JPH0755235B2

JPH0755235B2 - 骨形成用注入材料

Info

Publication number: JPH0755235B2
Application number: JP61211059A
Authority: JP
Inventors: 邦夫高岡; 正博肥塚; 銀男鈴木; 重雄八杉
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1986-09-08
Filing date: 1986-09-08
Publication date: 1995-06-14
Anticipated expiration: 2010-06-14
Also published as: JPS6365872A

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕この発明は、骨形成に用いる材料に関する。

〔背景技術〕

従来、生体における骨欠損部を補填する場合、主に、患
者自身から自家骨を採取して自家骨移植していた。これ
は、他人から移植骨の提供を受ける同種骨移植や、人以
外の他の動物の骨を移植する異種骨移植より骨形成がよ
り早く、確実だからである。しかし、自家骨移植には、
以下のような欠点がある。自家骨の採取量は自ずと限
られる。自家骨の採取は、同じ患者に付加的な外科処
置が必要で、感染の危険が増し、手術時間が長くなり、
患者に苦痛を与える。このため、骨欠損部が大きいと、
セラミックや金属などの人工生体材料が、骨移植に用い
られてきた。しかしながら、上記人工生体材料を用いた
骨移植も移植のための手術が必要である。骨欠損部を補
填してもらう患者は、前記いずれの骨移植を選択して
も、手術による苦痛を避けることはできない。

また、上記人工生体材料は、たやすく周囲の骨組織に取
り込まれない。なぜなら、充分な量の骨が生体材料の周
囲に形成されないからである。

この問題を解決するためにコラーゲンに骨形成因子を複
合させた骨誘導性生体材料や、さらに所要の形状のセラ
ミックなどの組織親和性を持った材料に前記複合体を付
着させた生体材料を骨欠損部の補填および固定に用いる
ことが、発明者らにより考えられた（特開昭60−253455
号，アメリカ特許出願第737386号）。

しかし、これらの骨誘導性生体材料はいずれも固体であ
るので、これらの生体材料を用いて骨欠損部などの治療
を行う場合にも、外科的手術を行う必要がある。このた
め、患者に手術による苦痛を与える。

〔発明の目的〕

この発明の目的は、生体に外科的侵襲を行うことなく必
要量を正確に患部に注入でき、骨形成を行わせることが
できる骨形成用の材料を提供することにある。

〔発明の開示〕

この発明は、上記の目的を達成するために、骨形成因子
と、コラーゲンと、造影剤とを含む骨形成用注入材料を
提供する。

以下に、この発明を詳しく説明する。

この発明の骨形成用注入材料は固体ではなく、溶液（ま
たは分散液）で用いられるので、患者に外科的侵襲を加
えることなしに、骨形成を行わせたい部位へ注入するこ
とができ、その部位で骨形成を行わせることができる。
このため、骨形成のための処置に際して、患者に外科用
手術による苦痛を与えずにすむ。なお、この発明の骨形
成用注入材料は主として人を対象にしているが、他の生
物に用いることも可能である。

この発明に用いる骨形成因子（Bone morphogenetic pro
tein:以下、「BMP」と記す）とは、未分化な間葉系細胞
に細胞外から作用して、その遺伝形質を軟骨細胞や骨芽
細胞へと誘導（軟骨誘導，骨誘導）し、局所に骨組織を
形成させる物質である。次にその製法の例を示すが、こ
れに限るものではない。

（BMPの製法の一例） Dunn骨肉腫をホモジナイズし、アセトン，メチルエーテ
ルで脱脂乾燥する。次に、脱脂乾燥粉末を4M塩酸グアニ
ジンで抽出し、５％酢酸を含むエタノールによってエタ
ノール分画を行い、分画した上澄みを10mM燐酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.4）に対して透析する。透析を十分に行
うと、チューブ内に沈澱が生じる。この沈澱を遠沈（10
000G,15分間））で回収し、上澄みは捨てる。回収した
沈澱分画は、塩酸グアニジンで再び溶解する。次に、ゲ
ル濾過などによってクロマトグラフィを行う。。第７図
はSephacryl S−200ゲル（ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ社）によってクロマトグラフィを行った場合の
溶出曲線である。図において縦軸は吸光度A₂₈₀、横軸は
溶出液量〔ml〕である。吸光度は280nmの紫外部吸収で
測定した。第７図に示す分画ｂを回収し、10mM燐酸ナト
リウム緩衝液に対して透析を行い、析出物を遠沈（1000
G,15分間）で回収し、精製し、凍結乾燥してBMPが得ら
れる。

ところで、発明者らは、このようにして得られたBMPを
マウスに移植した場合、BMP単独では大量に移植しても
骨形成が不十分であり、コラーゲンを担体して用いる
と、少量のBMPで極めて効率良く骨形成が誘導されるこ
とを見出した（特願昭61−145680号）。

この発明においても同様で、BMP単独の溶液をマウスに
注入しても骨形成は認められず、同量のBMPをコラーゲ
ン溶液と混合して用いると、骨形成が観察され、BMPの
担体としてのコラーゲンの有用性が認められる。コラー
ゲンの作用は充分明らかではないが、生体内に注入され
たコラーゲンがBMPを担持し、骨形成に必要な期間（２
〜３週間程度）溶解吸収されないでBMPを保持し、骨形
成を誘導させるものと考えられる。このことは、注入
後、骨形成が誘導される間保持されていたコラーゲンの
形状の骨が形成されていることからも明らかである。し
たがって、この発明で用いられるコラーゲンは、生体内
に注入された後、骨形成が誘導される間、溶解吸収され
ないで必要な形状を保持するものであり、より抗原性が
少ないものが好ましい。

コラーゲンは、動物の骨や皮膚などの結合組織を構成し
ている主要なタンパク質で、その分子は分子量約10万の
ポリペプチド鎖が３本集まってコラーゲン特有のらせん
構造を形成しており、長さ約3000Å、太さ約15Åの棒状
をなしている。この分子の両末端にらせん構造をとらな
いペプチド鎖（テロペプチド）が付いており、コラーゲ
ンの免疫活性の大部分は、このテロペプチドに存在して
いる。コラゲナーゼを除くタンパク分解酵素、たとえ
ば、ペプシンはコラーゲンのらせん構造の部分には作用
せず、テロペプチドのみを選択的に消化することが知ら
れている。したがって、一般に知られている可溶化コラ
ーゲンを得る方法、すなわち、原料の不溶性コラーゲン
をペプシンなどのタンパク分解酵素で処理する方法によ
り得られる酵素可溶化コラーゲン（アテロコラーゲン）
が、この発明に用いるコラーゲンとして適当であるが、
骨形成をより効率良く起こさせるためには、抗原性に関
与するテロペプチドをより十分に除去したものが好まし
い。より詳細には、テロペプチドの量を目安となるチロ
シン含量が1000残基あたり２残基未満含有するコラーゲ
ンが好ましい。このようなコラーゲンは、抗原性が小さ
く、良好な組織親和性を有し、BMPの担体として用いる
と、骨形成が再現性良く誘導され、少量のBMPで効率良
く骨形成が誘導されることが、発明者らによって見出さ
れた（特願昭61−145680号）。このようなコラーゲン
を、この発明の骨形成用注入材料に用いても同様に骨形
成が順調に起こる。もちろん、1000残基あたり２残基以
上のチロシン含量を有するコラーゲンを用いてもよい。

1000残基あた２残基未満のチロシン含量を有する可溶性
コラーゲンは、どんな方法によって得てもよい。このよ
うな方法として、一般に、適当なタンパク分解酵素を用
いて、充分に、コラーゲンに作用させる方法、または、
硫酸ソーダの存在下で苛性ソーダで処理する（得られた
コラーゲンは、アルカリ可溶化コラーゲンと呼ばれる）
方法などが知られている。前記可溶性コラーゲンとして
は、アルカリ可溶化したものよりもタンパク分解酵素可
溶化したものの方が好ましい。アルカリ可溶化コラーゲ
ンは、抗原性は充分に低いが、生体内に注入した場合、
溶解吸収が早いために骨形成に必要な期間BMPを保持す
ることができないおそれがあるのに対し、酵素可溶化コ
ラーゲンは、生体内で早く溶解吸収されるということが
ないからである。

この発明の骨形成用注入材料は、液状態としたときに、
液1mlに対する割合でコラーゲンを2mg〜20mg含んでいる
ことが好ましい。コラーゲンがこれより少ないと、生体
内での溶解吸収が早く、必要な形状を必要な期間保持す
ることができないことがある。コラーゲンの量の上限は
特に限定されないが、注射器による注入が可能な範囲で
あればよい。

上記の方法で得たBMPをコラーゲンと混合してマウスに
注入し、３週間後に骨形成量を測定したところ骨形成に
必要なBMPの最低量は、液1mlに対し、約0.1mgであり、
骨形成量はBMPの注入量とほぼ比例するが、0.3mgを上回
ると、それ以下の場合とほとんど同じであった。したが
って、この発明の骨形成用注入材料は、液1mlに対し、
0.1〜0.3mg含んでいることが好ましい。ただし、この量
範囲は、上記の方法で得たBMPの場合であって、BMPの精
製度（純度）が上がれば、前記最低濃度が0.1mg/mlより
も少なくてすむし、精製度が下がれば、0.3mg/mlより多
く用いても骨形成量が高まる。

この発明の骨形成用注入材料は、造影剤を含んでいる。
造影剤を含んでいると、注入材料をモニターしながら注
入できるので、注入したい部位へ必要量を正確に注入し
やすくなる。造影剤としては、たとえば、イオタウム酸
メグルミン注射液（第一製薬（株）製品：コンレイ、DI
Pコンレイなど）、メトラザミド（metrizamide）（日本
シエーリング（株）製品：アミパーク）などが挙げられ
るが、これらに限定されない。モニターを行う装置とし
ては、たとえば、Ｘ線透視装置が使用できる。この発明
の骨形成用注入材料は、造影剤を、造影剤それぞれの使
用基準濃度で使用して差支えない。

この発明の骨形成用注入材料は、所定濃度のコラーゲン
溶液、BMP溶液および造影剤の溶液を混合し、必要に応
じ中和して調製することができる。溶媒には水を用いれ
ばよいが、生理食塩水など生体に影響を及ぼさない範囲
で他の物質が含まれていてもよい。また、適当な造影剤
の溶液にコラーゲンおよびBMPの乾燥物を溶解させて調
製することもできる。一般に、注射液は、中性（pH7.4
くらい）であることが好ましいが、この発明の骨形成用
注入材料を溶液状態にしたものを中和すると、溶存して
いたコラーゲンやBMPが析出してくることがある。しか
し、このようにコラーゲンやBMPが析出した骨形成用注
入材料を生体に注入しても、骨形成には悪影響を及ぼさ
ない。

なお、この発明の骨形成用注入材料は、保存や流通など
に際して、あらかじめコラーゲンやBMPが溶解されてい
る溶液のままであってもよいが、溶解されていなくても
よく、凍結乾燥されていてもよい。コラーゲンおよびBM
Pが液に溶解しておらず、分散されていてもよい。ま
た、BMPおよびコラーゲンが固形であり、これらを溶解
させる水（単なる水でなくてもよい）と組合わされてい
てもよい。

この発明の骨形成用注入材料は、たとえば、形成外科領
域などで使用され、耳の形成、鼻の形成、顎の形成など
を行う。しかし、用途は前記のものに限定されない。

つぎに、実施例および比較例を示すが、この発明は実施
例に限定されない。

（実施例）新鮮な子牛の真皮層を脱毛して細断した後よく洗浄精製
し、HCl溶液に加えてpH3.0に調節して、ペプシンを加え
（コラーゲンに対するペプシンの割合はおよそ4/10
0）、混合液を時々かき回して20℃で24時間保持した。
ついで処理液をグラスフィルタで濾過し、さらに、ポア
サイズ0.45μｍのメンブランフィルタで濾過した。この
濾液を、さらに20℃で24時間保持したのち、NaOHでpH1
0.0に調整してペプシンを失活させた。

ペプシンを失活させた溶液をHClでpH7.0に調節し、生じ
たコラーゲン沈澱物を遠心分離により回収し、pH3.0のH
Cl溶液に溶解した。つぎに、その液量の1/5の30％NaCl
溶液を加え、得られた沈澱物を回収し、pH3.0のHCl溶液
に溶解した。この溶液を、pH3.0のHCl溶液に対して透析
したのち、NaOHでpH7.4に調整した。生じたコラーゲン
沈澱物を回収して、再びpH3.0のHCl溶液に再溶解したあ
と、0.45μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌を行
い、さらに、無菌的に凍結乾燥させ、コラーゲンの凍結
乾燥物を得た。このコラーゲンのチロシン含量は1000残
基あたりり1.2残基で、等電点は、７以上であった。

造影剤DIPコンレイ（イオタウム酸メグルミン注射液：
第一製薬（株）製品）に、前記凍結乾燥したコラーゲン
を6mg/mlの濃度になるように溶解させた。このコラーゲ
ン・造影剤溶液を、以下、コラーゲン溶液（Ａ）と称す
る。

他方の、上記の方法によって得られた精製されたBMPをp
H3.0のHCl溶液に溶解し、0.45μｍのメンブランフィル
ターで濾過滅菌した。濃度は、6mg/mlであった。この溶
液100μをコラーゲン溶液（Ａ）900μとよく混ぜ、
コラーゲン・BMP・造影剤混合液を調製し、骨形成用注
入材料を得た。

（実験１）実施例で得た骨形成用注入材料を第１図の写真にみるよ
うに皮膚上から、マウスの背部筋膜下に200μ注射し
た。３週間後に、マウスの皮膚を開いたところ、第２図
（ａ）の写真にみるように、筋膜下に骨（矢印で示す）
が誘導されていた。第２図（ｂ）に、取り出しした移植
物の一部拡大写真を示した。図中、Ｂは骨組織、Ｍは筋
肉、Ｒは肋骨をあらわす。

（実験２）実施例で得た骨形成用注入材料を第１図の写真にみるよ
うに皮膚上から、マウスの皮下に200μ注射した。３
週間後に、マウスの皮膚を開いたところ、第３図（ａ）
の写真にみるように、皮下に骨（矢印で示す）が誘導さ
れていた。第３図（ｂ）に、取り出した移植物の一部拡
大写真を示した。図中、Ｓは皮膚、Ｂは骨組織をあらわ
す。

第２図（ｂ）および第３図（ｂ）の写真において、骨組
織Ｂの周囲にある灰色の帯は骨基質（骨梁）である。骨
組織Ｂ中において、白い斑点状の部分が脂肪細胞、大き
な灰色の部分が骨基質（骨梁）であり、骨基質間の沢山
の黒い点が骨髄細胞（造血細胞）である。骨基質の辺縁
の黒い部分が骨芽細胞である。

第２図（ｂ）および第３図（ｂ）にみるように、前記の
注入材料をマウスの背部筋間内および皮下に移植する
と、骨組織がそれぞれ３週間後に形成された。造影剤は
骨形成に全く影響を及ぼさなかった（阻害しなかっ
た）。

（実験３）実施例で得た骨形成用注入材料を、マウスの皮下に注射
した。第４図（ａ）にみるように、この時の注入物（矢
印で示す）を、Ｘ線（Soft X−ray）でモニターした。
３週間後、再びＸ線（Soft X−ray）で観察したとこ
ろ、第４図（ｂ）の写真にみるように、骨組織（矢印で
示す）が誘導されていた。

第４図（ｂ）に矢印で示すものが、残存した造影剤では
ないことを確認するために、移植物を取り出してＸ線
（Soft X−ray）で観察した。第４図（ｃ）にみるよう
に、骨組織特有の骨梁が観察された。このことは、造影
剤が吸収されてなくなり、骨が誘導されたことを示して
いる。

（実験４）実施例で調製したコラーゲン溶液（Ａ）を、BMPを加え
ずにマウス筋膜下に200μ注射した。３週間後に、マ
ウスの皮膚を開いて観察したところ、コラーゲンのみが
注入部位に残り、骨は誘導されていなかった。第５図
に、３週間後の注入物の一部拡大写真を示した。第５図
でＣは注入したコラーゲン、Ｍは筋肉、Ｒは肋骨であ
る。

（実験５）実施例と同様にして調製したBMP溶液100μを、造影剤
DIPコンレイ（イオタウム酸メグルミン注射液：第一製
薬（株）製品）900μとよく混ぜ、コラーゲンを含ま
ないBMP・造影剤混合液を調製した。この溶液を、マウ
ス筋膜下に200μ注射した。３週間後に、マウスの皮
膚を開いて観察したところ、骨組織は全く誘導されてい
なかった。第６図に、３週間後の注入物周辺の一部拡大
写真を示した。第６図で矢印は注入部位を示している。
注入物はすべて吸収されており、なくなっている。ま
た、図中、Ｍは筋肉、Ｒは肋骨である。

以上の結果にみるように、BMPおよびコラーゲンがそれ
ぞれ単独の注入材料では骨形成が認められず、BMP−コ
ラーゲン複合体のみが骨形成を起こすことがわかる。ま
た、外科的侵襲を加えることなしに、骨形成させたい部
位に骨形成を行わせることができることがわかる。

〔発明の効果〕

この発明にかかる骨形成用注入材料は、以上にみてきた
ように、骨形成因子とコラーゲンと造影剤とを含むの
で、液状態にすれば、生体に外科的侵襲を行わずに、骨
形成を起こさせたい部位へ必要量を正確に注入できる。
しかも、注入部位から骨形成因子が流れ出すことがな
く、最初に注入した元の形で２〜３週間後骨形成を起こ
すことができる。このため、患者に外科的手術による苦
痛を与えることなく、所望の部位に骨形成を行わせるこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図（ａ）、第３図（ａ）は生物の形態をあ
らわす写真で、第１図はマウスに骨形成用注入材料を注
射する状態であり、第２図（ａ）はマウスの筋膜下に形
成された骨を観察したものであり、第３図（ａ）はマウ
スの皮下に形成された骨を観察したものであり、第２図
（ｂ）、第３図（ｂ）は生物組織の形態をあらわす写真
で、第２図（ｂ）はマウスの筋膜下で骨形成を行ったと
きの組織の一部を拡大したもの、第３図（ｂ）はマウス
の皮下で骨形成を行ったときの組織の一部を拡大したも
の、第４図（ａ）はマウスに注入した骨形成用注入材料
に含まれる造影剤を示すＸ線写真であり、第４図（ｂ）
はマウスに注入した骨形成用注入材料により誘導された
骨を示すＸ線写真であり、第４図（ｃ）は骨梁をあらわ
すＸ線写真であり、第５図および第６図は生物組織の形
態をあらわす写真で、第５図は実験４の骨形成を行った
ときの組織の一部を拡大したもの、第６図は実験５の骨
形成を行ったときの組織の一部を拡大したもの、第７図
は骨形成因子を得るためのクロマトグラフィーによる溶
出曲線である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】骨形成因子と、コラーゲンと、造影剤とを
含む骨形成用注入材料。