Ｂは骨Ｍｉ織を
あられす。

第２図山）および第３図ｆｂ）の写真において、骨組織
Ｂの周囲にある灰色の帯は骨基質（管渠）である。骨組
織Ｂ中において、白い斑点状の部分が脂肪細胞、大きな
灰色の部分が骨基質（管巣）で決り、骨店質問の沢山の
黒い点が骨髄細胞（造血糾胞）である。骨基質の辺縁の
黒い部分が骨芽細膣である。

第２図（ｂ）および第３図（ｂ）にみるように、前記の
注入材料をマウスの背部筋間内および皮下に移植すると
、骨組織がそれぞれ３週間後に形成された。造影剤は骨
形成に全く影響を及ぼさなかった（阻害しなかった）。

（実験３） 実施例で得た骨形成用注入材料を、マウスの皮下に注射
した。第４図（ａｌにみるように、この時の注入物（矢
印で示す）を、Ｘ線（Ｓｏｆｔ　Ｘ−ｒａｙ）でモニタ
ーした。３週間後、再びＸ線（Ｓｏｆｔ　Ｘ−ｒａｙ）
で観察したところ、第４図（ｂ）の写真にみるように、
骨組織（矢印で示す）が誘導されていた。

第４図（ｂｌに矢印で示すものが、残存した造影剤では
ないことを確認するために、移植物を取り出してＸ線（
Ｓｏｆｔ　Ｘ−ｒａｙ）でＨ察した。第４図（ｅ）にみ
るように、骨組織特有の管巣が観察された。こ、　　の
ことは、造影剤が吸収されてなくなり、骨が誘導された
ことを示している。

（実験４） 実施例で調製したコラーゲン溶液（Ａ）を、ＢＭＰを加
えずにマウス筋膜下に２０Ｄ１１１注射した。３週間後
に、マウスの皮膚を開いて観察したところ、コラーゲン
のみが注入部位に残り、骨は誘導されていなかった。第
５図に、３週間後の注入物の一部拡大写真を示した。第
５図でＣは注入したコラーゲン、Ｍは筋肉、Ｒは肋骨で
ある。

（実験５） 実施例と同様にして調製したＢＭＰ溶液Ｉｏ。

μｌを、造影剤ＤＩＰコンレイ　（イオタラム酸メグル
ミン注射液：第−製薬（（旬製品）９００μｌとよく混
ぜ、コラーゲンを含まないＢＭＰ・造影剤混合液を調製
した。この溶液を、マウス筋膜下に２００μｌ注射した
。３週間後に、マウスの皮膚を開いて観察したところ、
骨組織は全く誘導されていなかった。第６図に、３週間
後の注入物周辺の一部拡大写真を示した。第６図で矢印
は注入部位を示している。注入物はすべて吸収されてお
り、なくなっている。また、図中、Ｍは筋肉、Ｒは肋骨
である。

以上の結果にみるように、ＢＭＰおよびコラーゲンがそ
れぞれ単独の注入材料では骨形成が認められず、ＢＭＰ
−コラーゲン複合体のみが骨形成を起こすことがわかる
。また、外科的侵悶を加えることなしに、骨形成させた
い部位に骨形成を行わせることができることがわかる。

〔発明の効果〕

この発明にかかる骨形成用注入材料は、以上にみてきた
ように、骨形成因子およびコラーゲンを含むので、液状
態とすれば、外科的手術を行わずに、骨形成を起こさせ
たい部位に注入できる。しかも、注入部位から骨形成因
子が流れ出すことがなく、最初に注入した元の形で２〜
３週間後骨形成を起こすことができる。このため、患者
に外科的手術による苦痛を与えることなく、所望の部位
に骨形成を行わせることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図Ｔａ）、第３図（ａ）は生物の形態をあ
られす写真で、第１図はマウスに骨形成用注入材料を注
射する状態であり、第２図（ａｌはマウスの筋膜下に形
成された骨を観察したものであり、第３図（ａ）はマウ
スの皮下に形成された骨を観察したものであり、第２図
（ｂ）、第３回出）は生物ｍ織の形態をあられす写真で
、第２図ｆｂｌはマウスの筋膜下で骨形成を行ったとき
の組織の一部を拡大したもの、第３図ｆｂ）はマウスの
皮下で骨形成を行ったときのＭｉ織の一部を拡大したも
の、第４図（ａｌはマウスに注入した骨形成用注入材料
に含まれる造影剤を示すＸ線写真であり、第４図（ｂｌ
はマウスに注入した骨形成用注入材料により誘導された
骨を示すＸ線写真であり、第４図ｆｃ）は管巣をあられ
すＸ線写真であり、第５図および第６図は生物組織の形
態をあられす写真で、第５図は実験４の骨形成を行った
ときのＭ織の一部を拡大したもの、第６図は実験５の骨
形成を行ったときのＭｉ織の一部を拡大したもの、第７
図は骨形成因子を得るためのクロマトグラフィーによる
？容量曲線である。 ・　　　　１℃１　図 ぐ゛４７（ｃン Ｊ１２図（ａ） 第２１゛６ぐ（ｂ） 第３図（、、ａ３ ｉ’８３　ｔ’Ｕ（ｂ） 第５嵩 ＄７．’、　、、６．、．８＞３ 第４ （ｂ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）骨形成因子およびコラーゲンを含む骨形成用注入
   材料。
2. （２）造影剤をも含む特許請求の範囲第１項記載の骨形
   成用注入材料。