ES2255059T3

ES2255059T3 - Bmp-12, bmp-13 y composiciones suyas inductoras de tendon.

Info

Publication number: ES2255059T3
Application number: ES95904255T
Authority: ES
Inventors: Anthony J. Celeste; John M. Wozney; Vicki A. Rosen; Neil M. Wolfman; Gerald H. Thomsen; Douglas A. Melton
Original assignee: Harvard College; Genetics Institute LLC
Current assignee: Harvard College; Genetics Institute LLC
Priority date: 1993-12-07
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: PT733109E; ATE319823T1; OA10582A; US6984623B2; KR100353182B1; US5658882A; AU689184B2; EP0733109B1; JP2005312457A; WO1995016035A2; US20070004005A1; CA2176942C; NO962304L; WO1995016035A3; US20040146923A1; NO317801B1; DE69434651T2; DE69434651D1; JPH09506261A; CA2176942A1

Abstract

SE HAN CLONADO PROTEINAS MORFOGENETICAS DE HUESO BMP-12 Y BMP13. SE DESCRIBEN COMPOSICIONES DE ESTAS PROTEINAS CON ACTIVIDAD DE INDUCCION DE TEJIDO SIMILAR A TENDON/LIGAMENTO. LAS COMPOSICIONES SON UTILES EN EL TRATAMIENTO DE TENDINITIS Y DEFECTOS DE TENDON O LIGAMENTO Y EN LA REPARACION DE TEJIDOS RELACIONADOS.

Description

BMP-12, BMP-13 y composiciones suyas inductoras de tendón.

Solicitudes relacionadas

La presente invención es una continuación en parte de las solicitudes con los números de serie 08/217.780, presentada el 25 de marzo de 1994, 08/164.103 presentada el 7 de diciembre de 1993 y 08/333.576, presentada el 2 de noviembre de 1994.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de proteínas purificadas y a composiciones que contienen dichas proteínas, cuyas composiciones son útiles para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento, la curación de heridas y la reparación de ligamentos y de otros tejidos. Estas proteínas también se pueden utilizar en composiciones para incrementar la actividad de las proteínas morfogenéticas óseas.

Antecedentes de la invención

La búsqueda de la molécula o las moléculas responsables de la formación de hueso, cartílago, tendón y otros tejidos presentes en el hueso y otros extractos tisulares, ha llevado hasta el descubrimiento de un nuevo grupo de moléculas denominadas Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs). Las estructuras de diversas proteínas, denominadas BMP-1 hasta BMP-11, ya se han descrito previamente. La actividad exclusiva inductora de estas proteínas, junto con su presencia en el hueso, sugieren que son importantes reguladoras de los procesos de reparación ósea y que pueden estar implicadas en el mantenimiento normal del tejido óseo. Existe una necesidad de identificar proteínas adicionales que tengan una función en la formación de otros tejidos vitales. La presente invención se refiere a la identificación de una familia de proteínas que tiene actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento y que es útil en composiciones para la inducción de la formación de tejido similar al tendón/ligamento y para la reparación.

Sumario de la invención

En una realización, la presente invención comprende moléculas de ADN que codifican una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento que los inventores han denominado V1-1. Esta nueva proteína se denomina en la actualidad BMP-12. La presente invención también incluye moléculas de ADN que codifican proteínas relacionadas con BMP-12.

Las proteínas relacionadas con BMP-12 son un subgrupo de la familia de proteínas BMP/TGF-\beta/Vg-1, que incluyen a BMP-12 y a VL-1 que se definen como proteínas inductoras de tejido similar al tendón/ligamento, codificadas por secuencias de ADN que están clonadas e identificadas, p. ej., empleando PCR, empleando cebadores específicos de BMP-12, tales como los cebadores nº 6 y nº 7 descritos a continuación, con condiciones rigurosas. Se prefiere que las secuencias de ADN que codifican proteínas relacionadas con BMP-12, compartan al menos aproximadamente 80% de homología a nivel de aminoácido con los aminoácidos nº 3 hasta nº 103 de la SEQ ID NO: 1.

Las moléculas de ADN tienen preferentemente una secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12, cuya secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 1 o una proteína relacionada con BMP-12, tal y como se describe adicionalmente en esta memoria. Tanto la proteína BMP-12 como las proteínas relacionadas con BMP-12 se caracterizan por la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en el ensayo descrito en los ejemplos.

Las moléculas de ADN de la invención comprenden preferentemente una secuencia de ADN, tal y como se describe en SEQ ID NO: 1, más preferentemente los nucleótidos nº 496 hasta nº 882, nº 571 hasta nº 882 o nº 577 hasta nº 882 de la SEQ ID NO: 1; o secuencias de ADN que se hibridan con las anteriores, bajo condiciones rigurosas de hibridación, y que codifican una proteína que muestra la capacidad de formar tejido similar a tendón/ligamento. Las moléculas de ADN de la invención también pueden comprender una secuencia de ADN, tal y como se describe en SEQ ID NO: 25; más preferentemente los nucleótidos nº 604 o nº 658 de la SEQ ID NO: 25.

Las moléculas de ADN de la invención también incluyen moléculas de ADN que comprenden una secuencia de ADN que codifica una proteína relacionada con BMP-12, con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o en SEQ ID NO: 26, así como las secuencias alélicas presentes en la naturaleza y las secuencias equivalentes con codones degenerados de la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 26. Preferentemente, la secuencia de ADN de la presente invención codifica los aminoácidos nº -25 hasta nº 104, nº 1 hasta nº 104 o nº 3 hasta nº 103 de SEQ ID NO: 2; o los aminoácidos nº 1 hasta nº 120 o nº 19 hasta nº 120 de SEQ ID NO: 26. La secuencia de ADN puede comprender en la dirección 5' a 3', nucleótidos que codifican un propéptido y nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25 hasta nº 104, nº 1 hasta nº 104 o nº 3 hasta nº 103 de la SEQ ID NO: 2; o los aminoácidos nº 1 hasta nº 120 o nº 19 hasta nº 120 de la SEQ ID NO: 26. El propéptido útil en la realización anterior se selecciona preferentemente entre el grupo consistente en el propéptido de BMP-12 natural y un propéptido proteico de un miembro diferente de la superfamilia TGF-\beta o la familia BMP. La invención comprende adicionalmente secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de ADN anteriores bajo condiciones de hibridación rigurosas y que codifican una proteína relacionada con BMP-12 que muestra la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento.

En otras realizaciones, la presente invención comprende células hospedadoras y vectores que comprenden una molécula de ADN que codifica la proteína BMP-12, o una proteína relacionada con BMP-12. Las células hospedadoras y los vectores pueden comprender adicionalmente la secuencia codificadora ligada funcionalmente a una secuencia de control de la expresión para la misma.

En otra realización, la presente invención comprende un método para producir una proteína purificada relacionada con BMP-12, comprendiendo dicho método las etapas de cultivar una célula hospedadora con la molécula anterior de ADN o el vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína relacionada con BMP-12; y (b) recuperar y purificar dicha proteína relacionada con BMP-12 del medio de cultivo. En una realización preferida, el método comprende (a) cultivar una célula transformada con una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos nº 496, nº 571 o nº 577 hasta nº 879 o nº 882, tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 1; o la secuencia de nucleótidos desde el nº 604 o nº 658 hasta nº 963 de SEQ ID NO: 25 y

(b) recuperar y purificar de dicho medio de cultivo una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido nº -25, nº 1 o nº 3, hasta el aminoácido nº 103 o nº 104, tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 2; o desde el aminoácido nº 1 o nº 19 hasta el aminoácido nº 120, tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 26. La presente invención también incluye una proteína purificada producida por los métodos anteriores.

La presente invención comprende adicionalmente la proteína relacionada con BMP-12 purificada, caracterizada por la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento. Los polipéptidos relacionados con BMP-12 comprenden preferentemente una secuencia de aminoácidos tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El polipéptido comprende más preferentemente los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 hasta nº 103 o nº 104, tal y como se indica en la SEQ ID NO: 2; o los aminoácidos nº 1 o nº 19 hasta nº 120, tal y como se indica en la SEQ ID NO: 26. En una realización preferida, el polipéptido purificado puede estar en forma de un dímero que comprende dos subunidades, cada una de ellas con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

En otra realización, la presente invención comprende composiciones que comprenden una cantidad eficaz de las proteínas relacionadas con BMP-12, descritas anteriormente. En las composiciones, la proteína se puede incorporar por mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención también incluye métodos para la curación y la reparación de tejido similar a tendón/ligamento, para tratar la tendinitis u otros defectos del tendón o del ligamento, y para inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento en un paciente que lo necesite, comprendiendo administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de la composición anterior.

Otras realizaciones incluyen moléculas quiméricas de ADN que comprenden una secuencia de ADN que codifica un propéptido a partir de un miembro de la superfamilia de proteínas TGF-\beta, ligada con el marco de lectura correcto a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido relacionado con BMP-12. Otro propéptido adecuado es el propéptido de BMP-2. La invención también incluye moléculas de proteínas heterodímeras que comprenden un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos de otra proteína de la subfamilia de TGF-\beta.

Finalmente, la presente invención comprende métodos para inducir la formación de tejido similar a tendón/liga-
mento en un paciente que lo requiera, que comprenden administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de una composición que comprende una proteína que muestra la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o en SEQ ID NO: 26. Las secuencias de aminoácidos son más preferentemente una de las siguientes: (a) aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 hasta nº 103 o nº 104 de SEQ ID NO: 2; (b) aminoácidos nº 1 o nº 19 hasta nº 119 o nº 120 de SEQ ID NO: 26; (c) mutantes y/o variantes de (a) o de (b) que muestran la capacidad de formar tendón y/o ligamento. En otras realizaciones del método anterior, la proteína se codifica con una secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, más preferentemente una de las siguientes: (a) nucleótidos nº 496, nº 571 o nº 577 hasta nº 879 o nº 882 de SEQ ID NO: 1; (b) los nucleótidos nº 605 o nº 659 hasta nº 961 o nº 964 de SEQ ID NO: 25; y (c) secuencias que se hibridan con (a) bajo condiciones de hibridación rigurosas y que codifican una proteína que muestra la capacidad de formar tejido similar a tendón/ligamento.

Descripción de las Secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos que codifica la BMP-12 humana.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido maduro de BMP-12 humana.

SEQ ID NO: 3 que no forma parte de la invención, es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína MP52.

SEQ ID NO: 4 que no forma parte de la invención, es la secuencia de aminoácidos que comprende el polipéptido maduro de MP52.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de una parte específicamente amplificada de la secuencia que codifica BMP-12 humana.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótidos de una parte amplificada específicamente de la secuencia que codifica VL-1 humana.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos del plásmido pALVI-781, empleado para la expresión de BMP-12 en E. coli.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon de múrido, mV1.

SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína de múridos codificada por mV1.

SEQ ID NO: 12 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon de múridos, mV2.

SEQ ID NO: 13 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína de múridos codificada por mV2.

SEQ ID NO: 14 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento del clon de múridos, mV9.

SEQ ID NO: 15 es la secuencia de aminoácidos de un fragmento de la proteína de múridos codificada por mV9.

SEQ ID NO: 16 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso de la proteína BMP/TGF-\beta/Vg-1. El primer Xaa representa Gln o Asn; el segundo Xaa representa Val o Ile.

SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 1.

SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos de una secuencia de consenso de la proteína BMP/TGF-\beta/Vg-1. El Xaa representa Val o Leu.

SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 2.

SEQ ID NO: 20 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 3.

SEQ ID NO: 21 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 4.

SEQ ID NO: 22 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 5

SEQ ID NO: 23 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 6.

SEQ ID NO: 24 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 7.

SEQ ID NO: 25 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificadora de VL-1 (BMP-13) humana.

SEQ ID NO: 26 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 es la secuencia de nucleótidos que codifica una fusión del propéptido BMP-2 y la secuencia codificadora madura de BMP-12.

SEQ ID NO: 28 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mV1 de múridos. X01 es Val, Ala, Glu o Gly; X02 es Ser, Pro, Thr o Ala; X03 es Ser o Arg; X04 es Leu, Pro, Gln o Arg; X05 es Cys o Trp; X06 es Val, Ala, Asp o Gly; X07 es Val, Ala, Glu o Gly; X08 es Gln, Lys o Glu.

SEQ ID NO: 30 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29. X01 hasta X08 son los mismos que en SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína mV2 de múridos. X01 es Pro o Thr; X02 es Val.

SEQ ID NO: 32 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31. X01 y X02 son los mismos que en SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 es la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína BMP-12 humana.

SEQ ID NO: 34 es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 33.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido nº 8.

Breve Descripción de las Figuras

La Figura 1 es una comparación de las secuencias de BMP-12 humana y MP52 humana.

Descripción Detallada de la Invención

Las secuencias de ADN de la presente invención son útiles para producir proteínas que inducen la formación de tejido similar al tendón/ligamento, tal y como se describe más adelante. Las secuencias de ADN de la presente invención son también útiles para aislar y clonar otras secuencias de ADN que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 con actividad similar. Estas proteínas relacionadas con BMP-12 pueden ser homólogo de otras especies o pueden ser proteínas relacionadas dentro de la misma especie.

Aún otro aspecto de la invención son secuencias de ADN que codifican la expresión de una proteína inductora de tejido similar al tendón/ligamento. Dichas secuencias incluyen la secuencia de nucleótidos en dirección 5' a 3' ilustrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, cuyas secuencias de ADN son idénticas por la degeneración del código genético, a la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 o 25 y codifican la proteína de SEQ ID NO: 2 o 26. Adicionalmente se incluyen en la presente invención las secuencias de ADN que se hibridan bajo condiciones rigurosas, con la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 o 25 y que codifican una proteína que tiene la capacidad de inducir la formación de tendón o de ligamento. Las secuencias de ADN preferidas incluyen las que se hibridan bajo condiciones rigurosas, tal y como describen Maniatis y col, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389. Finalmente, variaciones alélicas u otras variaciones de las secuencias de SEQ ID NO: 1 o 25, independientemente de si tales cambios de nucleótidos dan como resultado cambios en la secuencia de péptidos o no, pero en donde la secuencia peptídica todavía tiene actividad inductora de tejido similar al tendón/ligamento, también están incluidas en la presente invención.

Las secuencia de ADN de BMP-12 humana (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) se anticipan en la Lista de Secuencias. Otra proteína que es útil para las composiciones y los métodos de la presente invención es VL-1. VL-1 es una proteína relacionada con BMP-12 que se clonó empleando secuencias de BMP-12. Los inventores han denominado ahora a VL-1, BMP-13. Una secuencia parcial de ADN de VL-1 (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 8); así como una secuencia de ADN que codifica la VL-1 madura (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de aminoácidos codificada (SEQ ID NO: 26) se muestran en la Lista de Secuencias. Aunque se hacen unas descripciones adicionales en relación con la secuencia de BMP-12 de SEQ ID NO: 1 y 2, se admitirá que la invención incluye modificaciones similares y mejoras que se pueden realizar en otras secuencias relacionadas con BMP-12, tal como la secuencia de VL-1 mostrada en SEQ ID NO: 25 y 26.

La secuencia de BMP-12 mostrada en SEQ ID NO: 1 incluye la secuencia madura completa del propéptido de aproximadamente 190 aminoácidos. La secuencia codificadora de la proteína BMP-12 madura y humana parece que comienza en el nucleótido nº 496 o nº 571 y que continúa hasta el nucleótido nº 882 de SEQ ID NO: 1. La primera cisteína en la estructura de siete cisteínas, característica de las proteínas TGF-\beta, comienza en el nucleótido nº 577. La última cisteína termina en el nº 879. Por tanto, se espera que las secuencias de ADN que codifican las especies activas de BMP-12 comprendan los nucleótidos nº 577 a nº 879 de SEQ ID NO: 1.

Se espera que BMP-12, tal y como se expresa en células de mamífero tales como células CHO, exista en forma de población heterogénea de especies activas de la proteína BMP-12 con extremos N-terminales variados. Se espera que todas las especies activas contengan la secuencia de aminoácidos que comienza con el residuo de cisteína en el aminoácido nº 3 de SEQ ID NO: 2 y que continúa hasta al menos el residuo de cisteína en el aminoácido 103 o hasta el codón de detención después del aminoácido 104. Otras especies activas contienen una secuencia de aminoácidos adicional, en dirección N-terminal. Tal y como se describe adicionalmente en esta memoria, los extremos N-terminales de las especies activas producidas por células de mamífero, se espera que comiencen después de la presencia de un sitio de corte de consenso, que codifica una secuencia peptídica Arg-X-X-Arg. Por consiguiente, se espera que las secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-12 activas tengan una secuencia de nucleótidos que comprenda la secuencia de nucleótidos que comienza en cualquiera de los nucleótidos nº 196, 199, 208, 217, 361, 388, 493, 496 o 571 hasta el nucleótido nº 879 o 882 de SEQ ID NO: 1.

El extremo N-terminal de una especie activa de BMP-12 humana se ha determinado experimentalmente por la expresión en E. coli, de modo que es el siguiente: [M]SRXSRKPLHVDF, en donde X designa un residuo de aminoácido con una señal que no está clara que sea compatible con un residuo de cisteína en esa posición. Por tanto, parece que el extremo N-terminal de esta especie de BMP-12 está en el aminoácido nº 1 de SEQ ID NO: 1, y una secuencia de ADN que codifica dicha especie de BMP-12 comenzaría en el nucleótido nº 571 de SEQ ID NO: 1. El peso molecular aparente de esta especie de dímero de BMP-12 humana se determinó por SDS-PAGE que era aproximadamente 20-22 kd en un gel Novex con tricina al 16%. La proteína BMP-12 humana existe como una solución clara, incolora en ácido trifluoroacético al 0,1%.

Tal y como se ha descrito anteriormente, las proteínas relacionadas con BMP-12 son un subgrupo de la familia de proteínas BMP/TGF-\beta/Vg-1 que incluyen BMP-12 y VL-1, que se pueden definir como proteínas inductoras de tejido similar al tendón/ligamento, codificadas por secuencias de ADN que se pueden clonar e identificar, p. ej., empleando PCR, empleando cebadores específicos de BMP-12, tales como los cebadores nº 6 y nº 7 descritos a continuación, con condiciones menos rigurosas. Se prefiere que las secuencias de ADN de la presente invención compartan al menos aproximadamente 80% de homología a nivel de aminoácidos con el ADN que codifica los aminoácidos nº 3 al nº 103 de SEQ ID NO: 1. Para los fines de la presente invención, la expresión "proteínas relacionadas con BMP-12" no incluye la proteína humana MP52. Empleando la información de la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la comparación proporcionada en la Figura 1, está dentro de la técnica diseñar los cebadores para la secuencia BMP-12, lo que permitirá la clonación de los genes que codifican proteínas relacionadas con BMP-12.

Un ejemplo de las proteínas relacionadas con BMP-12 de la presente invención es VL-1, denominada actualmente BMP-13. La secuencia de la secuencia BMP-13 completa madura y al menos una parte del propéptido de BMP-13 se proporciona en SEQ ID NO: 25. Del mismo modo que BMP-12, se espera que BMP-13, tal y como se expresa en las células de mamífero tales como células CHO, exista como una población heterogénea de especies activas de la proteína BMP-13, con extremos N-terminales variados. Se espera que todas las especies activas contengan la secuencia de aminoácidos que comienza con el residuo de cisteína en el aminoácido nº 19 de SEQ ID NO: 26 y continúe hasta al menos el residuo de cisteína en el aminoácido 119 o hasta el codón de detención, después del aminoácido 120. Otras especies activas contienen la secuencia de aminoácidos adicional en la dirección N-terminal. Tal y como se describe adicionalmente en esta memoria, se espera que los extremos N-terminales de las especies activas producidas por células de mamífero, comiencen después de la presencia de un sitio de corte de consenso, que codifica una secuencia peptídica Arg-X-X-Arg. Por tanto, se espera que las secuencias de ADN que codifican las proteínas BMP-13 activas tengan una secuencia de nucleótidos que comprenda la secuencia de nucleótidos que comienza en cualquiera de los nucleótidos nº 410, 458, 602, 605 o 659, hasta los nucleótidos nº 961 o 964 de SEQ ID NO: 25.

Para producir las proteínas inductoras purificadas de tejido similar a tendón/ligamento, útiles para la presente invención, se emplea un método que comprende cultivar una célula hospedadora transformada con una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificadora adecuada, particularmente la secuencia codificadora de ADN desde el nucleótido nº 496, nº 571 o nº 577 hasta el nº 879 o nº 882 de SEQ ID NO: 1; y recuperar y purificar desde el medio de cultivo una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos o una secuencia sustancialmente homóloga, tal y como se representa por los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 hasta el nº 103 o nº 104 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, el método empleado comprende cultivar una célula hospedadora transformada con una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificadora adecuada, particularmente la secuencia codificadora de ADN desde el nucleótido nº 605 o nº 659 hasta nº 961 o nº 964 de SEQ ID NO: 25; y recuperar y purificar del medio de cultivo una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos o una secuencia sustancialmente homóloga, tal y como se representa por los aminoácidos nº 1 o nº 19 hasta nº 119 o nº 120 de SEQ ID NO: 26.

El ADN humano de MP52 se describe en el documento WO 93/16099. La MP52 humana se aisló originalmente empleando ARN procedente de tejido embrionario humano. La secuencia de nucleótidos de MP52 humana (SEQ ID NO:3) y las secuencias de aminoácidos codificados (SEQ ID NO: 4) se muestran en la Lista de Secuencias en esta memoria, sin embargo, no forman parte de la invención. La proteína MP52 parece comenzar en el nucleótido nº 845 de SEQ ID NO: 3 y continúa hasta el nucleótido nº 1024 de SEQ ID NO: 3. La primera cisteína de la estructura de siete cisteínas, característica de las proteínas TGF-\beta, comienza en el nucleótido nº 899. La última cisteína termina en el nº 1201. Otras especies activas de la proteína MP52 pueden tener nucleótidos adicionales en la dirección N-terminal desde el nucleótido nº 845 de SEQ ID NO: 3.

Para la expresión de la proteína en células hospedadoras de mamífero, la célula hospedadora se transforma con una secuencia codificadora que codifica un propéptido adecuado para la secreción de proteínas en la célula hospedadora que está ligada con marco de lectura adecuado, a la secuencia codificadora de la proteína madura. Por ejemplo, véase la patente de Estados Unidos 5.168.050, en la que un ADN que codifica una parte precursora de una proteína de mamífero distinta de BMP-2, se fusiona con el ADN que codifica una proteína BMP-2 madura. Por tanto, la presente invención incluye moléculas de ADN quimérico que comprenden una secuencia de ADN que codifica un propéptido procedente de un miembro de la superfamilia de proteínas de TGF-\beta, que está ligado con el marco de lectura correcto, a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que induce el tejido similar al tendón/ligamento. El término "quimérico" se emplea para indicar que el propéptido se origina a partir de un polipéptido diferente que el polipéptido codificado maduro. Por supuesto, la célula hospedadora se puede transformar con una secuencia de ADN que codifica una secuencia que codifica el propéptido natural ligado con el marco de lectura correcto a una secuencia codificadora que codifica la proteína madura mostrada en SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 26. La secuencia completa del propéptido natural se puede determinar a través de métodos conocidos en la técnica, empleando las secuencias descritas en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 25, para diseñar una sonda adecuada para identificar y aislar el clon completo.

La presente invención también comprende las nuevas secuencias de ADN, sin asociación con secuencias de ADN que codifican otros materiales proteináceos y que codifican la expresión de proteínas que inducen el tejido similar a tendón/ligamento. Estas secuencias de ADN incluyen las descritas en SEQ ID NO: 1 en dirección 5' a 3’ y las secuencias que se hibridan con ellas, bajo condiciones de hibridación rigurosas [por ejemplo, 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC; véase, T. Maniatis y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] y que codifican una proteína que tiene actividad inductora de tejido similar a tendón/ligamento.

De forma similar, las secuencias de ADN que codifican proteínas codificadas por las secuencias de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, o las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 26, pero que difieren en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético o a variaciones alélicas (cambios de bases presentes en la naturaleza en la población de la especie que puede dar como resultado o no, un cambio de aminoácido) también codifican las proteínas que inducen el tejido similar al tendón/ligamento, descritas en esta memoria. La variaciones en las secuencias de ADN de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25 que están provocadas por mutaciones puntuales o por modificaciones inducidas (que incluyen la inserción, la deleción y la sustitución) para mejorar la actividad, la semivida o la producción de los polipéptidos codificados, también están incluidas en la invención.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un nuevo método para producir proteínas que inducen el tejido similar al tendón/ligamento. El método de la presente invención implica cultivar una línea celular adecuada que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica una proteína de la invención, bajo el control de secuencias reguladoras conocidas. Las células hospedadoras transformadas se cultivan y las proteínas se recuperan y se purifican a partir del medio de cultivo. Las proteínas purificadas están sustancialmente exentas de otras proteínas con las que se hayan producido conjuntamente, así como de otros contaminantes.

Las células o las líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). Tal y como se ha descrito anteriormente, la expresión proteica en células de mamífero, requiere un propéptido adecuado para asegurar la secreción de la proteína. La selección de las células hospedadoras de mamífero adecuadas y los métodos para la transformación, el cultivo, la amplificación, el escrutinio, la producción y la purificación del producto son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Gething y Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) o alternativamente, Kaufman y col., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) o Howley y col., documento de patente de EE.UU. 4.419.446. Otra línea celular de mamífero adecuada que se describe en los ejemplos acompañantes, es la línea celular de mono COS-1. La célula de mamífero CV-1 también puede ser adecuada.

Las células bacterianas también pueden ser hospedadoras adecuadas. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli (p. ej., HB101, MC1061) son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas u otros bacilos y similares, también se pueden emplear en este método. Para la expresión de la proteína en células bacterianas, no es necesario el ADN que codifica un propéptido.

La expresión bacteriana de las proteínas de mamífero que incluyen los miembros de la familia de TGF-\beta, es conocida por producir las proteínas de forma no glicosilada y en forma de sedimentos insolubles, conocidos como cuerpos de inclusión. Se han descrito técnicas para solubilizar estos cuerpos de inclusión, desnaturalizando la proteína empleando un agente caotrópico y renaturalizando la proteína de forma lo suficientemente correcta, para permitir su producción en forma soluble. Por ejemplo, véase el documento EP 0433225.

Alternativamente, se han ideado métodos que evitan la formación de cuerpos de inclusión, tales como la expresión de proteínas de fusión génica, en donde la proteína deseada se expresa como una proteína de fusión con una pareja para la fusión. La proteína de fusión se escinde posteriormente para producir la proteína deseada. Un ejemplo de un sistema de expresión tal de un gen de fusión para E. coli, se basa en el uso del gen de la tiorredoxina de E. coli como la pareja de fusión, LaVallie y col., Bio/Technology, 11:187-193 (1993).

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica, también pueden ser adecuadas como células hospedadoras para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Adicionalmente, si se desea, se pueden utilizar células de insecto como células hospedadoras en el método de la presente invención. Véase, p. ej., Miller y col., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press 1986).

Otro aspecto de la presente invención, proporciona vectores para emplear en el método de expresión de estas proteínas inductoras de tejido similar a tendón/ligamento. Preferentemente, los vectores contienen las nuevas secuencias de ADN completas, descritas anteriormente, que codifican los nuevos factores de la invención. Adicionalmente, los vectores contienen secuencias de control de la expresión adecuadas que permiten la expresión de las secuencias de la proteína. Alternativamente, los vectores que incorporan secuencias modificadas, tal y como se han descrito anteriormente, también son realizaciones de la presente invención. Adicionalmente, la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25 se podría manipular para expresar una proteína madura, delecionando secuencias del propéptido y reemplazándolas por secuencias que codifican los propéptidos completos de las proteínas BMP o miembros de la superfamilia de TGF-\beta. Por tanto, la presente invención incluye moléculas de ADN quiméricas que codifican un propéptido procedente de un miembro de la superfamilia de TGF-\beta, ligado con el marco de lectura correcto, a una secuencia de ADN que codifica un proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO: 26. Los vectores se pueden emplear en el método para transformar líneas celulares y contienen secuencias reguladoras seleccionadas ligadas funcionalmente a las secuencias codificadoras de ADN de la invención que son capaces de dirigir la replicación y la expresión de las mismas en las células hospedadoras seleccionadas. Las secuencias reguladoras para tales vectores son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden seleccionar dependiendo de las células hospedadoras. Dicha selección es rutinaria y no forma parte de la presente invención.

Una proteína de la presente invención que induce la formación de tejido similar a tendón/ligamento u otra formación de tejido, en circunstancias en las que dicho tejido no se forma normalmente, encuentra aplicación en la curación de desgarros del tendón o ligamento, deformidades y otros defectos del tendón o del ligamento en seres humanos y otros animales. Una preparación tal que emplea una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento puede tener un uso profiláctico para evitar la lesión del tejido del tendón o del ligamento, así como un uso en la fijación mejorada del tendón o del ligamento al hueso o a otros tejidos y para la reparación de defectos en el tejido del tendón o del ligamento. La formación de nuevo de tejido similar al tendón/ligamento, inducida por una composición de la presente invención, contribuye a la reparación de defectos congénitos, inducidos por traumas u otros defectos del tendón o del ligamento con otro origen y también es útil en la cirugía plástica cosmética para fijar o en la reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento de tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros defectos del tendón o del ligamento. Las composiciones de la presente invención también se pueden utilizar en otras indicaciones en las que es deseable curar o regenerar el tejido del tendón y/o del ligamento. Tales indicaciones incluyen, sin limitación, la regeneración o la reparación de lesiones del ligamento periodontal, tal y como ocurre con la tendinitis y la regeneración o reparación de la fijación del tendón al hueso. Las composiciones de la presente invención pueden proporcionar un medio para atraer células formadoras de tendón o de ligamento, estimular el crecimiento de las células formadoras de tendón o ligamento o inducir la diferenciación de células progenitoras de las células formadoras de tendón o de ligamento.

Las proteínas relacionadas con BMP-12 se pueden recuperar del medio de cultivo y purificar aislándolas de otros materiales proteináceos, a partir de los cuales se han producido conjuntamente y de otros contaminantes presentes. Las proteínas de la presente invención son capaces de inducir la formación de tejido similar al tendón/ligamento. Estas proteínas se pueden caracterizar adicionalmente por su capacidad de mostrar la actividad formadora de tejido similar al tendón/ligamento en el ensayo de implante ectópico en ratas, descrito a continuación. Se contempla que estas proteínas pueden tener la capacidad de inducir la formación de otros tipos de tejido, tal como también los ligamentos.

Las proteínas inductoras del tejido similar al tendón/ligamento proporcionadas en esta memoria también incluyen factores codificados por las secuencias, similares a las de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, pero en las que las modificaciones son de origen natural (p. ej., variaciones alélicas en la secuencia de nucleótidos que pueden dar como resultado cambios de aminoácidos en el polipéptido) o deliberadamente por ingeniería genética. Por ejemplo, los polipéptidos sintéticos se pueden duplicar total o parcialmente secuencias continuas de los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Estas secuencias, por el hecho de compartir las características estructurales y conformacionales primarias, secundarias o terciarias, con los polipéptidos del factor de crecimiento de tejido similar a tendón/ligamento de SEQ ID NO: 2, pueden poseer propiedades biológicas de factores de crecimiento de tejidos del tejido similar al tendón/ligamento u otros tejidos, en común con los mismos. Por tanto, se pueden emplear como sustitutos biológicamente activos para los polipéptidos presentes en la naturaleza que inducen el tejido similar al tendón/ligamento, en composiciones y en procedimientos terapéuticos.

Otras mutaciones específicas de las secuencias de proteínas inductoras del tejido similar al tendón/ligamento descritas en esta memoria, implican modificaciones de los sitios de glicosilación. Estas modificaciones pueden implicar sitios de glicosilación ligados a O o ligados a N. Por ejemplo, la ausencia de glicosilación o sólo una glicosilación parcial es el resultado de la sustitución o de la deleción de aminoácidos de los sitios de reconocimiento para la glicosilación ligada a asparagina. Los sitios de reconocimiento para la glicosilación ligados a asparagina comprenden secuencias de tripéptidos que son reconocidas específicamente por las enzimas adecuadas para la glicosilación celular. Estas secuencias de tripéptidos pueden ser asparagina-X-treonina, asparagina-X-serina o asparagina-X-cisteína, en donde X es generalmente cualquier aminoácido, excepto la prolina. Una variedad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o en ambas de las posiciones primera o tercera del aminoácido, en un sitio de reconocimiento para glicosilación (y/o deleción del aminoácido en la segunda posición) da como resultado la falta de glicosilación en la secuencia modificada del tripéptido. Adicionalmente, la expresión bacteriana de proteínas también dará como resultado la producción de una proteína no glicosilada, incluso si los sitios de glicosilación se dejan sin modificar.

Las composiciones de la presente invención comprenden una proteína relacionada con BMP-12 purificada, que se puede producir cultivando una célula transformada con la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25 y recuperando y purificando la proteína que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 26 a partir del medio de cultivo. La proteína expresada purificada está sustancialmente exenta de otros materiales proteináceos junto con los que se ha producido, así como de otros contaminantes. La proteína purificada recuperada se considera que muestra actividad formadora de tejido similar al tendón/ligamento y actividad de crecimiento de otro tejido, tal como la regeneración de ligamentos. Las proteínas de la invención se pueden caracterizar adicionalmente por la capacidad para mostrar actividad formadora de tejido similar al tendón/ligamento en el ensayo con ratas, descrito a continuación.

Las composiciones para inducir la formación de tejido similar al tendón/ligamento de la presente invención pueden comprender una cantidad eficaz de una proteína inductora del tejido similar al tendón/ligamento, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, preferentemente los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 a nº 103 o nº 104 de SEQ ID NO: 2; o los aminoácidos nº 1 o nº 19 hasta nº 120 de SEQ ID NO: 26; así como mutantes y/o variantes de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 26, que muestren la capacidad de formar tejido similar al tendón y/o ligamento.

Las composiciones de la presente invención pueden comprender también proteínas adicionales, tales como miembros adicionales de la superfamilia de proteínas TGF-\beta, tales como las activinas. Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína inductora del tendón/ligamento, tal como BMP-12 o VL-1 en un vehículo o soporte farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden utilizar para inducir la formación de tejido similar al tendón/ligamento u otro tejido. Se contempla que tales composiciones también se pueden utilizar para la reparación de tendones y ligamentos, curación de heridas y otra reparación de tejidos, tales como reparación de la piel. También se contempla que las proteínas de la invención pueden incrementar la supervivencia neuronal y, por tanto, ser útiles en trasplantes y en el tratamiento de estados que muestran una disminución de la supervivencia neuronal. Las composiciones de la invención pueden incluir adicionalmente al menos otro agente terapéuticamente útil, tal como las proteínas BMP, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, descritas por ejemplo en los documentos de patentes de los EE.UU. 5.108.922; 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; y 5.141.905; BMP-8, descrita en el documento de publicación de la PCT WO 91/18098; BMP-9, descrita en el documento de publicación de la PCT WO 93/00432; y BMP-10 o BMP-11, descritas en los documentos de las solicitudes de patentes en tramitación, número de serie 08/061.695 y 08/061.464, presentadas el 12 de mayo de 1993.

Las composiciones de la invención pueden comprender, además de una proteína inductora del tendón/ligamento, tal como BMP-12 o VL-1 (BMP-13), otros agentes terapéuticamente útiles que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), los factores de crecimiento transformante (TGF-\alpha y TGF-\beta) y el factor 4 de crecimiento de fibroblastos (FGF-4), la hormona paratiroidea (PTH), el factor inhibidor de la leucemia (LIF/HILDA/DIA), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF-I e IGF-II). También se pueden utilizar partes de estos agentes en composiciones de la presente invención. Por ejemplo, una composición que comprende BMP-2 y BMP-12 implantados juntos, produce un aumento tanto del tejido óseo como del tejido similar a tendón/ligamento. Una composición tal, puede ser útil para tratar defectos en las articulaciones embrionarias en donde el tendón, los ligamentos y el hueso se forman simultáneamente en posiciones anatómicamente contiguas y puede ser útil para regenerar tejido en el sitio en el que el tendón se fija al hueso. Se contempla que las composiciones de la invención también se pueden utilizar en la curación de heridas, tal como curación de la piel y en la reparación de tejidos relacionados. Los tipos de heridas incluyen, sin estar limitados a los mismos, las quemaduras, las incisiones y las úlceras. (Véase, p. ej., el documento de publicación PCT WO 84/01106 para la exposición de la curación de heridas y la reparación de tejidos relacionados).

Se espera que las proteínas de la invención puedan actuar junto, o quizá sinérgicamente, con otras proteínas relacionadas y factores de crecimiento. Otros métodos y composiciones terapéuticas de la invención comprenden, por tanto, una cantidad terapéutica de al menos una proteína de la invención con una cantidad terapéutica de al menos una de las proteínas BMP descritas anteriormente. Tales composiciones pueden comprender moléculas separadas de las proteínas BMP o heteromoléculas que comprenden diferentes restos de BMP. Por ejemplo, un método y una composición de la invención pueden comprender un dímero ligado a disulfuro que comprende una subunidad de proteína relacionada con BMP-12 y una subunidad de una de las proteínas "BMP" descritas anteriormente. Por ello, la presente invención incluye composiciones que comprenden un polipéptido purificado relacionado con BMP-12 que es un heterodímero en el que una subunidad comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácidos nº 1 hasta el aminoácido nº 104 de la SEQ ID NO: 2 y una subunidad comprende una secuencia de aminoácidos para una proteína morfogenética ósea, seleccionada entre el grupo que consiste en BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10 y BMP-11. Una realización adicional puede comprender un heterodímero de restos que inducen tejido similar a tendón/ligamento ligado a disulfuro, tal como BMP-12, VL-1 (BMP-13). Por ejemplo, el heterodímero puede comprender una subunidad que comprende una secuencia de aminoácidos desde el nº 1 hasta el nº 104 de SEQ ID NO: 2 y la otra subunidad puede comprender una secuencia de aminoácidos desde el nº 1 hasta el nº 120 de SEQ ID NO: 26. Además, las composiciones de la presente invención se pueden combinar con otros agentes beneficiosos para el tratamiento del defecto, la herida o el tejido en cuestión.

La preparación y la formulación de tales composiciones proteicas fisiológicamente aceptables, teniendo el debido cuidado con el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro del estado de la técnica. Las composiciones terapéuticas también son valiosas para aplicaciones veterinarias debido a la falta de especificidad de especie en las proteínas TGF-\beta. En particular, los animales domésticos y los caballos pura sangre, además de los seres humanos, son pacientes que requieren dicho tratamiento con las composiciones de la presente invención.

El método terapéutico incluye administrar la composición por vía tópica, sistémica o local, en forma de implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para uso en esta invención está por supuesto en forma fisiológicamente aceptable exenta de pirógenos. Además, la composición se puede encapsular o inyectar de forma deseable en forma viscosa para la entrega en el sitio de lesión del tejido. La administración por vía tópica puede ser adecuada para la curación de heridas y la reparación tisular. Agentes terapéuticamente útiles distintos de las proteínas que también se pueden incluir opcionalmente en la composición, tal y como se ha descrito anteriormente, se pueden administrar alternativa o adicionalmente de forma simultánea o secuencial a la composición en los métodos de la invención.

Las composiciones pueden incluir también una matriz y/o un agente secuestrante adecuados como vehículo. Por ejemplo, la matriz puede sostener la composición o proporcionar una superficie para la formación de tejido similar al tendón/ligamento y/o otra formación de tejido. La matriz puede proporcionar una liberación lenta de la proteína y/o el medio adecuado para su presentación. El agente secuestrante puede ser una sustancia que ayuda para facilitar la administración a través de la inyección u otros medios o puede retardar la migración de la proteína desde el sitio de aplicación.

La elección de un material de soporte se base en la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, las propiedades mecánicas, la apariencia cosmética y las propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación adecuada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y definidas químicamente. Otras matrices comprenden proteínas puras o componentes extracerlulares de la matriz. Otras matrices potenciales están definidas de modo no biodegradable y de forma química. Las matrices preferidas incluyen materiales basados en colágeno, tales como la esponja Helistat® (Integra LifeSciences, Plainsboro, N.J.) o colágeno de forma inyectable, así como agentes secuestrantes que también pueden ser biodegradables y que pueden incluir materiales alquil-celulósicos.

Otra clase preferida de vehículo son las matrices polímeras, porosas y en forma de partículas que incluyen polímeros de poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico. Estas matrices también pueden incluir un agente secuestrante. Las matrices polímeras adecuadas se describen, por ejemplo, en el documento WO 93/00050.

Una familia preferida de agentes secuestrantes son los materiales celulósicos, tales como alquilcelulosas (que incluyen las hidroxialquilcelulosas), que incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo los más preferidos las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC). Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen ácido hialurónico, alginato sódico, polietilenglicol, poli(óxido de etileno), polímero de carboxivinilo y poli(alcohol vinílico). La cantidad de agente secuestrante útil en esta memoria es 0,5-20% en peso, preferentemente 1-10% en peso, basado en el peso total de la formulación que representa la cantidad necesaria para evitar la desorción de la proteína de la matriz polímera y para proporcionar un manejo adecuado de la composición, no tanto que las células progenitoras no puedan infiltrar la matriz, proporcionando de este modo a la proteína la oportunidad de ayudar en la actividad de las células progenitoras. Otros componentes opcionales útiles en la práctica de la solicitud objeto, incluyen, p. ej., protectores criogénicos tales como manitol, sacarosa, lactosa, glucosa o glicina (para proteger la proteína de la degradación durante la liofilización), conservantes antimicrobianos tales como metil-paraben y propil-paraben y alcohol bencílico; antioxidantes tales como EDTA, citrato y BHT (hidroxitolueno butilado); y tensioactivos tales como poli(sorbatos) y poli(oxietilenos); etc.

La invención describe adicionalmente métodos para tratar una cantidad de defectos de los tendones, tales como la regeneración de tejido similar a tendón/ligamento en zonas de lesión del tendón o del ligamento, para ayudar en la reparación de desgarros de tejido del tendón, ligamentos y otros tipos diversos de defectos tisulares o heridas. Estos métodos, de acuerdo con la invención, implican administrar a un paciente que lo necesite dicha reparación del tejido similar a tendón/ligamento u otro tejido, una composición que comprende una cantidad eficaz de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento, tal y como la descrita en la SEQ lD NO: 2 y/o SEQ ID NO: 26. Estos métodos pueden implicar también la administración de una proteína que induce el tejido similar a tendón/ligamento junto con a menos una de las proteínas BMP descritas anteriormente.

Los métodos descritos pueden implicar la administración de una proteína heterodímera en la que uno de los monómeros es un polipéptido que induce el tejido similar a tendón/ligamento, tal como BMP-12 o VL-1 (BMP-13) y el segundo monómero es un miembro de la superfamilia de TGF-\beta de factores de crecimiento. Además, estos métodos pueden incluir también la administración de una proteína inductora de tejido similar a tendón/ligamento con otros factores de crecimiento que incluyen EGF, FGF, TGF-\alpha, TGF-\beta e IGF.

La invención también describe un método y una composición terapéuticos para la reparación de tejido similar al tendón/ligamento, para reparar tendón o ligamento así como para tratar la tendinitis y otros estados relacionados con defectos en el tendón o en el ligamento. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o de varias proteínas inductoras de tejido similar al tendón/ligamento, tales como BMP-12, una proteína relacionada con BMP-12, incorporadas por mezcla con un vehículo, un soporte o una matriz farmacéuticamente aceptable.

El régimen de dosificación lo determinará el médico responsable, considerando varios factores que modifican la acción de la composición, p. ej., la cantidad de tejido de tendón o de ligamento que se desea formar, el sitio de la lesión del tendón o del ligamento, el estado del tendón o del ligamento dañado, el tamaño de la herida, el tipo de tejido dañado, la edad del paciente, el sexo y la dieta, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosificación puede variar con el tipo de matriz empleada en la reconstitución y los tipos de proteínas adicionales en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF-I (factor de crecimiento I similar a insulina), a la composición final puede afectar también la dosificación.

El progreso se puede vigilar por determinación periódica de la formación de tejido similar a tendón/ligamento, o el crecimiento del tendón o del ligamento y/o la reparación. El progreso se puede vigilar por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, rayos X, artroscopia, determinaciones histomorfométricas y marcación con tetraciclina.

Los siguientes ejemplos ilustran la puesta en práctica de la presente invención para recuperar y caracterizar la proteína que induce la formación de tejido humano similar a tendón/ligamento y el empleo de la misma para recuperar las otras proteínas que inducen la formación de tejido similar al tendón/ligamento, obtener las proteínas humanas, expresar las proteínas mediante técnicas recombinantes y mostrar la capacidad de las composiciones de la presente invención para formar tejido similar a tendón/ligamento en un modelo in vivo. Aunque los ejemplos muestran la invención en relación con BMP-12, con unas modificaciones mínimas dentro de la técnica, se podrían obtener los mismos resultados con VL-1.

Ejemplo 1 Aislamiento de ADN

Las secuencias de ADN que codifican BMP-12 y las proteínas relacionadas con BMP-12 se pueden aislar mediante diversas técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Tal y como se describe más abajo, los cebadores de oligonucleótidos se pueden diseñar basándose en secuencias de aminoácidos presentes en otras proteínas BMP, proteínas relacionadas con Vg-1 y otras proteínas de la superfamilia TGF-\beta. Las regiones que contienen las secuencias de aminoácidos que están altamente conservadas en la familia de proteínas BMP y en otros miembros de la superfamilia de proteínas TGF-\beta, se pueden identificar y se pueden construir secuencias de aminoácidos de consenso de estas regiones altamente conservadas, basándose en la similitud de las regiones correspondientes de las proteínas individuales BMP/TGF-\beta/Vg-1. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos de consenso tal, se indica a continuación.

Secuencia de aminoácidos de consenso (1):

: Trp-Gln/Asn-Asp-Trp-Ile-Val/Ile-Ala (SEQ ID NO: 16)

En donde X/Y indica que cualquier residuo de aminoácido puede aparecer en esa posición.

El siguiente oligonucleótido se diseña basándose en la secuencia de aminoácidos de consenso, identificada más arriba (1):

: nº 1: CGGATCCTGGVANGAYTGGATHRTNGC (SEQ ID NO: 17)

Esta secuencia de oligonucleótidos se sintetiza en un sintetizador automático de ADN. Los símbolos convencionales de los nucleótidos en el cebador de oligonucleótidos identificado más arriba, son los siguientes: A, adenosina; C, citosina; G, guanina; T, timina; N, adenosina o citosina o guanina o timina; R, adenosina o citosina; Y, citosina o timina; H, adenosina o citosina o timina; V, adenosina o citosina o guanina; D, adenosina o guanina o timina.

Los siete primeros nucleótidos del oligonucleótido nº 1 (subrayados) contienen la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI, para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 y, por tanto, no se derivan de la secuencia de aminoácidos de consenso (1), presentada anteriormente.

Una segunda secuencia de aminoácidos de consenso se deriva de otra región altamente conservada de las proteínas BMP/TGF-\beta/Vg-1, tal y como se describe a continuación:

: His-Ala-Ile-Val/Leu-Gln-Thr (SEQ ID NO: 18)

El siguiente oligonucleótido se diseña basándose en la secuencia de aminoácidos de consenso identificada arriba (2):

: nº 2: TTTCTAGAARNGTYTGNACDATNGCRTG (SEQ ID NO: 19)

Esta secuencia de oligonucleótidos se sintetiza en un sintetizador automático de ADN. Se emplean los mismos símbolos de nucleótidos que los que se han descrito anteriormente.

Los siete primeros nucleótidos del oligonucleótido nº 1 (subrayados) contienen la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción XbaI, para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica la proteína BMP-12 y, por tanto, no se derivan de la secuencia de aminoácidos de consenso (2), presentada anteriormente.

Se contempla que la proteína BMP-12 de la invención y otras proteínas relacionadas con BMP/TGF-\beta/Vg-1 pueden contener secuencias de aminoácidos similares a las de las secuencias de aminoácidos de consenso descritas anteriormente y que la posición de estas secuencias dentro de una proteína BMP-12 u otras nuevas proteínas relacionadas, se correspondería con las posiciones relativas en las proteínas a partir de las cuales se han obtenido. Se contempla adicionalmente que esta información sobre la posición, obtenida a partir de la estructura de otras proteínas BMP/TGF-\beta/Vg-1 y las secuencias de oligonucleótidos nº 1 y nº 2 que se han obtenido a partir de las secuencias de aminoácidos de consenso (1) y (2), respectivamente, se podría utilizar para amplificar específicamente las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos correspondientes de una proteína BMP-12 u otras proteínas relacionadas con BMP/TGF-\beta/Vg-1.

Basándose en el conocimiento de las estructuras génicas de las proteínas BMP/TGF-\beta/Vg-1, se contempla adicionalmente que el ADN genómico humano se puede utilizar como un molde para realizar reacciones de amplificación específicas que darían como resultado la identificación de las secuencias que codifican BMP-12, BMP/TGF-\beta/Vg-1 (proteína relacionada con BMP-12). Tales reacciones de amplificación específicas de un molde de ADN genómico y humano, se podrían iniciar con el uso de cebadores de oligonucleótidos nº 1 y nº 2, descritos anteriormente. Los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 identificados anteriormente, se utilizan como cebadores para permitir la amplificación específica de una secuencia de nucleótidos específica procedente de ADN humano y genómico. La reacción de amplificación se realiza del modo siguiente:

El ADN genómico y humano (fuente: linfocitos de sangre periférica), proporcionado por Ken Jacobs of Genetics Institute, se cortó mediante pases repetidos a través de una aguja de calibre 25, se desnaturalizó a 100ºC durante 5 minutos y a continuación se enfrió sobre hielo antes de añadirlo a una mezcla de reacción que contenía 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,001% de gelatina, 1,25 unidades de ADN-polimerasa Taq, oligonucleótido nº 1 100 pM y oligonucleótido nº 2 100 pM. Esta mezcla de reacción se incuba a 94ºC durante dos minutos y a continuación se somete a ciclos térmicos del modo siguiente: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 40ºC, 1 minuto a 72ºC durante tres ciclos; a continuación 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 1 minuto a 72ºC durante treinta y siete ciclos, seguido de una incubación de 10 minutos
a 72ºC.

El ADN que se amplifica específicamente con esta reacción, se precipita con etanol, se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI y se somete a electroforesis en gel de agarosa. Una región del gel, que se corresponde con el tamaño previsto de BMP-12 u otro fragmento de ADN que codifica BMP/TGF-\beta/Vg-1, se escinde y los fragmentos de ADN amplificados específicamente contenidos en la misma se electroeluyen y se subclonan en el vector plasmídico pGEM-3, entre los sitios XbaI y BamHI del polienlazador. El análisis de la secuencia de ADN de uno de los subclones relacionados con BMP-12, indica que el producto de la secuencia de ADN amplificada específicamente en el mismo, codifica una parte de la proteína BMP-12 de la invención.

La secuencia de ADN (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 6) de este fragmento de ADN de BMP-12 amplificado específicamente, se muestran en la Lista de Secuencias.

Los nucleótidos nº 1 - nº 26 de SEQ ID NO: 5 comprenden una parte del oligonucleótido nº 1 y los nucleótidos nº 103 - nº 128 comprenden una parte de la hebra complementaria inversa del oligonucleótido nº 2, utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 para iniciar la reacción de amplificación, no se pueden corresponder exactamente con la secuencia real que codifica una proteína BMP-12 y por ello no se traducen en la derivación correspondiente de aminoácidos (SEQ ID NO: 6).

El análisis de la secuencia de ADN de otro subclon indica que el producto de ADN amplificado específicamente contenido en el mismo, codifica una parte de otra proteína BMP/TGF-\beta/Vg-1 (relacionada con BMP-12) de la invención, denominada VL-1.

La secuencia de ADN (SEQ ID NO: 7) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 8) de este fragmento de ADN amplificado específicamente, se muestran en la Lista de Secuencias.

Los nucleótidos nº 1 - nº 26 de SEQ ID NO: 7 comprenden una parte del oligonucleótido nº 1 y los nucleótidos nº 103 - nº 128 comprenden una parte de la hebra complementaria inversa del oligonucleótido nº 2, utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 1 y nº 2 para iniciar la reacción de amplificación, pueden no corresponder exactamente con la secuencia real que codifica una proteína VL-1 de la invención y, por tanto, no se traducen en la derivación correspondiente de aminoácidos (SEQ ID NO: 8).

La siguiente sonda de olignucleótidos se diseña basándose en la secuencia de ADN humano de BMP-12, amplificada específicamente, indicada anteriormente (SEQ ID NO: 5) y se sintetiza en un sintetizador de ADN automático:

: nº 3: CCACTGCGAGGGCCTTTGCGACTTCCCTTTGCGTTCGCAC (SEQ ID NO: 20)

Esta sonda de oligonucleótido se marca radiactivamente con ^{32}P y se emplea para escrutar una genoteca genómica humana construida en el vector \lambdaFIX (Stratagene nº de catálogo 944201). 500.000 recombinantes de la genoteca genómica humana se extendieron en placas con una densidad de aproximadamente 10.000 recombinantes por placa, en 50 placas. Se realizaron duplicados sobre nitrocelulosa de las placas de bacteriófagos recombinantes y se hibridaron con la sonda nº 3 de oligonucleótidos, en tampón de hibridación convencional (SHB = 5X SSC, SDS al 0,1%, 5X Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) a 65ºC durante una noche. Al día siguiente, la solución de hibridación que contiene el oligonucleótido marcado radiactivamente se retira y los filtros se lavan con 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Se identifica un recombinante aislado que se hibrida positivamente y la placa se purifica. Este clon bacteriófago recombinante, purificado de la placa que se hibrida con la sonda nº 3 de oligonucleótidos de BMP-12, se denomina \lambdaHuG-48. Se prepara un material de reserva de la placa del bacteriófago y el ADN del bacteriófago se aísla del clon genómico humano \lambdaHuG-48. El bacteriófago \lambdaHuG-48 se ha depositado en la "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, "ATCC", con el número de orden 75625, el 7 de diciembre de 1993. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes y Las Normas por las que se rige. La región que se hibrida con el oligonucleótido de este recombinante, \lambdaHuG-48, se localiza en un fragmento BamHI de 3,2 kb. Este fragmento se subclona en un vector plasmídico (pGEM-3) y se realiza el análisis de la secuencia de ADN. Este subclon plasmídico se denomina PCR1-1nº2 y se ha depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD "ATCC" con el número de orden 69517, el 7 de diciembre, 1993. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes y Las Normas por las que se rige. La secuencia parcial de ADN (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 2) del inserto de ADN de 3,2 kb del subclon plasmídico PCR1-1nº2, obtenido a partir del clon \lambdaHuG-48, se muestran en la Lista de Secuencias.

Se debe tener en cuenta que los nucleótidos nº 639 - nº 714 de SEQ ID NO: 1 se corresponden con los nucleótidos nº 27 - nº 102 del fragmento de ADN que codifica BMP-12 amplificado específicamente, descrito en SEQ ID NO: 5, confirmando de este modo que el clon bacteriófago \lambdaHuG-48 genómico y humano y el subclon derivado PCR1-1nº2, codifican al menos una parte de la proteína BMP-12 de la invención. La secuencia de nucleótidos de una parte del inserto de 3,2 kb de BamHI del plásmido PCR1-1nº2 contiene un marco de lectura abierto de al menos 882 pares de bases, tal y como se ha definido para los nucleótidos nº 1- nº 882 de SEQ ID NO: 1. Este marco de lectura abierto codifica al menos 294 aminoácidos de la proteína humana BMP-12 de la invención. La proteína humana BMP-12 codificada de 294 aminoácidos, incluye la proteína BMP-12 humana madura completa (aminoácidos nº 1 - nº 104 de SEQ ID NO: 2), así como la parte C-terminal de la región del propéptido del producto de traducción primario (aminoácidos nº -190 hasta nº -1 de SEQ ID NO: 2).

Una secuencia adicional de ADN del inserto BamHI de 3, 2 kb del plásmido PCR1-1nº2, descrito en SEQ ID NO: 33, muestra la presencia de un marco de lectura abierto de 1164 pb, tal y como se ha definido para los nucleótidos nº 138 hasta nº 1301 de SEQ ID NO: 33. [Obsérvese que toda la secuencia descrita en SEQ ID NO: 1 está contenida en SEQ ID NO: 33]. Como esta secuencia se obtiene a partir de un clon genómico, es difícil determinar el límite entre la extensión 5’ de la secuencia codificante y el límite 3' de la secuencia intercalada (intrón/secuencia no codificante).

Basándose en el conocimiento de otras proteínas BMP y otras proteínas de la familia TGF-\beta, se pronostica que el polipéptido precursor se escindirá en la secuencia multibásica Arg-Arg-Gly-Arg, de acuerdo con una secuencia consenso propuesta para el procesamiento proteolítico de Arg-X-X-Arg. La escisión del polipéptido precursor de BMP-12 se espera que genere un péptido maduro de 104 aminoácidos, que comienza con el aminoácido Ser en la posición nº 1 de SEQ ID NO: 2. El procesamiento de BMP-12 en la forma madura se espera que implique la dimerización y la eliminación de la región N-terminal de forma análoga al procesamiento de la proteína TGF-\beta relacionada [Gentry y col., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck y col. Nature, 316:701 1985)].

Se contempla, por tanto, que la especie activa y madura de BMP-12 comprende un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, comprendiendo cada subunidad los aminoácidos nº 1 a nº 104 de SEQ ID NO: 2, con un peso molecular pronosticado de aproximadamente 12.000 daltons. Otras especies activas se contemplan, comprendiendo al menos los aminoácidos nº 3 a nº 103 de SEQ ID NO: 2, incluyendo de este modo el primero y el último residuo de cisteína conservado. Como en otros miembros de la familia TGF-\beta/BMP de proteínas, la parte carboxi-terminal de la proteína BMP-12 muestra una mayor conservación de la secuencia que la parte más amino-terminal. El porcentaje de identidad de aminoácidos de la proteína humana BMP-12 en el domino C-terminal, rico en cisteínas (aminoácidos nº 3 - nº 104) para la región correspondiente de las proteínas BMP humanas y otras proteínas de la familia TGF-\beta, es el siguiente; BMP-2, 55%; BMP-3, 43%; BMP-4, 53%; BMP-5, 49%; BMP-6, 49%; BMP-7, 50%; BMP-8, 57%; BMP-9, 48%; BMP-10, 57%; activina WC (BMP-11), 38%; Vg1, 46%; GDF-1, 47%; TGF-\beta1, 36%; TGF-\beta2, 36%; TGF-\beta3, 39%; inhibina \beta(B), 36%; inhibina \beta(A), 41%.

La secuencia de ADN de BMP-12 humana (SEQ ID NO: 1) o una parte de la misma, se puede utilizar como sonda para identificar una línea de células humanas o un tejido que sintetice ARNm de BMP-12. En pocas palabras, el ARN se extrae de una fuente seleccionada celular o tisular y se somete a electroforesis sobre gel de agarosa y formaldehído y se transfiere a nitrocelulosa, o se hace reaccionar con formaldehído y se transfieren las manchas directamente a la nitrocelulosa. La nitrocelulosa se hibrida a continuación con una sonda obtenida a partir de la secuencia codificadora de BMP-12 humana.

Alternativamente, la secuencia de BMP-12 humana se emplea para diseñar cebadores de oligonucleótidos que amplificarán específicamente una parte de la secuencia codificadora de BMP-12, situada en la región entre los cebadores empleados para realizar la reacción de amplificación específica. Se contempla que estos cebadores obtenidos a partir de BMP-12 humana permitirán amplificar específicamente las secuencias correspondientes que codifican BMP-12 a partir de ARNm, o moldes de ADNc o de ADN genómico. Una vez que se ha identificado una fuente positiva mediante uno de los métodos descritos anteriormente, el ARNm se selecciona mediante cromatografía sobre celulosa con oligo (dT) y el ADNc se sintetiza y se clona en \lambdagt10 u otros vectores de bacteriófagos \lambda, conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, \lambdaZAP, mediante técnicas establecidas (Toole y col., véase más arriba). También es posible realizar la reacción de amplificación dirigida con el cebador oligonucleótido, descrita anteriormente, directamente sobre un ADNc humano establecido previamente o una genoteca genómica que se ha clonado en un vector de bacteriófago \lambda. En tales casos, una genoteca que proporciona un producto de ADN amplificado de forma específica que codifica una parte de la proteína humana BMP-12, se podría escrutar directamente, utilizando como sonda el fragmento de ADN amplificado que codifica BMP-12.

Los cebadores de oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia de ADN del clon genómico de BMP-12 humano, \lambdaHuG-48, se pronostica que permitirán la amplificación específica de las secuencias de ADN que codifican BMP-12 humanas, a partir de genotecas de ADNc humano preestablecidas, que se encuentran a disposición comercial (es decir, Stratagene, La Jolla, CA o Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). El siguiente cebador oligonucleótido se diseña basándose en los nucleótidos nº 571 a nº 590 de la secuencia de ADN descrita en SEQ ID NO: 1 y sintetizada en un sintetizador de ADN automático:

: nº 4: TGCGGATCCAGCCGCTGCAGCCGCAAGCC (SEQ ID NO: 21)

Los nueve primeros nucleótidos del cebador nº 4 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI que se puede utilizar para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente, que codifica la proteína humana BMP-12 de la invención y que, por tanto, no se obtiene a partir de la secuencia de ADN presentada en SEQ ID NO: 1.

El siguiente cebador de oligonucleótido se diseña basándose en los nucleótidos nº 866 - nº 885 de la secuencia de ADN descrita en SEQ ID NO: 1 y se sintetiza en un sintetizador de ADN automático:

: nº 5: GACTCTAGACTACCTGCAGCCGCAGGCCT (SEQ ID NO: 22)

Los nueve primeros nucleótidos del cebador nº 5 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción XbaI que se puede utilizar para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN específicamente amplificada que codifica la proteína BMP-12 humana de la invención y que, por tanto, no se deriva de la secuencia de ADN presentada en SEQ ID NO: 1.

Los símbolos convencionales de los nucleótidos en los cebadores identificados arriba, son los siguientes: A, adenina; C, citosina; G, guanina; T, timina.

Los cebadores nº 4 y nº 5 identificados arriba, se emplean como cebadores para permitir la amplificación de una secuencia específica de nucleótidos que codifica BMP-12 a partir de genotecas de ADNc establecidas previamente, que pueden incluir lo siguiente: ADNc de cerebro fetal humano/\lambdaZAPII (Stratagene nº de catálogo 936206), hígado humano/ \lambdaUNI-ZAP XR (Stratagene nº de catálogo 937200), pulmón humano/\lambdaUNI-ZAP XR (Stratagene nº de catálogo 937206) y bazo fetal humano/\lambdaUNI-ZAP XR (Stratagene nº de catálogo 937205).

Aproximadamente 1 x 10^{8} pfu (unidades formadoras de placa) de genotecas de bacteriófago \lambda que contienen insertos de ADNc humano, tales como los detallados anteriormente, se desnaturalizan a 95ºC durante 5 minutos antes de añadirlos a una mezcla de reacción que contiene 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de ADN-polimerasa Taq, cebador oligonucleótido nº 4 100 pM y cebador oligonucleótido nº 5 100 pM. La mezcla de reacción se somete a continuación a ciclación térmica del siguiente modo: 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a 72ºC durante treinta y nueve ciclos, seguido de 10 minutos a 72ºC.

El ADN que se amplifica específicamente con esta reacción, se esperaría que generara un producto que codifica BMP-12 de aproximadamente 333 pares de bases, cuyas 315 pb internas se corresponden con los nucleótidos nº 571 a nº 885 de SEQ ID NO: 1 y también incluyen 9 pb en cada extremo del fragmento específico de BMP-12 que se corresponden con los sitios de restricción definidos por los nucleótidos nº 1- nº 9 de los cebadores nº 4 y nº 5. El producto de ADN de 333 pb resultante se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y XbaI, se extrae con fenol, se extrae con cloroformo y se precipita con etanol.

Alternativamente, a la precipitación con etanol, el cambio del tampón y la eliminación de los pequeños fragmentos de ADN resultantes de la digestión de restricción con BamHI/XbaI, se realiza por dilución del producto de ADN digerido en Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM, seguido de centrifugación en una microconcentradora Centricon® 30 (W. R. Grace & Co., Beverly, MA; producto nº 4209). El producto resultante de ADN amplificado digerido con BamHI/XbaI, se subclona en un vector plasmídico (es decir, pBluescript, pGEM-3, etc.) entre los sitios BamHI y XbaI de la región del polienlazador. El análisis de la secuencia de ADN de los subclones resultantes tendrá que confirmar la integridad del inserto que codifica BMP-12. Una vez que se ha identificado una fuente positiva de ADNc de esta manera, la genoteca de ADNc correspondiente a partir de la cual se había amplificado una secuencia específica de 333 pb de BMP-12, se pudo escrutar directamente con el inserto de 333 pb o con otras sondas específicas para BMP-12, para identificar y aislar los clones de ADNc que codifican la proteína BMP-12 de longitud completa de la invención.

Se pueden utilizar métodos adicionales conocidos por los expertos en la técnica para aislar otros ADNc de longitud completa que codifican proteínas relacionadas con la BMP-12 humana o clones de ADNc de longitud completa que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 de la invención, a partir de especies distintas a los seres humanos, particularmente otras especies de mamíferos.

Los siguientes ejemplos muestran el uso de la secuencia de BMP-12 humana para aislar homólogos de proteínas relacionadas con BMP-12 en una genoteca de ADN genómico de múrido.

La secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12 humana de la invención se pronostica que va a ser significativamente homóloga a BMP-12 y a secuencias relacionadas con BMP-12 de especies distintas a los humanos, que se podrían utilizar para amplificar específicamente secuencias de ADN de estas otras especies que podrían codificar las proteínas correspondientes relacionadas con BMP-12. Específicamente, los siguientes oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de BMP-12 humana (SEQ ID NO: 1) y se sintetizan en un sintetizador de ADN automático:

: nº 6: GCGGATCCAAGGAGCTCGGCTGGGACGA (SEQ ID NO: 23)

: nº 7: GGAATTCCCCACCACCATGTCCTCGTAT (SEQ ID NO: 24)

Los ocho primeros nucleótidos de los cebadores de oligonucleótidos nº 6 y nº 7 (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI, respectivamente. Estas secuencias se utilizan para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN amplificada específicamente que codifica BMP-12 o una proteína relacionada con BMP-12 procedente de una especie distinta de la humana y, por tanto, no se obtiene a partir de la secuencia de ADN presentada en SEQ ID NO: 1. El cebador oligonucleótido nº 6 se diseña basándose en los nucleótidos nº 607 - nº 626 de SEQ ID NO: 1. El cebador oligonucleótido nº 7 se diseña basándose en la hebra complemenaria inversa de los nucleótidos nº 846 - nº 865 de la secuencia de ADN descrita en SEQ ID NO: 1.

Los cebadores oligonucleótidos nº 6 y nº 7 identificados anteriormente, se emplean como cebadores para permitir la amplificación de secuencias relacionadas con BMP-12 específicas procedentes de ADN genómico obtenido a partir de especies distintas de los humanos. La reacción de amplificación se realiza del modo siguiente:

ADN genómico de múrido (fuente: cepa de Balb c) se corta mediante el pase repetido a través de una aguja de calibre 25, se desnaturaliza a 100ºC durante cinco minutos y se enfría a continuación sobre hielo antes de añadirlo a una mezcla de reacción que contiene 200 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de ADN-polimerasa Taq, cebador oligonucleótido nº 6 100 pM y cebador oligonucleótido nº 7 100 pM. La mezcla de reacción se somete a continuación a ciclación térmica del modo siguiente: 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC, 1 minuto a 72ºC durante cuarenta ciclos, seguido de 10 minutos a 72ºC.

El ADN que se amplifica específicamente con esta reacción, se precipita con etanol, se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI y se somete a electroforesis en gel de agarosa. Una región del gel que se corresponde con el tamaño previsto del fragmento de ADN que codifica BMP-12 de múridos o proteínas relacionadas con BMP-12, se corta y los fragmentos de ADN amplificados específicamente contenidos en la misma, se extraen (por electroelución o por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica) y se subclonan en un vector plasmídico, tal como pGEM-3 o pBluescript, entre los sitios BamHI y EcoRI del polienlazador. El análisis de la secuencia de ADN de uno de los subclones resultantes, denominado mV1, indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente, contenida en la misma, codifica una parte de una proteína que parece ser el homólogo en múridos de la secuencia de BMP-12 o de VL-1 de la invención. La secuencia de ADN (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 11) de este fragmento de ADN de múrido amplificado específicamente, se muestran en la Lista de Secuencias.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de SEQ ID NO: 10 comprenden una parte del oligonucleótido nº 6 y los nucleótidos nº 246-nº 272 comprenden una parte de la hebra complementaria inversa del oligonucleótido nº 7, utilizada para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido nº 27 de SEQ ID NO: 10 parece ser el último nucleótido de un triplete de codones y los nucleótidos nº 244 - nº 245 de SEQ ID NO: 10 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codones. Por consiguiente, los nucleótidos nº 28 a nº 243 de SEQ ID NO: 10 se corresponden con una secuencia codificadora parcial de mV1. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 en el inicio de la reacción de amplificación, pueden no corresponder exactamente con la secuencia real que codifica el homólogo de múridos de la proteína BMP-12 o VL-1 humana de la invención y, por tanto, no se traducen en la derivación de la secuencia de aminoácidos correspondientes (SEQ ID NO: 11).

Las sondas de oligonucleótidos diseñadas basándose en la secuencia de ADN de BMP-12 o de VL-1 de múridos amplificada específicamente, descrita en SEQ ID NO: 10, se pueden utilizar por los expertos en la técnica para identificar los clones que codifican BMP-12 o VL-1 de múridos de longitud completa (tanto ADNc como genómico).

El análisis de la secuencia de ADN de otro de los subclones resultantes, denominado mV2, indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente, contenida en el mismo, codifica una parte de una secuencia relacionada con BMP-12 de múrido de la invención. La secuencia de ADN (SEQ ID NO: 12) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 13) de este fragmento de ADN de múridos, amplificado específicamente, se muestra en la lista de secuencias.

Los nucleótidos nº 1- nº 26 de SEQ ID NO: 12 comprenden una parte del oligonucleótido nº 6 y los nucleótidos nº 246 - nº 272 comprenden una parte de la hebra complementaria inversa del oligonucleótido nº 7, utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido nº 27 de SEQ ID NO: 12 parece ser el último nucleótido de un triplete de codones y los nucleótidos nº 244 - nº 245 de SEQ ID NO: 12 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codones. Por tanto, los nucleótidos nº 28 a nº 243 de SEQ ID NO: 12 se corresponden con una secuencia codificadora parcial de mV2. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 para iniciar la reacción de amplificación, no se pueden corresponder exactamente con la secuencia real que codifica la proteína relacionada con BMP-12 de múridos de la invención y por ello no se traducen en la derivación de la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 13).

Las sondas de oligonucleótidos diseñadas basándose en la secuencia de ADN relacionado con BMP-12 de múridos, amplificada específicamente, descrita en SEQ ID NO: 12, la pueden utilizar los expertos en la técnica para identificar clones que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 de múridos de longitud completa (tanto ADNc como genómico).

El análisis de la secuencia de ADN de otro de los subclones resultante, denominado mV9, indica que la secuencia de ADN amplificada específicamente contenida en la misma, codifica una parte de una secuencia relacionada con BMP-12 de múrido de la invención. Esta secuencia parece ser el homólogo en múridos de la secuencia de ADN de MP52 humana, descrita en SEQ ID NO: 3. La secuencia de ADN (SEQ ID NO: 14) y la secuencia de aminoácidos derivados (SEQ ID NO: 15) de este fragmento de ADN de múridos amplificado específicamente, se muestran en la Lista de Secuencias.

Los nucleótidos nº 1-nº 26 de SEQ ID NO: 14 comprenden una parte del oligonucleótido nº 6 y los nucleótidos nº 246 - nº 272 comprenden una parte de la hebra complementaria inversa del oligonucleótido nº 7 utilizado para realizar la reacción de amplificación específica. El nucleótido nº 27 de SEQ ID NO: 14 parece ser el último nucleótido de un triplete de codones y los nucleótidos nº 244 - nº 245 de SEQ ID NO: 14 parecen ser los dos primeros nucleótidos de un triplete de codones. Por tanto, los nucleótidos nº 28 a nº 245 de SEQ ID NO: 14 se corresponden con una secuencia codificadora parcial de mV9. Debido a la función de los oligonucleótidos nº 6 y nº 7 para iniciar la reacción de amplificación, puede que no se correspondan exactamente con la secuencia real que codifica la proteína relacionada con BMP-12 de múridos de la invención y por ello no se traducen en la derivación de la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 15).

Las sondas de oligonucleótidos diseñadas basándose en la secuencia de ADN relacionada con BMP-12 de múridos, amplificada específicamente, descrita en SEQ ID NO: 14, la pueden utilizar los expertos en la técnica para identificar clones que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 de múridos, de longitud completa (tanto ADNc como genómico).

Alternativamente, los cebadores oligonucleótidos nº 6 y nº 7 identificados anteriormente se utilizan como cebadores para permitir la amplificación específica de una sonda de ADN de 275 pares de bases, cuyas 259 pb internas se corresponden a los nucleótidos nº 607 a nº 865 de SEQ ID NO: 1, procedente del subclon plasmídico que codifica BMP-12, PCR1-1nº2. Esta sonda de ADN de 275 pb se marcó radiactivamente con ^{32}P y se empleó para escrutar una genoteca genómica de múridos, construida en el vector \lambda FIX II (Stratagene nº de catálogo 946306). Un millón de recombinantes de la genoteca genómica de múridos se extendieron en placas, con una densidad de aproximadamente 20.000 recombinantes por placa, sobre 50 placas. Los duplicados sobre nitrocelulosa de las placas de bacteriófagos recombinantes, se hibridaron bajo condiciones rigurosas, con la sonda de 333 pb amplificada específicamente, en tampón de hibridación convencional (SHB) = 5X SSC, SDS al 0,1%, 5X Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) a 60ºC durante una noche. Al día siguiente, se retira la solución de hibridación que contiene el oligonucleótido marcado radiactivamente y se lavan los filtros bajo condiciones rigurosas, con 2X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. Los recombinantes múltiples que se hibridan positivamente se identifican y las placas se purifican. Los fragmentos de los clones recombinantes genómicos de múridos que se hibridan positivamente se subclonan en vectores plasmídicos convencionales (es decir, pGEM-3) y se someten a análisis de la secuencia de ADN.

El análisis de la secuencia de ADN de uno de estos subclones, denominado MVR3, indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de la PCR, mV1 (homólogo en múrido de la secuencia de BMP-12 humana, descrita en SEQ ID NO: 1) descrito anteriormente. La secuencia parcial de ADN de este subclon y la traducción correspondiente de los aminoácidos, se indica en SEQ ID NO: 29 y en SEQ ID NO: 30, respectivamente.

El análisis de la secuencia de ADN de otro de estos subclones denominado MVR32, indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de la PCR, mV2 (homólogo en múrido de la secuencia de VL-1 humana, descrita en SEQ ID NO: 7) descrito anteriormente. La secuencia de ADN parcial de este subclon y la traducción correspondiente de los aminoácidos, se describe en SEQ ID NO: 31 y en SEQ ID NO: 32, respectivamente.

El análisis de la secuencia de ADN de otro de estos subclones, denominado MVR23, indica que codifica una parte del gen de ratón correspondiente al producto de la PCR, mV9 (homólogo en múrido de la secuencia de MP-52 descrita en SEQ ID NO: 3), descrito anteriormente.

De forma similar a la descrita anteriormente para identificar y aislar clones genómicos humanos que codifican la proteína BMP-12 de la invención, la(s) sonda(s) de oligonucleótidos que se corresponde con la secuencia que codifica VL-1 descrita en SEQ ID NO: 7, se puede diseñar y utilizar para identificar secuencias humanasgenómicas o de ADNc que codifican la proteína VL-1 (BMP-13). Estos oligonucleótidos se diseñarían para regiones específicas de las secuencias que codifican VL-1 y serían, por tanto, idóneos para obtenerse a partir de las regiones con el menor grado de identidad de secuencia de nucleótidos entre la secuencia (SEQ ID NO: 7) que codifica VL-1 amplificado específicamente y la secuencia (SEQ ID NO: 5) que codifica BMP-12 amplificada específicamente.

Alternativamente, los cebadores de oligonucleótidos nº 4 y nº 5 identificados anteriormente, se emplean como cebadores para permitir la amplificación específica de una sonda de ADN de 333 pares de bases, cuyas 315 pb internas se corresponden con los nucleótidos nº 571 a nº 885 de SEQ ID NO: 1, procedente del subclon PCR1-1nº2 del plásmido que codifica BMP-12. Esta sonda de ADN de 333 pb se marcó radiactivamente con ^{32}P y se empleó para escrutar una genoteca genómica humana, construida en el vector \lambdaDASH II (Stratagene nº de catálogo 945203). Un millón de recombinantes de la genoteca genómica humana se extendieron en placas con una densidad de aproximadamente 20.000 recombinantes por placa, sobre 50 placas. Los duplicados sobre nitrocelulosa de las placas de bacteriófagos recombinantes se hibridaron bajo condiciones rigurosas, con la sonda de 333 pb amplificada específicamente, en tampón de hibridación convencional (SHB) = 5X SSC, SDS al 0,1%, 5X Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) a 60ºC durante una noche. Al día siguiente, se retira la solución de hibridación que contiene el oligonucleótido marcado radiactivamente y se lavan los filtros bajo condiciones rigurosas, con 2X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC. Los recombinantes múltiples (aproximadamente 15) que se hibridan positivamente, se identifican y las placas se purifican.

Para distinguir los recombinantes que se hibridan positivamente que codifican la proteína VL-1 de la invención, de BMP-12 y de otros recombinantes que codifican proteínas relacionadas con BMP-12 que se pronosticaría que se hibridan positivamente con la sonda de ADN de 333 pb generada a partir de PCR1-1nº2 plasmídico que codifica BMP-12, utilizado en este proceso de escrutinio, se diseña la siguiente sonda de oligonucleótido, basándose en la secuencia de VL-1 descrita en SEQ ID NO: 7, y se sintetiza en un sintetizador automático de ADN:

: nº 8: TGTATGCGACTTCCCGC [SECUENCIA ID NO: 35]

Un oligonucleótido que se corresponde con los nucleótidos nº 60 a nº 76 de SEQ ID NO: 7 que contiene 5 diferencias en nucleótidos con la región correspondiente de la secuencia que codifica BMP-12 descrita en SEQ ID NO: 1 (nucleótidos nº 672 a nº 689). Uno de los clones recombinantes de bacteriófago que se hibrida con la sonda de oligonucleótido VL-1 nº 8, se denomina \lambdaJLDc31. Este clon recombinante bacteriófago se purifica en placa, se realiza una reserva de placas de bacteriófagos y se aísla el ADN bacteriófago a partir del clon genómico humano \lambdaJLDc31. El bacteriófago \lambdaJLDc31 se ha depositado en la "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, "ATCC", con el número de orden 75922, el 20 de octubre de 1994. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes y Las Normas por las que se rige. La región que se hibrida con el oligonucleótido de este recombinante \lambdaJLDc31, se localiza en un fragmento EcoRI de 2,5 kb. Este fragmento se subclona en un vector plasmídico (pGEM-3) y se realiza el análisis de la secuencia de ADN. El subclon plasmídico se denomina pGEMJLDc31/2.5 y se ha depositado en la "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, "ATCC", con el número de orden 69710, el 20 de octubre de 1994. Este depósito cumple los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a efectos de Procedimientos de Patentes y Las Normas por las que se rige.

Las secuencia parcial de ADN (SEQ ID NO: 25) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 26) de una parte del inserto de ADN de 2,5 kb del subclon plasmídico pGEMJLDc31/2.5, obtenido a partir del clon \lambdaJLDc31, se muestra en la Lista de Secuencias.

La secuencia de ADN de una parte del inserto EcoRI de 2,5 kb del plásmido pGEMJLDc31/2.5, se describe en SEQ ID NO: 25, contiene un marco de lectura abierto de 912 pb, tal y como lo definen los nucleótidos nº 52 a nº 963 de SEQ ID NO: 25. Como esta secuencia se deriva de un clon genómico, es difícil determinar los límites entre la extensión 5' de la secuencia codificadora y el límite 3' de la secuencia intercalada (intrón/secuencia no codificadora). El marco de lectura abierto completo (los nucleótidos nº 52 a nº 963 de SEQ ID NO: 25) codifica una parte de la proteína VL-1 de la invención, de hasta 304 aminoácidos.

Basándose en el conocimiento de otras proteínas BMP y otras proteínas que pertenecen a la familia TGF-\beta, se pronostica que el polipéptido precursor se escindirá en la secuencia multibásica Arg-Arg-Arg-Arg de acuerdo con una secuencia consenso propuesta para el procesamiento proteolítico de Arg-X-X-Arg. La escisión del polipéptido precursor de VL-1 se espera que genere un péptido maduro de 120 aminoácidos que comienza en el aminoácido Thr en la posición nº 1 de SEQ ID NO: 26. El procesamiento de VL-1 en la forma madura se espera que implique la dimerización y la eliminación de la región N-terminal de forma análoga al procesamiento de la proteína relacionada TGF-\beta [Gentry y col., Molec & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck y col., Nature, 316:701 (1985)].

Se contempla, por tanto, que la especie madura activa de VL-1 comprenda un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, comprendiendo cada subunidad los aminoácidos nº 1 a nº 120 de SEQ ID NO: 26 con un peso molecular pronosticado de aproximadamente 12.000 daltons. Otras especies activas se contemplan que comprendan al menos los aminoácidos nº 19 a nº 119 o nº 120 de SEQ ID NO. 26, incluyendo de este modo el primer y el último residuo de cisteína conservados.

Empleando dicho método, se obtuvo un clon que codifica VL-1 (BMP-13) humana madura. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente, codificada por este clon se indica en la Lista de Secuencias en SEQ ID NO: 25 y 26, respectivamente.

Ejemplo 2 Expresión de BMP-12

Para producir las proteínas BMP-12 humanas, el ADN que las codifica se transfiere a un vector de expresión adecuado y se introduce en células de mamífero o en otros hospedadores preferidos de eucariotas o procariotas, mediante técnicas de ingeniería genética convencionales.

Para producir la proteína BMP-12 humana en células bacterianas, se emplea el siguiente procedimiento.

Expresión de BMP-12 en E. coli

Un plásmido de expresión pALVI-781, para la producción de BMP-12 en E. coli, se construyó de modo que contenía las siguientes características principales. Secuencias de ADN que contienen los nucleótidos 1-2060 que se originan a partir del plásmido pUC-18 [Norrander y col., Gene 26:101-106 (1983)] que incluyen secuencias que contienen el gen de la \beta-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina en cepas hospedadoras de E. coli y un origen de replicación derivado de colE1. Las secuencias de ADN que contienen los nucleótidos 2061-2221 para el promotor principal a la izquierda (pL) del bacteriófago \lambda [Sanger y col., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982)], que incluye tres secuencias operadoras O_{L}1, O_{L}2 y O_{L}3. Los operadores son los sitios de unión para la proteína represora \lambdacI, cuyos niveles intracelulares controlan la cantidad de iniciación de la transcripción de pL. Los nucleótidos 2222-2723 contienen una secuencia de unión fuerte al ribosoma, incluida en una secuencia derivada de los nucleótidos 35566 a 35472 y 38137 a 38361 del bacteriófago lambda, tal y como describen Sanger y col., J. Mol. Biol. 162:729-773 (1982). Los nucleótidos 2724-3041 contienen una secuencia de ADN que codifica la proteína BMP-12 madura con toda la secuencia 3' no traducida, eliminada. Las secuencias de ADN de BMP-12 introducidas en el vector de expresión pALVI-781 se modificaron en el extremo 5’ para obtener el contenido A + T sin alterar la capacidad codificadora. Estos cambios se realizaron para incrementar la eficacia de la traducción iniciada en el ARNm de BMP-12 en E. coli. Los nucleótidos 3042-3058 proporcionan una secuencia de ADN "enlazadora" que contiene sitios para endonucleasas de restricción. Los nucleótidos 3059-3127 proporcionan una secuencia de terminación de la transcripción que se basa en la del gen asp A de E. coli [Takagi y col., Nucl. Acids Res. 13:2063-2074 (1985)]. Los nucleótidos 3128-3532 son secuencias de ADN derivadas de pUC-18.

El plásmido pALVI-781 se transformó en la cepa hospedadora de E. coli GI724 (F, lacI^{q}, lacp^{L8}, ampC::\lambdacI^{+}) mediante el procedimiento de Dagert y Ehrlich, Gene, 6:23 (1979). GI724 (nº de orden ATCC 55151) contiene una copia del gen represor \lambdacI de tipo silvestre, integrado de forma estable en el cromosoma, en el locus ampC, en donde se ha situado bajo el control de la transcripción de las secuencias de promotor/operador trp de Salmonella typhimurium. En GI724, la proteína \lambdaCI se produce sólo durante el crecimiento en medios exentos de triptófano, tales como medios mínimos o un medio mínimo suplementado con casaminoácidos tales como IMC, descrito anteriormente. La adición de triptófano a un cultivo de GI724 inhibe el promotor trp y detiene la síntesis de \lambdacI, causando gradualmente la inducción de la transcripción desde los promotores pL, si están presentes en la célula.

Los transformantes se seleccionaron sobre placas de agar al 1,5% de p/v que contenían medio IMC que se compone de medio M9 [Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1972)] que contenía MgSO_{4} 1 mM y suplementado con 0,5% de p/v de glucosa, 0,2% de p/v de casaminoácidos y 100 \mug/ml de ampicilina. GI724 transformado con pALVI-781 se dejó crecer a 37ºC hasta una A_{550} de 0,5 en medio IMC que contenía 100 \mug/ml de ampicilina. El triptófano se añadió a continuación hasta tener una concentración final de 100 \mug/ml y el cultivo se incubó durante otras 4 horas. Durante este tiempo, la proteína BMP-12 se acumula en la fracción "cuerpos de inclusión".

Preparación de Monómero Proteico

Se pesaron 18 g de células congeladas y se resuspendieron en 60 ml de Tris 100 mM, EDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF] 1 mM, pH 8,3. Las células se lisaron mediante 3 pases a través de un homogenizador de alta presión, Microfluidizer® [modelo nº MCF 100 T]. El sedimento de los cuerpos de inclusión se obtuvo por centrifugación a 15.000 g a 4ºC durante 20 minutos. El material sobrenadante se decantó y el sedimento se lavó con 100 ml de Tris 100 mM, NaCl 1,0 M, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM, pH 8,3. La suspensión se centrifugó de nuevo a 15.000 g a 4ºC durante 10 minutos y el material sobrenadante se decantó. El sedimento se lavó a continuación con 100 ml de Tris 100 mM, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1%, PMSF 1 mM, pH 8,3. La suspensión se centrífugó de nuevo a 15.000 g a 4º C durante 10 minutos y el material sobrenadante se decantó. El sedimento se resuspendió en 50 ml de Tris 20 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 8,3, que contenía 1% de DTT en un homogenizador de tejidos en vidrio. La BMP-12 monómera se solubilizó a continuación mediante acidificación a pH 2,5 con ácido acético glacial. La fracción soluble se aisló por centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos a 4ºC.

El material sobrenadante de esta centrifugación se recogió y se cromatografió sobre una columna de exclusión por tamaño Sephacryl S-100® (83 cm x 2,6 cm; \approx 440 ml de lecho) en incrementos de 20 ml. Por la columna de Sephacryl S-100® se hizo pasar una fase móvil de ácido acético al 1% con un caudal de 1,4 ml/min. Las fracciones correspondientes al monómero de BMP-12 se detectaron por absorbancia a 280 nm y empleando un coeficiente de extinción calculado por ordenador de 18200 M^{-1}cm^{-1} y peso molecular (11667 daltons). Este material reunido en la columna de exclusión por tamaño se empleó como material de partida para las reacciones de renaturalización.

Como alternativa a lo anterior, se midieron 1,0 g de células almacenadas a -80ºC. Se añade solución (3,4 ml de Tris 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,5). La solución se somete a la formación de un vórtice hasta que las células se suspenden bien. Se añaden 40 \mul de PMSF 100 mM en isopropanol. Las células se lisan a 6894,7 kPa en una célula de prensa francesa. Los cuerpos de inclusión se centrifugan a 4ºC durante 20 minutos en una microfuga de Eppendorf para formar sedimentos. El material sobrenadante se decanta. A un sedimento (de los 4 totales) se añade 1 ml de hidrocloruro de guanidina 8,0 M desgasificado, Tris 0,5 M, EDTA 5 mM, pH 8,5 que contiene DTT 250 mM. El sedimento se disuelve y se airea argón sobre el líquido durante 30 segundos. A continuación, la solución se incuba a 37ºC durante una hora. El material insoluble se sedimenta durante 2-3 minutos en una microfuga de Eppendorf a 23ºC. Se inyectan 0,5-1,0 ml de material sobrenadante en un cartucho protector de 2 cm de Supelco (LC-304) y se eluye con un gradiente de acetonitrilo en TFA al 0,1%, desde 1-70% durante 35 minutos. BMP-12 se eluye entre los minutos 29 y 31. Las fracciones se reúnen y se determina la concentración de proteína mediante adsorbancia a 280 nanómetros frente a TFA al 0,1%, empleando el coeficiente de extinción teórico que se basa en el contenido en aminoácidos.

Como segundo método alternativo al anterior, sedimentos de células congeladas obtenidas a partir de transformantes de E. coli, tal y como se ha descrito anteriormente, se descongelan en 30 ml de tampón TE8.3(100:10) (Tris-HCl 100 mM pH 8,3, Na_{2}EDTA 10 mM, PMSF 1 mM). Las células se lisan mediante tres pases a través de un homogenizador de alta presión [nº de modelo MCF 100T]. El sedimento inicial del material de los cuerpos de inclusión se disuelve en guanidina-HCl 8 M, tampón TE8.5 (100:10) (Tris-HCl 100 mM pH 8,5, Na_{2}EDTA 10 mM que contiene DTT 100 mM) y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Este material se centrifuga a 12.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Renaturalización de la proteína BMP-12 empleando el sistema CHAPS

Un volumen suficiente de un conjunto de BMP-12, se liofiliza para proporcionar 10 \mug de proteína. Se añaden 5 \mul de agua destilada en vidrio para disolver de nuevo el residuo, a continuación 100 \mul de la mezcla renaturalizada (Tris 50 mM, NaCl 1,0 M, 3-(3-colamido-propil)dimetilamonio-1-propano-sulfato (CHAPS) al 2%, EDTA 5 mM, glutatión 2 mM (reducido) glutatión 1 mM (oxidado); a pH de aproximadamente 8,5). La solución se agita suavemente y se almacena a 23ºC durante 1-4 días. La formación de dímeros se determina sometiendo una parte alícuota a un gel de tricina al 16% de Novex a 125 voltios, durante 2,5 horas, seguido de tinción con azul de Coomassie y retirando la tinción.

El dímero de BMP-12 se purificó empleando una columna (Vydac 214TP54) de RP-HPLC analítica C4 (cromatografía de alta resolución en fase inversa) que se había equilibrado con un tampón B al 1% (diluido en tampón A) y se dejó correr durante 35 minutos, tiempo durante el cual se eluía la proteína, empleando el siguiente gradiente (tampón A = ácido trifluoroacético al 0,1%, tampón B = acetonitrilo al 95%, ácido trifluoroacético al 0,1% [TFA]), con un caudal de 1 ml/min:

1-5 minutos	tampón B al 20%
5-10 minutos	tampón B al 20-30%
10-30 minutos	tampón B al 30-50%
30-35 minutos	tampón B al 50-100%

La proteína se vigiló por absorbancia a 280 nm. Las fracciones pico de BMP-12 (que se eluyen entre los minutos 29 y 31) se reunieron. La pureza se determinó por SDS-PAGE. La concentración se determinó por absorbancia a 280 nm y empleando el coeficiente de extinción calculado con ordenador y el peso molecular, tal y como se ha indicado anteriormente.

Expresión de BMP-12 en células de mamíferos

Otro sistema de expresión preferido, contemplado para BMP-12 humana y recombinante, biológicamente activa, son las células de mamífero transformadas de forma estable.

Un experto en la técnica puede construir vectores de expresión de mamíferos, empleando la secuencia de SEQ ID NO: 1 u otras secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-12 u otras secuencias modificadas y vectores conocidos, tales como pCD [Okayama y col., Mol. Cell Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough y col., EMBO J., 4:645-653 (1985)] y pMT2 CXM.

El vector de expresión de mamíferos pMT2 CXM es un derivado de p91023(b) (Wong y col., Science 228:810-815, 1985) que difiere del anterior en que contiene el gen de resistencia a la ampicilina en lugar del gen de resistencia a la tetraciclina y contiene, además, un sitio XhoI para la inserción de clones de ADNc. Los elementos funcionales de pMT2 CXM se han descrito (Kaufman, R. J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693) e incluyen los genes VA de adenovirus, el origen de replicación de SV40 que incluye el potenciador de 72 pb, el promotor tardío principal de adenovirus que incluye un sitio 5 de corte y empalme y la mayoría de la secuencia líder tripartita de adenovirus, presente en los ARNm tardíos de adenovirus, un sitio 3 aceptor de corte y empalme, un inserto de DHFR, el sitio de poliadenilación temprana de SV40 (SV40) y las secuencias de pBR322 necesarias para propagarse en
E. coli.

El plásmido pMT2 CXM se obtiene mediante digestión con EcoRI de pMT2-VWF, que se había depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (EE.UU. con el número de orden ATCC 67122. La digestión con EcoRI escinde el inserto de ADNc presente en pMT2-VWF, obteniéndose pMT2 en forma lineal que se puede ligar y se emplea para transformar HB 101 o DH-5 de E. coli para la resistencia a la ampicilina. El ADN del plásmido pMT2 se puede preparar mediante métodos convencionales. pMT2 CXM se construye a continuación empleando mutagénesis de bucle de fuera/adentro (del inglés, "loopout/in mutagenesis") [Morinaga y col., Biotechnology 84:636 (1984)]. Esta elimina las bases 1075 a 1145 relacionadas con el sitio HindIII cercano al origen de replicación de SV40 y las secuencias potenciadoras de pMT2. Además, se inserta una secuencia que contiene el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción XhoI. Un derivado de pMT2CXM, denominado pMT23, contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción PstI, EcoRI, SalI y XhoI. El plásmido pMT2 CXM y el ADN de pMT23 se pueden preparar mediante métodos convencionales.

pEMC2\beta1, obtenido a partir de pMT21, también puede ser adecuado en la práctica de la invención. pMT21 se obtiene a partir de pMT2 que se obtiene a partir de pMT2-VWF. Tal y como se ha descrito anteriormente, la digestión con EcoRI escinde el inserto de ADNc presente en pMT-VWF, obteniéndose pMT2 en forma lineal que se puede ligar y emplear para transformar HB 101 o DH-5 de E. coli para la resistencia a la ampicilina. El ADN plasmídico de pMT2 se puede preparar mediante métodos convencionales.

pMT21 se obtiene a partir de pMT2 mediante las dos siguientes modificaciones. Primero, se delecionan 76 pb de la región 5' no traducida del ADNc de DHFR que incluye un segmento de 19 residuos de G procedentes de la formación de una cola G/C para la clonación del ADN. En este procedimiento, se inserta un sitio XhoI para obtener la siguiente secuencia inmediatamente aguas arriba de DHFR. Segundo, se introduce un sitio ClaI único mediante digestión con EcoRV y XbaI, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN-polimerasa I y ligación con un enlazador de ClaI (CATCGATG). Esto deleciona un segmento de 250 pb de la región del ARN asociada con adenovirus (VAI) pero no interfiere con la expresión o con la función del gen de ARN VAI. pMT21 se digiere con EcoRI y XhoI y se emplea para obtener el vector pEMC2B1.

Una parte del líder de EMCV se obtiene a partir de pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, y col., J. Virol., 63:1651-1660 (1989)] por digestión con EcoRI y PstI, dando como resultado un fragmento de 2752 pb. Este fragmento se digiere con TaqI obteniéndose un fragmento EcoRI-TaqI de 508 pb que se purifica por electroforesis sobre agarosa con bajo punto de fusión. Un adaptador de 68 pb y su cadena complementaria se sintetizan con un extremo protuberante en 5' TaqI y un extremo protuberante en 3' XhoI que tiene una secuencia que se empareja con la secuencia líder del virus EMC desde el nucleótido 763 al 827. Esto cambia también la ATG en posición 10 dentro del líder del virus EM con un ATT y está seguido de un sitio XhoI. Una ligación trilateral del fragmento EcoRI-XhoI de pMT21, el fragmento EcoRI-TaqI del virus EMC y el adaptador TaqI-XhoI del adaptador oligonucleótido de 68 pb, da como resultado el vector pEMC2\beta1.

Este vector contiene el origen de replicación y el potenciador de SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, una copia de ADNc de la secuencia líder tripartita de adenovirus, una pequeña secuencia intercalada híbrida, una señal de poliadenilación de SV40 y el gen VA 1 de adenovirus, los marcadores DHFR y \beta-lactamasa y una secuencia EMC, en relaciones adecuadas para dirigir el alto nivel de expresión del ADNc deseado en células de mamífero.

La construcción de vectores puede implicar la modificación de las secuencias de ADN de BMP-12. Por ejemplo, el ADNc de BMP-12 se puede modificar eliminando los nucleótidos no codificantes en los extremos 5' y 3' de la región codificadora. Los nucleótidos no codificadores eliminados se pueden reemplazar o no con otras secuencias conocidas por ser beneficiosas para la expresión. Estos vectores se transforman en células hospedadoras adecuadas para expresar la proteína BMP-12. Adicionalmente, la secuencia de SEQ ID NO: 1 u otras secuencias que codifican proteínas BMP-12, se pueden manipular para expresar la proteína BMP-12, aislando la secuencia codificadora madura de los nucleótidos 571 a 882 de SEQ ID NO: 1 y añadiendo en el extremo 5' secuencias que codifican los propéptidos completos de otras proteínas BMP.

Por ejemplo, un experto en la técnica puede preparar una proteína de fusión en la que el propéptido de BMP-2 está ligado funcionalmente con el péptido BMP-12 maduro, preparando un vector de ADN en el que la secuencia de ADN que codifica el propéptido de BMP-2 está ligada con el marco de lectura adecuado, a la secuencia de ADN que codifica el péptido de BMP-12 maduro. La secuencia de ADN de dicha proteína de fusión se muestra en SEQUENCE ID NO: 27

Un experto en la técnica puede manipular las secuencias de SEQ ID NO: 1 eliminando o sustituyendo las secuencias reguladoras de mamífero que flanquean la secuencia codificadora, por secuencias bacterianas para crear vectores bacterianos para la expresión intra o extracelular mediante células bacterianas, tal y como se ha descrito anteriormente. Como otro ejemplo, las secuencias codificadoras se podrían manipular adicionalmente (p. ej., ligadas a otros enlazadores o modificadas delecionando secuencias no codificadoras de las mismas o alterando nucleótidos en las mismas mediante otras técnicas conocidas). La secuencia codificadora de BMP-12 modificada se podría insertar entonces en un vector bacteriano conocido, empleando procedimientos tales como los descritos en T. Taniguchi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980). Este vector bacteriano ejemplar se podría transformar entonces en células bacterianas hospedadoras y expresar de este modo una proteína BMP-12. Para una estrategia para producir la expresión extracelular de proteínas BMP-12 en células bacterianas, véase, p. ej., el documento de solicitud de patente europea EPA 177.343.

Se han realizado manipulaciones similares para la construcción de un vector de insecto. [Véanse, p. ej., los procedimientos descritos en el documento de solicitud de patente europea publicado 155.476] para la expresión en células de insecto. Un vector de levadura también se podría construir empleando secuencias reguladoras de levadura para la expresión intra o extracelular de los factores de la presente invención mediante células de levadura. [Véanse, p. ej., los procedimientos descritos en la solicitud de PCT publicada WO 86/00639 y el documento de solicitud de patente europea EPA 123.289].

Un método para producir altos niveles de una proteína BMP-12 de la invención en células de mamífero, puede implicar la construcción de células que contengan copias múltiples del gen heterólogo de BMP-12. El gen heterólogo está ligado a un marcador amplificable, p. ej., el gen de la reductasa de dihidrofolato (DHFR) para el cual se pueden seleccionar células que contienen copias incrementadas del gen, para la propagación en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX), de acuerdo con los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629 (1982). Este acercamiento se puede emplear con una variedad de tipos celulares distintos.

Por ejemplo, un plásmido que contiene una secuencia de ADN para una BMP-12 de la invención, ligada funcionalmente con otras secuencias de plásmidos que permiten su expresión y el plásmido de expresión de DHFR pAdA26SV(A)3 [Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982], se puede introducir conjuntamente en células CHO, deficientes para DHFR, DUKX-BII, por diferentes métodos que incluyen la coprecipitación con fosfato cálcico y la transfección, la electroporación o la fusión de protoplastos. Los transformantes que expresan DHFR se seleccionan para crecer en medios alfa con suero de ternera fetal dializado y, posteriormente, se seleccionan para la amplificación por crecimiento en concentraciones crecientes de MTX (p. ej., etapas secuenciales en MTX 0,02, 0,2, 1,0 y 5 \muM) tal y como describen Kaufman y col., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983). Los transformantes se clonan y la expresión de BMP-12 biológicamente activa se vigila mediante el ensayo en ratas de Sampath-Reddi modificado por Rosen, descrito en el Ejemplo 5. La expresión de BMP-12 se debe incrementar con niveles crecientes de resistencia a MTX. Los polipéptidos de BMP-12 se caracterizan empleando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tal como la marcación con impulsos de [^{35}S]metionina o cisteína y electroforesis en gel de poliacrilamida. Se pueden seguir procedimientos similares para producir otras proteínas relacionadas como BMP-12.

Ejemplo 3 Preparación de la fusión del propéptido de BMP-2/péptido maduro de BMP-12

Para construir un vector que codifica la fusión del propéptido BMP-2/péptido maduro BMP-12, se empleó el siguiente proceso de clonación para fusionar entre sí las dos secuencias.

Primero, un fragmento de ADN cortado con enzima de restricción que comprende el propéptido de la proteína humana BMP-2, que comprende los nucleótidos 1 a 843 de SEQ ID NO: 27, se corta de pBMP2\DeltaEMC. pBMP2\DeltaEMC es un plásmido obtenido a partir de lambda U20S-39 (ATCC nº 40345) que comprende la secuencia codificadora completa para la proteína humana BMP-2, con las secuencias 5' y 3' no traducidas de BMP-2 delecionadas del vector. La enzima de restricción 5' empleada era BglII y corta pBMP2\DeltaEMC en el vector en el nucleótido 979. La enzima de restricción 3' empleada era MaeII y corta pBMP2\DeltaEMC en el propéptido de BMP-2, en el nucleótido 1925, muy cerca del extremo carboxi. El producto resultante de 954 pb se aisló después en gel y los genes se purificaron. Segundo, un fragmento de ADN cortado con enzimas de restricción que comprende la parte 5' de la secuencia de ADN del péptido maduro de BMP-12 humana, se corta de pPCR1-1nº2 V1-1 (ATCC nº 69517). La enzima de restricción 5 empleada era EaeI y corta pPCR1-1nº2 V1-1 justo en 3' del extremo N-terminal de la secuencia peptídica madura de BMP-12 humana. El producto resultante de 259 pares de bases se aisló en gel y los genes se purificaron. Tercero, se diseñaron dos oligos de ADN y se sintetizaron, de modo que cuando se reasociaban, formaban un fragmento de ADN pequeño que comprendía la secuencia de fusión del extremo 3' del propéptido de BMP-2 humana y el extremo 5' del péptido maduro de BMP-12. El fragmento de ADN tiene un extremo cohesivo 5'complementario a MaeII que se reasocia con el fragmento 3' cortado con enzimas de restricción que comprende el propéptido de BMP-2 humana. El fragmento de ADN del oligo reasociado tiene un extremo cohesivo 3' complementario a EaeI que se reasocia con el 5' del fragmento cortado con enzimas de restricción que comprende el péptido maduro de BMP-12 humana. El oligo de la hebra codificadora se denomina B2/12 y tiene 13 pares de bases de longitud. A continuación, un fragmento de ADN que codifica las 123 pares de bases en el extremo 3' del fragmento del péptido maduro de BMP-12, se obtuvo del modo siguiente. Primero, un fragmento de ADN que comprende el propéptido de la proteína BMP-2 humana, que comprende los nucleótidos 1 a 846, se amplifica con la PCR a partir de pBMP2\DeltaEMC. El cebador 5' (oligo 655a) se reasocia justo en 5' del polienlazador. El cebador 3' (BMPpro3) se reasocia con el extremo 3' propéptido de BMP-2 se introduce un sitio para la enzima de restricción BglII mediante mutaciones con secuencias silenciosas. El producto resultante de la PCR se cortó con SalI que corta en el polienlazador y BglII. El fragmento de restricción de 850 pares de bases (que termina en la secuencia de aminoácidos REKR) se aisló en gel y se purificó el gen. El péptido maduro de BMP-12 se amplificó con PCR, empleando un cebador 5' (oligo 5-1) que codifica el sitio de la enzima de restricción BglII mediante mutaciones con secuencias silenciosas y se reasoció con el extremo 5' de un posible producto de escisión maduro, que comienza con la secuencia de aminoácidos SRCS. El cebador 3' (V1-1 3) se reasocia con el extremo 3' del péptido maduro de BMP-12 e introduce un sitio para la enzima de restricción XbaI después del codón de detención. El producto de la PCR resultante, se cortó con BglII y XbaI. El fragmento de restricción de 321 pares de bases se aisló en gel y se purificó el gen.

Los dos fragmentos de restricción se ligaron de forma trilateral en un vector que se corta previsiblemente con SalI y XbaI. La estructura artificial resultante se secuenció para comprobar la presencia de errores inducidos con la PCR y se observó una mutación silenciosa de C a T en el par de bases 185 en el propéptido. Este plásmido se denominó pREKRSRC. A continuación se cortó pREKRSRC con BglII y NgoMI y el fragmento del vector que contenía las 123 últimas pares de bases de la secuencia madura de BMP-12, se aisló de este modo. Los tres fragmentos de restricción y el oligoenlazador reasociado se ligaron en cuatro direcciones para obtener pREKR-TAL con el propéptido BMP-2 con el sitio de corte maduro en el extremo 3', fusionado con el extremo 5’ (TAL) del péptido maduro de BMP-12. La secuencia codificadora del vector ligado resultante se muestra en SEQ ID NO: 27.

Ejemplo 4 Actividad biológica de BMP-12 expresada

Para medir la actividad biológica de las proteínas BMP-12 expresadas, obtenidas en el Ejemplo 2 anterior, se recuperaron las proteínas del cultivo celular y se purificaron aislando las proteínas BMP-12 de los otros materiales proteináceos con los que se habían coproducido, así como de otros contaminantes. La proteína purificada se puede someter a ensayo de acuerdo con el ensayo en ratas descrito a continuación en el Ejemplo 5.

La purificación se realizó empleando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

El análisis de las proteínas se realizó mediante técnicas convencionales tales como SDS-PAGE acrilamida [Laemmli, Nature 227:680 (1970)]; tinción con azul de Coomassie o plata [Oakley y col., Anal. Biochem, 105:361 (1980)] y por inmunotransferencia [Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)].

Ejemplo 5 Ensayo de Sampath-Reddi modificado por Rosen

Se emplea una versión modificada del ensayo de implante ectópico en ratas, descrito por Sampath y Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591-6595 (1983), para evaluar la actividad de las proteínas BMP-12. Este ensayo modificado se denomina en esta memoria ensayo de Sampath-Reddi modificado por Rosen. El ensayo se ha empleado ampliamente para evaluar la actividad inductora de hueso y de cartílago de las BMP. La etapa de precipitación con etanol del procedimiento de Sampath-Reddi se sustituye por la dialización (si la composición es una solución) o la diafiltración (si la composición es una suspensión) de la fracción que se va a someter a ensayo, frente a agua. La solución o la suspensión se equilibra a continuación con TFA al 0,1%. La solución resultante se añade a 20 mg de matriz de rata. Una muestra simulada de matriz de rata no tratada con la proteína sirve como testigo. Este material se congela y se liofiliza y el polvo resultante se incluye en cápsulas de gelatina nº 5. Las cápsulas se implantan por vía subcutánea en el área torácica abdominal de ratas macho Long Evans con 21-49 días de edad. Los implantes se retiran después de 10 días. Una sección de cada implante se fija y se procesa para análisis histológico. Se tiñen secciones de 1 \mum de metacrilato de glicol con Von Kossa y fucsina ácida para valorar la cantidad de formación de tejido similar al tendón/ligamento que se ha inducido, presente en cada implante.

La BMP-12 se implantó en las ratas con dosis de 1, 5, 25 y 50 \mug por implante durante 10 días. La BMP-2 con una dosis de 5 \mug se incluyó como testigo positivo. Para todas las dosis de BMP-12 sometidas a ensayo, no se observó formación de hueso o de cartílago en los implantes después de diez días. Por el contrario, los implantes se llenaron con tejido semejante a tendón embrionario que se reconoce fácilmente por la presencia de haces densos de fibroblastos, orientados en el mismo plano y empaquetados muy juntos entre sí. [El tejido similar al tendón/ligamento se describe, por ejemplo, en Ham y Cormack, Histology (JB Lippincott Co. (1979), págs. 367-369)].

Estos descubrimientos se reprodujeron en un segundo grupo de ensayos en los que estaban presentes tejidos similares al tendón/ligamento en todos los implantes que contenían BMP-12. Por el contrario, los implantes de BMP-2, tal y como se esperaba, mostraban formación de cartílago y de hueso pero no contenían tejido similar a tendón/ligamento.

Las proteínas BMP-12 y las proteínas relacionadas de esta invención se pueden valorar por la actividad en este ensayo.

Ejemplo 6

Empleando métodos de acuerdo con los ejemplos anteriores, con modificaciones menores dentro del estado de la técnica, la proteína MP52 humana y el homólogo de múridos de la proteína BMP-13, se expresaron y se sometió a ensayo la actividad inductora de la formación de tejido similar a tendón/ligamento. Todas las proteínas mostraban resultados comparables, similares a los descritos anteriormente para la BMP-12.

Las descripciones anteriores detallan realizaciones actualmente preferidas de la presente invención. Se espera que los expertos en la técnica realicen numerosas modificaciones y variaciones en la puesta en práctica de la misma, después de considerar estas descripciones. Las modificaciones y las variaciones se consideran que están incluidas dentro de las reivindicaciones adjuntas a esta memoria.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, INC. PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES QUE INDUCEN TENDÓN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: GENETICS INSTITUTE, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 87 CambridgePark Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Cambridge

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Massachusetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 02140

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: Adjunta

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/164.103

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-DIC-1993

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/217.780

\vskip0.500000\baselineskip

(D): FECHA DE PRESENTACIÓN: 25-MAR-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/333.576

\vskip0.500000\baselineskip

(F): FECHA DE PRESENTACIÓN: 02-NOV-1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Lazar, Steven R.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE INSCRIPCIÓN: 32.618

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE ORDEN: 5202D-PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 617 498-8260

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 617 876-5851

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: v1-1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 571..882

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..882

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 294 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1207 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MP52

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 845..1204

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 120 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 128 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: fragmento de V1-1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28..102

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Asp Try Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cyas Asp Phe Pro}

\sac{Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Try Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 128 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: VL-1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28..102

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Val Cys Asp Phe Pro}

\sac{Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3585 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: pALV1-78

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: mV1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28..243

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: mV2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28..243

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: mV9

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 28..243

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 72 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Secuencia consenso BMP/TGF-beta

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Xaa Asp Trp Ile Xaa Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: oligonucleótido nº 1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGATCCTGG VANGAYTGGA THRTNGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: secuencia consenso BMP/TGF-beta

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Ala Ile Xaa Gln Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: oligonucleótido nº 2

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCTAGAAR NGTYTGNACD ATNGCRTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: oligonucleótido nº 3

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACTGCGAG GGCCTTTGCG ACTTCCCTTT GCGTTCGCAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): GENOTECA: oligonucleótido nº 4

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGGATCCA GCCGCTGCAG CCGCAAGCC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: oligonucleótido nº 5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTCTAGAC TACCTGCAGC CGCAGGCCT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): GENOTECA: oligonucleótido nº 6

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGATCCAA GGAGCTCGGC TGGGACGA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: oligonucleótido nº 7

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCCCC ACCACCATGT CCTCGTAT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1171 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: proteína VL-1 humana

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2..964

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 605..964

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 321 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

25

250

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1233 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: ADN que codifica el propéptido BMP-2/péptido maduro BMP-12

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1233

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 847..1233

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 411 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1203 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MV1 de múrido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2..721

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

31

32

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 240 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1046 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): NO CODIFICANTE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: MV2 de múrido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2..790

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1345 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): NO CODIFICANTE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: VI-1 humano

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 138..1301

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 990..1301

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 388 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): NO CODIFICANTE: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MATERIAL AISLADO INDIVIDUAL: cebador número 8

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTATGCGAC TTCCCGC

\hfill

17

Claims

1. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo consistente en:

(a) nucleótidos nº 196, nº 199, nº 208, nº 217, nº 361, nº 388, nº 493, nº 496, nº 571 o nº 577 hasta nº 879 o nº 882 de SEQ ID NO: 1;

(b) nucleótidos que codifican los aminoácidos nº -25, nº 1 o nº 3 hasta nº 103 o nº 104 de SEQ ID NO: 2;

(c) nucleótidos nº 410, nº 458, nº 602, nº 605 o nº 659 hasta nº 961 o nº 964 de SEQ ID NO: 25;

(d) nucleótidos que codifican los aminoácidos nº 1 o nº 19 hasta nº 119 o nº 120 de SEQ ID NO: 26; o

(e) secuencias alélicas humanas presentes en la naturaleza o secuencias equivalentes con codones degenerados de una cualquiera de (a) a (d);

en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar al tendón o similar al ligamento.

2. Una molécula de ADN quimérica que comprende una secuencia de ADN que codifica un propéptido de un miembro de la familia BMP de proteínas ligadas con el marco de lectura correcto, a una secuencia de ADN de la reivindicación 1.

3. Una molécula de ADN quimérica que comprende una secuencia de ADN que codifica un propéptido de un miembro de la superfamilia TGF-\beta de proteínas ligadas con el marco de lectura correcto, a una secuencia de ADN de la reivindicación 1.

4. La molécula de ADN quimérica de la reivindicación 3, en donde el propéptido es de BMP-2.

5. Un vector que comprende la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, asociado funcionalmente con una secuencia de control de la expresión para la misma.

6. Una célula hospedadora transformada con la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el vector de la reivindicación 5.

7. Un método para producir un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento de BMP-12 o de una proteína relacionada con BMP-12, que comprende:

(a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 6, y

(b) recuperar y, opcionalmente, purificar dicha BMP-12 o dicha proteína relacionada con BMP-12 del medio de cultivo.

8. Un polipéptido que tiene la capacidad de inducir la formación de tejido similar a tendón/ligamento de BMP-12 o de una proteína relacionada con BMP-12, codificado por la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o producido por el método de la reivindicación 7.

9. Un polipéptido en forma de un dímero comprendido por dos subunidades, cada una con la secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Una molécula proteica heterodímera que comprende un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la reivindicación 8, y un monómero que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína de la superfamilia TGF-\beta.

11. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, opcionalmente incorporada por mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable.