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Es
ist anzunehmen, dass eine Neubildung von Skelettmuskelgewebe durch
spezifische Proteinfaktoren reguliert wird, die natürlicherweise
bzw. naturgemäß innerhalb
der Knochenmatrix vorkommen. Wird ein Knochen beschädigt, stimulieren
jene Faktoren Zellen, um neues Knorpel- und Knochengewebe zu bilden, welches
verlorengegangenen oder beschädigten
Knochen ersetzt oder wiederhergestellt. Knochenneubildung ist insbesondere
dort wichtig, wo prothetische Implantate ohne Bindungs- bzw. Haftzement
verwendet werden, um erkrankte Knochen, wie bei der Hüftersetzung,
zu setzen. In diesen Fällen
ist es sehr wichtig eine sehr enge Bindung zwischen der Prothese
und dem vorhandenen Knochen auszubilden, und eine erfolgreiche Funktion
an der Schnittstelle ist von der Interaktion zwischen dem Implantat
und dem Knochengewebe abhängig.
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Knochenheilung
kann durch ein oder mehrere osteogene Proteine stimuliert werden,
die eine Entwicklungskaskade zellulärer Ereignisse induzieren,
welche zur endochondralen Knochenbildung führen. Proteine, die Knochenwachstum
stimulieren, wurden in der Literatur als Knochen morphogene Proteine,
Knochen induzierende Protein, osteogene bzw. osteogenetische Proteine,
Osteogenin oder osteoinduktive Proteine bezeichnet.
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Die
US-4,968,590 (6. November 1990) offenbart die Reinigung von "im Wesentlichen reinem" osteogenem Protein
aus dem Knochen, das, wenn es in Assoziation mit einer Matrix in
einen Säuger
implantiert wird, in einem Säuger
eine endochondrale Knochenbildung induzieren kann, und eine halbmaximale
Aktivität von
mindestens ungefähr
25 bis 50 Nanogramm pro 25 Milligramm implantierter Matrix aufweist.
Eine höhere Aktivität wurde
anschließend,
wie in der US-P-5,011,691 offenbart, für dieses Protein aufgezeigt,
bspw. 0,8–1,0 ng
osteogenem Protein pro mg implantierter Matrix. Dieses Patent offenbart
ebenfalls eine zur Identifizierung von osteogene Proteine kodierenden
Genen nützliche
Konsensus-DNA-Sequenzsonde,
und eine Anzahl von osteogene Proteine kodierenden menschlichen
Genen, die unter Verwendung der Konsensussonde identifiziert wurden,
einschließlich
eines vorher nicht identifizierten Gens, das hierin als "OP1" (osteogenes Protein-1) bezeichnet
wird. Mit der Konsensussonde wurden in der PCT/US87/01537 ebenfalls
DNA-Sequenzen identifiziert, wobei die Sequenzen, die BMP-2 Klasse
I und Klasse II ("BMP-2" bezieh ungsweise "BMP4") und BMP3 genannt
wurden, entsprechen. Diese durch diese Sequenzen kodierten osteogenen
Proteine werden hierin als "CBMP2A", "CBMP2B" beziehungsweise "CBMP3" bezeichnet. Die
US-5,011,691 definierte ebenfalls eine "aktive" Konsensus "Region", die für eine osteogene Aktivität erforderlich
ist und beschrieb unter Verwendung jener Konsensussequenz einige
neue biosynthetische Konstrukte, die in Assoziation mit einer Matrix
eine Knorpel- oder Knochenbildung in einem Säuger induzieren konnten.
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Diese
und andere Forscher gaben an, dass eine erfolgreiche Implantation
der osteogenen Faktoren für
eine endochondrale Knochenbildung erfordert, dass die Proteine mit
einem geeigneten Trägermaterial
oder einer Matrix, das/die die Proteine an der Anwendungsstelle
hält, assoziiert
sein müssen.
Für diesen
Zweck wurden Knochenkollagenteilchen verwendet, die nach Demineralisierung,
Guanidinextraktion und Entfettung pulverisierten Knochens erhalten
bleiben. Viele osteogene Proteine sind interspezifisch bzw. unter
Arten nützlich.
Demineralisierte, entfettete und Guanidin extrahierte xenogene Kollagenmatrices
hemmten jedoch gewöhnlich
eine Knocheninduktion in vivo. Sampath und Reddi, Proc Natl Acad.
Sci. USA, 80 (1983), 6591–6594. Unlängst haben
jedoch Sampath et al. ein Verfahren zur Behandlung demineralisierten,
Guanidin extrahierten Knochenpulvers beschrieben, um eine für xenogene
Transplantate nützliche
Matrix zu erzeugen. Siehe, US-4,975,526 (4. Dezember 1990). Andere
nützliche
Matrixmaterialien schließen
beispielsweise Kollagen, Homopolymere oder Kopolymere von Glycolsäure, Milchsäure und
Buttersäure
ein, einschließlich
von Abkömmlingen
davon, und Keramiken wie beispielsweise Hydroxylapatit, Tricalciumphosphat
und anderen Calciumphosphaten. Kombinationen jener Matrixmaterialien
können
ebenfalls nützlich
sein.
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Orthopädische Implantate
wurden gewöhnlich
unter Verwendung von Knochenzement an natürlichem Knochen angebracht.
Unlängst
wurden zementlose Prothesen verwendet, bei denen der mit dem natürlichen Knochen
in Kontakt stehende Prothesenanteil mit einem porösen Material
beschichtet ist. M. Spector, J. Arthroplasty, 2(2) (1987), 163–176, und
Cook et al., Clin. Orthoped. and Rel. Res. 232 (1988), 225–243. Es
wird eine zementlose Befestigung bevorzugt, da eine biologische
Befestigung der Prothese stärker
ist, wenn eine Knochenintegration erreicht wird. Die porösen Beschichtungen
stimulierten, wie berichtet, eine Knocheneinwachsung, die zu einer
verstärkten
biologischen Befestigung der Prothese führte. Es kommen jedoch einige Probleme
mit porös-beschichteten
Prothesen vor. Beispielsweise ist eine umsichtige Prothesenauswahl
erforderlich, um ein lückenloses
Passen an dem Knochen zu erhalten, so dass eine anfängliche
mechanische Stabilisierung der Vorrichtung gewährleistet ist und um einen
anfänglichen
Implantat-Knochen-Kontakt zu gewährleisten,
so dass Knocheneinwachsung gefördert
wird, ist eine chirurgische Genauigkeit erforderlich. In einigen Beispielen
führten
porös-beschichtete
Implantate nicht zu einer Knocheneinwachsung, beispielsweise bei
porös beschichtetem
Tibialkopf, der bei Knieersetzungen verwendet wird. Ein prothetisches
Implantat, das zu einer beträchtlichen
Knocheneinwachsung führt
und an der Verbindungsstelle eine starke Bindung mit dem natürlichen
Knochen bildet, wäre
sehr wertvoll.
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Der
gegenwärtige
Stand der Technik zum Verankern von eingebetteten Implantaten, wie
beispielsweise Zahnimplantaten ist ebenfalls nicht zufrieden stellend.
Gewöhnlich
erfordert eine Zahnimplantatbefestigung zuerst ein Herstellen einer
Zahnalveole bzw. Zahnfassung in dem Kieferknochen eines Individuums
zur Prothesenimplantation, wodurch eine Knocheneinwachsung in die
Fassungslücke
gestattet wird, um die Fassung auszufüllen. Ein solcher Vorbereitungsschritt
alleine kann bis zur Beendigung bzw. Fertigstellung einige Monate
dauern. Die Prothese wird dann in den neuen Knochen in der Fassung
gewunden bzw. geschraubt und neuer Knochen kann um den gewundenen
Anteil des in der Fassung eingebetteten Implantats erneut wachsen. Das
Intervall zwischen einer Zahnextraktion und prothetischer Wiederherstellung
kann somit bis zu acht Monaten dauern. Zusätzlich kann das Aufschrauben
der Prothese in den Knochen die Integrität des Knochens schädigen. Prothetische
Zahnimplantate, die eine Knochenintegration verbessern und die Zeitdauer
und den Aufwand zur Befestigung verringern wären vorteilhaft.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Gegenstand der Ansprüche. Die
Erfindung kann Anwendung in einem Verfahren zum Erhöhen des
Knochenwachstums an der Implantationsstelle einer Prothese finden,
um eine Bindung zwischen der Prothese und dem vorhandenen Knochen
zu bilden. Eine Prothese wird, wie hierin verwendet, verstanden,
um die Hinzufügung
eines künstlichen
Teils zu beschreiben, um einen Defekt in dem Körper zu versorgen. Das Verfahren
schließt
ein Beschichten oder auf andere Weise ein Inkontaktbringen der gesamten
oder eines Anteils der Prothese mit einem im Wesentlichen reinen
osteogenen Protein ein, der mit dem Knochen in Kontakt stehen wird.
Eine Prothese wird mit dem osteogenen Protein beschichtet und anschießend an
einer Stelle, an der das Knochengewebe und die Oberfläche der
Prothese für
eine ausreichende Zeitdauer in enger Nachbarschaft gehalten wird,
in das Individuum implantiert, um erhöhtes Knochengewebewachstum
zwischen dem Gewebe und der implantierten Prothese zu gestatten.
Das osteogene Protein, das mit der implantierten Prothese assoziiert
ist, stimuliert um die Prothese Knochenwachstum und bewirkt, dass zwischen
der Prothese und dem vorhandenen Knochen eine stärkere Bindung gebildet wird
als sie sich zwischen der Prothese und dem Knochen in der Abwesenheit
des Proteins bilden würde.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird eine prothetische Vorrichtung, wie beispielsweise eine künstliche
Hüftersatzvorrichtung,
bspw. eine aus Titan hergestellte metallische Vorrichtung, beispielsweise
zuerst mit einem eine Knocheneinwachsung induzierenden osteogenen
Material beschichtet. Wird die Vorrichtung anschliessend in das
Individuum implantiert, dann wird um die Stelle des Implantats ein
Knochenwachstum erhöht,
wodurch eine starke Bindung zwischen dem Implantat und dem vorhandenen
Knochen gebildet wird. Das Verfahren führt zu einer erhöhten bzw.
verstärkten
biologischen Befestigung der Prothese in dem Körper, was insbesondere für Gewicht
hervorbringende bzw. tragende Prothesen wichtig ist. Prothesen,
die eine Mikroporenoberflächenstruktur
definieren, werden an Ort und Stelle verschlossen, da sich eine
Knochenbildung innerhalb der Mikroporen ereignet. Die Metall- oder
Keramikprothese selbst definiert eine derartige Struktur.
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Das
Implantat kann eine Form aufweisen, die eine oder mehrere Einkerbungen
bzw. -buchtungen definiert, um eine Knocheneinwachsung zu gestatten.
Die Einbuchtungen sind vorzugsweise transversal zu der Langsachse
des Implantats. Im Allgemeinen wird die Längsachse des Implantats parallel
zu der Längsachse des
Knochens verlaufen, der behandelt wurde, um das Implantat zu empfangen
bzw. aufzunehmen. Das neue Knochenwachstum in die Einbuchtungen
füllt diese
dadurch aus, integriert bzw. baut, wie vorstehend beschrieben, die
Oberfläche
des Implantats ein, und integriert den vorhandenen Knochen. Die
Prothese kann somit in der Öffnung
und durch das Knochenwachstum in den Einbuchtungen enger befestigt
werden, und durch eine Knochenintegration von neuem Knochen mit
der Oberfläche
des Implantats an Ort und Stelle "festgeklammert" oder gehalten werden, wobei beide von
jenen durch das osteogene Protein stimuliert werden.
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In
einer speziellen Ausführungsform
wird ein Zahnimplantat verwendet, um einen fehlenden Zahn zu ersetzen.
Das Implantat umfasst gewöhnlich
einen gewundenen Anteil, der in dem Kieferknochen befestigt wird
und einen Zahnanteil, der dazu gestaltet ist mit den restlichen
Zähnen
des Patienten integriert bzw. eingegliedert zu werden. Das Implantat
wird mit osteogenem Protein beschichtet und in eine in dem Kieferknochen
befindliche Zahnfassung gewunden oder geschraubt, die dazu vorbereitet
bzw. hergestellt wurde, um es aufzunehmen (bspw. dem Knochen wurde
gestattet in die Fassungslücke
zu wachsen und sie auszufüllen).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird, um das Implantat
aufzunehmen, die Fassung durch Bepacken der Lücke mit einer Knochenwachstumszusammensetzung,
die aus in einem geeigneten Trägermaterial
dispergierten osteogenem Protein zusammengesetzt ist, hergestellt.
Die Kombination von osteogenem Protein und Träger wird hierin als eine "osteogene Vorrichtung" bezeichnet. Das
osteogene Protein fördert
eine Knochenintegration des Implantats in den Kieferknochen ohne
zuerst ein Knochenwachstum zum Ausfüllen der Fassung erforderlich
zu machen und ohne das Erfordernis, dass die Prothese in vorhandenen
Knochen gewunden wird, was die Integrität des vorhandenen Knochens
schwächen
könnte.
Demgemäß wird das
Zeitintervall zwischen Zahnextraktion und prothetischer Wiederherstellung
beträchtlich
verringert. Es wird erwartet, dass eine prothetische Wiederherstellung
in so kurzer Zeit wie einem Monat vollendet werden kann. Außerdem wird
die Fähigkeit
des osteogenen Proteins eine Knochenintegration der Prothese zu
fördern
einen besseren bzw. überlegenen
Anker bereitstellen.
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Die
Erfindung führt
zu einer erhöhten
biologischen Befestigung der Prothese. Es wird eine starke Bindung
zwischen dem vorhandenen Knochen und der Prothese gebildet, was
zu einer verbesserten mechanischen Festigkeit an der Verbindungsstelle
führt.
Eine höhere
Befestigungsfestigkeit bedeutet, dass die Prothese sicherer und
dauerhafter und somit für
den Patienten bequemer und beständiger
sein wird.
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Die
einzige Figur der Zeichnung stellt eine schematische Querschnittsansicht
eines Anteils einer Prothese dar, die in einen Femur bzw. Oberschenkelknochen
implantiert wurde und stellt den Klammerungsvorgang einer Knocheneinwachsung
gemäß einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform
dar.
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Hierin
wird ein Verfahren zur erhöhten
Knochenintegration zwischen einer Prothese und natürlichem Knochen
in einem Individuum an der Implantationsstelle der Prothese beschrieben.
Das Verfahren schließt
Bereitstellen einer Prothese an einer Implantationsstelle zusammen
mit im Wesentlichen reinem osteogenem Protein ein, so dass das osteogene
Protein mit dem gesamten oder einem Anteil der implantierten Prothese
in Kontakt steht. Das Protein fördert
eine Knochenintegration der Prothese und des Knochens, was zu einer
starken Bindung mit verbesserter Bruchfestigkeit führt.
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Die
in der vorliegenden Erfindung nützlichen
osteogenen Proteine, werden hiernach beschrieben.
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Das
aus einer natürlichen
Quelle stammende osteogene Protein ist in dessen reifer, nativer
Form ein glycosyliertes Dimer mit einem, wie durch SDS-Page bestimmten,
scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 30 kDa. Wird reduziert,
dann ergibt das 30 kDa Protein zwei glycosylierte Peptiduntereinheiten
mit scheinbaren Molekulargewichten von ungefähr 16 kDa und 18 kDa. In dem
reduzierten Zustand weist das Protein keine nachweisbare osteogene
Aktivität
auf. Das nicht glycosylierte Protein, welches ebenfalls osteogene
Aktivität aufweist,
weist ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 27 kDa auf. Wird reduziert,
dann ergibt das 27 kDa Protein zwei nicht glycosylierte Polypeptide
mit Molekulargewichten von ungefähr
14 kDa bis 16 kDa. Das rekombinant hergestellte, osteogene Protein
beschreibt eine eine endochondrale Knochenbildung in einem Säuger induzierende
Klasse dimerer Proteine, welche ein Paar von Polypeptidketten umfassen,
wobei jede von denen eine Aminosäuresequenz
aufweist, die ausreichend vervielfacht bzw. kopiert bzw. ähnlich zu
der Sequenz der biosynthetischen Konstrukte oder COP-5 oder COP-7, (SEQ ID No. 3
und 4) ist, so dass das Paar von Polypeptidketten, wird es über Disulfid
verbunden, um eine dimere Spezies herzustellen eine endochondrale
Knochenbildung in einem Säuger
induzieren kann. Wie hierin definiert, wird "ausreichend vervielfältigt" verstanden, um die Klasse von Proteinen
mit endochondraler Knochenaktivität als dimere Proteine zu beschreiben,
die in einen Säuger
in Assoziation mit einer Matrix implantiert sind, wobei jede der
Untereinheiten mindestens 60% Aminosäuresequenzhomologie in der
C-terminalen Cystein
reichen Region mit der Sequenz von OPS (Reste 335 bis 431, SEQ ID
No. 1) aufweist. "Homologie" wird hierin definiert
als Aminosäuresequenzidentität oder konservative
Aminosäureänderungen
innerhalb der Sequenz, wie durch Dayhoff et al., Atlas of Protein
Sequenz and Structure vol. 5, Supp. 3, pp. 345–362 (M. O. Dayhoff, ed. Nat'l Biomed. Research
Fdn., Washington, D. C., 1979) definiert. Nützliche Sequenzen schließen solche
ein, die die C-terminalen Sequenzen von DPP (von Drosophila), Vgl
(von Xenopus), Vgr-1 (von der Maus), der OP1 und OP2 Proteine, der CBMP2,
CBMP3 und CBMP4 Proteine umfassen (siehe US-P-5,011,691 und US-A-07/841,646
durch Oppermann et al., am 21. Februar 1992 eingereicht, welche
beiden Offenbarungen hierdurch durch Bezugnahme, als auch die Proteine,
die als BMP5 und BMP6 bezeichnet werden (siehe WO 90/11366, PCT/US90/01630), aufgenommen
werden). Eine Anzahl dieser Proteine werden ebenfalls in der WO
88/00205, US-P-5,013,649 und der WO 91/18098 beschrieben. Tabelle
I stellt eine Liste der bevorzugten Mitglieder dieser Familie von osteogenen
Proteinen bereit. Tabelle
I- osteogene Proteinsequenzen
| hOP1- | DNA-Sequenz,
die menschliches OP1 Protein (SEQ ID No. 1 oder 3) kodiert. Ebenfalls
wird es in verwandten Anmeldungen als "OP1", "hOP-1" und "OP-1" bezeichnet. |
| OP1- | Bezieht
sich generisch auf die Familie osteogen aktiver Proteine, die durch
Expression eines Teils oder des gesamten hOP1 Gens hergestellt werden.
Es wird ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "OPI" wird "OP-1" bezeichnet. |
| hOP1-PP- | Aminosäuresequenz
von menschlichem OP1 Protein (Präpro-Form),
SEQ ID No. 1, Reste 1–431.
Es wird ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "OP1-PP" und "OPP" bezeichnet. |
| OP1-18Ser- | Aminosäuresequenz
von reifem menschlichem OP1 Protein, SEQ ID No. 1, Reste 293–431. Die
N-terminale Aminosäure ist
Serin. Ursprünglich
als bei 18 kDa auf einem SDS-PAGE wandernd in COS Zellen identifiziert.
Abhängig
von dem Proteinglycosylierungsmuster in verschiedenen Wirtszellen
wandert es auf einem SDS-Page ebenfalls bei 23 kDa, 19 kDa und 17
kDa. Es wird in verwandten Anmeldungen ebenfalls als "OP1-18" bezeichnet. |
| OPS- | Menschliche
OP1 Proteinspezies, die das konservierte 6 Cystein-Skelett in der
aktiven Region (97 Aminosäuren,
SEQ ID No. 1, Reste 335–431)
definiert. "S" steht für "kurz". |
| OP7- | Menschliche
OP1 Proteinspezies, die das konservierte 7 Cystein-Skelett in der
aktiven Region (102 Aminosäuren,
SEQ ID No. 1, Reste 330–431)
definiert. |
| OP1-16Ser- | N-terminale
abgestumpfte/verkürzte
reife menschliche OP1 Proteinspezies. (SEQ ID No. 1, Reste 300–431). N-terminale
Aminosäure
ist Serin; Protein wandert auf einem SDS-PAGE abhängig vom
Glycosylierungsmuster bei 16 kDa oder 15 kDa. Ebenfalls in verwandten
Anmeldungen als "OP-16S" bezeichnet. |
| OP1-16Leu- | N-terminale
abgestumpfte/verkürzte
reife menschliche OP1 Proteinspezies, SEQ ID No. 1, Reste 313–431. N-terminale
Aminosäure
ist Leucin; Protein wandert auf einem SDS-PAGE abhängig vom
Glycosylierungsmuster bei 16 kDa oder 15 kDa. Ebenfalls in verwandten
Anmeldungen als "OP-16L" bezeichnet. |
| OP1-16Met- | N-terminale
abgestumpfte/verkürzte
reife menschliche OP1 Proteinspezies, SEQ ID No. 1, Reste 315–431. N-terminale
Aminosäure
ist Methionin; Protein wandert auf einem SDS-PAGE abhängig vom Glycosylierungsmuster
bei 16 kDa oder 15 kDa. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "OP-16M" bezeichnet. |
| OP1-16Ala- | N-terminale
abgestumpfte/verkürzte
reife menschliche OP1 Proteinspezies, SEQ ID No. 1, Reste 316–431. N-terminale
Aminosäure
ist Alanin; Protein wandert abhängig
vom Glycosylierungsmuster bei 16 kDa oder 15 kDa auf einem SDS-PAGE.
Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "OP-16A" bezeichnet. |
| OP1-16Val- | N-terminale
abgestumpfte/verkürzte
reife menschliche OP1 Proteinspezies, SEQ ID No. 1, Reste 318–431. N-terminale
Aminosäure
ist Valin; Protein wandert abhängig
vom Glycosylierungsmuster bei 16 kDa oder 15 kDa auf einem SDS-PAGE.
Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "OP-16V" bezeichnet. |
| mOP1- | DNA,
die das Maus OP1 Protein kodiert, SEQ ID No. 8. Ebenfalls in verwandten
Anmeldungen als "mOP-1" bezeichnet. |
| mOP1-PP- | Präpro-Form
des Maus-Proteins, SEQ ID No. 8, Reste 1–430. Ebenfalls in verwandten
Anmeldungen als "mOP-1-PP" bezeichnet. |
| mOP1-Ser- | Reife
OP1-Proteinspezies der Maus (SEQ ID No. 8, Reste 292–430). N-terminale
Aminosäure
ist Serin. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "mOPI" und "mOP-1" bezeichnet. |
| mOP2- | DNA,
die das OP2 Protein der Maus kodiert, SEQ ID No. 12. Ebenfalls in
verwandten Anmeldungen als "mOP-2" bezeichnet. |
| mOP2-PP- | Präpro-Form
des mOP2 Proteins, SEQ ID No. 12, Reste 1–399. Ebenfalls in verwandten
Anmeldungen als "mOP-2-PP" bezeichnet. |
| mOP2-Ala- | Reifes
OP2 Protein der Maus, SEQ ID No. 12, Reste 261–399. N-terminale Aminosäure ist
Alanin. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "mOP2" und "mOP-2" bezeichnet. |
| hOP2- | DNA,
die das menschliche OP2 Protein kodiert, SEQ ID No. 10. Ebenfalls
in verwandten Anmeldungen als "hOP-2" bezeichnet. |
| hOP2-PP- | Präpro-Form
des menschlichen OP2 Proteins, SEQ ID No. 10, Reste 1–402. Ebenfalls
in verwandten Anmeldungen als "hOP-2-PP" bezeichnet. |
| hOP2-Ala- | Mögliche reife
menschliche OP2 Proteinspezies: SEQ ID No. 10, Reste 264–402. Ebenfalls
in verwandten Anmeldungen als "hOP-2" bezeichnet. |
| hOP2-Pro- | Mögliche reife
menschliche OP2 Proteinspezies: SEQ ID No. 10, Reste 267–402. N-terminale
Aminosäure
ist Prolin. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "hOP-2P" bezeichnet. |
| hOP2-Arg- | Mögliche reife
menschliche OP2 Proteinspezies: SEQ ID No. 10, Reste 270–402. N-terminale
Aminosäure
ist Arginin. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "hOP-2R" bezeichnet. |
| hOP2-Ser- | Mögliche reife
menschliche OP2 Proteinspezies: SEQ ID No. 10, Reste 243–402. N-terminale
Aminosäure
ist Serin. Ebenfalls in verwandten Anmeldungen als "hOP-2S" bezeichnet. |
| Vgr-1-fx- | C-terminalen
102 Aminosäurereste
des "Vgr-1" Proteins des Maus
(SEQ D No. 7). |
| CBMP2A- | C-terminalen
101 Aminosäurereste
des menschlichen BMP2A Proteins. (Reste 296–396 der SEQ ID No. 14). |
| CBMP2B- | C-terminalen
101 Aminosäurereste
des menschlichen BMP2B Proteins. (SEQ ID No. 18). |
| BMP3- | Reifes
menschliches BMP3 (teilweise Sequenz, SEQ ID No. 16. Siehe US-5,011,691
für die
C-terminalen 102
Reste, "CBMP3".) |
| BMP5-fx- | C-terminalen
102 Aminosäurereste
des menschlichen BMP5 Proteins. (SEQ ID No. 20). |
| BMP6-fx- | C-terminalen
102 Aminosäurereste
des menschlichen BMP6 Proteins. (SEQ ID No. 21). |
| COP5- | Biosynthetisch
hergestellte osteogene 96 Aminosäuren
umfassende Sequenz (SEQ ID No. 3). |
| COP7- | Biosynthetisch
hergestellte osteogene 96 Aminosäuren
umfassende Sequenz (SEQ ID No. 4). |
| DPP-fx- | C-terminalen
102 Aminosäurereste
des Drosophila "DPP" Proteins. (SEQ ID
No. 5). |
| Vgl-fx- | C-terminalen
102 Aminosäurereste
des Xenopus "Vgl" Proteins (SEQ ID
No. 6). |
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Die
Mitglieder dieser Proteinfamilie teilen sich ein konserviertes sechs
oder sieben Cysteine umfassendes Skelett in dieser Region (bspw.
die lineare Anordnung jener C-terminalen
Cysteinreste ist in den verschiedenen Proteinen konserviert). Siehe
beispielsweise OPS, dessen Sequenz das sechs Cysteine umfassende
Skelett definiert, oder OP7, eine längere Form von OP1, das 102
Aminosäuren
umfasst und dessen Sequenz das sieben Cysteine umfassende Skelett
definiert. Außerdem
beinhalten die OP2 Proteine einen zusätzlichen Cysteinrest innerhalb
dieser Region.
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Diese
Familie von Proteinen schließt
längere
Formen eines gegebenen Proteins ein als auch Spezies und allelische
Varianten und biosynthetische Mutanten, einschließlich Additions-
und Deletionsmutanten und Varianten, wie beispielsweise jene, die
das konservierte C-terminale
Cystein-Skelett ändern,
vorausgesetzt, dass die Änderung
dem Protein immer noch gestattet eine dimere Spezies mit einer Konformation
zu bilden, die in einem Säuger
eine Knochenbildung induzieren kann, wenn es in Assoziation mit
einer Matrix in dem Säuger
implantiert wurde. Außerdem
können
die osteogenen Proteine dieser Erfindung Formen einschließen, die unterschiedliche
Glycosylierungsmuster und verschiedene N-Termini ausweisen, die
natürlich
vorkommen oder biosynthetisch abgeleitet sind und durch Expression
einer rekombinanten DNA in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen
erzeugt werden können.
Die Proteine sind als Einzelspezies (bspw. als Homodimere), oder
kombiniert als gemischte Spezies aktiv.
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Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
der Proteine, die in den erfindungsgemäßen prothetischen Vorrichtungen
nützlich
sind, umfasst Proteine, deren Aminosäuresequenz in der Cystein-reichen
C-terminalen Domäne
eine größer als
60%ige Identität
und vorzugsweise eine größer als
60%ige Identität
mit der Aminosäuresequenz
von OPS aufweist.
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Hierin
werden osteogene Proteine beschrieben, die Spezies von Polypeptidketten
umfassen, die die generische Aminosäuresequenz aufweisen, die hierin
als "OPX" bezeichnet wird,
welche die Homologien zwischen den verschiedenen identifizierten
Spezies der osteogenen OP1 und OP2 Proteine beherbergt bzw. aufnimmt,
und welche durch die Aminosäuresequenz
der SEQ ID No. 22 beschrieben wird.
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Ebenfalls
werden hierin Nukleinsäuren
und die osteogenen aktiven Polypeptidketten beschrieben, die durch
diese Nukleinsäuren
kodiert werden, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
an DNA- oder RNA-Sequenzen hybridisieren, die die aktive Region
von OP1 oder OP2 kodieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen
sind, wie hierin verwendet, als eine Hybridisierung in 40% Formamid,
5 × SSPE,
5 × Denhardt's Lösung und
0,1% SDS bei 37°C über Nacht,
und Waschen in 0,1 × SSPE,
0,1% SDS bei 50°C
definiert.
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Ebenfalls
werden hierin Nukleinsäuren
und die osteogenen aktiven Polypeptidketten beschrieben, die durch
jene Nukleinsäuren
kodiert werden, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen
an die "pro" Region der OP1 oder
OP2 Proteine hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet "osteogene aktive
Polypeptidketten" jene
Polypeptidketten, welche, wenn sie dimerisiert sind, eine Proteinspezies
mit einer Konformation erzeugen, so dass das Paar von Polypeptidketten
eine endochondrale Knochenbildung in einem Säuger induzieren kann, wenn
es in Assoziation mit einer Matrix oder einem Träger in einen Säuger implantiert
wurde.
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Angesichts
der vorstehend erwähnten
Aminosäure
und DNA Sequenzinformation, des Fertigkeitsniveaus in dem Fachgebiet
und der Offenbarungen der US-P-5,011,691 und der veröffentlichten
PCT/LTS 89/01469, die am 19. Oktober 1989 veröffentlicht wurde, deren Offenbarungen
durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind, können verschiedene DNAs gestaltet
werden, die mindestens die aktive Domäne eines in dieser Erfindung
nützlichen
osteogenen Proteins und verschiedene Analoge davon (einschließlich Spezies
und allelischen Varianten und solchen, die gentechnisch veränderte Mutationen
umfassen) kodieren, als auch Fusionsproteine, verkürzte Formen
der reifen Proteine, Deletions- und Additionsmutanten und ähnliche
Konstrukte. Außerdem
können
aus Fragmenten von jedem jener Proteine DNA Hybridisierungssonden
gestaltet oder de novo von der generischen Sequenz entwickelt werden.
Jene Sonden können
dann dazu verwendet werden verschiedene genomische und cDNA Bibliotheken
zu durchmustern, um zusätzliche
osteogene Proteine zu identifizieren, die in der Erfindung nützlich sind.
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Die
DNAs können
durch den Fachmann unter Verwendung wohl bekannter DNA-Manipulationsverfahren,
die genomische und cDNA Isolierung, Konstruktion synthetischer DNA
aus synthetischen Oligonukleotiden und Kassetten-Mutageneseverfahren
einschließen,
hergestellt werden. 15–100mer
Oligonukleotide können
an einem DNA Synthesizer synthetisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese
(PAGE) in Tris-Borat-EDTA-Puffer gereinigt werden. Die DNA kann
anschließend
von dem Gel elektroeluiert werden. Überlappende Oligomere können durch
T4 Polynukleotid Kinase phosphoryliert und in größere Blöcke ligiert werden, die ebenfalls
durch PAGE gereinigt werden können.
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Die
DNA von sachgemäß identifizierten
Klonen kann dann isoliert, subkloniert (vorzugsweise in einem Expressionsvektor)
und sequenziert werden. Plasmide, die Sequenzen von Interesse beinhalten,
können
anschließend
zur Proteinexpression und weiteren Charakterisierung in eine geeignete
Wirtszelle transfektiert werden. Der Wirt kann eine prokaryotische
oder eukaryotische Zelle sein, da die Unfähigkeit der ersteren Protein
zu glycosylieren die morphogene Aktivität des Proteins nicht zerstört. Nützliche
Wirtszellen schließen
E. coli, Saccharomyces, das Insekten/Baculavirus-Zellsystem, Myelomazellen,
CHO-Zellen und verschiedene anderen Säugerzellen ein. Die Vektoren
können
zusätzlich
verschiedene Sequenzen kodieren, die die korrekte Expression des
rekombinanten Proteins fördern,
einschließlich
Transriptionspromoter und Terminations-Sequenzen, Enhancer-Sequenzen, vorzugsweise
Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen, vorzugsweise mRNA Leadersequenzen,
vorzugsweise Signalsequenzen für
die Proteinsekretion und dergleichen.
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Die
DNA-Sequenz, die das Gen von Interesse kodiert kann ebenfalls manipuliert
sein, um möglicherweise
hemmende Sequenzen zu entfernen oder um eine unerwünschte Sekundärstrukturbildung
zu minimieren. Das rekombinante osteogene Protein kann ebenfalls
als ein Fusionsprotein exprimiert werden. Nach dem es translatiert
wurde, kann das Protein aus den Zellen selbst gereinigt oder aus
dem Kulturmedium wiedererlangt werden. Alle biologisch aktiven Proteinformen,
die dimere Spezies, die durch Disulfidbindungen verbunden oder auf
andere Weise assoziiert sind umfassen, werden durch Falten und Oxidieren
einer oder mehrerer der verschiedenen rekombinanten Polypeptidketten
innerhalb einer geeigneten eukaryotischen Zelle oder in vitro nach
Expression individueller Untereinheiten hergestellt. Eine ausführliche
Beschreibung eines von rekombinanter DNA in E. coli exprimierten
osteogenen Proteins wird in der US Serien-Nr. 422,699, die am 17. Oktober
1989 eingereicht wurde, offenbart, wobei deren Offenbarung hierin
durch Bezugnahme aufgenommen wird. Eine ausführliche Beschreibung von aus
rekombinanter DNA in zahlreichen unterschiedlichen Sägerzellen
exprimierten osteogenen Proteine, ist in der US Serien-Nr. 569,920,
die am 20. August 1990 eingereicht wurde, offenbart, deren Offenbarung
hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
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Alternativ
können
die osteogenen Polypeptidketten unter Verwendung herkömmlicher
Peptidsyntheseverfahren, die dem Fachmann wohl bekannt sind, chemisch
synthetisiert werden. Die Proteine können beispielsweise unter Standardbetriebsverfahren
an einem Festphasenpeptid-Synthesizer vollständig oder teilweise synthetisiert
werden. Vollständige
Ketten werden anschließend
entschützt
und durch HPLC (Hochdruchflüssigkeitschromatographie)
gereinigt. Wenn das Protein teilweise synthetisiert wird, können die
Teile unter Verwendung von Standardverfahren peptidisch verknüpft werden.
Im Allgemeinen kann die Art und Weise, in der die osteogenen Proteine
hergestellt werden herkömmlich
sein und bildet nicht einen Teil dieser Erfindung.
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Die
erfindungsgemäßen, nützlichen
osteogenen Proteine, sind Proteine, welche, wenn sie in einen Säugerkörper implantiert
werden, die Entwicklungskaskade einer endochondralen Knochenbildung,
einschließlich
Rekrutierung und Proliferation mesenchymaler Zellen, Differenzierung
der Vorläuferzellen,
Knorpelbildung, Calzifizierung des Knorpels, vaskuläre Invasion,
Knochenbildung, Umbilden und Knochenmarksdifferenzierung induzieren.
Die osteogenen Proteine, die in Kontakt mit der vorliegenden Prothese
stehen, können die
gesamte Entwicklungskaskade einer endochondralen Knochenbildung
an der Implantationsstelle, im Wesentlichen wie sie in der natürlichen
Knochenheilung vorkommt, induzieren.
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Die
erfindungsgemäßen Prothesen
können
nicht rostender Stahl, Titan, Molybdän, Kobalt, Chrom und/oder Legierungen
oder Oxide jener Metalle sein. Derartige Oxide umfassen gewöhnlich eine
dünne,
stabile, adhärente/anhaftende
Metalloxidoberflächenbeschichtung.
Die Prothesen werden vorzugsweise aus porösen Metallen gebildet, um eine
Infiltration des Knochens zu gestatten, wobei jedoch nicht-poröse Materialien ebenfalls
verwendet werden können.
Poröse
metallische Materialien zur Verwendung in Prothesen werden beispielsweise
durch Spector in J. Arthroplasty, 2(2) (1987), 163–176, und
durch Cook et al., in Clin. Orthoped. and Rel. Res., 232 (1988),
225–243,
beschrieben, deren beider Lehren hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen
sind. Metallische Prothesen können
für eine
Hauptknochen- oder Gelenk/Verbindungsstellen-Ersetzung und zur Wiederherstellung von
Nicht-Vereinigungs- bzw. Nicht-Zusammenschluss-Brüchen, verwendet werden,
wobei beispielsweise der vorhandene Knochen durch Erkrankung oder
Verletzung zerstört
wurde.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Vorrichtung und des Verfahrens, wird die Prothese
zusätzlich
zu dem Protein mit einem Material beschichtet, das eine Knocheneinwachsung
und Befestigung steigert. Materialien, die für diesen Zweck nützlich sind,
sind bioverträglich
und vorzugsweise in vivo biologisch abbaubar und nicht immunogen.
Derartige Materialien schließen
beispielsweise Kollagen ein, Hydroxylapatit, Homopolymere oder Kopolymere
von Glycolsäure,
Milchsäure
und Buttersäure
und Derivate davon, Tricalciumphosphat oder andere Calciumphosphate,
Metalloxide (bspw. Titanoxid) und demineralisierten, Guanidin extrahierten
Knochen.
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Die
vorliegenden beschichteten Prothesen werden durch Ausbringen einer
Lösung
des Proteins und wahlweise Hydroxylapatit oder eines anderen Material
auf die gesamte oder einen Anteil der Prothese hergestellt. Das
Protein kann durch jedes passende Verfahren, beispielsweise durch
Eintauchen, Anpinseln, Untertauchen (immersing), Sprühen oder
Gefriertrocknen aufgebracht werden. Hydroxylapatit wird vorzugsweise durch
ein Plasmasprühverfahren
aufgebracht. Das Protein wird vorzugsweise durch Untertauchen der
Prothesen in einer Lösung
des Proteins unter Bedingungen aufgebracht, die geeignet sind eine
Bindung oder Präzipitation
des Proteins aus der Lösung
auf das Implantat zu induzieren. Die auf das Implantat aufgebrachte
Proteinmenge sollte eine Konzentration sein, die ausreicht eine
endochondrale Knochenbildung zu induzieren, wenn die Prothese in
den Empfänger
implantiert wird. Im Allgemeinen ist eine Konzentration in dem Bereich von
mindestens 5 μg
Protein pro 3,4 cm2 Oberflächenbereich
für diesen
Zweck ausreichend. Wenn Hydroxylapatit oder anderes Trägermaterial
verwendet wird, wird es in einer erforderlichen Menge aufgebracht,
um eine Beschichtung von ungefähr
15 μ bis
ungefähr
60 μ Dicke
zu bilden. Eine Hydroxylapatitschichtdicke von ungefähr 25 μ von wurde
verwendet, um, wie in dem Beispiel gezeigt, eine Implantatbefestigung
zu verbessern.
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Die
Prothese kann eine Vorrichtung umfassen, die zum Einfügen in eine Öffnung gestaltet
ist, die dazu erzeugt wurde, um die Prothese aufzunehmen. In dieser
Ausführungsform
wird, wie in der Figur erläutert,
in Vorbereitung zum Einfügen
des Implantats 12 das Innere eines Knochens ausgehöhlt. Das
Implantat weist eine konturierte Oberflächengestaltung 14 auf,
die mehrere Einbuchtungen 16 definiert, um eine Einwachsung von Knochen
in die Einbuchtungen zu gestatten. Die Einbuchtungen sind vorzugsweise
transversal zu der Längsachse 18 des
Implantats. Der in die Öffnung
einzufügende
konturierte Anteil kann, wie vorstehend beschrieben, mit osteogenem
Protein beschichtet sein. Ein mit einem Matrixmaterial 20 verbundenes
osteogenes Protein wird mit dem prothetischen Implantat, das dadurch
von ihm umgeben wird, in die Öffnung
gepackt. Stimuliert durch das osteogene Protein, wächst neuer
Knochen in die Einbuchtungen 16 und integriert sich, wie vorstehend
beschrieben, mit der Oberfläche
des Implantats 12 und mit vorher vorkommendem Knochen 10. Somit
wird die Prothese sowohl mechanisch als auch biologisch an Ort und
Stelle befestigt und eine axiale Bewegung des Implantats relativ
zu dem Knochen erfordert ein Scheren des Knochengewebes. Das Matrixmaterial 20 kann
jedes der vorstehend beschriebenen Materialien zum Beschichten der
Prothese sein, bspw. Kollagen, Hydroxylapatit, Homopolymere und
Kopolymere von Glycolsäure,
Milchsäure
und Buttersäure
und Derivaten davon, Tricalciumphosphat oder andere Calciumphosphate,
Metalloxide und demineralisierten, Guanidin extrahierten Knochen,
um Knochenwachstum und -befestigung zu steigern. Matrixmaterialien
zur Verwendung mit osteogenen Proteinen, die in der vorliegenden
Ausführungsform
verwendet werden können,
sind solche, die beispielsweise in der US-P-5,011,691 und der US-P-5,266,683
beschrieben sind, deren Lehren hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen
sind.
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Die
in der Figur erläuterte
Prothese ist besonders nützlich
für Zahn-
oder andere Implantate, bei denen letztendlich ein Teil der Prothese
in Knochengewebe eingebettet werden soll. Packen der Öffnung,
bspw. einer Zahnfassung, mit einer "osteogenen Vorrichtung", bspw. einem osteogenen
Protein in Kombination mit einem Matrixmaterial, stellt ein Festmaterial
bereit, in dem die Prothese ohne das Erfordernis, dass die Vorrichtung
in den vorhandenen Knochen gewunden wird, eingebettet wird. Außerdem stimuliert
das osteogene Protein eine endochondrale Knochenbildung innerhalb
der Fassung und in und um das Implantat, wodurch der vorhergehend
erforderliche Schritt, eines zuerst zu gestattenden Knocheneinwachsens
in die Fassung um eine geeignete Oberfläche bereitzustellen, in die
die Prothese implantiert werden soll, beseitigt wird. Demgemäß kann unter
Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtungen der Erfindung eine
starke Befestigung einer implantierten Prothese in einem Bruchteil
der vorhergehend erforderlichen Zeit erreicht werden, was das Zeitintervall zwischen
einer Zahnextraktion und einer prothetischen Wiederherstellung wesentlich
verkürzt.
Zusätzlich
kann diese Behandlung die Verwendung einer Implantationstherapie
erweitern und die Erfolgsraten durch Beseitigen eines chirurgischen
Verfahrens steigern, die Menge eines auf eine Zahnextraktion erfolgenden
Knochenverlusts verringern, das Einfügen längerer Implantate gestatten
und prothetische Kompromisse, die durch eine Alveolarkammresorption
erforderlich sind, minimieren.
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Die
Erfindung wird weiterhin durch das erläuternde Beispiel, das nicht
vorgesehen ist in irgendeiner Weise beschränkend zu sein, erläutert werden.
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Erläuternde Beispiele
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Beispiel 1
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Metallimplantatbefestigung
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Zylindrische
Implantate, die 18 mm in der Länge
und 5,95 ± 0,05
mm im Durchmesser messen, werden aus sphärischen Co-Cr-Mo Teilchen hergestellt,
was zu einer Porengröße von 250–300 μm und einer
Volumenporosität
von 38–40%
führt.
Eine hoch kristalline, hoch dichte und nieder poröse Hydroxylapatit
(HA)-beschichtung wurde durch ein Plasmasprühverfahren bis zu der halben
Länge von
jedem der Implantate aufgebracht. Die Beschichtungsdicke betrug
25 μm und änderte die
poröse
Beschichtungsmorphologie nicht.
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In
der anfänglichen
Untersuchung wurden drei Implantate mit einer teilweise gereinigten
Rinder OP (bOP) Präparation
behandelt. Das bOP war natürlich
hervorgebrachtes (sourced) OP, das von einem Rinden(cortical)-knochen
extrahiert war und durch den Sepharyl-300 HR Schritt in dem Reinigungsprotokoll,
wie in Sampath et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 13198–13205,
beschrieben, teilweise gereinigt wurde. 200 μl Aliquots einer 4 M Guanidin-HCl,
50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7.0 Lösung,
die ungefähr
80 μg bOP
beinhaltete, wurden zu jedem Implantat in ein Eppendorf-Röhrchen hinzugefügt. Nach
einer Übernachtinkubation
bei 4°C
wurde das Protein präzipitiert
und das Implantat mit 80% Ethanol gewaschen. Die Implantate wurden
anschließend
gefriergetrocknet. Zwei Implantate ohne bOP dienten als die Kontrollen.
Die Implantate wurden in einem skelettmäßig reifen erwachsenen Mischlingshund
(3–5 Jahre
alt, 20–25
kg Gewicht) unter Verwendung des Femoral-Transcortical-Modells ausgewertet/beurteilt.
Standard chirurgische Verfahren wurden angewendet, so dass das Tier
die fünf
Implantate in einem Femur empfing. Nach drei Wochen wurde der Hund
geopfert und der Femur entfernt.
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Der
geerntete Femur wurde transversal zu der Längsachse geschnitten, so dass
jedes Implantat isoliert wurde. Jedes Implantat wurde halbiert,
um ein HA-beschichtete und eine unbeschichtete Ausdrückprobe (push-out)
zu erhalten. Die Befestigungsfestigkeit der Schnittstelle wurde
unter Verwendung einer speziell gestalteten Test-Aufspannvorrichtung
bestimmt. Die Implantate wurden gedrückt bzw. gestoßen, um
gegenüber einer
MTS Testmaschine bei einer Verschiebungsrate von 1,27 mm/Minute
zu versagen bzw. Schaden zu nehmen. Nach dem Test wurden alle Proben
für Standard
nicht-decalzifizierte histologische und mikroradiographische Analysen
vorbereitet. Die Abschnitte (4 Abschnitte von jedem Implantat) wurden
qualitativ auf den Typ und die Qualität der Gewebeeinwachsung untersucht,
und quantitativ auf % Knocheneinwachsung mit einem Computergestützten Bildanalysesystem
bewertet. Die mechanischen und quantitativen histologischen Daten sind
in Tabelle II gezeigt.
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Tabelle
II Metallimplantate-bOP
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Sowohl
die mechanischen als auch die histologischen Datenlegen nahe, dass
bOP eine Knochenintegration der Implantate steigerte. Sowohl HA-beschichtete
als auch unbeschichtete Implantate zeigten verglichen mit den unbehandelten
Kontrollen eine erhöhte
Scherfestigkeit und Knocheneinwachsung. Die histologischen Abschnitte
zeigten unmittelbar eine größere Anzahl
von Zellen zwischen den Metallporen.
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Die
positiven Ergebnisse der anfänglichen
Implantatuntersuchung veranlassten eine ausführlichere Untersuchung. Siebenundzwanzig
Implantate wurden mit einem rekombinanten OP1 Protein behandelt.
Das OP1 Protein wurde durch transformierte CHO Zellen hergestellt.
Einzelheiten über
die rekombinante Herstellung von OP1 sind in der USSN 841,646, die
vorstehend hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist, offenbart. Das
Protein wurde gereinigt, um als die Hauptspezies das als OP1-18Ser
bezeichnete Protein (SEQ ID No. 1, Reste 293–431) zu beinhalten, und ungefähr um 30%
verkürzte
Formen von OP1 (bspw. OP1-16Ser, OP1-16Leu, OP1-16Met, OP1-16Ala
und OP1-16Val). Das Protein war mehr als 90% rein. Die Implantate
wurden für
30 Minuten in 200 μl
50% Ethanol/0,01% TFA enthaltend 5 μg rekombinantes Protein untergetaucht und
die Lösung
in einem Ethanol/Trockeneisbad gefroren, während das Formulierungsröhrchen gerollt
wurde. Die Röhrchen
wurden anschließend
gefriergetrocknet. Neunzehn Implantate wurden ebenfalls durch Behandlung
mit Ethanol/TFA ohne das OP1 Protein durch das gleiche Verfahren
hergestellt.
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Bei
den Testimplantaten wurden gefunden, das OP1 aus behandelten Implantaten
mit 8 M Harnstoff, 1% Tween 80, 50 mM Tris, pH-Wert 8.0 extrahiert
und durch HPLC analysiert werden konnte. Durch dieses Verfahren
wurde gezeigt, dass das gesamte des OP1 in den Formulierungsröhrchen an
die Implantate unter den angewendeten Bedingungen gebunden war.
Weiterhin wurden, da die Testimplantate mit HA zur Hälfte beschichtet
waren, zusätzliche
Implantate erhalten, um das Binden von OP1 an jede jener Oberflächen unabhängig beurteilen
zu können.
Anfängliche
Bindungsuntersuchungen zeigten, dass das OP1 bereitwilliger an das
HA als an das unbeschichtet Metal bindet.
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Die
Implantate für
die zweite Untersuchung wurden skelettmäßig reifen erwachsenen Mischlingshunden
unter Verwendung des Femur-Transcortikal-Modells bewertet. Standard
keimfreie chirurgische Verfahren wurden verwendet, so dass jedes
Tier beidseitig fünf
Implantate empfing. Es wurden Implantationszeitdauern von drei Wochen
verwendet. Die mechanischen und quantitativen histologischen Daten
sind in Tabelle III gezeigt. Drei HA-beschichtete und unbeschichtete Konfigurationen
wurden beurteilt: Kontrollen (keine Behandlung), vorbeschichtete
Proben (formuliert ohne OP1) und die OP1 Proben.
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Tabelle
III Metallimplantate-OP-1
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Die
mechanischen Testergebnisse zeigten verglichen mit unbeschichteten
Proben eine gesteigerte Befestigungsfestigkeit für die HA-beschichteten Proben.
Nach drei Wochen wurde die größte Befestigung
mit dem mit Protein HA-beschichteten Implantat beobachtet.
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Die
histologische Analyse zeigte eine größere Knocheneinwachsung für alle HA
beschichteten gegenüber
unbeschichteten Proben, obwohl die Unterschiede nicht signifikant
waren. Die prozentuale Knocheneinwachsung war am größten für die HA-beschichteten
und unbeschichteten Implantate, wobei das Protein vorhanden war.
Eine lineare Regressionsanalyse zeigte, dass die Befestigungsfestigkeit
durch die Menge von Knochenwachstum in die poröse Struktur, die Gegenwart
von HA-Beschichtung und Gegenwart von Protein vorhergesagt wurde.
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Beispiel 2
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Titan
wird häufig
verwendet, um Metallprothesen herzustellen. Die Oberfläche von
jenen Prothesen umfasst eine Schicht von Titanoxid. Titanoxid wurde
daher auf dessen biologische Verträglichkeit mit dem Knochenbildungsprozess
selbst bewertet. Die biologische in vivo Aktivität von Implantaten, die eine
Kombination von Titanoxid und OP-1 (SEQ ID No. 1, Reste 293–431) beinhalteten,
wurden durch subkutane und intramuskuläre Assays in Ratten untersucht.
Die Implantate beinhalteten 0; 6,25; 12,5; 25 oder 50 μg OP-1, das
auf 30 mg Titanoxid formuliert war.
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Die
Implantate wurden durch eine Modifikation des Ethanol/TFA Gefriertrocknungsverfahrens
formuliert. Titanoxidkügelchen
wurden gemahlen und auf eine Teilchengröße von 250–420 Mikron gesiebt. 30 mg jener
Teilchen wurden mit 50 μl
Aliquots einer 45% Ethanol, 0,09% Trifluoressigsäure Lösung, die kein OP-1 oder verschiedene
Konzentrationen von OP-1 beinhaltet, gemischt. nach 3 Stunden bei
4°C wurden
die Proben gefroren, gefriergetrocknet und in Ratten implantiert.
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Nach
12 Tagen in vivo wurden die Implantate entfernt und durch die alkalische
Phosphatase spezifische Aktivität,
Calciumgehalt und histologischen Beleg auf eine Knochenbildung bewertet.
Die Ergebnisse zeigten, dass OP-1 die Knochenbildung bei jeder Konzentration
von OP-1 bei den sowohl subkutanen als auch intramuskulären Implantationsstellen
induzierte. Es wurde ohne OP-1 Zugabe zu dem Titanoxid kein Knochen gebildet.
Die durch den Calciumgehalt der Implantate quantifizierte Knochenmenge
war zu der unter Verwendung von Knochenkollagenträgern beobachteten ähnlich.
Titanoxid ist somit ein nützlicher
Träger
für osteogene
Proteine und ist mit dem Knochenbildungsprozess biologisch verträglich.
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Äquivalente
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Der
Fachmann wird unter Verwendung von nicht mehr als Routineexperimenten
viele Äquivalente
zu dem hierin beschriebenen Gegenstand herausfinden bzw. feststellen
können.
Derartige Äquivalente
sind durch die folgenden Ansprüche
umfasst.
