DE60304584T2

DE60304584T2 - Unter verringerter sauerstoffkonzentration mit einem osteoinduktiven protein beschichtetes metallimplantat

Info

Publication number: DE60304584T2
Application number: DE2003604584
Authority: DE
Inventors: Klaus Hellerbrand; Nicola Beaucamp; Ulrich Kohnert
Original assignee: Scil Technology GmbH
Current assignee: Bionet Pharma GmbH
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2023-07-10
Also published as: CA2498512C; ATE322916T1; PL207552B1; US8257728B2; CN100522241C; US20110020658A1; PT1539261E; PL375794A1; ES2260685T3; CA2498512A1; EP1539261A1; JP2006503611A; US7763270B2; US20060240062A1; WO2004024199A1; EP1539261B1; JP4358741B2; CN1681540A; DE60304584D1; DK1539261T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung einer Vorrichtung, umfassend die Schritte: (a) das Bereitstellen einer Lösung, die gelöstes osteoinduktives Protein umfasst, (b) das Inkontaktbringen der Lösung des vorangegangenen Schrittes mit einem Träger, der eine Oberfläche aus Metall oder einer Metalllegierung enthält, (c) das Beschichten der Oberfläche des Trägers mit dem gelösten Protein und (d) das Trocknen des in Schritt (c) erhaltenen beschichteten Trägers, wobei die Schritte (b) bis (d) unter einer verringerten Konzentration an Sauerstoff durchgeführt werden. Die Erfindung umfasst auch eine Vorrichtung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, das die Vorrichtung umfasst, und die Verwendung der Vorrichtung für die Herstellung eines Arzneimittels, das für eine beschleunigte Osteointegration und die Knochenneubildung zu verwenden ist. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst.
Im Verlauf der letzten Jahrzehnte wurden viele Verfahren beschrieben, um die Qualität von Implantaten zu verbessern, was den Kontakt zwischen dem Knochen und dem Implantat und ihre biologische Verträglichkeit betraf. Die Anforderungen für Implantate sind extrem, da solche Vorrichtungen starr mit dem Knochen verbunden und z. B. gegenüber hohem Druck stabil sein müssen (z. B. Zähne, Gelenke). Die anfängliche Antwortreaktion des Gewebes nach einer Implantation hängt von der Anwesenheit spezifischer Wachstumsfaktoren ab, die aus den umgebenden Geweben freigesetzt werden und die das Zellwachstum und die Differenzierung stimulieren.
Obwohl es gut etablierte Befestigungsverfahren für Zahnimplantate gibt, haben diese immer noch die Tendenz, sich im Verlauf der Zeit zu lockern. Es wurde eine Vielzahl von Ansätzen beschrieben, um die Inkorporation des betreffenden Implantats zu verbessern (Osteointegration). Diese Ansätze umfassen das Beschichten von Implantaten aus unterschiedlichen Materialien (z. B. aus Keramik, Metall oder anderen, vergleiche mit EP-B1 0 657 146) mit biologisch abbaubaren Materialien (z. B. tri-Calciumphosphat, Hydroxyapatit) und verschiedene Verfahren für die Ätzung von Metalloberflächen. Man nimmt an, dass Oberflächenunebenheiten im Nanometer- und Mikrometerbereich das Einwachsen von Kollagen und von Zellen verbessern (T. Albrektsson, in: Handbook of Biomaterials (Black, J. und Hastings, G. (Hrsg.), Chapman & Hall, London, 1988, S. 500–512).
Das Beschichten von Metallimplantaten mit keramischen Oberflächen wird z. B. als das Mischen von zwei Pulvern beschrieben, wobei eines das Metallpulver ist und das andere Pulver Calciumphosphat enthält ( EP 0467948 ), die dann im Verlauf eines Sintervorganges zu dem Implantatmaterial weiter verarbeitet werden.
Es wurde eine Vielzahl von anderen Sinterverfahren für die Herstellung von zusammengesetzten keramischen Materialien beschrieben (Offenlegungsschrift DE 2928007 , US-Patent Nr. 4,882,196). Ein Hauptaugenmerk liegt auf dem Beschichten von Metalloberflächen mit Calciumphosphaten wie z. B. tri-Calciumphosphat oder Hydroxyapatit (Y. Tsui, 1998), was eine verbesserte Integration der Implantate erlaubt (US-Patent Nr. 6,312,472; US-Anmeldung A-20020038149). Die beschriebenen Calciumphosphate und eine Reihe anderer anorganischer, biologisch verträglicher Materialien besitzen die Eigenschaft, Poren zu bilden. Von diesen Poren nimmt man an, dass sie die Integration des Implantats in den nativen Knochen erhöhen (WO 00/72776; US-Patent Nr. 4,051,598; EP 0806211 , H. Jennissen, 2001), da der native Knochen in die Poren wächst, wobei gleichzeitig die anorganische Calciumphosphatschicht des Implantats biologisch abgebaut wird (WO 96/10370; WO 01/97679). Daneben werden die Implantate aus zusammengesetzten Materialien als aus Schichten bestehend beschrieben, wobei die untere Schicht des Implantats, die oft ein Metall oder Metalllegierungen umfasst, wie z. B. Titan oder eine Titanlegierung (WO 98/43550; WO 00/72777), mit einer Lage aus Calciumphosphaten beschichtet ist ( EP 0478532 ). Typischerweise wird das Beschichten mit Calciumphosphaten durch eine hydrothermale Behandlung erreicht ( EP 0548365 ) oder durch Vollsaugen und Präzipitation (US-Patent Nr. 6,129,928, WO 97/41273) oder durch Aufsprühen von Plasma (US-Patent Nr. 5,697,997, US-Patent Nr. 6,113,993, EP 0548365 , EP 0739191 , Lichtinger, 2001).
Die Schicht aus Calciumphosphat auf dem Hauptkörper des Implantats kann entweder Teil eines Gemisches von Materialien innerhalb einer Schicht sein (WO 98/48862, US-Patent Nr. 5,934,287; US-Anmeldung A-20020033548) oder es kann sich um eine Anordnung aus mehreren Schichten handeln (WO 02/09788, US-Patent Nr. 6,322,728).
Neben den Modifizierungen der Oberfläche werden verschiedene Verfahren beschrieben, bei denen orthopädische oder Zahn-Implantate mit Proteinen oder Proteingemischen (vorwiegend Wachstumsfaktoren) beschichtet wurden. Von diesen Proteinen nimmt man an, dass sie die Integration der Implantate signifikant beschleunigen (Lichtinger, 2001; Shah, 1999). Es wurden mehrere Verfahren für das direkte Beschichten von Proteinen auf die Metalloberflächen beschrieben. Diese Verfahren besitzen jedoch mehrere Nachteile, insbesondere die schnelle Freisetzung von Proteinen von der Metalloberfläche, die es nicht erlaubt, das Protein über den Zeitraum zurückzuhalten, der für die Induktion der Knochenbildung nötig ist (Lichtinger, 2001).
Um die schnelle Freisetzung (spontanes Abspringen) des Proteins zu vermeiden, beschreiben K. Endo (1995) und Voggenreiter et al. (2001) die Immobilisierung der Proteine durch kovalente Bindung an die Metalloberfläche. Die Aktivität der entsprechenden Proteine wird beibehalten. Die kovalente Bindung kann jedoch Strukturveränderungen induzieren, die eine Auswirkung auf die Immunogenität der Proteine haben.
Viele Forscher haben festgestellt, dass die erfolgreiche Implantation der osteogenen Faktoren für die endochondrale Knochenbildung erfordert, dass die Proteine mit einem geeigneten Trägermaterial oder mit einer Matrix assoziiert sind, welche die Proteine an der Stelle der Anwendung zurückhält (USP 5,344,654). Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, lehrt USP 5,258,029, dass das „osteogene Protein der Erfindung normalerweise in osteogen wirksamen Mengen mit pharmazeutisch verträglichen festen oder flüssigen Trägern formuliert wird. Vorzugsweise enthalten die Formulierungen eine Matrix, die in der Lage ist, eine Struktur für die Entwicklung von Knochen und Knorpel bereitzustellen. Potenzielle Matrices können biologisch abbaubar oder auch nicht biologisch abbaubar sein, und können chemisch oder biologisch definiert werden". Die Suspension des TGF-β-Proteins und des Trägers wird getrocknet und anschließend auf die die Belastung tragende Prothese aufgetragen. Die Nachteile dieser Verfahren liegen in der Verwendung von aus Tieren stammenden Kollagenen oder anorganischen Bestandteilen, die während der Implantation abgerieben werden können.
Ein weiteres Verfahren, um eine schnelle Auswaschung des Proteins zu vermeiden, wird in Lichtinger et al. (2001) beschrieben; die Autoren behandeln die Oberfläche aus einer Titanlegierung mit Chromschwefelsäure, um eine ultrahydrophile, bioadhäsive Oberfläche zu erhalten. Chromschwefelsäure sollte jedoch während der Herstellung von medizinischen Produkten oder medizinischen Vorrichtungen vermieden werden, da Restmengen dieser Säure, die auf der Oberfläche verbleiben, die Oxidation des Proteins verursachen können, was anschließend zu Struktur- und Funktionsveränderungen führen kann, und auch dem Patienten einen Schaden zufügen können.
Weitere Verfahren werden in WO 00/72777 und in WO 00/72778 beschrieben, die ein Depot verwenden, das durch eine Porenanordnung einer dicken Oxidschicht auf der Titanoberfläche oder durch interne Räume, Kanäle oder Vertiefungen gebildet wird. Es ist jedoch wohlbekannt, dass Proteine dazu tendieren, in Gegenwart von Metallen und Metallionen oxidiert zu werden (Li et al. (1997), Ann. Occup. Hyg. 41, Ergänzungsband 1, 379–383). Daher kann ein Nachteil der vorstehend erwähnten Vorrichtungen darin bestehen, dass die Proteine auf den Oberflächen der Implantate oxidiert werden. Die Oxidation kann zu Strukturveränderungen führen, die zu immunogenen Antwortreaktionen führen können.
Daher besteht das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem in der Bereitstellung von Mitteln für eine verbesserte Knochenvermehrung.
Dieses technische Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung einer Vorrichtung, umfassend die Schritte:

(a) das Bereitstellen einer Lösung, die gelöstes osteoinduktives Protein umfasst;
(b) das Inkontaktbringen der Lösung gemäß Schritt (a) mit einem Träger, der eine Oberfläche aus Metall oder einer Metalllegierung enthält;
(c) das Beschichten der Oberfläche des Trägers mit dem gelösten Protein; und
(d) das Trocknen des in Schritt (c) erhaltenen beschichteten Trägers,

Der Begriff „Produktion" umfasst neben den Schritten, die explizit erwähnt werden, weitere Schritte der Herstellung wie z. B. die Verpackung usw. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt als ein automatisiertes Herstellungsverfahren durchgeführt, das durch geeignete Roboter begleitet wird. Die Begriffe „Produktion" und „Herstellung" sind im Sinne dieser Erfindung austauschbar.
Der Begriff „Vorrichtung", wie er gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf eine Einheit, die mindestens zwei Bestandteile umfasst. Einer dieser Bestandteile ist ein Träger.
Träger, die im Rahmen des Sinnes der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen feste Träger wie z. B. vollständig aus Metall oder aus Legierungen bestehende Träger sowie Matrices aus Metallen oder aus Legierungen. Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung feste Träger, die Hohlräume und Höhlungen enthalten. Des Weiteren besitzt der Träger vorzugsweise eine vergrößerte Oberfläche aufgrund der Bildung von Makro- und Mikroporen. Diese Makro- oder Mikroporen sind vorzugsweise auf die Oberflächenschicht des Trägers beschränkt. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Träger, die aus mindestens zwei unterschiedlichen Bestandteilen bestehen, wobei ein Metall- oder ein Legierungsbestandteil als Kern oder als Kernschicht verwendet wird und z. B. ein keramisches Material als Oberflächenschicht verwendet wird. Die Oberfläche des Trägers besitzt eine hohe Affinität für osteoinduktive Proteine, erlaubt jedoch auch die Freisetzung dieser Proteine in vivo. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Träger bevorzugt ein Metall oder eine Legierung, wie nachstehend beschrieben wird. Der Träger, der in der Vorrichtung der Erfindung enthalten ist, kann für die Verabreichung der Vorrichtung in vivo in eine geeignete Form gebracht werden. Dies umfasst auch die Herstellung von Implantaten oder von chirurgischen Vollprothesen. Diese Prothesen werden vorzugsweise aus Metalloberflächen geformt oder werden mit ihnen beschichtet, wie nachstehend in Einzelheiten beschrieben wird. Prothesen werden aus Titan oder aus Titanlegierungen hergestellt wie z. B. aus einer Titanlegierung oder aus rostfreiem Stahl.
Ein weiterer Bestandteil der Vorrichtung ist ein Protein oder ein Polypeptid, das osteoinduktive Eigenschaften besitzt, wie in Einzelheiten nachstehend beschrieben wird. Das Protein oder das Polypeptid wird auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert. Es wird bevorzugt, dass die Bindung des Proteins oder des Polypeptids an den Träger reversibel ist. Daher wird beabsichtigt, dass das Protein oder das Polypeptid, das osteoinduktive Eigenschaften besitzt, an die Metalloberfläche des Trägers nicht über eine kovalente Bindung angeheftet ist. Die Anheftung erfolgt bevorzugt über elektrostatische Wechselwirkungen, hydrophobe oder nicht elektrostatische Wechselwirkungen wie z. B. über Van-der-Waals-Kräfte. Aufgrund der reversiblen Bindung des osteoinduktiven Proteins wird die Ab/Auflösung des Proteins erlaubt, sobald die Vorrichtung in vivo in eine geeignete Umgebung gebracht worden ist, wie z. B. in die Höhlung eines Knochens. Vorzugsweise handelt es sich bei der Ab/Auflösung des Proteins um eine langsame Freisetzung, was die Diffusion des Proteins in das Gewebe ermöglicht, das die Vorrichtung umgibt. Wie in den beigefügten Beispielen gezeigt wird, erlaubt die Vorrichtung somit die lokale Anwesenheit von osteoinduktiven und nativen Proteinen, die die Bildung von neuen Knochen und das Einwachsen des Knochens in die Oberfläche der Matrix beschleunigen. Die Vorrichtung der Erfindung kann ein Implantat sein, was bedeutet, dass die Begriffe „Vorrichtung" und „Implantat", wie sie hierin verwendet werden, austauschbar sind. Es ist wohlbekannt, dass sich der Begriff „Implantat" auf jede Vorrichtung bezieht, wie sie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, die so entworfen wurde, dass sie vollständig oder teilweise unter die Epitheloberfläche gebracht werden kann (Koeck, B. und Wagner, W. (Hrsg.) 1996). Das Implantat kann flach oder dicht sein oder eine komplexe Form aufweisen, d. h. es kann jede üblicherweise verwendete oder handhabbare Vorrichtung verwendet werden. Die vorstehend erwähnten Implantate reichen von einer einfachen zylindrischen Form, wie sie z. B. für den Ersatz von langen Knochen oder als Grundlage für künstliche Zähne verwendet wird, bis hin zu flachen Implantaten, wie sie für den Ersatz von flachen Hirnknochen und künstlichen Gelenken z. B. für die Hüfte, das Knie oder den Ellenbogen verwendet werden.
Durch das Beschichten der Vorrichtung der Erfindung mit dem osteoinduktiven Protein wird beabsichtigt, die Transformation der mesenchymalen Stammzellen zu Osteobasten und Chondrocyten zu initiieren und zu stimulieren, wie nachstehend beschrieben wird. Dementsprechend wird beabsichtigt, dass nur diejenigen Teile der Vorrichtung der Erfindung beschichtet zu werden brauchen, die gegen das entsprechende Knochengewebe gerichtet sind. Ein solcher Teil ist bevorzugt die gesamte Oberfläche oder zumindest Teile davon, die an das Knochengewebe angrenzen. Zum Beispiel umfasst ein Zahnimplantat, das dazu verwendet wird, einen fehlenden Zahn zu ersetzen, einen gewindeförmigen Teil, der in den Kieferknochen eingedreht wird, und einen herausragenden Teil (Sockel), der für die Verankerung der künstlichen Zahnkrone verwendet wird. Dementsprechend ist es nur nötig, den gewindeförmigen Teil mit dem osteoinduktiven Protein zu beschichten. Der Teil, der nicht mit dem osteoinduktiven Protein beschichtet wird, kann jedoch mit anderen Agenzien wie z. B. mit Calciumphosphaten, Kollagen oder ähnlichen Agenzien beschichtet werden.
Der Begriff „osteoinduktiv" bezieht sich auf die Fähigkeit der Transformation mesenchymaler Stammzellen und Prä-Osteoblasten zu Osteoblasten. Eine Vorbedingung für die Osteoinduktion ist ein Signal, das durch die Vorrichtung in die umgebenden Gewebe verteilt wird, wobei die vorstehend erwähnten Osteoblasten-Vorläuferzellen und andere mesenchymale Zellen aktiviert werden. Osteoinduktion, wie sie hierin verwendet wird, umfasst die Differenzierung mesenchymaler Zellen zu den Knochen-Vorläuferzellen, den Osteoblasten. Darüber hinaus umfasst Osteoinduktion auch die Differenzierung der Osteoblasten zu Osteocyten, den reifen Knochenzellen. Somit erfordert die Osteoinduktion die Differenzierung nicht differenzierter oder wenig differenzierter Zellen zu Osteocyten, die in der Lage sind, den Knochen zu bilden. Wie vorstehend beschrieben wurde, werden die osteoinduktiven Proteine, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, nach der Implantation von der Vorrichtung langsam freigesetzt und in den umgebenden Geweben effizient verteilt. Darüber hinaus besitzen die Proteine und Polypeptide, die in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen sind, osteoinduktive Eigenschaften in vivo. So ist zum Beispiel im Fachgebiet wohlbekannt, dass die Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)- Superfamilie Mitglieder umfasst, die osteoinduktive Eigenschaften aufweisen. Individuelle Mitglieder dieser TGF-β-Superfamilie, die besonders gute osteoinduktive Eigenschaften besitzen, werden nachstehend angeführt. Abschließend kann gesagt werden, dass die osteoinduktiven Proteine der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung auf der Oberfläche und nachdem sie von dem Träger freigesetzt worden sind, als ein osteoinduktives Signal für die Osteocyten-Vorläuferzellen in dem Gewebe dienen, das den Ort der Implantation der Vorrichtung umgibt.
Der Begriff „osteoinduktives Protein", wie vorstehend angeführt wurde, bezieht sich auf die Mitglieder der Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)- Superfamilie, die osteoinduktive Eigenschaften besitzen wie z. B. den Wachstums- und Differenzierungsfaktor 5; vergleiche mit dem Nachstehenden. Überraschenderweise weisen diese osteoinduktiven Proteine eine hohe Affinität zu Metalloberflächen auf, wie in den beigefügten Beispielen gezeigt wird. Eine wichtige Vorbedingung für einen solchen Adsorptionsvorgang an die Metalloberfläche ist eine ausreichende Löslichkeit der Proteine in der Beschichtungslösung.
Die Vorrichtung oder das Implantat der Erfindung ist vorzugsweise jede Art einer Metalloberfläche, wie vorstehend beschrieben wurde. Bevor die Lösung, die das gelöste osteoinduktive Protein enthält, mit einem Träger in Kontakt gebracht wird, der eine Oberfläche aus Metall oder einer Metalllegierung enthält, wie sie hierin beschrieben wird, wird beabsichtigt, dass die entsprechende Metalloberfläche vorzugsweise gereinigt oder behandelt wird, um jegliche Oberflächenverunreinigungen zu entfernen und eine gute Adhäsionsstärke der Beschichtung zu fördern. Im Fachgebiet sind verschiedene Verfahren bekannt, die für diesen Zweck geeignet sind und die auch in den beigefügten Beispielen erläutert werden. Zum Beispiel kann die Metalloberfläche der Vorrichtungen der Erfindung mit Aceton oder mit Alkylalkoholen wie z. B. Ethanol abgespült werden und anschließend mit sterilem destilliertem oder entmineralisiertem Wasser ausgiebig gespült werden.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung besitzt vorzugsweise eine vergrößerte Oberfläche aufgrund von porösen, perlen- oder netzförmigen Oberflächenmodifikationen. Solche Modifikationen können durch im Fachgebiet wohlbekannte Verfahren eingeführt werden, einschließlich chemischer oder mechanischer Mittel. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine vergrößerte Oberfläche, die Unebenheiten im Nanometer- und Mikrometerbereich aufweist, für die Osteointegration nützlich ist.
Es sind viele Verfahren für die Stabilisierung von Proteinen in pharmazeutischen Produkten beschrieben worden. Die Experimente, denen diese Erfindung zu Grunde liegt, haben jedoch gezeigt, dass die wohlbekannten Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen in Lösung oder in gefriergetrockneten Proteinformulierungen auf ein an einer Metalloberfläche adsorbiertes Protein nicht direkt übernommen werden können. Das Beschichten von Proteinen auf Metalloberflächen wie z. B. auf Titan oder Titanlegierungen gemäß den Verfahren, die im Fachgebiet offenbart wurden und auf die vorstehend Bezug genommen wurde, verursacht das Auftreten von modifizierten Formen des Proteins, was zu einer Aggregatbildung oder zu einer Oxidation der Proteine führt (für Einzelheiten vergleiche mit dem Beispiel 5). Darüber hinaus führt sogar die Zugabe von Reduktionsmitteln nicht zu einer Verminderung der Menge an oxidiertem Protein (für Einzelheiten vergleiche mit dem Beispiel 10). Dank dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Vorrichtungen herzustellen, die nach der Implantation das Knochenwachstum effizient verbessern. Die unerwünschten Nebenwirkungen wie z. B. Entzündungen aufgrund einer erhöhten Immunogenität der oxidierten Proteine können so in vorteilhafter Weise vermieden werden. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung ein weniger zeitaufwendigeres und kostengünstigeres Herstellungsverfahren für die medizinischen Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung, da das Beschichten des Metall- oder des Legierungs-Körpers des Implantats mit einer Schicht aus Calciumphosphat oder Kollagen nicht erforderlich ist. Ein weiterer Vorteil in dieser Hinsicht besteht darin, dass möglicherweise verunreinigte Materialien wie z. B. Kollagene, die infektiöse Viren übertragen können, von dem Herstellungsvorgang ausgeschlossen werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung werden die Schritte (b) bis (d) unter einer Sauerstoffkonzentration von weniger als 10 Vol% Sauerstoff, bevorzugt weniger als 5% und am stärksten bevorzugt weniger als 2% durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung werden die Schritte (b) bis (d) bei einer Temperatur unter 25°C, bevorzugt unter 15°C und am stärksten bevorzugt unter 8°C durchgeführt.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung ist das Metall oder die Metalllegierung Titan oder eine Titanlegierung.
Es wird bevorzugt, dass die Metalle oder die Metalllegierungen der Erfindung biologisch verträglich sind. Der Begriff „biologisch verträglich" bedeutet die Qualität, keine toxischen oder verletzenden Wirkungen auf biologische Systeme zu haben (Williams, D.F., 1999). Solche Eigenschaften sind unter anderem für Titan oder Titanlegierungen bekannt und umfassen solche, auf die nachstehend ausdrücklich Bezug genommen wird.
Noch bevorzugter handelt es sich bei der Titanlegierung um eine Titanlegierung, die mindestens 50% Titan enthält. Weiterhin ist diese Titanlegierung vorzugsweise eine Ti-Al-V-Legierung, eine Ti-Al-Fe-Legierung, eine Ti-Al-Nb-Legierung oder eine Ti-Mo-Zr-Al-Legierung, am stärksten bevorzugt wird Ti6Al4V.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung wird das Beschichten durch Eintauchen der Metalloberfläche in die Proteinlösung durchgeführt.
In einer anderen weiterhin bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung wird das Beschichten durch Auftropfen der Proteinlösung auf die Metalloberfläche durchgeführt.
Ebenfalls als bevorzugte Ausführungsform mit eingeschlossen ist ein Verfahren, bei dem das Beschichten durch Aufsprühen der Proteinlösung auf die Metalloberfläche durchgeführt wird.
Der Begriff „Trocknen" umfasst Mittel zur Entfernung von Flüssigkeiten wie z. B. überschüssiger Pufferlösung, die nach dem Beschichten des Trägers mit dem osteoinduktiven Protein noch vorhanden sind. Das Trocknen wird bevorzugt durch Vakuum- oder durch Gefriertrocknung erreicht.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung wird das Trocknen durch Verdunstung in einem inerten Gasstrom bei Raumtemperatur durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das osteoinduktive Protein ein Mitglied der TGF-β-Familie.
Der Begriff „Mitglied der TGF-β-Familie" umfasst die biologisch aktiven, reifen Formen dieser Proteine sowie die entsprechenden Proformen, d. h. Proproteine einschließlich der entsprechenden Prodomäne dieser Mitglieder der TGF-β-Familie, wie sie in Einzelheiten nachstehend genauer beschrieben werden.
Es wurde gezeigt, dass die TGF-β-Familie der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren an zahlreichen biologischen Vorgängen, die Knochenbildung einschließen, beteiligt sind. Alle Mitglieder dieser Familie sind Polypeptide, die sekretiert werden und die eine charakteristische Domänenstruktur besitzen. Am äußersten N-Terminus enthalten die Mitglieder der TGF-β-Familie ein Signalpeptid oder eine sekretorische Leader-Sequenz. Dieser Sequenz schließt sich in Richtung des C-Terminus die Prodomäne an und dann folgt die Sequenz des reifen Polypeptids. Die Sequenz des reifen Polypeptids umfasst sieben konservierte Cysteine, von denen sechs für die Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen benötigt werden, während ein Cystein für die Dimerisierung von zwei Polypeptiden erforderlich ist. Das biologisch aktive Mitglied der TGF-β-Familie ist ein Dimer, das vorzugsweise aus zwei reifen Polypeptiden besteht. Die Mitglieder der TGF-β-Familie werden in der Regel als Präproproteine sekretiert, die zusätzlich zu der reifen Sequenz eine Prä- (Signalsequenz) und eine Prosequenz enthalten. Die Signalsequenz und die Prodomäne werden extrazellulär abgespalten und sind nicht mehr Teil des signalübertragenden Moleküls. Es wurde jedoch berichtet, dass die Prodomäne(n) für die extrazelluläre Stabilisierung der reifen Polypeptide erforderlich sein kann (können). Eine Übersicht über die Mitglieder der TGF-β-Familie befindet sich in: Wozney, J.M., Rosen, V. (1988): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair, Clin. Orthop. 346: 26–37. Die Aminosäuresequenzen der Mitglieder der TGF-β-Familie können aus den bekannten Datenbanken wie z. B. aus Swiss-Prot über das Internet erhalten werden (http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html). Die Aminosäuresequenzen der Präproformen von BMP2, BMP7 und GDF-5, d. h. Mitglieder der TGF-β-Familie mit einem besonders hohen osteogenen Potenzial, werden auch in den SEQ ID NOs: 1 bis 3 gezeigt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Mitglied der TGF-β-Familie" oder die Proteine dieser Familie, auf die nachstehend Bezug genommen wird, alle biologisch aktiven Varianten dieser Proteine oder Mitglieder und alle Varianten sowie ihre inaktiven Vorläufer. Somit befinden sich Proteine, die nur die reife Sequenz umfassen, sowie Proteine, die das reife Protein und die Prodomäne oder die das reife Protein, die Prodomäne und die Leader-Sequenz umfassen, sowie biologisch aktive Fragmente davon alle im Rahmen der Erfindung. Ob ein Fragment eines Mitglieds der TGF-β-Familie die biologische Aktivität besitzt, kann leicht durch biologische Testansätze bestimmt werden, die beschrieben worden sind, wie z. B. in: Katagiri T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshiki S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S und Suda T (1990): The nonosteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2, Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295–299 oder in: Nishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1990): Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptors for growth/differentiation factor-5, J. Biol. Chem. 271:21345-21352.
Die biologische Aktivität gemäß der Erfindung kann bevorzugt mit in vivo-Modellen bestimmt werden, wie sie in den begleitenden Beispielen beschrieben werden. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Varianten der Mitglieder der TGF-β-Familie, die Aminosäuresequenzen besitzen, die mindestens zu 75%, mindestens zu 80%, mindestens zu 90%, mindestens zu 95%, mindestens zu 96%, mindestens zu 97%, mindestens zu 98% oder mindestens zu 99% mit den Aminosäuresequenzen der Mitglieder der TGF-β-Familie, auf die hierin Bezug genommen wird, identisch sind, insbesondere zu denjenigen, die in irgendeiner der SEQ ID NOs. 1 bis 3 gezeigt werden.
Noch bevorzugter handelt es sich bei dem Mitglied der TGF-β-Familie um ein Mitglied der BMP-Unterfamilie.
Es wurde gezeigt, dass die Mitglieder der Knochen-morphogenetisches Protein-Unterfamilie (BMP) unter anderem an der Induktion und Remodellierung des Knochengewebes beteiligt sind. Die BMPs wurden ursprünglich aus der Knochenmatrix isoliert. Diese Proteine sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, die Knochenneubildung an ectopischen Orten zu induzieren. Zahlreiche in vivo-Studien haben die Förderung der Osteogenese und der Chondrogenese von Vorläuferzellen durch BMPs aufgezeigt und werfen die Möglichkeit auf, dass jedes BMP-Molekül eine bestimmte Rolle im Verlauf der Entwicklung des Skeletts besitzt. Weitere Einzelheiten über die molekularen und die biologischen Eigenschaften der BMPs sind beschrieben in: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair, Clin. Orthop. 346: 26–27, Schmitt J, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance, J. Orthop. Res. 17: 269–278 und in Lind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools, A review, Acta Orthop. Scand. 67: 407–17. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei dem Mitglied der BMP-Familie um BMP2 oder um BMP7. Die Aminosäuresequenz der Präproform von BMP2 ist unter der Swiss-Prot-Zugangsnummer P12643 hinterlegt und wird nachstehend gezeigt. Die Aminosäuren 1 bis 23 entsprechen der Signalsequenz, die Aminosäuren 24 bis 282 entsprechen dem Propeptid, und die Aminosäuren 283 bis 396 entsprechen dem reifen Protein. Die Aminosäuresequenz der Präproform von BMP7 ist unter der Swiss-Prot-Zugangsnummer P18075 hinterlegt oder wird in der SEQ ID NO: 2 gezeigt. Die Aminosäuren 1 bis 29 entsprechen der Leader-Sequenz, die Aminosäuren 30 bis 292 entsprechen der Proform, und die Aminosäuren 293 bis 431 entsprechen dem reifen Protein. Es wird bevorzugt, dass das BMP2 oder BMP7 sich auf die Präproform, die Proform oder auf das reife BMP-2- beziehungsweise BMP-7-Peptid bezieht. Darüber hinaus sind auch Fragmente dieser Proteine mit eingeschlossen, die im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität besitzen, vorzugsweise die osteoinduktiven Eigenschaften. Weitere Sequenzinformationen für BMP2 und BMP7 werden nachstehend bereitgestellt. Die Aminosäuresequenz der Proform von BMP2, die als proBMP-2 bezeichnet wird, kann unter anderem aus der Swiss-Prot-Datenbank unter der Zugangsnummer Pro BMP2_HUMAN; P12643 erhalten werden und wird auch in der SEQ ID NO: 4 gezeigt. Unter der SEQ ID NO: 5 wird die Aminosäuresequenz von rhproBMP-2 einschließlich einer zusätzlichen His-Markierungssequenz am N-Terminus gezeigt. rhproBMP2 ist die rekombinante Form des menschlichen pro-BMP-2.
Sowohl rhproBMP-2, das in SEQ ID NO: 4 gezeigt wird, als auch rhproBMP-2 einschließlich der N-terminalen His-Markierungssequenz, das in SEQ ID NO: 5 gezeigt wird, können unter anderem in den beigefügten Beispielen verwendet werden. Die Beispiele sind jedoch nicht auf die SEQ ID NO: 4 beziehungsweise 5 beschränkt. Es wird beabsichtigt, dass die hierin nachstehend angeführten Beispiele auch mit jeder beliebigen anderen Aminosäuresequenz ausgeführt werden können, die hierin offenbart wird.
Ebenfalls noch stärker bevorzugt ist das Mitglied der TGF-TGF-β-Familie ein Mitglied der GDF-Unterfamilie.
Von dem Wachstums- und Differenzierungsfaktor (GDF) ist ebenfalls gezeigt worden, dass er unter anderem an der Induktion und der Remodellierung von Knochengewebe beteiligt ist. Der Wachstums- und Differenzierungsfaktor 5 (GDF-5), der auch als aus dem Knorpel stammendes morphogenetisches Protein 1 (CDMP-1) bekannt ist, ist ein Mitglied einer Untergruppe der BMP-Familie, die auch andere verwandte Proteine umfasst, vorzugsweise GDF-6 und GDF-7. Die reife Form des Proteins ist ein Homodimer von 27 kDa. Verschiedene in vivo- und in vitro-Untersuchungen zeigen die Rolle von GDF-5 im Verlauf der Bildung unterschiedlicher morphologischer Merkmale im Skelett von Säugern. Mutationen in GDF-5 sind für Skelett-Abnormalitäten verantwortlich, einschließlich der Abnahme der Länge der langen Knochen der Gliedmaßen und einer abnormalen Gelenkentwicklung in den Gliedmaßen und des Sternums (Storm & Kingsley (1999), Developmental Biology 209, 11–27). Die Aminosäuresequenz zwischen der Maus und dem Menschen ist hoch konserviert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Mitglied der GDF-Unterfamilie um GDF-5. Bei der am stärksten bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei GDF-5 um den rekombinanten menschlichen GDF-5 (rhGDF-5), wie er in Einzelheiten nachstehend beschrieben wird.
Die Aminosäuresequenz der Präproform des GDF-5 ist unter der Swiss-Prot-Zugangsnummer P43026 hinterlegt oder wird in der SEQ ID NO: 3 gezeigt. Die Aminosäuren 1 bis 27 entsprechen der Leader-Sequenz, die Aminosäuren 28 bis 381 entsprechen der Proform, und die Aminosäuren 382 bis 501 entsprechen dem reifen Protein. Es wird bevorzugt, dass GDF-5 sich auf die Präproform, die Proform oder auf das reife GDF-5-Peptid bezieht. Darüber hinaus sind auch Fragmente des GDF-5 mit eingeschlossen, die im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität besitzen, vorzugsweise die osteoinduktiven Eigenschaften. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Fragment die Aminosäuren 383 bis 501 der Sequenz, die in der SEQ ID NO: 3 gezeigt wird. Es wird auch beabsichtigt, dass jede beliebige Kombination der vorstehend erwähnten Mitglieder der TGF-TGF-β-Famile in der Lösung verwendet werden können, die bei dem Verfahren der Erfindung verwendet wird. Die folgenden Tabellen zeigen die Aminosäuresequenzen der Präproformen von BMP-2, BMP-7 und GDF-5: Präproform des menschlichen BMP-2 (Swiss-Prot Prim. Zugangs-Nummer P12643), SEQ ID NO: 1:
Referenzen

[1] VON DER NUCLEINSÄURE ABGELEITETE SEQUENZ MEDLINE=89072730; PubMed=3201241; Wozney J.M., Rosen V., Celeste A.J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R.W., Hewick R.M., Wang E.A.; "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities."; Science 242:1528–1534(1988).
[2] RÖNTGEN-KRISTALLOGRAPHIE (2,7 ANGSTRÖM) VON 292–396 MEDLINE=99175323; PubMed=10074410; Scheufler C., Sebald W., Huelsmeyer M.; "Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution."; J. Mol. Biol. 287:103–115(1999).

Präproform des menschlichen BMP-7 (Swiss-Prot Prim. Zugangs-Nummer P18075), SEQ ID NO: 2:
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[1] VON DER NUCLEINSÄURE ABGELEITETE SEQUENZ UND TEILSEQUENZ GEWEBE = Plazenta MEDLINE=90291971; PubMed=2357959; Oezkaynak E., Rueger D.C., Drier E.A., Corbett C., Ridge R.J., Sampath T.K., Oppermann H.; "OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family."; EMBO J. 9:2085–2093(1990).
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Präproform des menschlichen GDF-5 (Swiss-Prot Prim. Zugangs-Nummer P43026), SEQ ID NO: 3:
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[1] VON DER NUCLEINSÄURE ABGELEITETE SEQUENZ GEWEBE = Plazenta MEDLINE=95071375; PubMed=7980526; Hoetten G., Neidhardt H., Jacobowsky B., Pohl J.; "Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5."; Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:646–652(1994).
[2] VON DER NUCLEINSÄURE ABGELEITETE SEQUENZ GEWEBE = Gelenkknorpel MEDLINE=95050604; PubMed=7961761; Chang S., Noang B., Thomas J.T., Vukicevic S., Luyten F.P., Ryba N.J.P., Kozak C.A., Reddi A.H., Moos M.; "Cartilage-derived morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factor-beta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development."; J. Biol. Chem. 269:28227–28234(1994).

Es kann sein, dass die vorstehend gezeigten veröffentlichten Sequenzen, wenn sie aus der Swiss-Prot-Datenbank erhalten werden, einen oder mehrere Fehler enthalten, wie zum Beispiel einen, der durch Ungenauigkeiten während der Sequenzierung verursacht wurde. Als Konsequenz können solche Sequenzierungsfehler zu einer oder mehreren stillen Mutationen oder zu einer Veränderung eines oder mehrerer Codons führen, die somit eine oder mehrere andere Aminosäuren, als zuvor veröffentlicht, codieren. Da jedoch die Swiss-Prot-Datenbank, wenn angenommen werden muss, dass Sequenzierungsfehler aufgetreten sind, auf den neuesten Stand gebracht wird, können auch die neuesten Sequenzen von der Swiss-Prot-Datenbank heruntergeholt werden, und zwar unter der Referenz-Nummer oder unter den entsprechenden Namen der Polypeptide, wie sie vorstehend angegeben wurden.
So kann zum Beispiel die SEQ ID NO: 3 die folgenden Aminosäureaustausche in der Proform der Präproform des menschlichen GDF-5 enthalten: an Position 38 ist die Aminosäure Serin (S) durch die Aminosäure Threonin (T) ausgetauscht, an Position 254 der SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäure Valin (V) durch die Aminosäure Alanin (A) ausgetauscht, an Position 256 der SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäure Arginin (R) durch die Aminosäure Glycin (G) ausgetauscht, an Position 257 der SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäure Serin (S) durch die Aminosäure Glycin (G) ausgetauscht, an Position 258 der SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäure Arginin (R) durch die Aminosäure Glycin (G) ausgetauscht, an Position 276 ist die Aminosäure Alanin (A) durch die Aminosäure Serin (S) ausgetauscht und an Position 321 der SEQ ID NO: 3 ist die Aminosäure Threonin (T) durch die Aminosäure Alanin (A) ausgetauscht. Die so erhaltene Aminosäuresequenz, in der die vorstehend erwähnten Aminosäureaustausche auftreten können, wird in der SEQ ID NO: 6 gezeigt. Dies sollte so verstanden werden, dass ein oder mehrere Aminosäureaustausche in der Proform der Aminosäuresequenz der Präproform von GDF-5, die in der SEQ ID NO: 3 gezeigt wird, die physiologische Funktion oder Funktionen von GDF-5 nicht umwandelt, verändert oder vernichtet. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung wird beabsichtigt, dass die SEQ ID NO: 6 in Verbindung mit den Mitteln und den Verfahren der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Vorrichtung frei von toxischen Stoffen.
Der Begriff „toxische Stoffe" umfasst bevorzugt diejenigen toxischen organischen Lösungsmittel und Zusätze, die bei den im Fachgebiet beschriebenen Verfahren verwendet werden, wie z. B. Acetonitril oder Chromschwefelsäure. Diese Stoffe können Entzündungen und andere Reaktionen nach der Implantation der Vorrichtungen, die diese Stoffe enthalten, verursachen. Diese Vorrichtungen sind aufgrund dieser unerwünschten Nebenwirkungen, die bei den Beschichtungsverfahren und bei einigen der Verfahren zur Oberflächenbehandlung, wie sie im Fachgebiet beschrieben sind, nicht vermieden werden können, therapeutisch weniger verträglich. Darüber hinaus erfordern die internationalen Richtlinien für die Entwicklung von therapeutischen Proteinen, dass bei dem Herstellungsverfahren schädliche und toxische Stoffe vermieden werden sollten (für Einzelheiten vergleiche mit: International Conference on Harmonisation (ICH), Thema Q3C; www.emea.eu.int/). Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung oder eine Vorrichtung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, ist jedoch vorteilhafterweise frei von toxischen Stoffen und daher therapeutisch sehr gut verträglich, und sie erfüllt die Forderungen der regulierenden Behörden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung erlaubt die Lösung das Auflösen des Proteins über einen Zeitraum, der für eine homogene Beschichtung der Metalloberfläche des Trägers ausreicht.
Der Begriff „Lösung, die das Auflösen des Proteins über einen Zeitraum erlaubt, der für eine homogene Beschichtung der Metalloberfläche des Trägers ausreicht", bezieht sich auf eine Lösung, in der die osteoinduktiven Proteine effizient aufgelöst werden können. Homogene Beschichtung bedeutet, dass die Oberfläche des Trägers mit dem osteoinduktiven Protein nach der Behandlung mit der Lösung vollständig beschichtet ist. Eine homogene Beschichtung ist dadurch charakterisiert, dass im Wesentlichen identische Mengen an Protein in wirklich jedem Bereich der Oberfläche des Trägers vorliegen. Die homogene Beschichtung ist eine Vorbedingung für die effiziente Freisetzung sowie die homogene Verteilung und Aktivität des osteoinduktiven Proteins in das bzw. dem Gewebe, das den Ort der Implantation umgibt. Darüber hinaus sollte dies so verstanden werden, dass die osteoinduktiven Proteine nicht aggregiert vorliegen und nicht teilweise oder vollständig aufgrund einer Präzipitatbildung oder einer Mikropräzipitatbildung inaktiviert werden, sondern durch die homogene Beschichtung soll vielmehr eine Anheftung von biologisch aktiven und nicht aggregierten Proteinen erreicht werden. Die homogene Beschichtung kann durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht werden, wie es in den begleitenden Beispielen beschrieben wird. Des Weiteren werden Mittel und Verfahren für die Kontrolle des homogenen Beschichtungsvorganges sowie für die Quantifizierung und die Charakterisierung des immobilisierten Proteins in den begeleitenden Beispielen beschrieben. Die Lösung kann durch Fachleute auf Grundlage der Löslichkeit des osteoinduktiven Proteins, die von dem pH-Wert, der Ionenstärke und dem Einfluss des Trägers auf diese Parameter nach dem Inkontaktbringen des Trägers mit der Lösung abhängig ist, zusammengestellt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, dass eine geeignete Lösung für das Verfahren der vorliegenden Erfindung nur Bestandteile umfasst, die den Oxidationszustand des osteoinduktiven Proteins nicht beeinflussen. So können zum Beispiel Saccharide wie z. B. Saccharose oder Trehalose (für Einzelheiten vergleiche mit Beispiel 9), die oft als Excipienten in Proteinformulierungen verwendet werden (als Stabilisatoren oder als Massenmittel), für den Beschichtungsvorgang nicht verwendet werden, da sie die Bindung des Proteins an die Metalloberfläche vermindern. Andere Bestandteile, die vermieden werden sollten, werden in den begleitenden Beispielen nachstehend beschrieben.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die Lösung eine Konzentration des osteoinduktiven Proteins von mehr als 0,5 mg/ml, bevorzugt von mehr als 2 mg/ml und am stärksten bevorzugt von mehr als 3 mg/ml.
Ebenfalls bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem die Lösung einen sauren pH-Wert aufweist.
Der Begriff „schwache Säure" bezieht sich auf organische oder anorganische Verbindungen, die mindestens ein ionogen gebundenes Wasserstoffatom enthalten. Schwache Säuren sind im Fachgebiet wohlbekannt und werden in Standardwerken wie z. B. in Römpp, Lexikon der Chemie beschrieben. Vorzugsweise besitzen diese schwachen Säuren einen geringen Dissoziationsgrad und werden durch pK-Werte zwischen 3 und 7, bevorzugt zwischen 4 und 6, beschrieben.
Am stärksten bevorzugt enthält die saure Lösung HCl, Essigsäure, Zitronensäure und/oder Bernsteinsäure.
In einer weiteren, am stärksten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung beträgt die Konzentration der Säure weniger oder gleich 100 mMol/l, bevorzugt weniger als 50 mMol/l, noch stärker bevorzugt weniger als 25 mMol/l und am stärksten bevorzugt weniger als 15 mMol/l.
In einer weiteren, am stärksten bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung wird die Lösung mit einem inerten Gas gesättigt, am stärksten bevorzugt mit Stickstoff, Argon oder Helium. Bei dieser am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung in einem Raum mit kontrollierter Atmosphäre, Feuchtigkeit und Temperatur und einer definierten Atmosphärenaustauschrate durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann.
Die Definitionen und die Erklärungen der Begriffe, die vorstehend im Zusammenhang mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung gegeben wurden, gelten mutatis mutandis auch für die Vorrichtungen, die nachstehend beschrieben werden.
Die Vorrichtung ist durch die Eigenschaften charakterisiert, die durch die vorstehend erwähnten Verfahren beigetragen wurden. Insbesondere umfasst die Vorrichtung ein osteoinduktives Protein, mit dem eine poröse oder nicht poröse Metall- oder Metalllegierungsoberfläche der Vorrichtung homogen beschichtet wurde, wobei sich der Oxidationszustand des osteoinduktiven Proteins im Vergleich zu dem osteoinduktiven Protein, das nicht zur Beschichtung der Metall- oder Metalllegierungsoberfläche verwendet wurde, nicht signifikant erhöht hat. Bevorzugte Vorrichtungen werden in den begleitenden Beispielen in Einzelheiten beschrieben.
Die Erfindung schließt ein Arzneimittel mit ein, welches die Vorrichtung der Erfindung umfasst oder eine Vorrichtung umfasst, die durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden kann.
Die Definitionen und die Erklärungen der Begriffe, die vorstehend im Zusammenhang mit den Verfahren und den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung gegeben wurden, gelten mutatis mutandis für die Arzneimittel, die hierin beschrieben werden.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer Vorrichtung der Erfindung oder einer Vorrichtung, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, für die Herstellung eines Arzneimittels, das für eine beschleunigte Osteointegration und Knochenneubildung verwendet werden soll. Die Definitionen der Begriffe, auf die vorstehend Bezug genommen wurde, gelten mutatis mutandis für die vorstehend erwähnte Verwendung der vorliegenden Erfindung und diejenigen, die nachstehend beschrieben werden.
Der Begriff „Osteointegration und Knochenneubildung" beschreibt, dass Knochen die Fähigkeit besitzen, neue Knochen um das Implantat zu bilden und das Implantat zu integrieren. Integration bedeutet die Anheftung von Knochenzellen an die Oberfläche des Implantats, die zu einer festen und dauerhaften Verankerung der Prothese-Neukonstruktion unter funktioneller Belastung ohne Schmerzen, Entzündungen oder Lockerung führt.
Noch bevorzugter wird die beschleunigte Osteointegration und die Knochenneubildung für die Behandlung von traumatischen, bösartigen oder künstlichen Defekten, für die Behandlung von Zahndefekten oder für die Behandlung des Hüft-, Ellenbogen-, Rückgrat-, Knie-, Finger- oder Fuß-Gelenks durchgeführt.
Die Symptome der Erkrankungen und Störungen, auf die hierin vorstehend Bezug genommen wurde, werden in Einzelheiten in den Standard-Lehrbüchern der Medizin beschrieben, wie z. B. in Pschyrembel und in Stedman.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung befindet sich auch ein Verfahren für die Behandlung einer oder mehrerer der Krankheiten, auf die gemäß den Verwendungszwecken der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, wobei das Verfahren zumindest den Schritt der Verabreichung der Vorrichtung der Erfindung oder einer Vorrichtung, die durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, in einer pharmazeutisch verträglichen Form an ein Individuum umfasst. Bevorzugt handelt es sich bei dem Individuum um einen Menschen.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Kit, das die Vorrichtung der Erfindung umfasst oder eine Vorrichtung, die durch das Verfahren der Erfindung erhalten werden kann.
Die Definitionen und die Erklärungen der Begriffe, die vorstehend im Zusammenhang mit den Verfahren, den Vorrichtungen, den Arzneimitteln und den Verwendungen der vorliegenden Erfindung gegeben wurden, gelten mutatis mutandis für den Kit, der hierin beschrieben wird.
Die Bestandteile des Kits der Erfindung können individuell in Gefäßen oder in anderen geeigneten Mitteln verpackt sein, und zwar in Abhängigkeit von dem entsprechenden Bestandteil oder in Kombination mit geeigneten Behältern oder Mehrfachbehältern. Die Herstellung des Kits erfolgt bevorzugt durch Standardverfahren, die den Fachleuten bekannt sind. Die Vorrichtung wird bevorzugt in einem Behälter oder in einem Gefäß unter einer sauerstofffreien Atmosphäre verpackt wie z. B. unter einer inerten Gasatmosphäre, bevorzugt besteht diese aus Stickstoff.
Die Figuren zeigen:
1: Prozentsatz an oxidiertem rhGDF-5 nach der Extraktion mit 10 mMol/l HCl.
2: Fluoreszenzfärbung einer Metallplatte, die mit rhGDF-5 in 10 mM HCl beschichtet wurde.
3: Fluoreszenzfärbung einer Metallplatte, die mit rhGDF-5 in PBS beschichtet wurde.
4: Fluoreszenzfärbung einer Metallplatte, die mit 10 mMol/l HCl beschichtet wurde.
5: Fluoreszenzfärbung einer unbeschichteten Metallplatte.
6: Freisetzung von rhGDF-5 von vorbehandelten Titanoberflächen. Zusammenfassung der Ergebnisse, die durch einen ELISA bestimmt wurden.
7: Beschichtung von Titanoberflächen mit rhGDF-5-Lösungen mit und ohne Saccharose.
8: Prozentsatz an oxidiertem rhGDF-5 nach der Extraktion von vorbehandelten Platten bei Raumtemperatur.
9: Prozentsatz an oxidiertem rhGDF-5 nach der Extraktion von vorbehandelten Platten bei 4°C.
10: Zunahme an modifiziertem rhproBMP-2 nach dem Beschichten und der Extraktion im Vergleich zur Beschichtungslösung.
Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden biologischen Beispiele beschrieben, die nur der Erläuterung dienen und nicht als Einschränkung des Rahmens der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden dürfen.
Beispiel 1: Quantifizierung von rhGDF-5 mittels RP-HPLC
Die Menge an rhGDF-5 wird durch eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse bestimmt. Die Probe wird auf eine Poros-C8-18-Säule (R2/10, 21 × 30 mm) aufgetragen, die mit 0,1% Ameisensäure und 21% Acetonitril äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule erfolgt die Elution mit 0,1% Ameisensäure und einem Gradienten von 21 bis 84% Acetonitril (Durchflussrate: 0,4 ml/min). Die Elution wird durch die Messung der Extinktion bei 220 nm überwacht. Die Quantifizierung erfolgt über den Peak und die Verwendung einer Standardkurve, die kurz zuvor aufgenommen wurde.
Beispiel 2: Extraktion und Quantifizierung des gebundenen Proteins
Das Protein wurde durch die Inkubation des beschichteten Körpers zuerst mit PBS 1 h bei Zimmertemperatur extrahiert. Anschließend wurde der beschichtete Körper 3 h bei Zimmertemperatur in 10 mMol/l HCl inkubiert. Nach dem Einstellen der PBS-Probe auf den pH-Wert 2 wurden die PBS- und die HCl-Lösung, die den extrahierten Knochen-Wachstumsfaktor enthielten, über RP-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Beispiel 3: Quantifizierung von löslichen Aggregaten in Lösungen, die das extrahierte Protein enthielten
Die Menge an löslichen Aggregaten in den Proben, die das extrahierte Protein enthielten, wurde durch Größenausschluss-Chromatographie bestimmt. Die Säule (TSK 3000) wurde mit 50 mMol/l Essigsäure, 50 mMol/l Phosphorsäure, NaOH, pH-Wert 3,0 äquilibriert.
Die Elution wird durch UV-Nachweis bei 220 nm überwacht. Die Quantifizierung erfolgt über das Verhältnis der Peakfläche des Aggregats zur gesamten Peakfläche.
Beispiel 4: Bestimmung von chemischen Modifikationen des extrahierten Proteins
Die Menge an chemischen Modifikationen, d. h. die Oxidation des Knochen-Wachstumsfaktors in Lösungen, die das extrahierte Protein enthielten, wurde über RP-HPLC bestimmt. Die Probe wird auf eine Vydak-C8-18-Säule (2 × 250 mm) aufgetragen, die zuvor mit 0,15% TFA, 20% Acetonitril äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule erfolgt die Elution des Knochen-Wachstumsfaktors mit 0,1% TFA und einem Stufen-Gradienten von 20% bis 84% Acetonitril (Durchflussrate: 0,3 ml/min). Die Elution wird durch Messen der Extinktion bei 220 nm überwacht. Die Quantifizierung erfolgt über das Verhältnis der Peakfläche der modifizierten Spezies zu der gesamten Peakfläche.
Beispiel 5: Beschichtung und Freisetzung von Ti6Al4V mit dem Knochen-Wachstumsfaktor
rhGDF-5 kann nach dem Beschichtungs-Freisetzungs-Zyklus bei der Verwendung von Titanplatten als Oberfläche zu einem signifikanten Ausmaß oxidiert werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren und eine Vorrichtung für das Beschichten, das die Oxidation des Proteins während der Beschichtungsprozedur vermeidet.
Vorrichtung für die Beschichtung von Titan oder Titanlegierungen mit dem Knochen-Wachstumsfaktor:
Der Beschichtungsvorgang wird unter einer inerten Gasatmosphäre durchgeführt, um Sauerstoff auszuschließen. Um diese Bedingungen zu erreichen, wird eine Kammer verwendet. Die Kammer besteht aus einem hermetisch abgeschlossen Raum mit einem kontinuierlichen durchfließenden Strom aus inertem Gas, wie z. B. N₂-Gas. In der Kammer wird ein schwacher Überdruck aufrechterhalten. Die Materialien, die für den Beschichtungsvorgang benötigt werden, werden in die Kammer durch eine gasundurchlässige Schleuse transportiert. Die Kammer erlaubt einen manuellen sowie eine automatisierten Beschichtungsvorgang. Für die Definierung und die Standardisierung des Beschichtungsvorgangs wird die relative Feuchtigkeit in der Kammer überwacht und eingestellt.
Beschichten:
Die Titanplatten wurden gereinigt, mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und getrocknet. Die Titanplatten wurden mit 60 μg rhGDF-5 beschichtet. Jede Platte wurde flach in eine Schale gelegt und mit rhGDF-5-Lösung auf einer Seite der Metallplatte beschichtet. Das Beschichten wurde unter N₂-Gas-Atmosphäre in der wie vorstehend beschriebenen Kammer und bei einer Temperatur von 0°C bis 4°C durchgeführt. Nach dem Beschichten wurde die Platte unter den entsprechenden Bedingungen 30 Minuten unter Vakuum getrocknet.
Extraktion:
Der rhGDF-5 wurde zuerst in PBS inkubiert, um annähernd physiologische Bedingungen zu simulieren. Um die Proben so gut wie möglich sauerstofffrei zu halten, wurde die PBS-Lösung mit N₂-Gas bei den entsprechenden Proben gesättigt.
Nach der Inkubation in PBS wurden die Platten 3 h in 10 mMol/l HCl bei der entsprechenden Temperatur inkubiert. Der rhGDF-5 in den extrahierten Lösungen wurde durch RP-HPLC quantifiziert (vergleiche mit Beispiel 1). Die Menge an oxidiertem rhGDF-5 wurde ebenfalls mittels RP-HPLC bestimmt (vergleiche mit Beispiel 4).
Um in der Lage zu sein, Proben, die, wie vorstehend beschrieben, beschichtet und extrahiert worden waren, vergleichen zu können, wurde das gleiche Verfahren bei Raumtemperatur und unter Sauerstoff-Atmosphäre durchgeführt.
Tabelle 1:
Die in den hier beschriebenen Experimenten untersuchten Parameter haben einen Einfluss auf die Menge an oxidiertem rhGDF-5 nach der Extraktion von den Titanplatten: Proben, die in Gegenwart von Luftsauerstoff bei Raumtemperatur beschichtet worden waren, weisen eine Menge an oxidiertem rhGDF-5 von 10,0% ± 1,6% auf, wie in Tabelle 1 und in 1 gezeigt wird.
Die Proben, die bei 4°C und unter N₂-Gas bearbeitet worden waren, weisen nach der Extraktion 5,6% ± 0,6% an oxidiertem rhGDF-5 auf. Verglichen mit der rhGDF-5-Hauptlösung (bulk) weisen die bei 4°C und unter N₂-Gas bearbeiteten Proben keinen signifikanten Unterschied in der Menge an oxidiertem rhGDF-5 auf (4,7% ± 0%).
Beispiel 6: Bestimmung der Homogenität der Beschichtung mit dem Knochen-Wachstumsfaktor auf Titanoberflächen durch Fluoreszenz-Mikroskopie
Wir untersuchten die Beschichtungsdichte des Knochen-Wachstumsfaktors auf dem Titankörper unter Verwendung eines Fluoreszenz-Markers für Proteine. Der Nachweis erfolgte durch Fluoreszenz-Mikroskopie.
Beschichten:
Eine Platte wurde flach in eine Schale gelegt und mit 10 μl einer Lösung von 6,18 mg/ml rhGDF-5 in 10 mMol/l HCl auf einer Seite der Metallplatte beschichtet. Eine zweite Platte wurde mit 10 μl 10 mMol/l HCl beschichtet. Die Platten wurden 30 Minuten unter Vakuum getrocknet. Eine dritte Platte wurde nicht beschichtet und als Leerprobe verwendet. Darüber hinaus wurde eine Platte mit einer Lösung von 6,0 mg/ml rhGDF-5 in PBS beschichtet.
Fluoreszenzfärbung des Proteins:
2,3 μl einer 10 mMol/l-Lösung von Alexa Fluor^TM 488 wurden zu 1 ml einer 0,15 M NaHCO₃-Lösung gegeben. Die 3 Metallplatten wurden in 1 ml des Fluoreszenzfarbstoff-Gemisches 4 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das Verhältnis Protein : Fluorophor betrug 1:10. Die als Leerprobe verwendete Platte wurde nur 20 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten ausgiebig mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und 15 Minuten unter Vakuum im Dunkeln getrocknet.
Das Fluoreszenzsignal wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen und durch eine bildgebende Software dokumentiert.
In der 2 kann die Fläche, die mit dem rhGDF-5 beschichtet worden war, durch Fluoreszenz-Mikroskopie deutlich nachgewiesen werden. Dies bedeutet, dass der Fluoreszenzmarker an das Protein gebunden hat. Im Gegensatz dazu, zeigt 3 die Bedeutung des Lösungsmittels für den rhGDF-5, da eine Beschichtungslösung, die PBS enthält, zu einer inhomogenen Verteilung des Proteins und zu Proteinflecken führt.
Um Artefakte auszuschließen, wird in 4 die mit 10 mMol/l HCl beschichtete Platte gezeigt. 10 mMol/l HCl ist das Lösungsmittel für den rhGDF-5 in Lösung.
Um alle möglichen Wirkungen des Lösungsmittels auszuschließen, stellten wir auch eine leere Platte her, die nicht mit dem rhGDF-5 oder mit 10 mMol/l HCl beschichtet, aber ebenfalls mit dem Fluoreszenzmarker Alexa Fluor^TM 488 inkubiert wurde (5).
Die Abbildungen zeigen deutlich, dass nur der rhGDF-5 durch den Fluoreszenzmarker angefärbt wurde. Weiterhin ist die Verteilung des Proteins auf der Oberfläche regulär, wenn das verwendete Lösungsmittel 10 mMol/l HCl ist.
Beispiel 7: Langzeit-in vitro-Freisetzung des Knochen-Wachstumsfaktors von vorbehandelten Titan-Oberflächen
Wir entwickelten ein Verfahren für das Beschichten des Knochen-Wachstumsfaktors auf Titan-Oberflächen. Nach einer standardisierten Extraktion waren wir in der Lage, das Protein auf Aggregate (Beispiel 3) und die Menge an oxidiertem Knochen-Wachstumsfaktor (Beispiel 4) zu untersuchen und waren auch in der Lage, das extrahierte Protein zu quantifizieren (Beispiel 1). In dem hier beschriebenen Experiment bestimmten wir die Freisetzungs-Kinetik des Knochen-Wachstumsfaktors durch Inkubation beschichteter Titanplatten in Zellkulturmedium über 30 Tage. Um physiologische Bedingungen und Stoffwechselaktivität zu simulieren, tauschten wir das Medium alle 48 Stunden aus und quantifizierten die Menge an freigesetztem Protein durch ELISA.
Beschichten:
Die Probe wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, beschichtet.
30 Tage-Freisetzung:
Die Platte wurde in 6 ml Freisetzungs-Medium: 89% αMEM, 1% Penicillin, Streptomycin, 10% FCS 30 Tage bei 4°C inkubiert. Die Proben wurden ständig in einem Mischgerät gerollt. Nach jeweils 48 Stunden Inkubation wurde der Überstand entnommen und bei –70°C eingefroren aufbewahrt. Ein Volumen von 6 ml frischem Medium wurde den Freisetzungs-Proben zugegeben.
Das freigesetzte Protein in den Proben wurde durch einen ELISA mit dem Knochen-Wachstumsfaktor quantifiziert. Die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen werden mit einem monoclonalen Antikörper gegen den rhGDF-5 beschichtet. Nach dem Waschen der Platte mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, und dem Blockieren mit SuperBloc-Lösung (Pierce, Katalog-Nr. 37515) werden die den rhGDF-5 enthaltenden Proben hinzugefügt, und dann wird die Platte 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der Proben (vergleiche mit dem Vorstehenden) wird ein zweiter, biotinylierter Antikörper gegen den rhGDF-5 hinzu gegeben, und die Proben werden 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach einem Waschschritt wird ein Streptavidin-Peroxidase-Komplex zugefügt und die Proben werden weitere 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthält, gewaschen, und die Menge an gebundener Peroxidase wird unter Verwendung von BM Blue-POD-Substrat (Roche Diagnostics, Katalog-Nr. 148428) quantifiziert. Die Nachweis-Wellenlänge ist 450 nm, die Referenz-Wellenlänge ist 630 nm. Die Menge an rhGDF-5 wird unter Verwendung einer rhGDF-5-Standardkurve berechnet.
Die Ergebnisse der Freisetzung des Knochen-Wachstumsfaktors, die durch den ELISA bestimmt wurden, sind in der Tabelle 2 und in der 6 zusammengefasst. Die Menge an freigesetztem Protein nach 30 Tagen, die durch den ELISA bestimmt wurde, beträgt 100,4% ± 0,8%. Tabelle 2:
Beispiel 8: Beschichten und Extrahieren von Titan oder Titan-Legierungen mit dem rhBMP-5
Hier untersuchten wir das Verhalten des rhBMP-2 im Verlauf des Beschichtungs-Extraktions-Vorganges. Das rhBMP-2 ist ähnlich wie der rhGDF-5 ein weiteres Mitglied der TGF-β-Proteinfamilie.
Beschichten:
Die Platten wurden flach in eine Schale gelegt und mit 10 μl einer 6,0 mg/ml-Lösung entweder des Knochen-Wachstumsfaktors oder des rhBMP-2 auf einer Seite der Platte beschichtet. Alle Platten wurden 30 Minuten unter Vakuum getrocknet.
Extraktion:
Alle Platten wurden 1 h bei Raumtemperatur mit PBS extrahiert. Dann wurden die Platten, die mit dem Knochen-Wachstumsfaktor und mit rhBMP-2 beschichtet worden waren, 3 Stunden in 10 mmol/l HCl inkubiert. Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Experimente sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3:
Im Verlauf der Inkubation in PBS wurde kein rhBMP-2 extrahiert. Von dem rhGDF-5 wurden 8,8% in PBS extrahiert.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Proteine, die zu der TGF-β-Proteinfamilie gehören, an Metalloberflächen binden und (fast) vollständig mit 10 mmol/l HCl nach einer Inkubation in PBS extrahiert werden können.
Beispiel 9: Beschichten von Titan oder Titan-Legierungen mit dem Knochen-Wachstumsfaktor in Gegenwart von Saccharose
Hier beschreiben wir das Beschichten von Titanoberflächen mit einer rhGDF-5-Lösung mit 10% Saccharose. Zum Vergleich beschichteten wir Titanoberflächen mit dem Knochen-Wachstumsfaktor in 10 mMol/l HCl.
Die Titanplatten wurden mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, getrocknet und mit 40 μg Knochen-Wachstumsfaktor in 10 mMol/l HCl beziehungsweise mit 40 μg Knochen-Wachstumsfaktor in 10% Saccharose, 10 mMol/l HAc und 5 mMol/l HCl beschichtet.
Anschließend wurde das Titanmaterial in PBS 1 h bei Zimmertemperatur gewaschen. Dann wurde das Protein durch 3 h Inkubation in 100 mMol/l HCl bei Zimmertemperatur extrahiert. Der Proteingehalt aller Lösungen wurde durch Quantifizierung mittels RP-HPLC bestimmt. Vor der Quantifizierung wurde die PBS-Lösung auf einen pH-Wert von 2 eingestellt, um die Löslichkeit des Knochen-Wachstumsfaktors zu erhöhen.
Bei den hierin beschriebenen Experimenten wurden zwei unterschiedlich beschichtete Metallstücke hergestellt:
Titanplatten, die mit Lösungen des Knochen-Wachstumsfaktors mit oder ohne 10% Saccharose beschichtet worden waren. Die Ergebnisse des Beschichtungs- und des Extraktionsverfahrens sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4:
Es gibt einen signifikanten Unterschied bei dem Beschichten von Titanplatten mit den Knochen-Wachstumsfaktor-Lösungen mit oder ohne 10% Saccharose. Aus der Probe, die Saccharose enthielt, wurden 32,5% des Proteins gewonnen, aus der Probe ohne Saccharose wurden 70,3% des Knochen-Wachstumsfaktors gewonnen (vergleiche mit 7).
Bei den vorstehend beschriebenen Experimenten wollten wir die Anwesenheit von Saccharose in der Beschichtungslösung auf die Bindung des Knochen-Wachstumsfaktors an Metalloberflächen bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtgewinnung signifikant niedriger ist als die Gewinnung des Knochen-Wachstumsfaktors nach dem Beschichten ohne Saccharose.
Beispiel 10: Beschichten und Freisetzen von Ti6Al4V-Knochen-Wachstumsfaktor – Einfluss von Reduktionsmitteln
A) Einfluss von Reduktionsmitteln in der Beschichtungslösung:
Um die Proteinoxidation des Proteins während des Beschichtungs- und Extraktions-Zyklus zu vermeiden, schlossen wir Reduktionsmittel in die Beschichtungslösung mit ein: wir fügten 10 mMol/l der folgenden Verbindungen oder Kombinationen davon der Knochen-Wachstumsfaktor-Beschichtungslösung zu:
10 μl Probe 1 (Leerprobe): 5,04 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor in 10 mMol/l HCl
12 μl Probe 2: 10 mMol/l EDTA + 3,94 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor
10 μl Probe 3: 10 mMol/l Met + 4,54 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor
10 μl Probe 4: 10 mMol/l Na₂SO₃ + 4,54 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor
11 μl Probe 5: 10 mMol/l Met + 10 mMol/l EDTA + 3,84 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor
11 μl Probe 6: 10 mMol/l EDTA + 10 mMol/l Na₂SO₃ + 3,84 mg/ml Knochen-Wachstumsfaktor
und führten das Beschichten, wie in Beispiel 5 beschrieben, durch.
Extraktion:
Zuerst wurde der Knochen-Wachstumsfaktor 1 h bei Zimmertemperatur mit PBS extrahiert (die Inkubation in PBS stellt eine Simulierung der physiologischen Situation im Körper dar). Anschließend wurden die Platten 3 h mit 10 mMol/l HCl extrahiert. Der Knochen-Wachstumsfaktor in den Extraktionslösungen jeder Probe wurde mittels RP-HPLC quantifiziert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Menge an oxidiertem Protein wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Experimente sind in der Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5:

*) Nach der HCl-Extraktion wurde durch Quantifizierung mittels HPLC kein Protein nachgewiesen

Die Rückgewinnung lag bei allen Proben zwischen 50% und 82%. Das Protein konnte in allen Proben mit PBS extrahiert werden, außer bei derjenigen, die Na₂SO₃ enthielt. Die Menge an oxidierten Spezies wurde in den Proben, die mit PBS extrahiert worden waren, sowie in den Proben, die mit HCl extrahiert worden waren, bestimmt. Die Menge an oxidierten Spezies liegt zwischen 8% und 23%.
Als Schlussfolgerung lässt sich sagen, dass ein Verfahren, das Reduktionsmittel in der Beschichtungslösung verwendet, nicht das Verfahren der Wahl ist, um eine Oxidation des Knochen-Wachstumsfaktors zu vermeiden. Entweder ist die Gesamt-Rückgewinnung niedrig oder das Protein wird in hohem Maße bereits mit PBS extrahiert oder die Menge an oxidiertem Knochen-Wachstumsfaktor ist signifikant hoch. Daher sind andere Verfahren nötig, um die Oxidation des Knochen-Wachstumsfaktors während des Beschichtungs- und Extraktions-Zyklus zu vermeiden.
B) Vollsaugen der Oberfläche mit Reduktionsmitteln vor dem Beginn des Beschichtungsvorganges:
Wir beschrieben den Einfluss von Reduktionsmitteln in der Beschichtungslösung. Hier vergleichen wir die Wirkung unterschiedlicher Reduktionsmittel nach der Inkubation vorbehandelter Metallplatten über 24 h in einer Lösung, die das entsprechende Reduktionsmittel enthielt. Anschließend wurde der Beschichtungs- und Extraktionsvorgang bei zwei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt.
Alle Proben wurden in einer 10 mMol/l-Lösung der folgenden reduzierenden Agenzien inkubiert: Thiocarbamid, Ascorbinsäure, Natriumsulfit, Cystein, Methionin, Mercaptoethanol.
Nach 24 h Inkubation wurden die Platten mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und 15 Minuten unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Alle Platten wurden flach in eine Schale gelegt und mit 10 μl einer Lösung von 6,95 mg/ml rhGDF-5 auf einer Seite der Metallplatte beschichtet. Die eine Hälfte der Platten wurde unter Vakuum bei 4°C getrocknet, die andere Hälfte der Platten wurde unter Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.
Die Beschichtungs- und die Extraktions-Prozedur wurden bei 4°C und bei Zimmertemperatur durchgeführt. Zuerst wurde der rhGDF-5 mit PBS 1 h bei Zimmertemperatur extrahiert. Dann wurden die Platten 3 h in 10 mMol/l HCl inkubiert. Der rhGDF-5 in den Extraktionslösungen jeder Probe wurde durch RP-HPLC quantifiziert (Beispiel 1). Anschließend wurde die Menge an oxidierten Spezies durch RP-HPLC bestimmt (Beispiel 4).
In Tabelle 6 sind die Proben entsprechend ihrer Art der Vorbehandlung aufgelistet.
Tabelle 6:
Die Menge an oxidiertem rhGDF-5 in allen Proben liegt zwischen 9,0% und 12,6%, während die Proteinlösung, die als Ausgangsmaterial verwendet wurde, einen Anteil von 5% oxidierter Spezies enthielt. In den bei 4°C inkubierten Proben ist die Menge an oxidiertem Protein niedriger als in den entsprechenden Proben, die bei Zimmertemperatur behandelt worden waren. Aus den Ergebnissen kann man schließen, dass keiner der verwendeten Excipienten in der Lage ist, die Oxidation signifikant zu vermeiden. Die Menge an oxidiertem Protein wird in den 8 und 9 dargestellt.
Der Hauptpunkt der hier beschriebenen Experimente ist die Inkubation der vorbehandelten Platten mit unterschiedlichen Reduktionsmitteln. Wir folgern, dass die Inkubation der Metallplatten über 24 Stunden in Lösungen von Reduktionsmitteln nicht das Verfahren der Wahl für die Vermeidung der Proteinoxidation ist.
Beispiel 11: Quantifizierung von rhproBMP-2 und rhBMP-2 mittels RP-HPLC
Die Menge an rhproBMP-2/rhBMP-2 wird durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse bestimmt. Die Probe wird auf eine Poros-C4-Säule (20 × 2 mm) aufgetragen, die mit 0,045% TFA äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule erfolgt die Elution mit 0,025% TFA, 84% Acetonitril und einem Gradienten von 21–84% Acetonitril (Durchflussrate: 0,4 ml/min). Die Elution wird durch Messung der Extinktion bei 220 nm überwacht. Die Quantifizierung erfolgt über den Peak und die Verwendung einer Standardkurve.
Beispiel 12: Bestimmung chemischer Modifikationen des extrahierten rhproBMP-2
Die Menge an modifizierten Formen des Knochen-Wachstumsfaktors in Lösungen, die das extrahierte Protein enthielten, wurde durch RP-HPLC bestimmt. Die Probe wird auf eine YMC-C4-Säule (4,6 × 250 mm) aufgetragen, die mit 0,1% TFA äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule erfolgt die Elution mit einem Gemisch aus 100% Acetonitril, 0,1% TFA und einem Stufen-Gradienten von 25% – 100% Acetonitril (Durchflussrate: 0,8 ml/min). Die Elution wird durch Messung der Extinktion bei 220 nm überwacht. Die relative Menge an modifizierten Proteinspezies wird aus dem Verhältnis der entsprechenden Peakfläche und der gesamten Peakfläche berechnet.
Beispiel 13: Bestimmung der Menge an modifiziertem rhproBMP-2 nach der Extraktion
In diesem Beispiel wird das Verhalten des rhproBMP-2 während des Beschichtungs-Extraktions-Vorgangs unter optimierten Bedingungen untersucht; rhproBMP-2 ist die rekombinante Form von proBMP-2. Die Aminosäuresequenz von rhproBMP-2 wird in der SEQ ID NO: 4 gezeigt. Nach der Extraktion wurde die Menge an modifizierten Spezies bestimmt.
Beschichten:
Titanplatten wurden mit rhproBMP-2, wie in Beispiel 5 vorstehend beschrieben, beschichtet. Eine Reihe an Platten wurde unter Standardbedingungen (Luft, Raumtemperatur) beschichtet (Reihe 1); eine weitere Reihe an Platten wurde unter N₂-Atmosphäre beschichtet (Reihe 2).
Jede Platte wurde flach in eine Schale gelegt und mit je 10 μl einer Lösung von 1,9 mg/ml rhproBMP-2 auf einer Seite der Metallplatte beschichtet.
Extraktion:
Die Extraktion wurde, wie in dem vorstehenden Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt. Die Menge an modifiziertem rhproBMP-2 wurde ebenfalls durch RP-HPLC bestimmt; vergleiche mit Beispiel 12, vorstehend.
Die Charakterisierung des extrahierten Proteins erfolgte durch die Quantifizierung der modifizierten Spezies. Dementsprechend wurden die Veränderungen in der Menge an modifiziertem rhproBMP-2 mit der Hauptlösung des rhproBMP-2 verglichen. Diese Daten sind in Tabelle 7 dargestellt, welche die Menge an chemisch modifiziertem rhproBMP-2 nach der Extraktion zeigt. Tabelle 7:
Die in den hier beschriebenen Experimenten untersuchten Parameter besitzen einen Einfluss auf die Menge an modifiziertem rhproBMP-2 nach der Extraktion von den Titanplatten: Proben, die unter Luftatmosphäre beschichtet worden waren, weisen eine Menge an modifiziertem rhproBMP-2 von 4,9% ± 1,2% auf im Vergleich zu der Beschichtungslösung, die in der vorstehenden Tabelle 2 gezeigt wurde.
Die Proben, die bei Raumtemperatur und unter N₂-Gas bearbeitet worden waren, weisen nach der Extraktion eine Steigerung von 1,5% ± 0,6% an modifiziertem rhproBMP-2 auf.
Die unter Luft behandelten Proben zeigen eine Steigerung von +4,9% (vergleiche mit 10, nachstehend) im Vergleich zur Protein-Hauptlösung. 10 zeigt die Erhöhung an modifiziertem rhproBMP-2 nach dem Beschichten/Extrahieren im Vergleich zu der Beschichtungslösung. In der nachstehenden 10 überlappen die Fehlerbalken der entsprechenden Proben nicht. Daher wurde gefolgert, dass die umgebende Gasatmosphäre einen signifikanten Einfluss auf die Menge an Modifikationen des rhproBMP-2 nach der Extraktion von den Titanplatten hat.
Referenzen:

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• Williams, D.F. The Williams Dictionary of Biomaterials (Liverpool, GB: Liverpool University Press (1999) 40.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, umfassend die Schritte: (a) das Bereitstellen einer Lösung, die gelöstes osteoinduktives Protein umfasst; (b) das Inkontaktbringen der Lösung gemäß Schritt (a) mit einem Träger, der eine Oberfläche aus Metall oder einer Metalllegierung enthält; (c) das Beschichten der Oberfläche des Trägers mit dem gelösten Protein; und (d) das Trocknen des in Schritt (c) erhaltenen beschichteten Trägers, wobei die Schritte (b) bis (d) unter einer verringerten Konzentration an Sauerstoff ausgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Schritte (b) bis (d) unter einer Sauerstoffkonzentration von weniger als 10 Vol% Sauerstoff ausgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Schritte (b) bis (d) bei einer Temperatur unter 25°C ausgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Metall oder die Metalllegierung Titan oder eine Titanlegierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Titanlegierung eine Titanlegierung ist, die mindestens 50% Titan enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Titanlegierung eine Ti-Al-V-Legierung, eine Ti-Al-Fe-Legierung, eine Ti-Al-Nb-Legierung oder eine Ti-Mo-Zr-Al-Legierung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Ti-Al-V-Legierung Ti6Al4V ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Beschichten durch Eintauchen der Metalloberfläche in die Proteinlösung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Beschichten durch Auftropfen der Proteinlösung auf die Metalloberfläche durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Beschichtung durch Aufsprühen der Proteinlösung auf die Metalloberfläche ausgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Trocknen durch Vakuumtrocknen erreicht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Trocknen durch Gefriertrocknen erreicht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Trocknen durch Verdunstung bei Raumtemperatur in einem inerten Gasstrom erreicht wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das osteoinduktive Protein ein Mitglied der TGF-β-Familie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Mitglied der TGF-β-Familie ein Mitglied der BMP-Unterfamilie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Mitglied der BMP-Familie BMP-2 oder BMP-7 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das Mitglied der TGF-β-Familie ein Mitglied der GDF-Unterfamilie ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Mitglied der GDF-Unterfamilie GDF-5 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Vorrichtung frei von toxischen Stoffen ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Lösung die Auflösung des Proteins für eine Zeit erlaubt, welche ausreichend zur homogenen Beschichtung der Metalloberfläche des Trägers ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Lösung eine Konzentration des osteoinduktiven Proteins von mehr als 0,5 mg/ml erlaubt.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Lösung einen sauren pH-Wert hat.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die saure Lösung HCl, Essigsäure, Zitronensäure oder Bernsteinsäure enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, wobei die Konzentration der Säure kleiner oder gleich 100 mmol/l ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Lösung mit einem inerten Gas gesättigt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das inerte Gas Stickstoff, Argon oder Helium ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26, welches in einem Raum mit kontrollierter Atmosphäre und Feuchtigkeit ausgeführt wird.
Vorrichtung, welche durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 erhältlich ist.
Arzneimittel, umfassend die Vorrichtung, welche durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 erhältlich ist.
Verwendung der Vorrichtung, welche durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 erhältlich ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung für eine beschleunigte Osteointegration und Knochenneubildung.
Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei die beschleunigte Osteointegration und Knochenneubildung zur Behandlung von traumatischen, malignen oder künstlichen Defekten verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei die beschleunigte Osteointegration und Knochenneubildung zur Behandlung von Zahndefekten verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 30, wobei die beschleunigte Osteointegration und Knochenneubildung zur Behandlung des Hüft-, Ellenbogen-, Rückgrat-, Knie-, Finger- oder Fuß-Gelenks verwendet wird.
Kit, umfassend die Vorrichtung, welche durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27 erhältlich ist.