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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft Materialien und Verwendungen solcher Materialien
zur Reparatur und Regeneration vieler verschiedener Gewebe an einer
einzigen Defektstelle in einem Säugetier.
Die Erfindung betrifft insbesondere Materialien und Verwendungen
solcher Materialien zur Herstellung autogener bzw. autologer Ersatzkörperteile
in vivo, einschließlich
von Skelettgelenken, die viele unterschiedliche Gewebe umfassen,
wie beispielsweise Bänder,
Gelenkknorpel und Knochengewebe.
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Hintergrund der Erfindung
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Skelettgelenke
stellen eine bewegliche Einheit von zwei oder mehr Knochen dar.
Synovial-Gelenke bzw. echte Gelenke sind hoch entwickelte Gelenke,
die eine freie Bewegung ermöglichen.
Weil die unteren Gliedmaßen
der Säugetiere
mit der Bewegung befasst sind und die oberen Gliedmaßen eine
Vielfalt von Bewegungen bereitstellen, sind die meisten der Gelenke
in den Extremitäten
vom Synovial-Typ. Es existieren verschiedene Typen von Synovial-Gelenken
bzw. echten Gelenken bzw. Junctura synovialis. Ihre Klassifikation beruht
auf dem Typ der tatsächlichen
Bewegung, die sie ermöglichen
(uniaxial, biaxial und polyaxial). Sie werden gemäß ihren
morphologischen Hauptmerkmalen unterschieden (Gelenk, Achse, condylär). Im Gegensatz zu
fibrösen
und knorpelartigen Gelenken, bei denen die Enden der Knochen in
Durchgängigkeit
mit dazwischen liegendem Gewebe zu finden sind, werden die Enden
der Knochen in einem echten Gelenk zwar in Berührung gebracht, sind jedoch
getrennt. Weil die Knochen innen nicht gebunden sind, ergibt sich
die Integrität bzw.
Vollständigkeit
eines echten Gelenkes aus seinen Bändern und der Kapsel (die das
Gelenk extern bindet) und in gewissem Ausmaß aus den umgebenden Muskeln.
Bei echten Gelenken sind die benachbarten Knochenoberflächen mit
einem Gelenk- oder Hyalin-Knorpel
bedeckt und die Gelenkhöhle
wird von einer Bindegewebskapsel umgeben, die das Gelenk von der
es umgebenden vaskularisierten Umgebung abtrennt. Die Innenoberfläche der
Kapsel ist von einer Synovial-Schicht oder "Membran" ausgekleidet, die Zellen enthält, die in
die Sekretion der viskosen, gleitfähig machenden Synovial-Flüssigkeit
bzw. Gelenk flüssigkeit
involviert sind. Gray, Anatomy of the Human Body, Seiten 312; 333-336
(13. Ausgabe; C. C. Clemente, Hsg. (1985)).
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Bei
bestimmten echten Gelenken kann die Gelenk- oder Synovial-Höhle durch
einen Meniskus aus einem Faserknorpel unterteilt sein. Die echten
Gelenke, die zwei Knochen einschließen und die eine einzige Gelenkhöhle enthalten,
werden als einfache Gelenke bezeichnet. Gelenke, die einen Meniskus
enthalten, der zwei Höhlen
ausbildet, werden als zusammengesetzte Gelenke bezeichnet. Der Begriff "zusammengesetztes Gelenk" wird für solche
Gelenke verwendet, bei denen mehr als ein einzelnes Paar an Gelenkoberflächen vorliegt.
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Der
Gelenkersatz, insbesondere der echte Gelenkersatz, ist ein üblich durchgeführtes Verfahren
in der orthopädischen
Chirurgie. Jedoch ist das ideale Material zum Ersatz von Gelenken
nach wie vor schwer fassbar. Typischerweise erfordert die Gelenkrekonstruktion
die Heilung des Knochendefektes, des Gelenkknorpels und zusätzlich einer
oder mehrerer der verbindenden Bänder.
Bis jetzt existiert kein zufrieden stellendes klinisches Mittel
zur einfachen Reparatur sowohl des Skelettknorpels als auch von
Knochendefekten innerhalb eines Gelenkes, das zuverlässig lebensfähige, voll
funktionsfähige
und Gewicht tragende Gelenke zur Folge hat. Prothesen-Gelenke, die
alle endogenen Gelenk-Gewebe ersetzen, umgehen einige dieser Probleme.
Jedoch weisen Prothesen-Gelenke zahlreiche, wohl dokumentierte Beschränkungen
auf, insbesondere bei jüngeren und
hoch aktiven Patienten. Zusätzlich
ist unter einigen Umständen
ein prothetischer Gelenkersatz nicht möglich und die Reparaturoptionen
sind auf Osteochondro-Allotransplantatmaterialien beschränkt.
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Der
Gelenk- oder Hyalin-Knorpel, der am Ende der Gelenk-Knochen zu finden
ist, ist ein spezialisiertes, histologisch ausgeprägtes Gewebe
und ist für
die Verteilung der Belastungsbeständigkeit gegenüber Druckkräften verantwortlich,
und für
das glatte Gleiten, das Teil der Gelenkfunktion ist. Der Gelenk-Knorpel weist
geringe oder keine selbst regenerierenden Eigenschaften auf. Somit
wird, wenn der Gelenk-Knorpel zerrissen oder in seiner Dicke abgenutzt
oder in anderer Weise als Funktion der Zeit, einer Erkrankung oder
einer Verletzung geschädigt
wird, seine Fähigkeit,
die darunter liegende Knochenoberfläche zu schützen, beeinträchtigt.
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Andere
Knorpeltypen in Skelett-Gelenken schließen Faserknorpel und elastischen
Knorpel ein. Sekundäre
knorpelartige Gelenke werden durch Scheiben eines Faserknorpels
gebildet, die die Wirbel in der Wirbelsäule verbinden. Im Faserknorpel
ist das Mucopoly saccharid-Netzwerk mit hervortretenden Kollagen-Bündeln durchflochten
und die Chondrozyten bzw. Knorpelzellen sind breiter verstreut als
im Hyalin-Knorpel. Elastischer Knorpel enthält Kollagenfasern, die histologisch
Elastin-Fasern ähnlich
sind. Wie bei anderen Bindegeweben, ist die Bildung von knorpelartigem
Gewebe ein komplexes biologisches Verfahren, das die Interaktion von
Zellen und Kollagenfasern in einem einzigartigen biochemischen Milieu
einschließt.
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Knorpelgewebe,
einschließlich
Gelenkknorpel, fehlt anders als Bindegeweben Blutgefäße, Nerven, Lymphgefäße und Basalmembran.
Der Knorpel ist aus Knorpelzellen zusammengesetzt, die ein reichliches
extrazelluläres
Milieu synthetisieren, zusammengesetzt aus Wasser, Kollagenen, Proteoglycanen
und nicht-kollagenösen
Proteinen und Lipiden. Kollagen dient dazu, Proteoglycane einzufangen
und um dem Gewebe eine Zugfestigkeit zu verleihen. Typ-II-Kollagen
ist im Knorpelgewebe das vorherrschende Kollagen. Die Proteoglycane
sind aus einer variablen Anzahl von Glycosaminoglycan-Ketten, Keratinsulfat,
Chrondroitinsulfat und/oder Dermatansulfat und N-gebundenen und
O-gebundenen Oligosacchariden zusammengesetzt, die kovalent an einem
Proteinkern gebunden sind. Die sulfatierten Glycosaminoglycane sind
negativ geladen, was einen osmotischen Quelldruck zur Folge hat,
der Wasser einzieht.
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Im
Gegensatz hierzu sind bestimmte Kollagene, wie beispielsweise die
fibrotischen knorpelartigen Gewebe, die beispielsweise in Narbengewebe
auftreten, Keloid- und typischerweise Narbentypgewebe, d. h. aus Kapillaren
und reichlichen, irregulären
dysorganisierten Bündeln
aus Typ-I- und Typ-II-Kollagen zusammengesetzt.
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Histologisch
gesehen können
Gelenk- oder Hyalin-Knorpel von anderen Formen von Knorpel unterschieden
werden, sowohl durch ihre Morphologie als auch durch ihre Biochemie.
Morphologisch gesehen ist Gelenkknorpel durch Oberflächen- gegen
Mittel- gegen Tiefe-"Zonen" gekennzeichnet,
die eine charakteristische Abstufung von Merkmalen von der Oberfläche des
Gewebes zur Basis des Gewebes, das an den Knochen angrenzt, zeigen.
In der oberflächlichen
Zone beispielsweise sind die Knorpelzellen abgelacht und liegen zur
Oberfläche
parallel eingebettet in einem extrazellulären Netzwerk, das tangential
angeordnetes Kollagen und wenige Proteoglycane enthält. In der
mittleren Zone sind die Chondrozyten kugelförmig und sind von einem extrazellulären Netzwerk
umgeben, das reich an Proteoglycanen und abgestuft organisierten
Kollagenfasern ist. In der tiefen Zone, nahe dem Knochen, sind die
Kollagenfasern vertikal orientiert. Die Konzentration der Keratinsulfat-reichen
Proteoglycane erhöht
sich mit zunehmendem Abstand von der Knorpeloberfläche. Für eine ausführliche
Beschreibung einer Gelenk-Knorpel-Mikrostruktur, siehe beispielsweise
(Aydelotte und Kuettner (1988), Conn. Tiss. Res. 18: 205; Zanetti
et al. (1985), J. Cell Biol. 101: 53; und Poole et al., (1984), J.
Anat. 136: 13).
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Biochemisch
gesehen kann Gelenk-Kollagen durch das Vorhandensein von Typ-II-
und Typ-IX-Kollagen ebenso wie durch das Vorliegen von wohl charakterisierten
Proteoglycanen und durch die Abwesenheit von Typ-X-Kollagen identifiziert
werden, was mit einer Ersatzknochenbildung assoziiert ist.
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Bei
dem normalen Gelenkknorpel existiert ein Gleichgewicht zwischen
Synthese und Zerstörung
des oben beschriebenen extrazellulären Netzwerks. Jedoch tritt
bei Gewebe, das einer wiederholten Verletzung unterworfen wird,
beispielsweise einer, die auf eine Reibung zwischen schlecht aneinander
ausgerichteten Knochen zurückzuführen ist,
die miteinander in Berührung
stehen, oder bei Gelenk-Erkrankungen, die durch einen Netto-Verlust
von Gelenk-Knorpel gekennzeichnet sind, beispielsweise Osteoarthritis,
ein Ungleichgewicht zwischen Synthese und Abbau auf.
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Zwei
Typen von Defekten werden in Gelenk-Oberflächen erkannt, d. h. Defekte
mit volle-Dicke- und Oberflächendefekten.
Diese Defekte unterscheiden sich nicht nur im Ausmaß der physischen
bzw. physikalischen Schädigung
des Knorpels sondern auch in der Natur der Heilungs-Reaktion, die
jede Verletzungsart zeigen kann.
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Defekte
der Gelenkoberfläche
in voller Dicke schließen
eine Schädigung
des Hyalin-Knorpels,
der kalzifizierten Knorpel-Schicht und des subchondralen Knochen-Gewebes
mit seinen Blutgefäßen und
Knochenmark ein. Voll-Dicke-Defekte können ernsthaften Schmerz verursachen,
weil die Knochenplatte sensorische Nervenenden enthält. Solche
Defekte entstehen im Allgemeinen aus schweren Verletzungen und/oder
während
der späten
Stadien einer degenerativen Gelenkerkrankung, wie beispielsweise
einer Osteoarthritis. Voll-Dicke-Defekte
können
gelegentlich zu einer Blutung führen
und zur Induktion einer Heilungsreaktion aus dem subchondralen Knochen.
In einigen Fällen
jedoch ist das gebildete Reparaturgewebe bzw. Ersatzgewebe ein vaskularisierter
faseriger bzw. fibröser
Knorpeltyp mit nicht ausreichenden biomechanischen Eigenschaften
und persistiert nicht auf einer Langzeitbasis.
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Im
Gegensatz hierzu sind Oberflächendefekte
im Gelenkknorpel-Gewebe auf das Knorpelgewebe selbst beschränkt. Solche
Defekte sind berüchtigt,
weil sie nicht abheilen und keine Neigung zu Heilungsreaktionen
zeigen. Oberflächliche
Defekte können
als Fissuren, Soden oder Spalten in der Oberfläche des Knorpels auftreten
oder sie können
ein "Krebsfleisch"-Aussehen im betroffenen
Gewebe aufweisen. Sie enthalten keine Blutgefäße (Blut-Spots), wie sie beispielsweise in Defekten
mit voller Dicke ersichtlich sind. Oberflächliche Defekte mögen keine
bekannte Ursache aufweisen, sie sind jedoch oftmals Ergebnis mechanischer
Fehlanordnungen, die zur Abnutzung des Knorpelgewebes führen. Solche
mechanischen Fehlanordnungen können durch
eine Verletzung des Gelenkes, beispielsweise durch eine Ablösung von
Tomo-Meniskus-Gewebe in das Gelenk, Meniskektomie, eine Laxation
des Gelenkes durch ein gerissenes Band, eine Fehlausrichtung von
Gelenken, Knochenfraktur oder Erbkrankheiten verursacht sein. Oberflächliche
Defekte sind ebenfalls durch frühe
Stadien von degenerativen Gelenk-Erkrankungen, wie beispielsweise
einer Osteoarthritis, gekennzeichnet. Weil das Knorpelgewebe nicht
innerviert oder vaskularisiert ist, heilen oberflächliche
Defekte nicht und degenerieren oftmals zu Defekten mit voller Dicke.
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Ein
Ersatz mit Prothesen-Gelenken ist derzeit die bevorzugte Option
für eine
ernsthafte Degeneration einer Gelenk-Funktion, die den Verlust an
Gelenk-Knorpel mit einschließt.
Es wird angenommen, dass ein Mittel zur funktionellen Rekonstruktion
von Gelenk-Komplexen, einschließlich
der Regeneration und Heilung von Gelenkknorpel, einen tief greifenden
Effekt auf die alloplastische Gelenks-Ersatzchirurgie und die Behandlung degenerativer
Gelenk-Erkrankungen
haben würde.
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Wie
auch Gelenkknorpel, weisen Gelenk-Bänder, die zur Verbindung interagierender
Knochen im Gelenk dienen, nur geringe oder keine selbst regenerativen
Eigenschaften auf. Bänder
sind typischerweise aus im Wesentlichen parallelen Bündeln von
weißem
fibrösem
Bindegewebe zusammengesetzt. Sie sind biegsam und flexibel und ermöglichen
eine im Wesentlichen vollständige
Bewegungsfreiheit, sind jedoch undehnbar, um eine Überdehnung
der interagierenden Knochen im Gelenk zu vermeiden. Wie Knorpel
fehlt dem Bändergewebe
im Wesentlichen Blutgefäße und es
weist nur geringe oder nicht vorhandene selbstregenerative Eigenschaften
auf. Die chirurgische Heilung von Tomo- oder geschädigtem Band-Gewebe
ist bis heute auf die Verwendung autogener bzw. autologer Transplantate
oder synthetischer Materialien beschränkt, die chirurgisch an den
Gelenkextremitäten
des Knochens befestigt werden. Allogene Ligamente versagen typischerweise
mechanisch, was vermutlich auf die Behandlungen zurückzuführen ist,
die dazu erforderlich sind, um diese Materialien biokompatibel zu
machen. In ähnlicher
Weise sind Sehnen Seil- bzw. Tau-artige Strukturen, die Muskelfasern
an Knochen oder Knorpel binden und die aus im Wesentlichen parallelen
Fibroiden aus weißem Bindegewebe
gebildet sind. Die Synovialkapsel bzw. Gelenkkapsel ist aus einer
dünnen
Schicht aus bandartigem Gewebe zusammengesetzt, das das Gelenk einschließt und es
dem Gelenk ermöglicht,
in der gleitfähig machenden
Gelenkflüssigkeit
gebadet zu werden. Das Innere der Gelenkkapsel ist mit einer dünnen Membran aus
Bindegewebe ausgekleidet, die verzweigte Bindegewebskörperchen
aufweist, die die Synovial-Membran definieren, und die in erster
Linie zur Absonderung bzw. Sezernierung von Synovial-Flüssigkeit
in den Hohlraum bzw. die Höhle
verantwortlich ist Die Integrität
dieser Membran ist deswegen zur Gewährleistung einer Quelle für die gleitfähig machenden
Synovial-Flüssigkeit
von Bedeutung. Eine Heilung dieser Gewebe im orthopädischen
Kontext ist typischerweise auf die erneute Vernähung von existierendem Gewebe
beschränkt.
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Knochengewebe
unterscheidet sich von den anderen hierin vorstehend beschriebenen
Geweben signifikant, einschließlich
von Knorpelgewebe. Insbesondere ist Knochengewebe vaskularisiertes
Gewebe, zusammengesetzt aus sowohl Zellen als auch einem zweiphasigen
Medium, das aus einem mineralisierten, anorganischen Bestandteil
(in erster Linie Hydroxyapatit-Kristalle) und einem organischen
Bestandteil zusammengesetzt ist, der in erster Linie Typ-I-Kollagen
umfasst. Glycosaminoglycane bilden weniger als 2% dieses organischen
Bestandteils und weniger als 1% des zweiphasigen Mediums selbst
oder von Knochengewebe per se. Überdies
liegt, bezüglich
Knorpelgewebe, das Kollagen, das im Knochengewebe vorliegt, in einer
hoch organisierten parallelen Anordnung vor.
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Knochendefekte,
gleichgültig,
ob mit degenerativer, traumatischer oder kanzeröser Äthiologie, stellen eine beachtliche
Herausforderung für
den rekonstruktiven Chirurgen dar. Insbesondere ist die Rekonstruktion oder
Reparatur von Skelettteilen schwierig, die Teil eines Multigewebs-Komplexes
sind, wie es beispielsweise bei Säugetiergelenken der Fall ist.
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Saugetier-Knochengewebe
enthält
bekanntermaßen
ein oder mehrere proteinartige Materialien, die vermutlich während Wachstum
und natürlicher
Knochenheilung aktiv sind, und die eine Entwicklungskaskade zellulärer Ereignisse
induzieren können,
die eine Ersatzknochenbildung zur Folge haben. Die Entwicklungskaskade,
die in die Ersatzknochen differenzierung involviert ist, besteht
aus einer Chemotaxis mesenchymaler Zellen, der Proliferation von
Vorläuferzellen
zu Knorpelzellen und Osteoblasten, einer Differenzierung von Knorpel,
einer vaskulären
Invasion, Knochenbildung, Umformung und letztendlich einer Marksdifferentiation.
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Echte
osteogene bzw. osteogenetische Faktoren, die zum Induzieren der
oben beschriebenen Kaskade von Ereignissen in der Lage sind, die
eine Ersatzknochenbildung zur Folge haben, wurden nunmehr identifiziert,
isoliert und kloniert. Diese Proteine, die in der Natur als Disufid-verbrückte dimere
Proteine auftreten, werden in der Technik als "osteogene" Proteine, "osteoinduktive" Proteine und "Knochen-morphogenetische" Proteine bezeichnet.
Gleichgültig,
ob natürlich
vorkommend oder synthetisch hergestellt, sind diese osteogenen Proteine,
wenn sie in ein Säugetier
typischerweise in Verbindung mit einem Substrat implantiert werden, das
die Bindung, Proliferation und Differentiation von migratorischen
Vorläuferzellen
ermöglicht,
zum Induzieren einer Rekrutierung empfänglicher Vorläuferzellen
und zu einer Stimulierung deren Proliferation, zur Induktion der
Differenzierung zu Knorpelzellen und Osteoblasten und weiter zu
einer Induzierung der Differentiation von intermediärem Knorpel,
einer Vaskularisierung, Knochenbildung, Umformung und zuletzt zu
einer Marks-Differentiation in der Lage. Diese Proteine werden als
Mitglieder der Vgr-1/OP1-Proteinunterfamilie der TGPβ-Supergen-Familie
strukturell verwandter Proteine bezeichnet. Mitglieder schließen die
Proteine ein, die in der Technik als OP1 (BMP-7), OP2 (BMP-6), BMP2,
BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, 60A, DPP, Vgr-1 und Vgl beschrieben werden.
Siehe beispielsweise
US 5011
691 ;
US 5266663 ,
Ozkaynak et al. (1990) EMBO J. 9: 2065-2093, Wharton et al. (1991)
PNAS 88: 9214-9218); (Ozkaynak (1992) J. Biol. Chem. 267: 25220-25227 und
US 5266 683 ); (Celeste et
al. (1990) PNAS 87: 9643-9847); (Lyons et al. (1989) PNAS 86: 4554-4558). Diese
Offenbarungen beschreiben die Aminosäure- und DNA-Sequenzen, ebenso
wie die chemischen und physikalischen Eigenschaften dieser Proteine.
Siehe ebenfalls (Wozney et al. (1986) Science 242: 1528-1533); BMP
9 (
WO93/00432 , veröffentlicht
am 7. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81-84;
und Vg-1 (Weeks (1 987) Cell 51: 861-667).
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine bioresorbierbare
Matrix und Vorrichtung bereitzustellen, die zum Regenerieren von
Körperteilen
geeignet ist, die zwei oder mehr funktionell und strukturell verbundene,
jedoch verschiedene Ersatzgewebe in einem Säugetier umfassen. Es ist eine
weitere Aufgabe, Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Zusammensetzungen
zur Heilung oder vollständigen
Wiederherstellung eines mechanisch und funktionell lebensfähigen Skelett-Gelenkes
in einem Säugetier,
insbesondere eines Gelenks oder Synovial-Gelenkes, ebenso wie anderer
Körperteile
bereitzustellen, die Knochen und bona fide Hyalin-Knorpel umfassen,
ohne auf Prothesen-Vorrichtungen angewiesen zu sein. Es ist eine weitere
Aufgabe, Materialien und Verwendungen solcher Materialien zur Heilung
von Gewebsdefekten in einem Säugetiergelenk
bereitzustellen, um ein mechanisch und funktionell lebensfähiges Gelenk
zu bilden, das Knochen- und Gelenkknorpel, Band, Sehne, Synovialmembran
und synoviales Kapselgewebe umfasst. Es ist eine weitere Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Wiederherstellung von
funktionellem nicht-mineralisiertem Gewebe in einem Skelett-Gelenk
bereitzustellen, einschließlich
des darin vorliegenden avaskulären
Gewebes.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Vorrichtungen, wie in Anspruch 1 beansprucht, bereitgestellt.
Bei einem Aspekt schließt
der Ersatzkörperteil
ein gesamtes Säugetierskelett-Gelenk
oder einen Teil hiervon ein, einschließlich ein echtes oder Synovial-Gelenk. Wie hierin
nachstehend beschrieben, sind die Zusammensetzungen der Erfindung
ausreichend, um die mechanische und funktionelle Lebensfähigkeit
der Gewebe, die mit einem Skelett-Gelenk assoziiert sind, einschließlich Knochen
(und Knochenmark), Gelenkknorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel und
Synovialmembran-Gewebe, wieder herzustellen. Somit stellt die Erfindung
Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Zusammensetzungen zum
Ersatz einer oder mehrerer der vielen verschiedenen Gewebe bereit,
die ein Säugetierskelett-Gelenk
definieren.
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Die
Erfindung stellt in einem anderen Aspekt deswegen eine Vorrichtung
bereit, wie sie in Anspruch 1 beansprucht wird. Die Matrix umfasst
Reste, die von zumindest zwei verschiedenen Geweben des Ersatzkörperteils
abstammen. Es wird aus der hierin nachstehend bereitgestellten Beschreibung
klar werden, dass die Matrix Reste einschließen kann, die für vier oder
mehr unterschiedliche Gewebe spezifisch sind. Die Matrix ist biokompatibel
und bioresorbierbar. Sie ist insbesondere ausreichend frei von pathogenen
und antigenen Reizen, die eine Transplantat-Abstoßung zur
Folge haben können.
Vorzugsweise wird die Matrix aus einem auogenen oder xenogenen Körperteil
gewonnen. Sie wird vorzugsweise von einem Säugetier-Spender, beispielsweise
einem Kadaver, gewonnen. Der Körperteil
kann durch Dehydratation inert oder "devitalisiert" gemacht werden, wie beispielsweise
durch Ethanol-Extraktion und Lyophilisation, sodass kein restlicher
zellulärer
Metabolismus zurückbleibt,
sodass jedoch die Funktion endogener Wachstumsfaktoren und dergleichen
nach in-situ Rekonstitution durch endogene Körperflüssigkeiten wiederhergestellt
werden kann. Der behandelte Körperteil,
der nunmehr im Wesentlichen bezüglich
antigener und pathogener Bestandteile abgereichert ist und nunmehr
kompatibel ist, hält
die Reste aufrecht, die für
die vielfachen verschiedenen Gewebe spezifisch sind, die das zu
ersetzende Körperteil
bilden. Diese Reste schließen
solche vielfachen verschiedenen Gewebe mit Dimensionen und strukturellen
Beziehungen zueinander ein, die solche in dem zu ersetzenden Körperteil nachahmen.
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Der
so behandelten Matrix, die eine Nützlichkeit in den Vorrichtungen
der Erfindung aufweist, fehlt eine signifikante mechanische Integrität im Vergleich
mit nativem Gewebe und ist von selbst aus nicht ausreichend, um
die Regeneration eines Ersatzkörperteils
oder Gewebes, wenn es implantiert wird, zu induzieren. Jedoch wird
durch Imprägnieren
oder in anderer Weise Infundieren der Zwischenräume der Matrix mit osteogenem Protein,
sodass das Protein auf den Oberflächen der Matrix abgelagert
oder auf diesem absorbiert wird, die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung gebildet, und ist ausreichend, um die Bildung von neuem
Gewebe in vivo zu induzieren, sodass die Regeneration eines mechanisch
und funktionell lebensfähigen
Ersatzkörperteils in-situ
auftritt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung ein vollständiges Skelett-Gelenk oder einen
Teil hiervon, das aus einem Saugetier-Spender ausgeschnitten wird,
der gegenüber
dem Empfänger
allogen oder xenogen ist. Wie hierin beschrieben behandelt, ist
die Vorrichtung, die das allogene oder xenogene Skelett-Gelenk (1)
enthält,
biokompatibel, nämlich
ist nicht pathogen und ausreichend nicht antigen, um eine Transplantat-Abstoßung in
vivo zu vermeiden und (2) ist ausreichend, um die Bildung eines
funktionell lebensfähigen
autogenen Ersatzgelenkes in vivo zu induzieren, einschließlich der
Erzeugung von funktionellem Knochen, Gelenkknorpel, Bändern und
Kapselgewebe in der korrekten Beziehung zueinander, so dass sich
ein strukturell und mechanisch funktionelles Ersatzgelenk ergibt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung eine Vorrichtung bereit, die als Matrix bzw.
Matrize zur Ausbildung eines funktionellen Skelett-Gelenkes oder
eines Teils hiervon dienen kann, wie in Anspruch 1 beanspruch wird.
Die neu geformten Gewebe nehmen die Form und Funktion der Originalgewebe
im Skelett-Gelenk an.
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Bei
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung wie in Ansprüchen 3 bis
5 und 7, 7-10, 13-14, 16-18, 20-22, 24-29 und 46-51 beanspruchte
Verwendungen der Matrix und des osteogenen Proteins von Anspruch 1
zur Herstellung der oben beschriebenen Vorrichtung bereit. In einer
Ausführungsform
umfasst eine solche Verwendung die Bereitstellung einer Zufuhr von
mesenchymalen Zellen zur implantierten Vorrichtung, wie durch Durchfädeln oder
in anderer Weise Bereitstellen eines Muskellappens, der mit einer
Blutzufuhr in einem hohlen Anteil der Vorrichtung perfundiert wird.
In einer weiteren Ausführung
wird die Vorrichtung an einem Ort im Körper des Individuums implantiert,
die von der Defektstelle beabstandet ist bzw. verschieden ist, der
jedoch die Erzeugung des Ersatzkörperteiles
erlaubt. Das somit gebildete autogene Körperteil kann dann an der Defektstelle
implantiert werden.
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Wie
aus der hierin bereitgestellten Beschreibung klar sein wird, dass
die Erfindung bei der funktionellen und mechanischen Wiederherstellung
eines oder mehrerer individueller Gewebe in einem Säugetierskelett-Gelenk,
einschließlich
des nicht-mineralisierten und avaskulären Gewebs in diesem, Anwendung
findet. Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform Vorrichtungen bereit,
die zur Wiederherstellung, ohne Einschränkung, funktionellen Gelenkknorpels,
von Bändern,
Synovial-Membran und Synovialkapsel-Gewebe in der Lage sind. Die hierin
beschriebenen Vorrichtungen können
beispielsweise dazu verwendet werden, oberflächliche Gelenkknorpel-Defekte
in einem Gelenk zu korrigieren, zerrissene oder beeinträchtigte
Bänder und/oder
Sehnen zu ersetzen, und Defekte der Synovialkapsel oder des Membrangewebes
zu heilen.
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Die
Vorrichtungen zur Heilung von individuellem Skelettgelenk-Gewebe
umfassen osteogenes Protein, abgelagert auf einer Matrix, die Reste
enthält,
die von mehreren verschiedenen Geweben eines Skelett-Gelenks abgeleitet
sind, einschließlich,
ohne Beschränkung,
Knorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel oder Synovialmembran-Gewebe.
Die Matrix ist vorzugsweise aus allogenem oder xenogenem Gewebe
abgeleitet und wird wie hierin beschrieben behandelt, um eine biokompatible,
devitalisierte Matrix zu bilden.
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Wenn
sie gemäß der Verwendung
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, er füllen die
Vorrichtungen der Erfindung und/oder die Gewebe, die sich aus ihrer
Anwendung ergeben, im Wesentlichen die folgenden Kriterien eines
bevorzugten Transplantat-Materials:
- 1. Sie
haben die Bildung von mechanisch und funktionell lebensfähigen Geweben
zur Folge, die normalerweise an der Stelle bzw. dem Ort vorliegen.
Diese Gewebe weisen eine geeignete Größe und korrekte Strukturbeziehungen
auf, so dass sie einen funktionellen Körperteil zur Folge haben. Insbesondere
wird das Multi-Gewebsersatzteil, gleichgültig ob es in-situ an der Stelle
der beabsichtigten Verwendung produziert wird oder davon entfernt
produziert wird, eingebaut, mit benachbarten Geweben integriert,
wobei es im Wesentlichen seine Form beibehält, und indem er eine abnormale
Resorption vermeidet, unabhängig von
den Konditionen, die an der Empfängerstelle
vorliegen. Weiland et al. (1983) Clin. Orthop. 174: 61(1983).
- 2. Die Vorrichtungen sind dazu in der Lage, präzise ausgeformt
und gebildet zu werden, um sich exakt an jeden Defekt anzupassen,
wie auch immer komplex die Skelett- oder Organform, die ersetzt werden
soll, ist.
- 3. Die Vorrichtungen weisen praktisch unbegrenzten Vorrat auf
und sind relativ leicht zu gewinnen.
- 4. Die Vorrichtungen weisen eine minimale Morbidität auf der
Spender-Seite auf.
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Weiterhin
versieht die vorliegende Erfindung den praktizierenden Fachmann
mit Materialien und Verwendungen solcher Materialien für die Skelettgelenk-Reparatur
bzw. -Heilung, einschließlich
der Reparatur von Knochen- und Gelenkknorpel, der darin vorliegt,
und die Probleme lösen,
die unter Verwendung der Verfahren und Vorrichtungen nach dem Stand
der Technik auftreten. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung
die Bildung von bona fide Hyalin-Knorpel eher als Faserknorpel an
einer Defektstelle induzieren. Unter Verwendung der hierin offenbarten
Materialien und Verfahren bildet sich funktioneller Hyalin-Knorpel auf der Gelenkoberfläche des
Knochens an einer Defektstelle und degeneriert über die Zeit nicht zu Faser-Knorpel. Im
Gegensatz hierzu resultieren die Verfahren nach dem Stand der Technik
zur Heilung von Knorpeldefekten im Allgemeinen letztendlich in der
Entwicklung von Faser-Knorpel an der Defektstelle. Anders als Hyalin-Knorpel
fehlt dem Faser-Knorpel die physiologische Fähigkeit, Gelenke wieder auf
ihre volle Kapazität
zu bringen. Somit, wenn die vorliegenden Materialien gemäß der vorliegenden
Verfahren verwendet werden, kann der praktizierende Fachmann im
Wesentlichen einen Knorpeldefekt in einem Gelenk funktionell wiederherstellen, insbesondere
einen oberflächlichen
Gelenkknorpel-Defekt, und kann im Wesentlichen die unerwünschte Bildung
von Faser-Knorpel, die für
die Verfahren nach dem Stand der Technik typisch sind oder eine
Degeneration zu "Volle-Dicke-Defekten" vermeiden. Die Erfindung
stellt ebenfalls Mittel zur Reparatur von individuellem Gewebe eines
Gelenkes bereit, das nicht leicht reparierbar ist, individuell unter
Verwendung der Verfahren des Stands der Technik und das in einigen
Fällen
früher
einen Ersatz des gesamten Gelenkes durch eine Prothesen-Vorrichtung
erforderte. Die Erfindung ermöglicht
weiterhin die Verwendung allogener Ersatzmaterialien zur Reparatur
des avaskulären
Gewebes in einem Skelett-Gelenk und hat die Bildung von mechanisch
und funktionell lebensfähigen
Ersatzgeweben am Gelenkort zur Folge.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Während die
Beschreibung mit Ansprüchen
schließt,
die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung angesehen
wird, speziell darlegt und besonders beansprucht, wird angenommen,
dass die Erfindung durch die nachfolgende ausführliche Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen
besser verständlich
ist, wenn diese in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen zur
Hand genommen wird, bei denen:
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1 eine
fragmentarische Vorderansicht eines Säugetier-Kniegelenkes ist, wobei
ausreichend Gewebe entfernt wird, um den Knorpel auf den Kondylen
des Oberschenkelknochens, die Bänder,
die Synovial-Membran, die Gelenkkapsel zu zeigen und weiterhin ein
geschädigtes
Areal im Gelenkknorpel zu zeigen, das einer Heilung bedarf;
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2A bis 2D schematische
Darstellungen der Elemente sind, die zur Erzeugung eines lebensfähigen, funktionellen
glenohumeralen Halb-Gelenkes in einer Ausführungsform der Erfindung verwendet
werden. 2A zeigt ein lyophilisiertes
Allotransplantat; 2B zeigt osteogenetisches Protein
zur Aufbringung auf das lyophilisierte Allotransplantat von 2A;
-
2C zeigt
eine Muskelklappe aus kutanem Maximus-Muskel, der in den Schaft
des lyophillisierten Allotransplantates eingefädelt werden muss; und 2D zeigt
ein lebensfähiges,
funktionelles Halb-Gelenk, das sich aus der Kombination der Elemente
in den 2A, 2B und 2C ergibt.
D repräsentiert
eine Ausführungsform
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
-
3A bis 3D schematische
Darstellungen der vier Allotransplantate sind, die im Halb gelenk
von Beispiel 2 (5 Wochen) getestet wurden und
-
4A bis 4D schematische
Darstellungen der vier Allotransplantate sind, die im Halb-Gelenk von Beispiel
3 getestet wurden (6 Monate).
-
Ausführliche
Beschreibung
-
Hierin
werden neuartige Materialien und Verwendungen zur Heilung und Regeneration
vielfacher verschiedener Gewebe eines Skelett-Gelenks beschrieben.
Das Ersatzkörperteil
ist ein Skelettgelenk, insbesondere ein echtes Gelenk, und schließt ohne
Einschränkung
Reste ein, die von Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel
und Synovialmembran-Gewebe abgeleitet sind.
-
Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung bei einem Aspekt eine Vorrichtung,
wie in Anspruch 1 beansprucht, bereit. Wie hierin verwendet, bedeutet
der Begriff „Matrix" eine Struktur mit
Zwischenräumen
zur Anlagerung bzw. Bindung, Proliferation und Differentiation infiltrierender
Zellen. Sie umfasst Reste, die von dem zu ersetzenden Gewebe abgeleitet
sind, und weist eine Form und Dimension auf, die wenn sie implantiert ist,
im Wesentlichen diejenige des erwünschten Ersatzgewebes nachahmt.
-
Wie
hierin verwendet soll der Begriff "Rest" einen
Bestandteil eines gegebenen Gewebes bedeuten, das aus den nicht-lebensfähigen Bestandteilen
des gegebenen Gewebes abgeleitet ist. Eine Matrix, die diesen Rest
(Reste) umfasst, wenn sie mit osteogenem Protein kombiniert wird,
und die in ein Säugetier
in einer Umgebung implantiert wird, die die lokale Umgebung des
Gewebes unter physiologischen Bedingungen nachahmt und ausreichend
zur Bildung eines spezifischen, mechanisch und funktionell lebensfähigen Ersatzgewebes
ist.
-
Der
Begriff "vielfache
verschiedene Gewebe" soll
physiologisch unterscheidbare Gewebe bedeuten, wie beispielsweise
biochemisch oder ultrastrukturell unterscheidbare Gewebe, die an
einem anatomisch ähnlichen
Ort vorliegen. In einer Gelenk-Ersatzvorrichtung kann die Matrix
beispielsweise Reste umfassen, die von Knochen, Knorpel, Band, Sehnen
und Synovialmembran-Gewebe abgeleitet sind. Somit ist ein signifikanter
Aspekt der Matrix der Erfindung eine einzelne Struktur, die Reste
aus vielfachen, getrennten Geweben umfasst und die, wenn sie mit
einem osteogenetischen Protein, wie hierin definiert, kombiniert
wird, zum Induzieren der Heilung oder Regeneration eines Körperteils
geeignet ist, der über
eine Zeitspanne hinweg in vivo mechanisch und funktionell lebensfähig ist.
-
Wie
hierin verwendet, sollen die Begriffe "Knochen" und "Gelenkknorpel" das Folgende bedeuten: Knochen bedeutet
ein kalzifiziertes (mineralisiertes) Bindegewebe, das in erster
Linie einen Verbundstoff aus abgelagertem Kalzium und Phosphat in
Form von Hydroxyapatit, Kollagen (in erster Linie Typ-I-Kollagen)
und Knochenzellen, wie beispielsweise Osteoblasten, Osteozyten und
Osteoklasten ebenso wie das Knochenmarksgewebe umfasst, das sich
im Inneren des echten Ersatzknochens bildet. Knorpel betrifft einen
Typ an Bindegewebe, der Knorpelzellen in einem extrazellulären Netzwerk
eingebettet enthält,
das Kollagenfibrillen (vorherrschend Typ-II-Kollagen zusammen mit
anderen untergeordneten Typen, beispielsweise Typen IX und XI),
verschiedene Proteoglycane (beispielsweise Chondroitinsulfat-, Keratansulfat-
und Dermatansulfat-Proteoglycane), andere Proteine und Wasser umfasst.
Gelenkknorpel bedeutet Hyalin- oder Gelenk-Knorpel, ein avaskuläres, nicht-mineralisiertes
Gewebe, das die Gelenkoberflächen
des Anteils der Knochen in Gelenken bedeckt und die Bewegung in
den Gelenken ermöglicht,
ohne einen direkten Knochen-zu-Knochen-Kontakt und dadurch eine
Abnutzung und eine Beschädigung
der gegenüberliegenden
Knochenoberflächen
verhindert. Der größte Teil
normalen gesunden Gelenk-Knorpels wird als "Hyalin" bezeichnet, d. h. er weist eine charakteristische
Milchglas-Erscheinung auf. Unter physiologischen Bedingungen ruht
Gelenkknorpelgewebe auf der darunter liegenden, mineralisierten
Knochenoberfläche;
der Ersatzknochen, der hoch vaskularisierte Ossikeln enthält. Diese
in hohem Maße
vaskularisierten Ossikel können
diffusionsfähige
Nährstoffe
an den darüber
liegenden Knorpel bereitstellen, jedoch nicht mesenchymale Stammzellen.
-
"Band" soll sowohl die
Tau-artigen Strukturen von weißem
fibrösem
Bindegewebe, die die Vorderextremitäten von interagierenden Knochen
befestigen, ebenso wie das Gewebe bedeuten, das eine Synovial-Kapsel
bzw. Gelenk-Kapsel definiert. "Synovial-Membran" soll die Bindegewebsmembran
definieren, die die Innenseite der Gelenkhöhle auskleidet und die in die
Absonderung von Synovial-Flüssigkeit
involviert ist. "Sehne" soll die Bindegewebsstruktur
definieren, die den Muskel am Knochen befestigt.
-
Ersatzknochenteile
-
Wie
hierin offenbart, stellt die vorliegende Erfindung Verwendungen
und Zusammensetzungen zum Ersetzen und Heilen defekter Knochenteile
bereit. Die Anwendungen schließen
ein chirurgisches Ausschneiden des defekten Körperteiles, ein Implantieren
einer Vorrichtung, die eine Matrix des Typs, der oben beschrieben
ist, umfasst an der Stelle des Ausschnittes und, falls notwendig,
eine chirurgische Heilung von Geweben ein, die der Stelle des Ausschnittes,
wie hierin nachstehend beschrieben wird, benachbart sind. Es ist
beispielsweise für
den synovialen Gelenk-Ersatz wünschenswert,
die Gelenkkapsel zu heilen, einschließlich der Synovial-Membran
und der Bänder,
um chirurgisch die Gelenkstruktur physiologischen Bedingungen anzupassen,
wodurch eine avaskulare Umgebung erzeugt wird, die die Synovial-Höhle ist,
und die in Synovial-Flüssigkeit
gebadet ist. Es ist ebenfalls bevorzugt, die implantierte Vorrichtung
an das umgebende Gewebe zu vernähen
oder in anderer Weise mechanisch mit diesem temporär zu verbinden.
-
In
einer Ausführungsform
ist die Vorrichtung so konstruiert, dass sie die Pfanne oder die
gesamte Säugetier-Skelettgelenkstruktur
ersetzt und eine Matrix mit Resten einschließt, die von vielfachen, verschiedenen Geweben
abgleitet sind, einschließlich
zwei oder mehr von Knochen, Knorpel, Band, Sehne, Synovialkapsel und/oder
Synovialmembran-Gewebe. Die Matrix umfasst devitalisiertes, nicht
mineralisiertes Gewebe. In einer bevorzugten Ausführungsform
kann das Ersatzgewebe Gelenkknorpel, Band, Knochen, Sehne oder Synovialkapsel-Gewebe
einschließen.
-
Bei
einem teilweisen oder vollständigen
Gelenkersatz wird bevorzugt, ist es jedoch nicht erforderlich, bei
der Durchführung
des Verfahrens den zusätzlichen
Schritt einzuschließen,
eine Muskelklappe bzw. Muskellappen in einen hohlen Anteil der implantierten
Vorrichtung einzufädeln.
Beispielsweise kann unter Verwendung des in Khouri,
US 5,067,963 beschriebenen Verfahrens
und hierin nachstehend beschrieben, eine Muskelklappe, die selbst
mit einem osteogenetischen Protein vorbehandelt sein kann, chirurgisch
in eine Kavität in
der implantierten Matrix eingebracht werden, wie beispielsweise
in die Mark-Kavität
des devitalisierten Knochens, um eine Blutzufuhr bereitzustellen,
um die Morphogenese von vaskularisiertem Gewebe zu beschleunigen
und um eine fertige Versorgung für
mesenchymale Stammzellen bereitzustellen.
-
Die
Matrix der vorliegenden Erfindung weist eine Nützlichkeit als implantierbare
Vorrichtung auf, wenn das osteogenetische Protein auf den Oberflächen der
Matrix angeordnet ist, vorliegend in einer Menge, die ausreicht,
um die Bildung jedes der Ersatzgewebe zu induzieren. Dies ermöglicht die
Regeneration des Körperteils
innerhalb des Säugetiers, einschließlich vielfacher
Gewebe der geeigneten Größe, Beziehung
und Funktion. Osteogene Proteine, die in der vorliegenden Erfindung
als nützlich
betrachtet werden, werden nachstehend beschrieben und wurden früher beispielsweise
in
US-Patent Nr. 4 968,590 ,
5,256,499 und
5,266,683 beschrieben. Das osteogene
Protein kann beispielsweise irgendeines der bekannten knochenmorphogenetischen
Proteine und/oder Äquivalente
hiervon sein, die hierin beschrieben und/oder im Stand der Technik
beschrieben sind, und schließt
Material aus natürlicher
Quelle, rekombinantes Material und irgendein Material ein, das in
anderer Weise produziert wird und das zum Induzieren einer Gewebsmorphogene
in der Lage ist.
-
Die
Verwendungen und Materialien der vorliegenden Erfindung sind insbesondere
zur Heilung und/oder zum teilweisen oder vollständigen Ersatz von Säugetierkörper-Gelenken,
einschließlich,
ohne Beschränkung,
Gelenken, insbesondere Gelenken, die von einer bandartigen Kapsel
eingeschlossen und in Synovial-Flüssigkeit gebadet sind, nützlich.
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Bei
einigen echten Gelenken ist die Bewegung uniaxial, d. h. alle Bewegungen
finden um eine Achse herum statt: Zu diesen zählt der Ginglymus oder das
Scharniergelenk, bei dem die Bewegungsachse quer zu den Achsen der
Knochen verläuft,
und das Trochoid- oder Zapfengelenk, bei dem die Achse in Längsrichtung verläuft. Im
Falle von biaxialen Synovial-Gelenken
erfolgen die Bewegungen um zwei Achsen in einem rechten Winkel herum
oder in irgendeinem anderen Winkel zueinander: Diese schließen die
Chondyloid-, die Ellipsoid- und die Sattel-Gelenke ein. Es existiert
eine dritte Art von Synovial-Gelenk, das spheroidale oder das Kugel- und
Sockel-Gelenk, bei dem die Bewegungen polyaxial sind, d. h. es werden
Bewegungen in einer unbegrenzten Anzahl von Achsen ermöglicht.
Zuletzt existieren die ebenen oder Gleittyp-Synovial-Gelenke.
-
Bei
den Scharnier-Gelenken sind die Gelenkoberflächen aneinander in einer solchen
Weise geformt, sodass eine Bewegung in nur einer Ebene um die Querachse
ermöglicht
wird. Eine Biegung des Ellenbogen-gelenkes ist ein Beispiel hierfür; weitere
Beispiele schließen
die interphalangialen Gelenke sowohl der Finger als auch der Zehen
ein. Bei Zapfengelenken tritt die Bewegung eines Zapfengelenkes
um eine einzige Achse auf, es ist jedoch die Längsachse. Es existieren mehrere
Zapfengelenke im menschlichen Körper,
wie beispielsweise das proximale radioulnare Gelenk. In Kondylar-Gelenken
tritt eine Bewegung in erster Linie in einer Ebene auf. Das tibiofemorale
Gelenk des Kniegelenkes ist ein Beispiel hierfür. Beim Ellipsoid-Gelenk erfolgt
die Bewegung um zwei Hauptachsen herum, die im rechten Winkel zueinander
stehen. Beispiele für
diese Gelenke schließen
die radiokarpalen und metakarpophalangialen Gelenke ein. In einem
Sattelgelenk ist das Gelenkende des proximalen Knochens in einer
Achse konkav und in einer dazu senkrecht stehenden Achse konvex.
Diese Oberflächen
passen wechselseitig in konvexe und konkave Oberflächen des
distalen Knochens. Das beste Beispiel eines Sattelgelenkes ist das
karpometakarpale Gelenk des Daumens. Ein Kugel- und Sockel-Gelenk
ist ein solches, bei dem der distale Knochen zu einer Bewegung um
eine unbegrenzte Anzahl von Achsen mit einem gemeinsamen Zentrum
herum in der Lage ist. Beispiele dieser Form eines Gelenkes sind
in den Hüft-
und Schultergelenken zu finden. Ein Ebene- oder Gleittyp-Gelenk
ermöglicht
ein Gleiten oder Abrutschen eines Knochens über den anderen. Anders als
die oben beschriebenen Gelenke ist der Bewegungsumfang zwischen
den Oberflächen
durch die Bänder-
oder Knochen-artige Fortsätze
eingeschränkt, die
das Gelenk umgeben. Dies ist die Form, die in den Gelenken zwischen
den Gelenkfortsätzen
bestimmter Wirbel vorliegen, die Karpal-Gelenke und die intermetatarsalen
Gelenke.
-
Obwohl
es in Betracht gezogen wird, dass die vorliegende Erfindung zur
Reparatur von Defekten, einschließlich Knochen- und Gelenk-Knorpel
an anderer Stelle in einem Säugetierkörper verwendbar
ist, werden die Aspekte bzw. Grundgedanken der Erfindung hierin
in Verbindung mit den Gelenkoberflächen auf dem Oberschenkelknochen
in einem Kniegelenk 10 dargestellt, illustriert in 1.
-
1 illustriert
ein Kniegelenk 10 zwischen dem Oberteil eines Oberschenkelknochens 11 und
dem Oberteil eines Schienbeins 12. Zur Klarheit der Darstellung
sind nur die Anteile 13 und 14 der medialen und lateralen
kollateralen Bänder,
die den Oberschenkelknochen 11 beweglich an das darunterliegende
Schienbein 12 und das Wadenbein 15 befestigen,
in 1 dargestellt. In ähnlicher Weise ist die Gelenkkapsel
durch die äußere dunkle
Auskleidung 25 und die Synovial-Membran dargestellt, die
die Synovial-Höhle
auskleidet und die gleitfähig
machende Synovial-Flüssigkeit
sezerniert, ist durch die innere dunkle Auskleidung 26 repräsentiert.
Normalerweise zwischen den gegenüberliegenden
Flächen
des Oberschenkelknochens 11 und des Schienbeins 12 dazwischen
gelegen sind laterale und mediale Meniskusknorpel 16 und 17 und
vordere und hintere Kreuzbänder
(nicht dargestellt). Konvex gekrümmte
Kondylen 20 und 21 am unteren Ende des Schienbeins 11 werden
normalerweise durch die Meniskusknorpel 16 bzw. 17 am
oberen Ende des Schienbeins 12 gelagert.
-
Normalerweise
wird das untere Ende des Schienbeins 11, einschließlich der
Kondylen 20 und 21, von einer Schicht 22 aus
einem Hyalin-Knorpelmaterial bedeckt, der als Gelenk-Knorpel 22 bezeichnet
wird. Der Gelenk-Knorpel 22 bildet im Allgemeinen ein elastisches
Polster, das auf der Oberfläche
des unteren Endes des Oberschenkelhalsknochens 11 fixiert
ist, um das Letztere von einer Abnutzung und einer mechanischen Erschütterung
zu schützen.
Darüber
hinaus stellt der Gelenk-Knorpel 22, wenn er von der Synovial-Flüssigkeit im
Kniegelenk 10 gleitfähig
gemacht wird, eine Oberfläche
bereit, die einfach auf den darunter liegenden Oberflächen der
Meniskusknorpel 16 und 17 während der Biegung des Kniegelenkes 10 gleitbar
ist (oder auf der oberen Oberfläche
des Schienbeins 12 sollte ein oder beide der Meniskusknorpel 16 und 17 teilweise
oder vollständig
abwesend sein).
-
Ein
Teil des Gelenkes kann durch eine Verletzung oder Erkrankung geschädigt werden
oder exzessiv abgenutzt werden. 1 illustriert
ein Beispiel eines geschädigten
Areals 23.
-
Matrix-Erwägungen
-
Bei
der vorliegenden Erfindung dient das Substrat als Gerüst, auf
dem bestimmte zelluläre
Ereignisse, vermittelt durch ein osteogenetisches Protein, notwendigerweise
eintreten werden. Die spezifischen Reaktionen auf das osteogenetische
Protein werden ultimativ durch die endogene Mikroumgebung an der
Implantatstelle und durch das Entwicklungspotential der reagierenden
Zellen vorgeschrieben. Wie es ebenfalls durch den Fachmann auf dem
Gebiet erkannt werden wird, hängt
die präzise
Auswahl eines Substrats, das für
die hierin offenbarten Matrices verwendet wird, teilweise vom zu
heilenden Defekttyp, anatomischen Erwägungen, wie beispielsweise
dem Umfang der Vaskularisierung an der Defektstelle und dergleichen
ab.
-
Die
Matrix der Erfindung kann wie folgt gewonnen werden. Ein Ersatzgewebe
oder Körperteil,
das als Ersatz-Körperteil
verwendet werden soll und das zumindest zwei verschiedene Gewebe
in Verbindung umfasst, um das Körperteil
zu bilden, wird bereitgestellt, beispielsweise von einem Kadaver
bzw. einem Leichnam oder von einer Knochenbank, und wird durch Ethanol-Behandlung
behandelt und durch Lyophilisation dehydriert, so dass das verbleibende
Material nicht pathogen ist und ausreichend nicht-antigen ist, um
eine Transplantat-Abstoßung
zu vermeiden. Wie oben beschrieben, umfasst das so behandelte Material,
das in den Vorrichtungen der Erfindung eine Nützlichkeit aufweist, weiterhin
die Reste des extrahierten Gewebes oder von Geweben, aus dem es
abgleitet bzw. gewonnen ist. Eine Ersatzkörperteilmatrix, die so behandelt
wird, ist weiterhin so dimensioniert, dass die Reste eine strukturelle
Beziehung zueinander aufweisen, die diejenige des zu ersetzenden
Körperteils
nachahmt.
-
Matrices aus natürlicher Quelle
-
Geeignete
allogene oder xenogene Matrices können wie hierin nachstehend
beschrieben unter Verwendung von Verfahren erzeugt werden, die in
der Technik wohl bekannt sind. Vorzugsweise wird das Ersatzkörperteil
oder das Gewebe frisch gewonnen, und zwar aus einem Kadaver oder
einer Gewebebank, die ihre Gewebe nach Gewinnung einfriert. In allen
Fällen
und wie es für
den praktizierenden Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist,
ist es bevorzugt, jedes Gewebe nach Gewinnung einzufrieren, insofern
das Gewebe nicht zur sofortigen Anwendung entnommen wird. Vor Verwendung
wird das Gewebe mit einem geeigneten Mittel behandelt, um zelluläre nicht-strukturelle
Bestandteile des Gewebes zu extrahieren, um das Gewebe zu devitalisieren.
Das Mittel sollte dazu in der Lage sein, irgendwelche wachstumshemmenden
Bestandteile zu extrahieren, die mit dem Gewebe verbunden sind,
ebenso wie irgendwelche Pathogene zu extrahieren oder in anderer
Weise zu zerstören.
Das sich ergebende Material ist eine Art zelluläre Matrix, die Zwischenräume definiert,
die von Zellen infiltriert werden können, und ist im Wesentlichen
bezüglich
nicht strukturell assoziierter Bestandteile abgereichert.
-
Bei
einem gegenwärtig
bevorzugten Verfahren wird das Gewebe einer Methodik folgend devitalisiert, wie
beispielsweise diejenige, die in der Technik zum Fixieren von Gewebe
verwendet wird. Das Gewebe wird einem nicht-polaren Lösungsmittel
ausgesetzt, wie beispielsweise 100% (200 Proof) Ethanol für eine Zeitspanne,
die ausreichend ist, um den Wassergehalt des Gewebes im Wesentlichen
durch Ethanol zu ersetzen und um die zelluläre Struktur des Gewebes zu
zerstören.
Typischerweise wird das Gewebe gegenüber 200 Proof Ethanol für mehrere
Tage exponiert, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 4 bis
40°C, und
es wird Sorge getragen, die Lösung
durch frischen Ethanol alle 6-12 Stunden zu ersetzen, bis zu einem
solchen Zeitpunkt, wenn der Flüssigkeitsgehalt
des Gewebes 70-90 Ethanol umfasst. Typischerweise ist eine Behandlung für 3-4 Tage
geeignet. Das Volumen an Flüssigkeit,
das zugesetzt wird, sollte mehr als ausreichend sein, um das Gewebe
einzu tauchen. Das behandelte Gewebe wird dann lyophilisiert bzw.
gefriergetrocknet. Die sich ergebende, trockene bzw. wasserfreie
Matrix ist im Wesentlichen bezüglich
nichtstruktureller Bestandteile abgereichert, behält jedoch
sowohl intrazelluläre
als auch extrazelluläre
Matrixbestandteile, die von dem Gewebe abgeleitet sind.
-
Zahlreiche
weitere Verfahren sind in der Technik zum Extrahieren von Geweben
beschrieben, einschließlich
von mineralisiertem Gewebe, wie beispielsweise Knochen, und um diese
Gewebe für
allogene oder xenogene Implantate biokompatibel zu machen. Siehe
beispielsweise Sampath et al. (1983) PNAS 80: 6591-6595,
US 5,011,691 und
US-Patent Nr. 4,975,526 und
5,171,574 . Diese Veröffentlichungen
beschreiben die Extraktion mit 4 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl,
pH 7,0 für
16 Stunden bei 4°C
und verschiedene Deglycosylierungs- und Kollagenfibrill-modifizierende
Mittel, einschließlich
Flusssäure,
Trifluoressigsäure,
Trichlormethan, Acetonitril, Isopropanol, erhitzte saure wässrige Lösungen und
verschiedene Kombinationen dieser Reagenzien. Die Offenbarungen
der Patente ist hierin durch Bezugnahme mit aufgenommen. Wie hierin
und nachstehend beschrieben kann, wenn die Matrix mit einem Fibrillen-modifizierenden
Mittel behandelt wird, die behandelte Matrix zur Entfernung irgendwelcher
extrahierten Bestandteile gewaschen werden, und zwar folgend einer
Form des hierin nachstehend beschriebenen Verfahrens:
- 1. Suspendieren einer Matrixzubereitung in TBS (Tris-gepufferte
Salzlösung)
1 g/200 ml und Rühren
bei 4°C
für 2 Stunden;
oder in 6 M Urea, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTES) oder
Wasser und Rühren
bei Raumtemperatur (RT) für
30 Minuten (ausreichend Zeit, um den pH zu neutralisieren);
- 2. Zentrifugieren und Wiederholen des Waschschrittes; und
- 3. Zentrifugieren; Verwerfen des Überstandes; Waschen des Rückstands
mit Wasser; und darauf lyophilisieren.
-
Behandelte
allogene oder xenogene Matrices weisen zur Erzeugung von Vorrichtungen
zur Ausbildung von Ersatzkörperteilen,
die vielfache verschiedene Gewebe umfassen, ebenso wie zur Erzeugung
von Vorrichtungen zum Ersetzen individueller Gelenk-Gewebe, wie
beispielsweise Bänder
und Gelenkknorpel-Gewebe besondere Nützlichkeit auf. Beispielsweise
kann eine Ersatzband-Vorrichtung aus einer allogenen Band-Matrix
und osteogenetischem Protein formuliert und in einen Skelettgelenk-Ort
unter Befolgung von chirurgischen Standardverfahren für den autogenen
Band-Ersatz implantiert werden. In ähnlicher Weise kann eine allogene
Gelenkknorpel-Vorrichtung aus devitalisiertem Knorpelgewebe oder
anderem inerten, nicht-mineralisiertem Matrix-Material und osteogenetischem
Protein gebildet werden und die Vorrichtung kann auf der subchondralen
Knochenoberfläche
als eine Schicht abgelagert werden. Alternativ kann eine formulierte
Vorrichtung pulverisiert oder in anderer Weise mechanisch abgeschliffen
bzw. abgeschabt werden, um Teilchen zu erzeugen, die zu einer Paste
oder einem Gel, wie hierin beschrieben, zur Aufbringung auf die
Knochenoberfläche
formuliert werden können.
-
Erwägungen
bezüglich
der Formulierungen
-
Die
Vorrichtungen der Erfindung können
unter Verwendung irgendwelcher Verfahren formuliert werden, die
in der Technik zur Formulierung osteogener Vorrichtungen beschrieben
sind. Siehe beispielsweise
US-Patent
Nr. 6,266,683 . Kurz gesagt wird das osteogene Protein typischerweise
in einem geeigneten Lösungsmittel
gelöst
und mit der Matrix kombiniert. Man lässt die Bestandteile sich verbinden.
Typischerweise wird das kombinierte Material darauf lyophilisiert,
mit dem Ergebnis, dass das osteogene Protein auf den Obertflächen der
Matrix abgelagert oder adsorbiert wird. Nützliche solubilisierende Lösungsmittel
schließen ohne
Beschränkung
Ethanoltrifluoressigsäure-Lösung, beispielsweise
47,5% EtOH/0,01% TFA; und eine Acetonitrila/TFA-Lösung, Ethanol
oder Ethanol in Wasser und physiologisch gepufferte Salzlösungen ein.
Formulierungen in einem sauren Puffer können die Absorption an OP1
auf der Matrixoberfläche
erleichtern. Für
Ersatzkörperteil-Vorrichtungen
der Erfindung ist die gegenwärtig
bevorzugte Formulierungs-Vorschrift eine Inkubation der Matrix und
des osteogenen Proteins in einer Ethanol/TFA-Lösung (beispielsweise 30-40
EtOH/0,01 bis 0,1% TFA) für
24 Stunden, gefolgt von Lyophilisation. Dieses Verfahren ist ausreichend,
um 70-90% des Proteins auf der Matrixoberfläche zu adsorbieren oder zu
präzipitieren.
-
Die
Menge an osteogenem Protein, die verwendet wird, hängt von
der Größe der Ersatzvorrichtung, die
verwendet werden soll, und von der spezifischen Aktivität des osteogenen
Proteins ab. Typischerweise können
0,5 mg-100 mg/10 g Matrix Trockengewicht vorteilhafterweise verwendet
werden.
-
Zusätzlich zu
osteogenen Proteinen können
verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische
Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere bioaktive Mittel ebenfalls
an ein Substrat adsorbiert oder mit diesem imprägniert werden und über die
Zeit hinweg freigesetzt werden, wenn sie implantiert werden und
die Matrix langsam adsorbiert wird. Somit können verschiedene bekannte
Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-a
und TGF-b in vivo freigesetzt werden. Die Matrix kann ebenfalls
dazu verwendet werden, chemotherapeutische Mittel, Insulin, Enzyme,
Enzyminhibitoren oder chemotaktische Chemoattraktanz-Faktoren freizusetzen.
-
Erwägungen
bezüglich
des Proteins
-
Wie
hierin definiert, schließen
die osteogenen Proteine, die in der Zusammensetzung und den Anwendungen
der Erfindung von Nutzen sind, die Familie von dimeren Proteinen
mit einer Ersatzknochen-Aktivität ein,
wenn sie einem Säugetier
in Verbindung mit einer Matrix implantiert werden, und die eine
Subklasse der "Superfamilie" von "TGFβ-ähnlichen" Proteinen umfassen.
Das osteogene Protein aus natürlicher
Quelle in seiner reifen, nativen Form ist ein glycosyliertes Dimer,
das typischerweise ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 30-36
kDa aufweist, wie durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Wenn es reduziert
wird, lässt
das 30 kDa Protein zwei glycosylierte Peptid-Untereinheiten mit
apparenten Molekülgewichten
bzw. Molekülmassen von
ungefähr
16 kDa und 18 kDa entstehen. Im reduzierten Zustand weist das Protein
keine nachweisbare osteogenetische Aktivität auf. Das nicht glycosylierte
Protein, das ebenfalls osteogene Aktivität aufweist, weist ein apparentes
bzw. scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Wenn es reduziert
ist, lässt
das 27 kDa Protein zwei unglycosylierte Polypeptide mit Molekulargewichten
von ungefähr
14 kDa bis 16 kDa entstehen, die zum Induzieren einer Ersatzknochenbildung
in einem Säugetier
in der Lage sind. Nützliche
Sequenzen schließen
solche ein, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen von DPP (von Drosophila),
Vgl (von Xenopus), Vgr-1 (von der Maus), das OP1 und dergleichen
Proteine, Proteine (siehe
US-Patent
Nr. 5,011,691 und Oppermann et al.), ebenso wie die als
BMP2, BMP3, BMP4 bezeichneten Proteine (siehe
WO88/00206 ,
US-Patent Nr. 5,013,649 und
WO91/18098 ), BMP5 und BMP6
(siehe
WO90/11366 ,
PCT/US90/01630 ) und BMP8
und 9 umfassen.
-
Die
Mitglieder dieser Familie von Proteinen teilen ein konserviertes
6- oder 7-Cystein-Skelett
im C-terminalen Bereich. Siehe beispielsweise 335-431 von SEQ ID
NO: 1, dessen Sequenz die 6-Cystein-Skelett-Reste definiert, die
hierin als "OPS" oder Reste 330-431
von SEQ ID NO. 1 bezeichnet werden, die 102 Aminosäuren umfassen
und deren Sequenz das 7-Cystein-Skelett
definiert.
-
Diese
Familie von Proteinen schließt
längere
Formen eines gegebenen Proteins ebenso wie phylogenetische Spezies
und Allel-Varianten und biosynthetische Mutanten ein, einschließlich Additions-
und Deletions-Mutanten und -Varianten, wie beispielsweise solche,
die das konservierte C-terminale Cystein-Skelett verändern können, vorausgesetzt,
dass die Veränderung
nach wie vor ermöglicht,
dass das Protein eine dimere Spezies mit einer Konformation bildet,
die zum Induzieren einer Knochenbildung in einem Säugetier
in der Lage ist, wenn es dem Säugetier
in Verbindung mit einer Matrix implantiert wird. Zusätzlich können die
osteogenen Proteine, die in den Vorrichtungen dieser Erfindung von
Nutzen sind, Formen einschließen,
die variierende Glycosylierungsmuster und variierende N-Termini
einschließen,
können
natürlich
vorkommend oder biosynthetisch gewonnen sein und können durch
Expression rekombinanter DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen
Wirtszellen erzeugt werden. Die Proteine sind als einzelne Spezies
(beispielsweise als Homodimere) aktiv oder kombiniert als gemischte
Spezies, einschließlich
von Heterodimeren.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst das osteogenetische Protein, das hierin betrachtet wird,
OP1 oder OP1-verwandte Sequenzen. Nützliche OP1-Sequenzen werden
in
US-Patent Nr. 5,011,691 ;
5,108,753 und
5,266,683 erwähnt; in Ozkaynak et al. (1990)
EMBOJ 9: 2085-2093; und Sampath et al. (1993) PNAS 90: 6004-6006.
OPI-verwandte Sequenzen schließen
xenogene Homologe, beispielsweise 60A von Drosophila, Wharton et
al. (1991) PNAS 86: 9214-9218; und Proteine ein, die mehr als 60%
Identität
mit OPI in der C-terminalen 7-Cystein-Domäne teilen, vorzugsweise zumindest
eine 65%-ige Identität.
Beispiele von OPI-verwandten Sequenzen schließen BMP5, BMP6 (und deren Spezies-Homolog
Vgr-I, Lyons et
al. (1989) PNAS 86: 4554-4558), Celeste et al. (1990) PNAS 87: 9843-9847
und die internationale PCT-Anmeldung
WO93/00432 ein;
OP-2 (Sampath et al. (1990) J. Biol. Chem. 267:
13196-13205 ). Wie dem Fachmann
auf dem Gebiet klar sein wird, können
chimäre
Konstrukte in einfacher Weise unter Verwendung von molekularbiologischen
Standardverfahren und Mutagenese-Techniken erzeugt werden, die verschiedene
Anteile unterschiedlicher Morphogene bzw. morphogenetischer Proteinsequenzen
zur Erzeugung einer neuen Sequenz kombinieren und diese Formen des
Proteins werden hierin ebenfalls betrachtet.
-
In
einem anderen bevorzugten Aspekt betrachtet die Erfindung osteogene
Proteine, die Spezies von Polypeptid-Ketten mit der generischen
Aminosäuresequenz
umfassen, die hierin als "OPX" bezeichnet werden,
die die Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten Spezies
der osteogenen OP1- und OP2-Proteine aufnimmt und die durch die
nachstehend und in SEQ ID NO. 3 präsentierte Aminosäuresequenz beschrieben
ist.
![Figure 00240001](https://patentimages.storage.googleapis.com/15/31/3f/a5b5f08a57f19a/00240001.png)
und wobei
Xaa bei Res. 2 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 3 = (Lys oder Arg);
Xaa bei Res. 11 = (Arg oder Gln); Xaa bei Res. 16 = (Gln oder Leu);
Xaa bei Res. 19 = (Ile oder Val); Xaa bei Res. 23 = (Glu oder Gln);
Xaa bei Res. 26 = (Ala oder Ser); Xaa bei Res. 35 = (Ala oder Ser);
Xaa bei Res. 39 = (Asn oder Asp); Xaa bei Res. 41 = (Tyr oder Cys);
Xaa bei Res. 50 = (Val oder Leu); Xaa bei Res. 52 = (Ser oder Thr);
Xaa bei Res. 56 = (Phe oder Leu); Xaa bei Res. 57 = (Ile oder Met);
Xaa bei :Res. 58 = (Asn oder Lys); Xaa bei Res. 60 = (Glu, Asp oder
Asn); Xaa bei Res. 61 = (Thr, Ala oder Val); Xaa bei Res. 65 = (Pro
oder Ala); Xaa bei Res. 71 = (Gln oder Lys); Xaa bei Res. 73 = (Asn
oder Ser); Xaa bei Res. 75 = (Ile oder Thr); Xaa bei Res. 80 = (Phe
oder Tyr); Xaa bei Res. 82 = (Asp oder Ser); Xaa bei Res. 84 = (Ser
oder Asn); Xaa bei Res. 89 = (Lys oder Arg); Xaa bei Res. 91 = (Tyr
oder His); und Xaa bei Res. 97 = (Arg oder Lys).
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Bei
einem noch weiter bevorzugten Grundgedanken wird eine oder beide
der Polypeptidketten-Unter-einheiten des ostengen aktiven Dimers
von Nukleinsäuren
kodiert, die an DNA- oder RNA-Sequenzen hybridisieren, die die aktive
Region von OP-1 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen kodieren.
Wie hierin verwendet, sind stringente Hybridisierungsbedingungen
als Hybridisierung in 40% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's Lösung
und 0,1% SDS bei 37°C über Nacht
und Waschen in 0,1 × SSPE,
0,1% SDS bei 50°C
definiert.
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Unter
Vorgabe der vorhergehenden Aminosäure- und DNA-Sequenzinformation,
des Ausmaßes
der Fähigkeiten
auf dem Fachgebiet und der Offenbarungen zahlreicher Veröffentlichungen
bezüglich
osteogener Proteine, einschließlich
US Patent-Nr. 5,011,691 und
der offengelegten PCT-Anmeldung
US
89/01469 , veröffentlicht
am 19. Oktober 1969, können
zahlreiche DNAs konstruiert werden, die zumindest die aktive Domäne eines
osteogenen Proteins kodieren, das in den Vorrichtungen dieser Erfindung
von Nutzen ist, und verschiedene Analoge hiervon (einschließlich Spezies-
und Allel-Varianten und solcher, die gentechnische Mutationen enthalten),
ebenso wie Fusionsproteine, trunkierte Formen der reifen Proteine,
Deletions- und Additionsmutanten und ähnliche Konstrukte, die in
den Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Darüber hinaus
können
DNA-Hybridisierungssonden aus Fragmenten irgendwelcher dieser Proteine
konstruiert oder de novo aus den generischen bzw. Gattungsequenzen
entwickelt werden. Diese Sonden können dann zum Screenen unterschiedlicher
genomischer und cDNA-Banken bzw. -Bibliotheken zum Identifizieren zusätzlicher
osteogener Proteine verwendet werden, die in den Prothesen-Vorrichtungen
dieser Erfindung von Nutzen sind.
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Die
DNAs können
vom Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung wohl bekannter DNA-Manipulationstechniken
hergestellt werden, die eine genomische und cDNA-Isolierung, Konstruktion synthetischer
DNA aus synthetisierten Oligonukleotiden und Kassetten-Mutagenesetechniken
einschließen.
15-100-mer Oligonukleotide können
auf einem DNA-Synthetisiergerät
synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) in
Tris-Borat-EDTA-Puffer aufgereinigt werden. Die DNA kann dann aus
dem Gel elektroeluiert werden. Überlappende
Oligomere können
durch T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert und in größeren Blocks
Iigiert werden, die ebenfalls durch PAGE gereinigt werden können.
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Die
DNA aus in geeigneter Weise identifizierten Klonen kann dann isoliert,
subkloniert (vorzugsweise in einen Expressionsvektor) und sequenziert
werden. Plasmide, die interessierende Sequenzen enthalten, können dann
zu einer geeigneten Wirtszelle zur Proteinexpression transfiziert
und weiter charakterisiert werden. Der Wirt kann eine prokaryotische
oder eukaryotische Zelle sein, weil das Unvermögen der Letzteren, ein Protein
zu glycosylieren, die morphogenetische Aktivität des Proteins nicht zerstören wird.
Nützliche
Wirtszellen schließen
E. coli, Saccharomyces, das Insekten/Baculovirus-Zellsystem, Myelomazellen,
CHO-Zellen und verschiedene andere Säugetierzellen ein. Die Vektoren
können
zusätzlich
verschiedene Sequenzen kodieren, um die korrekte Expression des
rekombinanten Proteins zu fördern,
einschließlich
Transkriptionspromotor- und Terminationssequenzen, Enhancer-Sequenzen,
bevorzugter Ribosomen-Bindungsstell-Sequenzen, bevorzugten mRNA-Leader-Sequenzen,
bevorzugten Signalsequenzen zur Proteinsekretion und dergleichen.
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Die
DNA-Sequenz, die das interessierende Gen kodiert, kann ebenfalls
manipuliert werden, so dass potentiell hemmende Sequenzen entfernt
oder eine unerwünschte
Sekundärstruktur-Bildung
minimiert wird. Das rekombinante osteogene Protein kann ebenfalls
als ein Fusionsprotein exprimiert werden. Nachdem es translatiert
ist, kann das Protein aus den Zellen selbst aufgereinigt und aus
dem Kulturmedium gewonnen werden. Alle biologisch aktiven Proteinformen
umfassen dimere Spezies, die durch Disulfid-Brücken verbunden oder in anderer
Weise assoziiert sind, erzeugt durch Falten und Oxidieren einer oder
mehrerer der verschiedenen rekombinanten Polypeptid-Ketten innerhalb
einer geeigneten eukaryotischen Wirtszelle oder in vitro nach Expression
individueller Untereinheiten. Eine ausführliche Beschreibung osteogener
Proteine, die aus rekombinanten DNA in E. coli exprimiert werden
und in zahlreichen unterschiedlichen Säugetierzellen exprimiert werden,
ist im
US-Patent Nr. 5266 963 offenbart.
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Alternativ
können
osteogene Polypeptid-Ketten chemisch unter Verwendung konventioneller
Peptid-Synthesetechniken chemisch synthetisiert werden, die dem
Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wohl vertraut sind. Beispielsweise
können
die Proteine intakt oder in Teilen auf einem Festphasen-Peptidsynthesegerät unter
Verwendung von Standardbetriebsverfahren synthetisiert werden. Vollständige Keilen
werden dann entschützt
und durch HPLC aufgereinigt (Hochdruckflüssigchromatographie). Wenn
das Protein in Teilen synthetisiert wird, können die Teile unter Verwendung
einer Standardmethodik zur Bildung des intakten Proteins Peptid-gebunden
werden. Im Allgemeinen kann die Art und Weise, in der das osteogene
Protein hergestellt wird, konventionell sein und bildet keinen Teil
dieser Erfindung.
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Beispiele
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Die
Mittel zum Herstellen und zur Verwendung der Matrices und Vorrichtungen
der Erfindung ebenso wie andere Materialaspekte, die die Art und
Nützlichkeit
dieser Zusammensetzungen betreffen, einschließlich, wie der Gegenstand,
der beansprucht wird, herzustellen und zu verwenden ist, wird aus
dem Nachfolgenden weiter verstanden werden, das die beste Art und
Weise darstellt, die gegenwärtig
ins Auge gefasst wird, um die Erfindung auszuüben. Es wird klar sein, dass
die Erfindung nicht auf eine so beispielhafte Arbeit oder auf die
speziellen Details, die hierin in diesen Beispielen dargelegt sind,
beschränkt
ist.
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Im
Beispiel wird eine Halb-Gelenkrekonstruktion eines echten Synovial-Gelenkes
in einem existierenden Gelenk-Ort aufgeschnitten. Wie der Durchschnittsfachmann
auf dem Gebiet erkennen wird, können
die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung in gleicher Weise
auf die Bildung von Ersatzkörperteilen, die
nicht Skelett-Gelenke sind, ebenso wie auf andere Skelett-Gelenke
als Gelenk- oder Synovial-Gelenke angewendet werden. Darüber hinaus
kann, falls erwünscht,
das autogene Ersatz-Gelenk zuerst im Empfänger konstruiert werden, indem
die Vorrichtung der Erfindung an einem anderen geeigneten Ort entfernt
von der Defektstelle angeordnet wird, für eine Zeitspanne, die ausreichend
ist, um die Bildung des Ersatzkörperteils
zu induzieren, und der somit geformte autogene Körperteil wird dann im Gelenkort
zur Verwendung vernäht.
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Beispiel 1: Rekonstruktion eines Saugetier-Hemi-Gelenkes
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Weiße Neuseeland-Kaninchen
wurden als experimentelles Modell verwendet. Orthopädische Standard-Chirurgieausrüstung und
-verfahren wurden verwendet.
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Wie
in 2A dargestellt, wurden Gelenkdefekte in einem
Empfänger
durch chirurgisches Ausschneiden des gesamten glenohumeralen Hemiartikularkomplexes
mit den proximalen zwei Dritteln des Numerus erzeugt. Allotransplantate
zur Implantation wurden aus Hemi-Gelenken hergestellt, die aus einem
Spendertier mit der Gelenk-Oberfläche des glenohumeralen Gelenkes
ausgeschnitten wurden. Alle Allotransplantate wurden in Ethanol
extrahiert und unter Verwendung von Standardverfahren und wie hierin
oben beschrieben lyophilisiert, um die Pathogenität und Antigenität des Materials
zu zerstören.
Insbesondere wurden intakte Gelenkkomplexe ausgeschnitten, entmarkt
und durch Exposition gegenüber
200 ml bis 500 ml 200 Proof Ethanol für 72 Stunden bei 40°C Ethanol-behandelt.
Frisches Ethanol wurde alle 6-8 Stunden bereitgestellt. Im Anschluss
an die Ethanol-Behandlung wurde die Matrix lyophilisiert und in
Ethanol/TFA mit oder ohne osteogenem Protein rehydriert. Die behandelten
Halb-Gelenke umfassten devitalisierten Knochen, Gelenkknorpel, Band,
Sehne, Synovial- bzw. Gelenkkapsel und Synovial-Membrangewebe.
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Wie
in
2B dargestellt wurden alle lyophilisierten, osteogenen
Protein-behandelten Allotransplantate mit OP-1 wie in
US 5,011,691 beschrieben beschichtet.
Insbesondere wurde reifes, dimeres rekombinantes OP-1 (ThOP1) in
einer Acetonitril-Trifluoressigsäure-Lösung solubilisiert, mit dem
lyophilisierten Allotransplant kombiniert und implantiert. 15-20 mg Protein/8-10
g Matrix Trockengewicht wurden verwendet. Die distalen Knochenanteile
aller Allotransplantate wurden am Ort mit einer 4-Loch-Titan-Miniplatte
befestigt. Eine peinlich genaue chirurgische Rekonstruktion der
Gelenkkapsel wurde durch Vernähen
der lyophilisierten Kapselenden an die endogene Kapsel unter Verwendung
chirurgischer Standardverfahren durchgeführt, die in der Technik wohl
bekannt sind, unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren,
die in der Technik wohl etabliert sind. Dies erzeugte erneut eine
intakte Kapsel und Synovial- bzw. Gelenk-Auskleidung, wodurch das Gelenk-Milieu
der transplantierten Gelenk-Oberfläche wiederhergestellt wurde.
Eine Bewegung war fast unmittelbar nach dem chirurgischen Eingriff
möglich,
so dass erneut normale Gelenk-Bedingungen hergestellt wurden.
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Bei
einigen Tieren wurden lokale Muskellappen (kutaner Maximus-Muskel,
2C)
in den Bereich des Defektes durch Einfädeln des Muskels in die Markhöhle des
Allotransplantates eingebaut, wie in
2D beschrieben
ist, unter Verwendung des Verfahrens von Khouri, wie beschrieben
in
US-Patent Nr. 5067963 .
Kurz gesagt wurden vaskularisierte und herkömmliche Muskellappen unter
Verwendung von Standardverfahren, die dem praktizierenden Fachmann
in der Rekonstruktionschirurgie wohl bekannt sind, geschnitten,
um eine perfundierende Blutzufuhr aufrechtzuerhalten und wurden
in die Knochenmarkshöhlen
der Allotransplantate eingefädelt.
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Vorläufige Auswertungen
der rekonstruierten Halbgelenke wurden durch serielle wöchentliche
Radiographien unter Verwendung von Röntgenstrahlung und/oder Magnetresonanz-Bildgebung
(MRI) erzielt. Histologische und mechanische bestätigende
Auswertungen wurden nach Töten
bei 5 Wochen und 6 Monaten nach dem chirurgischen Eingriff durchgeführt.
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Mechanische
Evaluationen involvierten den Standardbereich der Bewegung (ROM)-Messungen, die seriell
bis zur Tötung
erzielt wurden. Histologische Auswertungen involvierten die Färbung von
Sagittalschnitten durch die gewonnenen Allotransplantate unter Verwendung
von Standardtechniken.
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Kurz
gesagt kann die Identifizierung eines bona fade Gelenk-Knorpels
unter Verwendung ultrastruktureller und/oder biochemischer Parameter
erreicht werden. Beispielsweise bildet der Gelenk-Knorpel eine kontinuierliche
Schicht aus Knorpelgewebe, der identifizierbare Zonen besitzt. Die
oberflächliche
Zone ist durch Knorpelzellen charakterisiert, die eine abgeflachte
Morphologie und ein extrazelluläres
Netzwerk aufweisen, das sich mit Toluidinblau nicht anfärben lässt oder
schlecht anfärben
lässt,
was auf die relative Abwesenheit sulfatierter Proteoglycane hinweist.
Knorpelzellen in den Mittel- und Tiefenzonen weisen eine kugelförmige Erscheinung
auf und die Matrix enthält
reichlich sulfatierte Proteoglycane, wie es durch Färbung mit
Toluidinblau bewiesen wird. Kollagenfasern sind gegenwärtig diffus
in der ganzen Matrix verteilt. Die Knorpelzellen besitzen reichlich
rohes endoplasmatisches Retikulum und sind von extrazellulärem Netzwerk
umge ben. Das perizelluläre
Netzwerk enthält
zahlreiche dünne
nicht zusammengebundene Kollagenfasern. Das Kollagen in interterritorialem
Netzwerk ist weniger verdichtet und in ein Elektronen durchlässiges,
amorphes Material eingebettet, ähnlich
dem Gelenkknorpel. Kollagenfasern im interterritorialen Bereich
des Netzwerkes zeigen die periodische Bandenbildung, die für Kollagenfasern
in der interterritorialen Zone von Knorpelgewebe charakteristisch ist.
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Biochemisch
gesehen weist das Vorhandensein von Typ-I- und Typ-IX-Kollagen in
Knorpelgewebe auf den differenzierten Phänotyp von Knorpelzellen hin.
Das Vorliegen von Typ-II- und/oder Typ-IX-Kollagen kann durch Standard-Gelelektrophorese,
Western-Blot-Analyse
und/oder immunhistochemische Färbung
unter Verwendung beispielsweise kommerziell erhältlicher Antikörper bestimmt
werden. Weitere biochemische Marker schließen Hämatoxilin, Eosin, Goldners
Trichrom und Safranin-O ein.
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Die
Gelenknorpel-Regeneration wurde histologisch in den hierin beschriebenen
Beispielen unter Verwendung von Glycosaminoglycan-spezifischen Färbungen
und Techniken, die in der Technik wohl bekannt sind, histologisch
ausgewertet. Für
die initiale histologische Auswertung wurden die Defektstellen durch
das Zentrum des Defektes in Längsrichtung
zweifach geschnitten. Die sich ergebenden Hälften und das umgebende Gewebe
wurden in Paraffin eingebettet und durch das Zentrum des Defektes
hindurch geschnitten. Eine Hälfte
jedes Defektes wurde zur histologischen Färbung mit Toluidinblau und/oder
Hämatoxilin
und Eosin, Goldners Trichrom und Safranin-O verwendet. Die andere
Hälfte
wurde bei der Herstellung von Schnitten zur Immunfärbung verwendet.
Histologische Auswertungen involvierten die Bestimmung von: Glycosaminoglycan-Gehalt
im Reparaturknorpel; Knorpel und Knorpelzell-Morphologie; und strukturelle
Integrität
und Morphologie an der Defektgrenzfläche. Die Morphologie des Reparaturknorpels
wurde für
den gebildeten Knorpeltyp dargestellt: Gelenk – gegen fibrotisch durch Auswertung
des Glycosaminoglycan-Gehalts,
des Ausmaßes
der Knorpelablagerung und dergleichen.
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Histologische
Auswertungen unter Verwendung von Standardmethodologien, die im
Stand der Technik gut charakterisiert sind, ermöglichen ebenfalls die Bestimmung
von neuem Knochen und Knochenmarksbildung. Siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 5266 683 .
In ähnlicher
Weise kann die Band- und Gelenkkapsel-Integrität durch MRI, ebenso wie durch
Histologie nach Tötung überwacht
werden.
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Beispiel 2: 5-wöchige Dauer (Kurzzeit)
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Für die 5-Wochen-Studie
wurden vier Gruppen mit 10 Kaninchen pro Gruppe lyophilisiertes
Allotransplantat implantiert. Siehe 3A, 3B, 3C und 3D.
In Gruppe 1 wurde ein lyophilisiertes Kontroll-Allotransplantat 30,
das frei von osteogenem Protein war, implantiert (3A).
In Gruppe 2 wurde experimentelles lyophilisiertes Allotransplantat 31 mit
OP-1 vor der Implantation (3B) imprägniert.
In Gruppe 3 wurde lyophilisiertes Kontroll-Allotransplantat 30,
das frei von osteogenem Protein war, mit Muskellappen 32 implantiert,
die in die Markhöhle 33 (3C)
eingefädelt
waren. In Gruppe 4 wurde ein experimentelles lyophilisiertes Allotransplantat 31 mit
OP-1 vor der Implantation imprägniert
und Muskellappen 32 wurden in die Markhöhle 33 (3D)
eingefädelt.
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Wie
oben festgestellt folgten der Transplantatheilung nicht-invasive
serielle Röntgenbestrahlungen und
Standard-MRI (Magnetresonanz-Bildgebung). Durch Röntgenbestimmung
wiesen Allotransplantate, die mit osteogenem Protein behandelt wurden,
eine bemerkenswert verdickte Rinde postoperativ bei Woche 1 auf, im
Vergleich zu Kontroll-Allotransplantaten (Gruppen 1, 3), die eine
nur dünne,
Eierschalen-artige Rinde zeigten. Zum Zeitpunkt 4 Wochen war die
Großzahl
der Kontroll-Allotransplantate gebrochen und instabil. Im Gegensatz
hierzu verblieben OP-1-behandelte Allotransplantate (Gruppen 2,
4) stabil.
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Eine
MRI wurde als nicht-invasives Mittel zur anschließenden Neubildung
von Gelenkknorpel in den Allotransplantaten verwendet. Ein dunkles
Signal, das durch MRI produziert wurde, repräsentiert die Abwesenheit oder
nicht-lebensfähigen
Knorpel, wohingegen ein helles Signal lebensfähigen, lebendigen Knorpel anzeigt.
Kontroll-Allotransplantate erzeugten lediglich ein dunkles Signal,
wenn sie bei 1, 3 und 5 Wochen post-operativ getestet wurden. Diese
MRI-Befunde wurden durch histologische Analyse bestätigt, die
bei 5 Wochen postoperativ durchgeführt wurden. Ein Sagittalschnitt
durch Kontroll-Allotransplantate zeigte eine degenerierte Gelenk-Oberfläche ohne
lebende Zellen.
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Im
Gegensatz hierzu zeigten die MRI-Erkenntnisse der Gelenk-Kappe bzw.
-Kapsel von OP-1-behandelten Allotransplantaten ein helles Signal
bei Woche 3 postoperativ, was auf die Regeneration von lebensfähigem Gelenk-Knorpel
hinweist. Eine histologische Analyse der OP-1-behandelten Allotransplantate
zeigte bei Woche 5 eine Schicht aus neu erzeugtem Gelenk-Knorpel
oben auf der Allotransplantat-Matrix. Die Allotransplantate von
Gruppe 4 zeigten ein wenig dickere Knorpelschichten als solche von
Gruppe 2, was nahe legt, dass der Zusatz des Muskellappens die Geschwindigkeit
der Gelenk-Regeneration weiter erhöhen kann.
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Zusätzlich erhielten
Gelenke, die mit den OP-1-behandelten Allotransplantaten regeneriert
wurden, einen nahezu normalen Bewegungsbereich zu dem Zeitpunkt
zurück,
zu dem sie 5 Wochen nach der Rekonstruktion gewonnen wurden. Der
nahezu normale Bereich der Bewegung weist ebenfalls auf das Vorhandensein einer
gleitfähig
machenden Gelenkflüssigkeit
hin. Im Gegensatz hierzu waren die gewonnenen Kontroll-Allotransplantate
steif und bei Gewinnung kontrahiert. Somit waren die Hemi-Gelenk-Ersatzvorrichtungen
der Erfindung bei der Ausbildung mechanisch und funktionell lebensfähiger Ersatzgelenke
erfolgreich, mit einer intakten Kapsel und Synovium und funktionierendem
Band, Knochen und Gelenkknorpel-Gewebe. Bei Fehlen von osteogenem
Protein sind die Allotransplantate von sich aus nicht ausreichend,
während
sie vom Spender nicht abgestoßen
werden, um ein funktionelles, Gewicht tragendes Gelenk zu erzeugen.
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Beispiel 3: 6-monatige Dauer (Langzeit)
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Für die 6-Monats-Studie
wurde die Variable des Abschabens bzw. des Abschälens der alten Knorpel-Kappe
in den lyophilisierten Allotransplantaten mit eingebracht. Kurz
gesagt wurde dies durch mechanisches Abtrennen der Gelenkknorpel-Kappe
der Gelenk-Oberfläche
erreicht.
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Die
folgenden Gruppen wurden mit 4 Kaninchen pro Gruppe verwendet: In
Gruppe 5 wurde lyophilisiertes Allotransplantat 34 mit
einer abgeschälten
Gelenkoberfläche
und Muskellappen 32 implantiert (siehe 4A);
in Gruppe 6 wurde lyophilisiertes Kontroll-Allotransplantat 30 mit nicht-abgeschälter Gelenk-Oberfläche und
Muskellappen 32 implantiert (siehe 4B); in
Gruppe 7 wurde lyophilisiertes Allotransplantat 35 mit einer
abgeschälten
Gelenkoberfläche
und OP-1 und einem Muskellappen 36, behandelt mit OP-1,
implantiert (siehe 4C); und in Gruppe 6 wurde ein
lyophilisiertes Allotransplantat 37 mit einer nicht-abgeschälten Gelenk-Oberfläche und
OP-1 und Muskellappen 36, der mit OP-1 behandelt wurde,
implantiert (siehe 4D). Transplantate in den Gruppen
5-8 wurden 6 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff gewonnen.
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Basierend
auf den Bildgebungsstudien vor der Gewinnung sind die zum Zeitpunkt
3 Monate nach der Operation gesammelten Ergebnisse mit den oben
beschriebenen Ergeb nissen konsistent, die bei 5 Wochen gesammelt
wurden. Intakte Allotransplantate, die mit OP-1 (Gruppe 8) behandelt
wurden, regenerierten eine lebende Knorpel-Gelenkoberfläche zum
Zeitpunkt 3 Wochen, wenn dies unter Verwendung von MRI evaluiert wurde.
Diese Gelenkkappe liegt zum Zeitpunkt 3 Monate noch vor und ist
sogar besser entwickelt. Ohne OP-1 Behandlung des Allotransplantates
(Gruppe 6) existierte eine vernachlässigbare Knorpelregeneration
bezüglich
der OP-1-behandelten Gruppen.
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In ähnlicher
Weise erhielten Gruppe-8-Kaninchen (Allotransplantat + OP-1, nicht-abgeschält) einen nahezu
normalen Bewegungsbereich (mehr als 80%) im rekonstruierten Gelenk
zurück.
Gruppe-7-Kaninchen (Allotransplantat + OP-1, abgeschält) erreicht
nur 50% Bewegungsbereich und Gruppe 5 und 6 (kein OP-1) erreichten
weniger als 30%.
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Wie
durch Histologie bestimmt wurde, waren die Vorrichtungen der Erfindung
dazu in der Lage, sowohl die Knochen- als auch Gelenkknorpel-Bildung
im geeigneten Kontext zueinander in einer Langzeitstudie (mehr als
6 Monate) zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Insbesondere demonstrierten
die Kaninchen von Gruppe 8 eine Gelenkknorpel-Bildung auf der Oberfläche des
Knochens, wie es morphologisch durch das Vorliegen von ruhenden,
zentralen und tieferen Zonen-Knorpelzellen unter Beweis gestellt
wurde. Im Gegensatz hierzu wurde in Gruppen, die lediglich mit Muskellappen
(Gruppe 5 und 6) behandelt wurden, der Muskel durch Narbengewebe
ersetzt. In den Gruppen, die mit abgeschälten Knochen-Matrices behandelt
wurden, wurde keine signifikante Knorpel-Regeneration identifiziert, was das
Erfordernis von Knorpel-spezifischen Resten in der Gelenkknorpel-Bildung
in einem nicht-vaskularisierten Milieu demonstriert.
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Sowohl
in der Kurzzeit- als auch in der Langzeitstudie ergaben sich mechanisch
und funktionell lebensfähige
Synovial-Gelenke aus den rekonstruierten Halb-Gelenken, die mit
osteogenem Protein behandelt wurden, wie es durch Morphologie und
Biochemie unter Beweis gestellt wurde. Zusätzlich bildete sich neues Gewebe,
einschließlich
Gelenk-Knorpel, entsprechend Form, Art und strukturellem Verhältnis zu
dem Rest im devitalisierten Gewebe, das die Matrix der Vorrichtung
bildete. Zusammen genommen demonstrieren diese Beispiele, dass eine
Vorrichtung, die osteogenes Protein und abgeschälte, nicht-lebensfähige lyophillisierte devitalisierte
Matrix enthält,
zu einer lebensfähigen,
mechanisch und strukturellen Ersatzkörperteil-Struktur transformiert
werden kann, die viele verschiedene neu gebildete Gewebe umfasst,
die die Form und Funktion eines Originalgewebes annehmen. Die Vorrichtung
kann die normale Funktion eines zerstörten Körperteils wiederherstellen,
einschließlich
eines zerstörten
Skelettgelenkes, der Wiederherstellung mechanisch und funktionell
lebensfähiger
vielfacher verschiedener Gewebe, einschließlich Knochen- und Knochenmark,
Gelenk-Knorpel, Band, Sehne, Synovial-Kapsel und synovialem Membrangewebe. Überdies
werden die Gewebe unter im Wesentlichen physiologischen Bedingungen
wiederhergestellt, einschließlich,
beispielsweise aus reagierenden Zellen, die in einer Gelenkumgebung
vorliegen und ohne Exposition gegenüber avaskularisierten Muskellappen.
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Eine
Vorrichtung, die osteogene Protein behandelte Matrices umfasst,
einschließlich
lyophilisierte Allotransplantate oder Xenotransplantate, wie hierin
offenbart, kann zur Bildung eines neuen, mechanisch, strukturell
und funktionell lebensfähigen
Ersatzgewebes führen
und zu Ersatzkörperteilen,
die vielfache verschiedene Gewebe umfassen, die durch Wirtszellen
besiedelt werden und dies ohne irgendeine der Einschränkungen
von Prothesenmaterialien.
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Der
Fachmann wird wissen, oder dazu in der Lage sein, sicherzustellen,
ohne nicht mehr als Routine-Experimente zu verwenden, dass viele Äquivalente
für die
speziellen Ausführungsformen
der hierin beschriebenen Erfindung existieren. Diese und alle anderen Äquivalente
sollen durch die nachfolgenden Ansprüche mit umfasst werden.
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