ES2295026T3 - Proteinas gil-19/ae289 humanas y polinucleotidos que codifican las mismas. - Google Patents
Proteinas gil-19/ae289 humanas y polinucleotidos que codifican las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por: (a) la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1; (b) la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65 hasta el nucleótido 601; (c) la secuencia de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína de longitud completa del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231; (d) la secuencia de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína madura del clon HGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; (f) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179; y
Description
Proteínas GIL-19/AE289 humanas y
polinucleótidos que codifican las mismas.
La presente invención proporciona proteínas
novedosas que muestran homología con interleucina 10
(IL-10) y polinucleótidos que codifican tales
proteínas, junto con utilidades terapéuticas, de diagnóstico y de
investigación para estos polinucleótidos y proteínas.
La tecnología dirigida al descubrimiento de
factores proteicos (incluyendo por ejemplo, citocinas, tales como
linfocinas, interferones, CSF e interleucinas) ha madurado
rápidamente durante la última década. Las ahora rutinarias técnicas
de clonación por expresión y clonación por hibridación clonan
polinucleótidos novedosos "directamente" en el sentido de que
se basan en información directamente relacionada con la proteína
descubierta (es decir, secuencia parcial de ADN/aminoácidos de la
proteína en el caso de la clonación por hibridación; actividad de
la proteína en el caso de la clonación por expresión). Técnicas más
recientes de clonación "indirecta" tales como clonación por
secuencia señal, que aísla secuencias de ADN basándose en la
presencia de un motivo de secuencia líder secretora ahora bien
reconocido, así como diversas técnicas de clonación por hibridación
de baja rigurosidad o basadas en PCR, han hecho avanzar el estado de
la técnica poniendo a disposición grandes números de secuencias de
ADN/aminoácidos para proteínas que se sabe que tienen actividad
biológica en virtud de su naturaleza secretada en el caso de la
clonación por secuencia líder, o en virtud de la fuente celular o
tisular en el caso de las técnicas basadas en PCR. A estas proteínas
y los polinucleótidos que las codifican es a los que se refiere la
presente invención.
En una realización, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo
constituido por:
(a) un polinucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos de SEC ID NO: 1;
(b) un polinucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65 hasta el
nucleótido 601;
(c) un polinucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína de longitud
completa del clon hGIL-19/AE289 depositado con el
número de acceso ATCC 207231;
(d) un polinucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína madura del
clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de
acceso ATCC 207231;
(e) un polinucleótido que codifica una proteína
que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2;
(f) a secuencia de nucleótidos que codifica una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2
desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179; y
(g) una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 2, comprendiendo el fragmento una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los
aminoácidos 50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2.
Preferiblemente, tal polinucleótido comprende la
secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65
hasta el nucleótido 601; la secuencia de nucleótidos de la secuencia
que codifica proteína de longitud completa del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231; o la secuencia de nucleótidos de una secuencia que
codifica proteína madura del clon hGIL-19/AE289
depositado con el número de acceso ATCC 207231 (por ejemplo,
nucleótidos 1-1177 de SEC ID NO: 1). En otras
realizaciones preferidas, el polinucleótido codifica la proteína de
longitud completa o madura codificada por el inserto de ADNc del
clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de
acceso ATCC 207231 (por ejemplo, aminoácidos 1-179
de SEC ID NO: 2). También se describen en el presente documento
polinucleótidos que codifican una proteína que comprende un
fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 que tiene
actividad biológica, comprendiendo preferiblemente el fragmento
ocho (más preferiblemente veinte, lo más preferiblemente treinta)
aminoácidos contiguos de SEC ID NO: 2, o un polinucleótido que
codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 2 que tiene actividad biológica,
comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos desde el
aminoácido 84 hasta el aminoácido 93 de SEC ID NO: 2.
Otras realizaciones proporcionan el gen
correspondiente a la secuencia de ADNc de SEC ID NO: 1.
También se describen en el presente documento
polinucleótidos aislados producidos según un procedimiento
seleccionado del grupo constituido por:
(a) un procedimiento que comprende las etapas
de:
- (i)
- preparar una o más sondas de polinucleótido que se hibridan en 6X SSC a 65ºC con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
- (aa)
- SEC ID NO: 1, pero excluyendo la cola de poli(A) en el extremo 3' de SEC ID NO: 1; y
- (ab)
- la secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231;
- (ii)
- hibridar dicha(s) sonda(s) con ADN genómico humano en condiciones al menos tan rigurosas como 4X SSC a 50ºC; y
- (iii)
- aislar los polinucleótidos de ADN detectados con la(s) sonda(s); y
(b) un procedimiento que comprende las etapas
de:
- (i)
- preparar uno o más cebadores de polinucleótido que se hibridan en 6X SSC a 65ºC con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
- (ba)
- SEC ID NO: 1, pero excluyendo la cola de poli(A) en el extremo 3' de SEC ID NO: 1; y
- (bb)
- la secuencia de nucleótidos del inserto de ADNc del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231;
- (ii)
- hibridar dicho(s) cebador(es) con ADN genómico humano en condiciones al menos tan rigurosas como 4X SSC a 50ºC;
- (iii)
- amplificar secuencias de ADN humano; y
- (iv)
- aislar los productos de polinucleótido de la etapa (b)(iii).
Preferiblemente, el polinucleótido aislado según
el procedimiento anterior comprende una secuencia de nucleótidos
correspondiente a la secuencia de ADNc de SEC ID NO: 1, y que se
extiende de manera contigua desde una secuencia de nucleótidos
correspondiente al extremo 5' de SEC ID NO: 1 hasta una secuencia de
nucleótidos correspondiente al extremo 3' de SEC ID NO: 1, pero
excluyendo la cola de poli(A) en el extremo 3' de SEC ID NO:
1. También preferiblemente, el polinucleótido aislado según el
procedimiento anterior comprende una secuencia de nucleótidos
correspondiente a la secuencia de ADNc de SEC ID NO: 1 desde el
nucleótido 65 hasta el nucleótido 601, y que se extiende desde una
secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' de dicha
secuencia de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65 hasta el
nucleótido 601, hasta una secuencia de nucleótidos correspondiente
al extremo 3' de dicha secuencia de SEC ID NO: 1 desde el
nucleótido 65 hasta el nucleótido 601.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona una composición que comprende una proteína, en la que
dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:
2;
(b) un fragmento de la secuencia de aminoácidos
de SEC ID NO: 2, comprendiendo el fragmento una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos
50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2;
(c) la secuencia de aminoácidos codificada por
una secuencia que codifica proteína de longitud completa del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231;
(d) la secuencia de aminoácidos codificada por
una secuencia que codifica proteína madura del clon
hGIL-19/
AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231; y
AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231; y
(e) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2
desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179;
estando la proteína sustancialmente libre de
otras proteínas de mamífero. Preferiblemente, tal proteína comprende
la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2. También se describe en
el presente documento una proteína que comprende un fragmento de la
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 que tiene actividad
biológica, comprendiendo preferiblemente el fragmento ocho (más
preferiblemente veinte, lo más preferiblemente treinta) aminoácidos
contiguos de SEC ID NO: 2.
En ciertas realizaciones preferidas, el
polinucleótido está operativamente unido a una secuencia de control
de la expresión. La invención también proporciona una célula
huésped, incluyendo células bacterianas, de levadura, de insectos y
de mamíferos, transformadas con tales composiciones de
polinucleótido. La presente invención también proporciona
organismos que tienen una expresión potenciada, reducida o
modificada del/de los gen(es) correspondien-
te(s) a la secuencia de polinucleótido dada a conocer en el presente documento.
te(s) a la secuencia de polinucleótido dada a conocer en el presente documento.
También se proporcionan procedimientos para
producir una proteína, que comprenden:
(a) hacer crecer un cultivo de la célula huésped
transformada con tales composiciones de polinucleótido en un medio
de cultivo adecuado; y
(b) purificar la proteína del cultivo. La
presente invención también proporciona la proteína producida según
tales procedimientos.
Las composiciones de proteína de la presente
invención pueden comprender adicionalmente un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la invención se refiere a
un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a una proteína tal
como se describe y reivindica en el presente documento. El
anticuerpo puede ser un anticuerpo neutralizante, y puede
seleccionarse del grupo constituido por un anticuerpo monoclonal, un
anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de
cadena sencilla, un anticuerpo con injerto de CDR y un anticuerpo
humanizado. También puede ser un anticuerpo humano.
Aún en otra realización, la invención se refiere
al uso de un anticuerpo tal como se describe y reivindica en el
presente documento para la preparación de una composición
farmacéutica para tratar o prevenir la artritis en un sujeto. En
una realización, la artritis es artritis reumatoide.
En otra realización, la invención se refiere a
un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos
que se hibrida en condiciones sumamente rigurosas con SEC ID NO: 1
o un complemento de la misma. Aún en otra realización, la invención
se refiere a una proteína codificada por una secuencia de
nucleótidos que se hibrida en condiciones sumamente rigurosas con
el complemento de SEC ID NO: 1, estando la proteína sustancialmente
libre de otras proteínas de mamífero.
La invención se refiere adicionalmente a un
polinucleótido aislado que codifica un fragmento de una proteína
que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por los aminoácidos 50-60,
63-81 y 168-177 de SEC ID NO: 2.
Además, la invención se refiere a un fragmento de una proteína
sustancialmente purificada que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos
50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2.
Aún en otra realización, la invención se refiere
a una proteína de fusión que comprende una proteína tal como se
describe y reivindica en el presente documento fusionada a una
molécula vehículo. La molécula vehículo puede ser una
inmunoglobulina o la parte Fc de una inmunoglobulina. La
inmunoglobulina puede ser una inmunoglobulina IgG o una IgM. La
proteína puede estar fusionada adicionalmente con la molécula
vehículo a través de una secuencia conectora.
La presente invención también proporciona
composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona
específicamente con la proteína descrita y reivindicada en el
presente documento.
También se describen procedimientos en el
presente documento para prevenir, tratar o mejorar un estado médico
que comprende administrar a un sujeto mamífero una cantidad
terapéuticamente eficaz de una composición que comprende una
proteína de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
A continuación se notifican secuencias de
nucleótidos y aminoácidos, tal como se determinan en el presente
documento, para cada clon y proteína descrita en la presente
solicitud. La secuencia de nucleótidos de cada clon puede
determinarse fácilmente secuenciando el clon depositado según
procedimientos conocidos. Entonces puede determinarse la secuencia
de aminoácidos prevista (formas tanto de longitud completa como
madura) a partir de tal secuencia de nucleótidos. También puede
determinarse la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada
por un clon particular mediante expresión del clon en una célula
huésped adecuada, recogida de la proteína y determinación de su
secuencia.
Tal como se usa en el presente documento una
proteína "secretada" es una que, cuando se expresa en una
célula huésped adecuada, se transporta a través de una membrana,
incluyendo transporte como resultado de secuencias señal en su
secuencia de aminoácidos. Las proteínas "secretadas" incluyen,
sin limitación, proteínas secretadas totalmente (por ejemplo,
proteínas solubles) o parcialmente (por ejemplo, receptores) de la
célula en la que se expresan. Las proteínas "secretadas"
también incluyen, sin limitación, proteínas que se transportan a
través de la membrana del retículo endoplasmático.
Se identificó inicialmente un polinucleótido de
la presente invención como clon "hTIF/AE289", posteriormente
se renombró y también se le hace referencia en el presente documento
como "hGIL-19/AE289" y
"hGIL-19". El clon
hGIL-19/AE289 se aisló según el siguiente
procedimiento. Se identificó una EST murina a partir de una
biblioteca de ADNc murino preparada a partir de esplenocitos
activados tanto con ConA como células dendríticas derivadas de
médula ósea. Se identificó la EST usando procedimientos que son
selectivos para ADNc que codifican proteínas secretadas (véase la
patente estadounidense número 5.536.637). Se usó la secuencia EST
murina para aislar un clon murino de longitud completa de la misma
biblioteca de ADNc (SEC ID NO: 4; la figura 1 representa la
secuencia del ADNc de GIL-19 murino). El análisis de
la secuencia del clon murino reveló una homología significativa con
interleucina-10 (IL-10).
Con el fin de aislar un homólogo humano del clon
murino, se construyeron cebadores de PCR basándose en la región de
la secuencia murina que mostraba homología con
IL-10. El uso de tales cebadores para la
amplificación en una biblioteca de CMSP humanas produjo un producto
de PCR de tamaño significativo. El análisis de la secuencia del
producto de PCR confirmó que era un homólogo del ADNc murino. Se
construyeron oligonucleótidos a partir de la secuencia del clon
humano parcial y se usaron para aislar un clon de longitud completa
human de la biblioteca de CMSP.
El hGIL-19/AE289 es un clon
humano de longitud completa, que incluye toda la secuencia
codificante de una proteína secretada (también denominada en el
presente documento como "proteína de hTIF/AE289", "proteína
de hGIL-19/AE289" y "proteína de
hGIL-19"). El análisis de su secuencia confirma
su homología con IL-10.
La secuencia de nucleótidos de
hGIL-19 tal como se determina en el presente
documento se notifica en SEC ID NO: 1, e incluye un cola de
poli(A). El marco de lectura abierto y la secuencia de
aminoácidos de proteína hGIL-19 de longitud
completa correspondiente a la secuencia de nucleótidos anterior se
notifica en SEC ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de
hGIL-19 madura corresponde a los aminoácidos
34-179 de SEC ID NO: 2.
El clon "hGIL-19/AE289" se
depositó el 28 de abril de 1999 en la colección americana de
cultivos tipo ("American Type Culture Collection") (10801
University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209
EE.UU.) como un depósito original según el tratado de Budapest y se
le asignó el número de acceso ATCC 207231. Todas las limitaciones
sobre la disponibilidad para el público del material depositado se
eliminarán irrevocablemente tras conceder la patente, excepto por
los requisitos especificados en el artículo 37 del C.F.R. nº
1.808(b), y el término del depósito cumplirá con el artículo
37 del C.F.R. nº 1.806.
La presente invención también abarca fragmentos
de las proteínas de la presente invención (por ejemplo fragmentos
que pueden mostrar actividad biológica). Los fragmentos de la
proteína pueden ser de forma lineal o pueden ciclarse usando
procedimientos conocidos, por ejemplo, tal como se describe en H. U.
Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778
(1992) y en R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114,
9245-9253 (1992). Tales fragmentos pueden
fusionarse con moléculas vehículo tales como inmunoglobulinas para
muchos fines, incluyendo aumentar la valencia de los sitios de
unión a proteína. Por ejemplo, los fragmentos de la proteína pueden
fusionarse a través de secuencias "conectoras" a la parte Fc de
una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la proteína, una
fusión de este tipo puede ser a la parte Fc de una molécula de IgG.
También pueden usarse otros isotipos de inmunoglobulina para
generar tales fusiones. Por ejemplo, una fusión
proteína-IgM generará una forma decavalente de la
proteína de la invención.
La presente invención también proporciona las
formas tanto de longitud completa como madura de las proteínas
descritas. La forma de longitud completa de tales proteínas se
identifica en el listado de secuencias mediante traducción de la
secuencia de nucleótidos de cada clon descrito. La(s)
forma(s) madura(s) de tal proteína puede(n)
obtenerse mediante expresión del polinucleótido de longitud completa
descrito (preferiblemente los depositados en la ATCC) en una célula
de mamífero adecuada u otra célula huésped. La(s)
secuencia(s) de la(s) forma(s)
madura(s) de la proteína también pueden ser determinables a
partir de la secuencia de aminoácidos de la forma de longitud
completa y se exponen en el presente documento, por ejemplo como
aminoácidos 1-179 de SEC ID NO: 2.
La presente invención también proporciona genes
correspondientes a las secuencias de polinucleótido descritas en el
presente documento. Los "genes correspondientes" son las
regiones del genoma que se transcriben para producir los ARNm a
partir de los cuales se derivan las secuencias de polinucleótido de
ADNc y pueden incluir regiones contiguas del genoma necesarias para
la expresión regulada de tales genes. Los genes correspondientes
pueden incluir por tanto, pero no se limitan a, secuencias
codificantes, regiones no traducidas en sentido 5' y 3',
potenciadores, promotores, intrones y exones cortados de manera
alternativa, y elementos silenciadores o supresores. Los genes
correspondientes pueden aislarse según procedimientos conocidos
usando la información de secuencia descrita en el presente
documento. Tales procedimientos incluyen la preparación de sondas o
cebadores a partir de la información de secuencia descrita para la
identificación y/o amplificación de genes en bibliotecas genómicas
apropiadas u otras fuentes de materiales genómicos. Un "gen
aislado" es un gen que se ha separado de las secuencias
codificantes adyacentes, si las hay, presentes en el genoma del
organismo del que se ha aislado el gen.
También puede determinarse la ubicación
cromosómica correspondiente a las secuencias de polinucleótido
descritas en el presente documento, por ejemplo, hibridando
polinucleótidos de la presente invención apropiadamente marcados
con cromosomas in situ. También puede ser posible determinar
la ubicación cromosómica correspondiente para un polinucleótido
descrito identificando secuencias de nucleótidos significativamente
similares en bases de datos públicas, tales como etiquetas de
secuencia expresadas (EST), que ya se han mapeado en ubicaciones
cromosómicas particulares. Para al menos algunas de las secuencias
de polinucleótido descritas en el presente documento, se han
enumerado secuencias de bases de datos públicas que tienen al menos
algo de similitud con el polinucleótido de la presente invención
mediante número de acceso de la base de datos. Entonces pueden
realizarse búsquedas usando los números de acceso de GeneBank de
estas secuencias de bases de datos públicas en un sitio de internet
proporcionado por el Centro Nacional para la Información
Biotecnológica ("National Center for Biotechnology
Information") que tiene la dirección
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, con el fin de identificar
"agrupaciones de UniGene" de secuencias solapantes. Muchas de
las "agrupaciones de UniGene" así identificadas ya se habrán
mapeado en sitios cromosómicos particulares.
Se proporcionan organismos que tienen expresión
potenciada, reducida o modificada del/de los gen(es)
correspondientes a las secuencias de polinucleótido descritas en el
presente documento. El cambio deseado en la expresión génica puede
lograrse mediante el uso de polinucleótidos antisentido o ribozimas
que se unen y/o rompen el ARNm transcrito a partir del gen (Albert
y Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15(7):
250-254; Lavarosky et al., 1997, Biochem.
Mol. Med 62(1): 11-22; y Hampel, 1998, Prog.
Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1-39). Se
proporcionan animales transgénicos no humanos que tienen múltiples
copias del/de los gen(es) correspondiente(s) a las
secuencias de polinucleótido descritas en el presente documento,
preferiblemente producidos mediante transformación de células con
constructos génicos que se mantienen de manera estable dentro de las
células transformadas y su progenie. También se proporcionan
animales transgénicos no humanos que tienen regiones de control
génico modificadas que aumentan o reducen los niveles de expresión
génica, o que cambian los patrones temporales o espaciales de la
expresión génica (véase la patente europea número 0649 464 B1).
Además, se proporcionan organismos no humanos en los que el/los
gen(es) correspondiente(s) a las secuencias de
polinucleótido descritas en el presente documento se han inactivado
parcial o completamente, mediante inserción de secuencias extrañas
en el/los gen(es) correspondiente(s) o mediante
deleción de todos o parte del/de los gen(es)
correspondiente(s). La inactivación génica parcial o
completa puede lograrse mediante inserción, preferiblemente seguido
por escisión imprecisa, de elementos transponibles (Plasterk, 1992,
Bioessays 14(9): 629-633; Zwaal et
al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(16):
7431-7435; Clark et al., 1994, Proc. Natl.
Acad Sci. USA 91(2): 719-722), o mediante
recombinación homóloga, preferiblemente detectada mediante
estrategias de selección génica positiva/negativa (Mansour et
al., 1988, Nature 336: 348-352; patentes
estadounidenses números 5.464.764; 5.487.992; 5.627.059; 5.631.153;
5.614.396; 5.616.491 y 5.679.523). Estos organismos con expresión
génica alterada son preferiblemente eucariotas y son más
preferiblemente mamíferos no humanos. Tales organismos son útiles
para el desarrollo de modelos no humanos para el estudio de
trastornos que implican el/los gen(es)
correspondiente(s), y para el desarrollo de sistemas de
ensayo para la identificación de moléculas que interaccionan con
el/los producto(s) de proteína del/de los gen(es)
correspondiente(s).
Las proteínas y fragmentos de proteína descritos
en el presente documento incluyen proteínas con longitudes de
secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más
preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos
el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos el
60% de identidad de secuencia (más preferiblemente, al menos el 75%
de identidad; lo más preferiblemente al menos el 90% o el 95% de
identidad) con esa proteína descrita, en las que la identidad de
secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de
las proteínas cuando están alineadas de manera que se maximiza el
solapamiento y la identidad al tiempo que se minimizan los huecos
de secuencia. También se incluyen proteínas y fragmentos de proteína
que contienen un segmento que comprende preferiblemente 8 o más
(más preferiblemente 20 o más, lo más preferiblemente 30 o más)
aminoácidos contiguos que comparte al menos el 75% de identidad de
secuencia (más preferiblemente, al menos el 85% de identidad; lo
más preferiblemente al menos el 95% de identidad) con cualquier
segmento de este tipo de cualquiera de las proteínas descritas.
En una realización, las proteínas, fragmentos de
proteína y proteínas recombinantes de la presente invención
incluyen las que pueden identificarse basándose en la presencia de
al menos un "motivo de unión al receptor de
HGIL-19/AE299." Tal como se usa en el presente
documento, la expresión "motivo de unión al receptor de
hGIL-19/AE289" incluye secuencias o residuos de
aminoácidos que son importantes para la unión de
hGIL-19 a su receptor requerido. En una realización
preferida, una proteína hGIL-19 contiene un motivo
de unión al receptor de hGIL-19/AE289 que incluye
aproximadamente los aminoácidos 50-60 de SEC ID NO:
2. En otra realización, una proteína GIL-19
contiene un motivo de unión al receptor de
hGIL-19/AE289 que incluye aproximadamente los
aminoácidos 63-81 de SEC ID NO: 2. Aún en otra
realización, una proteína GIL-19 contiene un motivo
de unión al receptor de hGIL-19/AE289 que incluye
aproximadamente los aminoácidos 168-177 de SEC ID
NO: 2. En una realización preferida, una proteína
GIL-19 contiene un motivo de unión al receptor de
hGIL-19/AE289 que incluye al menos uno de los
aminoácidos 50-60, los aminoácidos
63-81 y/o aproximadamente los aminoácidos
168-177 de SEC ID NO: 2.
Aún en otra realización, un motivo de unión al
receptor de hGIL-19/AE289 tiene una secuencia de
aminoácidos de al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad o
más con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por los aminoácidos 50-60 de SEC ID NO:
2, los aminoácidos 63-81 de SEC ID NO: 2 y los
aminoácidos 168-177 de SEC ID NO: 2.
En otra realización, las proteínas, fragmentos
de proteína y proteínas recombinantes de la presente invención
incluyen aquellas que pueden identificarse basándose en la presencia
de al menos uno, dos, tres, cuatro o más sitios para la
glucosilación unida a N.
En particular, la identidad de secuencia puede
determinarse usando el programa WU-BLAST (Washington
University BLAST) versión 2.0, que se construye basándose en
WU-BLAST versión 1.4, que a su vez se basa en el
NCBI-BLAST de dominio público versión 1.4 (Altschul
y Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in
Enzymology 266: 460-480; Altschul et al.,
1990, Basic local alignment search tool, Journal of Molecular
Biology 215: 403-410; Gish y States, 1993,
Identification of protein coding regions by database similarity
search, Nature Genetics 3: 266-272; Karlin y
Altschul, 1993, Applications and statistics for multiple
high-scoring segments in molecular sequences, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Los programas
ejecutables de WU-BLAST versión 2.0 para diversas
plataformas UNIX pueden descargarse desde
ftp://blast.wustl.edu/bast/executables. En ese sitio se proporciona
la serie completa de programas de búsqueda (BLASTP, BLASTN, BLASTX,
TBLASTN y TBLASTX), además de varios programas de apoyo.
WU-BLAST 2.0 está registrado y no puede venderse ni
redistribuirse de ninguna forma ni manera sin el consentimiento
expreso por escrito del autor; pero por lo demás los ejecutables
publicados pueden usarse libremente para fines comerciales, sin
beneficio o académicos. En todos los programas de búsqueda en la
serie (BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN y TBLASTX) las rutinas de
alineación con huecos son parte integral de la propia búsqueda de
bases de datos, y por tanto proporcionan una sensibilidad y
selectividad mucho mejores mientras producen un resultado más
fácilmente interpretable. Opcionalmente, puede desactivarse la
formación de huecos en todos estos programas, si se desea. La
penalización por defecto (Q) para un hueco de longitud uno es Q=9
para proteínas y BLASTP, y Q=10 para BLASTN, pero puede cambiarse
por cualquier valor entero incluyendo cero, de uno a ocho, nueve,
diez, once, de doce a veinte, de veintiuno a cincuenta, de cincuenta
y uno a cien, etc. La penalización por residuo por defecto para
extender un hueco (R) es R=2 para proteínas y BLASTP, y R=10 para
BLASTN, pero puede cambiarse por cualquier valor entero incluyendo
cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,
diez, once, de doce a veinte, de veintiuno a cincuenta, de cincuenta
y uno a cien, etc. Puede usarse cualquier combinación de valores
para Q y R con el fin de alinear secuencias de manera que se
maximice el solapamiento e identidad mientras que se minimizan los
huecos de secuencia. La matriz de comparación de aminoácidos por
defecto es BLOSUM62, pero pueden utilizarse otras matrices de
comparación de aminoácidos tales como PAM.
En el presente documento también se describen
homólogos de especie de los polinucleótidos y proteínas descritas.
Tal como se usa en el presente documento, un "homólogo de
especie" es una proteína o polinucleótido con una especie de
origen diferente de la de una proteína o polinucleótido dado, pero
con similitud de secuencia significativa con la proteína o
polinucleótido dado. Preferiblemente, los homólogos de especie de
polinucleótidos tienen al menos el 60% de identidad de secuencia
(más preferiblemente, al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) con
el polinucleótido dado, y los homólogos de especie de proteína
tienen al menos el 30% de identidad de secuencia (más
preferiblemente, al menos el 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%) con la proteína dada, en los que la identidad de
secuencia se determina comparando las secuencias de nucleótidos de
los polinucleótidos o la secuencias de aminoácidos de las proteínas
cuando están alineadas de manera que se maximiza el solapamiento y
la identidad mientras se minimizan los huecos de secuencia. Los
homólogos de especie pueden aislarse e identificarse preparando
sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias
proporcionadas en el presente documento y examinando una fuente de
ácido nucleico adecuada a partir de la especie deseada.
Preferiblemente, los homólogos de especie son los aislados a partir
de especies de mamíferos. Lo más preferiblemente, los homólogos de
especie son los aislados a partir de ciertas especies de mamíferos
tales como, por ejemplo, Pan troglodytes, Gorilla
gorilla, Pongo pygmaeus, Hylobates concolor,
Macaca mulatta, Papio papio, Papio hamadryas,
Cercopithecus aethiops, Cebus capucinus,
Aotus trivirgarus, Sanguinus oedipus, Microcebus
murinus, Mus musculus, Rattus norvegicus,
Cricetulus griseus, Felis catus, Mustela vison,
Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus,
Bos taurus, Ovis aries, Sus scrofa y
Equus caballus, para los cuales se han creado mapas
genéticos que permiten la identificación de relaciones sinténicas
entre la organización genómica de genes en una especie y la
organización genómica de los genes relacionados en otra especie
(O'Brien y Seuánez, 1988, Ann. Rev. Genet. 22:
323-351; O'Brien et al., 1993, Nature
Genetics 3: 103-112; Johansson et al., 1995,
Genomics 25: 682-690; Lyons et al., 1997,
Nature Genetics 15: 47-56; O'Brien et al.,
1997, Trends in Genetics 13(10): 393-399;
Carver y Stubbs, 1997, Genome Research 7:
1123-1137).
En el presente documento también se describen
variantes alélicas de los polinucleótidos o proteínas descritas; es
decir, formas alternativas que se producen de manera natural de los
polinucleótidos aislados que también codifican proteínas que son
idénticas o tienen secuencias significativamente similares a las
codificadas por los polinucleótidos descritos. Preferiblemente, las
variantes alélicas tienen al menos el 60% de identidad de secuencia
(más preferiblemente, al menos el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) con
el polinucleótido dado, en el que la identidad de secuencia se
determina comparando las secuencias de nucleótidos de los
polinucleótidos cuando están alineadas de manera que se maximiza el
solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de
secuencia. Las variantes alélicas pueden aislarse e identificarse
preparando sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias
proporcionadas en el presen-
te documento y examinando una fuente de ácido nucleico adecuada a partir de individuos de la especie apropiada.
te documento y examinando una fuente de ácido nucleico adecuada a partir de individuos de la especie apropiada.
La invención también incluye polinucleótidos con
secuencias complementarias a las de los polinucleótidos descritos
en el presente documento.
La presente invención también incluye
polinucleótidos que se hibridan en condiciones sumamente rigurosas
con polinucleótidos descritos en el presente documento. En el
presente documento también se describen polinucleótidos que se
hibridan en condiciones rigurosas o de rigurosidad reducida con
polinucleótidos descritos en el presente documento. Los ejemplos de
condiciones de rigurosidad se muestran en la tabla siguiente: las
condiciones sumamente rigurosas son las que son al menos tan
rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-F;
las condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como, por
ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de
rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo,
las condiciones M-R.
\vskip1.000000\baselineskip
En Sambrook, J., E. F. Fritsch y T. Maniatis,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y
Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et
al., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y
6.3-6.4, se proporcionan ejemplos adicionales de
condiciones de rigurosidad para la hibridación de
polinucleótidos.
Preferiblemente, cada uno de tales
polinucleótidos de hibridación tiene una longitud que es al menos el
25%(más preferiblemente al menos el 50% y lo más preferiblemente al
menos el 75%) de la longitud del polinucleótido de la presente
invención con el cual se hibrida, y tiene al menos el 60% de
identidad de secuencia (más preferiblemente, al menos el 75% de
identidad; lo más preferiblemente al menos el 90% o el 95% de
identidad) con el polinucleótido de la presente invención con el
cual se hibrida, en el que la identidad de secuencia se determina
comparando las secuencias de los polinucleótidos de hibridación de
manera que se maximiza el solapamiento y la identidad mientras se
minimizan los huecos de secuencia.
El polinucleótido aislado de la invención puede
estar operativamente unido a una secuencia de control de la
expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en
Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19,
4485-4490 (1991), con el fin de producir la proteína
de manera recombinante. En la técnica se conocen muchas secuencias
de control de la expresión. También se conocen procedimientos
generales de expresión de proteínas recombinantes y se ejemplifican
en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185,537-566
(1990). Tal como se define en el presente documento,
"operativamente unido" significa que el polinucleótido aislado
de la invención y una secuencia de control de la expresión están
situados dentro de un vector o célula de tal manera que se expresa
la proteína mediante una célula huésped que se ha transformado
(transfectado) con el polinucleótido acoplado/secuencia de control
de la
expresión.
expresión.
Varios tipos de células pueden actuar como
células huésped para la expresión de la proteína. Las células
huésped de mamíferos incluyen, por ejemplo, células COS de mono,
células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñón
humano, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas,
células 3T3, células CV-1, otras líneas celulares
de primate transformadas, células diploides normales, cepas de
células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario,
explantos primarios, células HeLa, células L de ratón, BHK,
HL-60, U937, HaK o células
Jurkat.
Jurkat.
Como alternativa, puede ser posible producir la
proteína en eucariotas inferiores tales como levaduras o en
procariotas tales como bacterias. Las cepas de levadura
potencialmente adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces,
Candida, o cualquier cepa de levadura que pueda expresar
proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas potencialmente
adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa
bacteriana que pueda expresar proteínas heterólogas. Si la proteína
se fabrica en levaduras o bacterias, puede ser necesario modificar
la proteína producida en las mismas, por ejemplo mediante
fosforilación o glucosilación de los sitios apropiados, con el fin
de obtener la proteína funcional. Tales uniones covalentes pueden
lograrse usando procedimientos químicos o enzimáticos
conocidos.
La proteína también puede producirse uniendo de
manera operativa el polinucleótido aislado de la invención con
secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión
de insectos, y empleando un sistema de expresión en insectos. Los
materiales y procedimientos para los sistemas de expresión en
baculovirus/células de insectos están disponibles comercialmente en
forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, California,
EE.UU. (el kit MaxBac®), y tales procedimientos se conocen bien en
la técnica, tal como se describe en Summers y Smith, Texas
Agricultural Experiment Station Bulletin nº 1555 (1987). Tal como se
usa en el presente documento, una célula de insecto que puede
expresar un polinucleótido de la presente invención está
"transformada".
La proteína de la invención puede prepararse
cultivando células huésped transformadas en condiciones de cultivo
adecuadas para expresar la proteína recombinante. Entonces puede
purificarse la proteína expresada resultante a partir de un cultivo
de este tipo (es decir, a partir de medio de cultivo o extractos
celulares) usando procedimientos de purificación conocidos, tales
como cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel. La
purificación de la proteína también puede incluir una columna de
afinidad que contiene agentes que se unirán a la proteína; una o
más etapas de columna sobre resinas de afinidad tales como
concanavalina A-agarosa,
heparina-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharose®;
una o más etapas que implican cromatografía de interacción hidrófoba
usando resinas tales como fenil éter, butil éter o propil éter; o
cromatografía de inmunoafinidad.
Como alternativa, la proteína de la invención
también puede expresarse en una forma que facilitará la
purificación. Por ejemplo, puede expresarse como una proteína de
fusión, tal como las de proteína de unión a maltosa (MBP),
glutatión-S-transferasa (GST) o
tiorredoxina (TRX). Los kits para la expresión y purificación de
tales proteínas de fusión están disponibles comercialmente de New
England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway. NJ) e
Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), respectivamente. La proteína
también puede marcarse con etiquetas con un epítopo y
posteriormente purificarse usando un anticuerpo específico dirigido
contra tal epítopo. Un epítopo de este tipo ("Flag") está
disponible comercialmente de Eastman Kodak Company (New Haven,
CT).
Además, para purificar adicionalmente la
proteína, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía de
líquidos de alto rendimiento en fase inversa
(RP-HPLC) empleando un medio de
RP-HPLC hidrófobo, por ejemplo, gel de sílice que
tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes. También
pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación
anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una
proteína recombinante aislada sustancialmente homogénea. La
proteína así purificada está sustancialmente libre de otras
proteínas de mamíferos y se define según la presente invención como
una "proteína aislada".
La proteína de la invención también puede
expresarse como un producto de animales transgénicos no humanos,
por ejemplo, como componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u
ovejas transgénicas que se caracterizan por células somáticas o
germinales que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica
la proteína.
La proteína may también puede producirse
mediante síntesis química convencional conocida. Los expertos en la
técnica conocen procedimientos para construir las proteínas de la
presente invención por medios sintéticos. Las secuencias de
proteína construida de manera sintética, en virtud de que comparten
características de estructura primaria, secundaria o terciaria y/o
conformacionales con proteínas, pueden poseer propiedades biológicas
en común con las mismas, incluyendo actividad de proteína. Por
tanto, pueden emplearse como sustitutos inmunológicos o
biológicamente activos para proteínas naturales, purificadas en la
selección de compuestos terapéuticos y en procedimientos
inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.
Las proteínas proporcionadas en el presente
documento también incluyen proteínas caracterizadas por secuencias
de aminoácidos similares a las de proteínas purificadas pero en las
que se proporcionan modificaciones de manera natural o se diseñan
deliberadamente mediante ingeniería. Por ejemplo, los expertos en la
técnica pueden preparar modificaciones en el péptido o secuencias
de ADN usando técnicas conocidas. Las modificaciones de interés en
las secuencias de proteína pueden incluir la alteración,
sustitución, reemplazo, inserción o deleción de un residuo de
aminoácido seleccionado en la secuencia codificante. Por ejemplo,
uno o más de los residuos de cisteína pueden delecionarse o
reemplazarse por otro aminoácido para alterar la conformación de la
molécula. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para
tal alteración, sustitución, reemplazo, inserción o deleción
(véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.518.584).
Preferiblemente, tal alteración, sustitución, reemplazo, inserción
o deleción conserva la actividad deseada de la proteína.
Otros fragmentos y derivados de las secuencias
de proteínas que se espera que conserven actividad de proteína en
su totalidad o en parte y por tanto pueden ser útiles para la
selección u otras metodologías inmunológicas también pueden
prepararse fácilmente por los expertos en la técnica teniendo en
cuenta las descripciones en el presente documento. Se cree que
tales modificaciones están abarcadas por la presente invención.
Los polinucleótidos y proteínas de la presente
invención pueden mostrar uno o más de los usos o actividades
biológicas (incluyendo las asociadas con ensayos mencionados en el
presente documento) identificadas a continuación. Los usos o
actividades descritas para proteínas de la presente invención puede
proporcionarse mediante administración o uso de tales proteínas o
mediante administración o uso de polinucleótidos que codifican tales
proteínas (tales como, por ejemplo, en terapias génicas o vectores
adecuados para la introducción ADN).
Debido a su homología con IL-10,
la GIL-19/AE289 humana puede considerarse un miembro
de la familia general de las citocinas y, como tal, puede mostrar
actividades similares a IL-10. Las citocinas
desempeñan papeles importantes en la salud y la enfermedad y tienen
múltiples indicaciones clínicas. Por tanto, esta molécula (y otras
moléculas de la presente invención) serán útiles como agonista en
ciertas indicaciones clínicas y los antagonistas de esta molécula
serán útiles en otras situaciones clínicas, particularmente en
aquellas en las que IL-10 actúa como agonista o los
antagonistas de IL-10 actúan como un antagonista. Si
el fármaco preferido es el agonista o el antagonista dependerá de
los aspectos particulares de la patología de la enfermedad, tales
como los tipos celulares implicados, la naturaleza del estímulo y el
microentorno celular.
En una realización preferida, una actividad de
hGIL-19 es al menos una o más de las siguientes
actividades: (1) modulación, por ejemplo antagonizar una ruta de
transducción de señales (por ejemplo una ruta dependiente de
GIL-19); (2) modulación de la producción y/o
secreción de citocinas (por ejemplo, producción y/o secreción de
una citocina proinflamatoria); (3) modulación de la producción y/o
secreción de linfocinas; (4) modulación de la producción de
moléculas de adhesión y/o adhesión celular; (5) modulación de la
expresión o actividad de factores de transcripción nucleares; (7)
modulación de la secreción de IL-1; (8) competencia
con receptores para otras citocinas; (9) competencia con otra
proteína miembro de la familia de hGIL-19 para
unirse al receptor de hGIL-19; (10) modulación de
la translocación nuclear de receptor internalizado para
hGIL-19 u otra citocina o receptor complejado con
ligando, (11) modulación de la proliferación, desarrollo o
diferenciación celular, por ejemplo, proliferación, desarrollo o
diferenciación estimulada por proteína hGIL-19 o
estimulada por citocina (por ejemplo, de una célula epitelial, por
ejemplo, una célula epitelial escamosa del esófago, o de una célula
de la piel, por ejemplo, un queratinocito); (12) modulación de la
proliferación, desarrollo o diferenciación celular de una célula
osteógena (por ejemplo, de una célula precursora de osteoclastos,
osteoclasto y/u osteoblasto); (13) modulación de la formación ósea,
metabolismo óseo y/u homeostasis ósea (por ejemplo, inhibición de la
resorción ósea); (15) modulación de respuestas inmunitarias
celulares; (16) modulación de acciones proinflamatorias mediadas
por citocinas (por ejemplo, inhibición de la síntesis de proteína de
fase aguda por hepatocitos, fiebre y/o síntesis de prostaglandina,
por ejemplo síntesis de PGE_{2}); y (17) promoción y/o
potenciación de la cicatrización de heridas.
Teniendo en cuenta su aparente papel
inmunomodulador, las proteínas GIL-19/AE289 humanas
pueden actuar sobre los siguientes tipos celulares: células T,
células B, células dendríticas, macrófagos/monocitos, neutrófilos,
mastocitos, basófilos, eosinófilos, células presentadoras de
antígenos del sistema nervioso y células presentadoras de antígenos
del riñón. Basándose en su homología con IL-10, las
proteínas GIL-19/AE289 humanas (o agonistas o
antagonistas de las mismas) pueden tener las siguientes actividades
y usos:
(a) regulación por incremento de respuestas
inmunitarias humorales y atenúa las reacciones inmunitarias mediadas
por células;
(b) función como agente antiinflamatorio
mediante inhibición de la síntesis de citocinas y quimiocinas
proinflamatorias;
(c) modulación de respuestas inflamatorias
asociadas con lesión, septicemia, enfermedad gastrointestinal y
cardiovascular, e inflamación tras la cirugía;
(d) tratamiento de leucemia mielógena aguda,
linfoma no de Hodgkin, trasplante de médula ósea para tratar al
receptor antes de un injerto, trasplante de médula ósea para tratar
las células madre del donante antes del trasplante, y para mejorar
la enfermedad de injerto contra huésped tras un trasplante de médula
ósea;
(e) tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
mediadas por células tales como esclerosis múltiple, diabetes,
artritis reumatoide, miastenia grave, lupus eritematoso sistémico,
nefrotoxicidad asociada con glomerulonefritis, enfermedad
inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, pancreatitis y
asma.
Los agonistas de GIL-19/AE289
humana incluyen, sin limitación, proteínas
GIL-19/AE289 humanas y fragmentos, mutantes de
deleción y mutantes de adición de las mismas; y péptido y compuestos
de molécula pequeña que interaccionan con el receptor u otra diana
a la que se dirige la GIL-19/AE289 humana. Los
antagonistas de GIL-19/AE289 humana incluyen, sin
limitación, anticuerpos dirigidos contra proteínas
GIL-19/AE289 humanas; formas solubles del receptor
u otra diana a la que se dirige la GIL-19/AE289
humana; anticuerpos dirigidos contra el receptor u otra diana a la
que se dirige la GIL-19/AE289 humana; y péptido y
compuestos de molécula pequeña que inhiben o interfieren con la
interacción de GIL-19/AE289 humana con su receptor u
otra diana.
Los polinucleótidos proporcionados por la
presente invención pueden usarse por la comunidad de investigación
para diversos fines. Los polinucleótidos pueden usarse para expresar
proteína recombinante para análisis, caracterización o uso
terapéutico; como marcadores para tejidos en los que se expresa
preferiblemente la proteína correspondiente (ya sea
constitutivamente o en una fase particular de diferenciación o
desarrollo tisular o en estados patológicos); como marcadores de
peso molecular sobre geles de tipo Southern; como etiquetas o
marcadores de cromosomas (cuando están marcados) para identificar
cromosomas o para mapear posiciones de genes relacionados; para
compararse con secuencias de ADN endógenas en pacientes para
identificar posibles trastornos genéticos; como sondas para
hibridarse y así descubrir secuencias de ADN novedosas,
relacionadas; como fuente de información para derivar cebadores de
PCR para la huella genética; como una sonda para "extraer por
sustracción" secuencias conocidas en el procedimiento para
descubrir otros polinucleótidos novedosos; para seleccionar y
preparar oligómeros para la unión a una "micromatriz génica" u
otro soporte, incluyendo para la exploración de patrones de
expresión; para preparar anticuerpos anti-proteína
usando técnicas de inmunización de ADN; y como antígeno para
preparar anticuerpos anti-ADN o provocar otra
respuesta inmunitaria. Cuando el polinucleótido codifica una
proteína que se une o potencialmente se une a otra proteína (tal
como, por ejemplo, en una interacción
receptor-ligando), el polinucleótido también puede
usarse en ensayos de trampa de interacción (tales como, por
ejemplo, los descritos en Gyuris et al., 1993, Cell 75:
791-803 y en Rossi et al., 1997, Proc. Natl.
Acad Sci. USA 94: 8405-8410) para identificar
polinucleótidos que codifican la otra proteína con la que se
produce la unión o para identificar inhibidores de la interacción de
unión.
Las proteínas proporcionadas por la presente
invención pueden usarse de manera similar en ensayos para determinar
la actividad biológica, incluyendo en un panel de múltiples
proteínas para la selección de alto rendimiento; para preparar
anticuerpos o para provocar otra respuesta inmunitaria; como
reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en ensayos diseñados para
determinar cuantitativamente los niveles de la proteína (o su
receptor) en fluidos biológicos; como marcadores para tejidos en
los que se expresa preferiblemente la proteína correspondiente (ya
sea constitutivamente o en una fase particular de la diferenciación
o desarrollo tisular o en un estado patológico); y, por supuesto,
para aislar ligandos o receptores correlativos. Cuando la proteína
se une o posiblemente se une a otra proteína (tal como, por
ejemplo, en una interacción receptor-ligando), la
proteína puede usarse para identificar la otra proteína con la que
se produce la unión o para identificar inhibidores de la
interacción de unión. Las proteínas implicadas en estas
interacciones de unión también pueden usarse para examinar para
seleccionar inhibidores peptídicos o de molécula pequeña o agonistas
de la interacción de unión.
Cualquiera o todas estas utilidades de
investigación pueden desarrollarse en un formato de kit o calidad de
reactivo para su comercialización como productos de
investigación.
Los procedimientos para realizar los usos
enumerados anteriormente se conocen bien por los expertos en la
técnica. Las referencias que describen tales procedimientos
incluyen, sin limitación, "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook,
J., E. F. Fritsch y T. Maniatis eds., 1989, y "Methods in
Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic
Press, Berger, S. L. y A. R. Kimmel eds., 1987.
Los polinucleótidos y proteínas de la presente
invención también pueden usarse como fuentes o complementos
nutricionales. Tales usos incluyen, sin limitación, el uso como un
complemento de proteínas o aminoácidos, uso como una fuente de
carbono, uso como una fuente de nitrógeno y uso como una fuente de
hidratos de carbono. En tales casos, la proteína o polinucleótido
de la invención puede añadirse a la alimentación de un organismo
particular o puede administrarse como una preparación sólida o
líquida separada, tal como en forma de polvos, pastillas,
disoluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de
microorganismos, la proteína o polinucleótido de la invención puede
añadirse al medio en o sobre el que se cultiva el
microorganismo.
Una proteína de la presente invención puede
mostrar actividad de citocinas, de proliferación celular (induciendo
o bien inhibiendo) o de diferenciación celular (induciendo o bien
inhibiendo) o puede inducir la producción de otras citocinas en
determinadas poblaciones celulares. Muchos factores proteicos
descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citocinas
conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de
proliferación celular dependiente de factor, y por tanto los
ensayos sirven como una confirmación conveniente de la actividad de
citocinas. La actividad de una proteína de la presente invención se
pone en evidencia mediante uno cualquiera de varios ensayos
rutinarios de proliferación celular dependiente de factor para
líneas celulares incluyendo, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10,
B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preBM+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2,
CTLL2, TF-1, Mo7e y CMK. La actividad de una
proteína de la invención puede medirse, entre otros medios, mediante
los siguientes procedimientos:
Los ensayos para determinar la proliferación de
células T o timocitos incluyen sin limitación los descritos en:
Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A.M.
Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience
(capítulo 3, In vitro assays for Mouse Linfocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:
3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J.
Immunol.145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et
al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991;
Bertagnolli, et al., J. Immunol.149:
3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol.
152: 1756-1761, 1994.
Los ensayos para determinar la producción de
citocinas y/o proliferación de células del bazo, células de los
ganglios linfáticos o timocitos incluyen, sin limitación, los
descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. y
Shevach, E.M. en Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan eds.
volumen 1 págs. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and
Sons, Toronto. 1994; y Measurement of mouse and human Interferon
\gamma, Schreiber, R.D. en Current Protocols in Immunology. J.E.
Coligan eds. volumen 1 págs. 6.8.1-6.8.8, John Wiley
and Sons, Toronto. 1994.
Los ensayos para determinar la proliferación y
diferenciación de células hetamopoyéticas y linfopoyéticas
incluyen, sin limitación, los descritos en: Measurement of Human and
Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. y
Lipsky, P.E. en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan
eds. volumen 1 págs. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and
Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:
1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:
690-692, 1988; Greenberger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2931-2938, 1983;
Measurement of mouse and human interleukin 6 - N\tilde{o}rdan, R.
en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. volumen I
págs. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto.
1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:
1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11
- Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. y Turner, K. J. en
Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. volumen 1
págs. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of
mouse and human Interleukin 9 - Ciarletta, A., Giannotti, J.,
Clark, S.C. y Turner, K.J. en Current Protocols in Immunology.
J.E.e.a. Coligan eds. volumen 1 págs. 6.13.1, John Wiley and Sons,
Toronto. 1991.
Los ensayos para determinar respuestas de clones
de células T frente a antígenos (que identificarán, entre otras,
proteínas que afectan a las interacciones
APC-células T así como los efectos directos de
células T midiendo la proliferación y producción de citocinas)
incluyen, sin limitación, los descritos en: Current Protocols in
Immunology, Ed by J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies,
E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (capítulo 3, In vitro
assays for Mouse Linfocyte Function; capítulo 6, Cytokines and
their cellular receptors; capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J.
Immun. 11: 405-411, 1981; Takai et al., J.
Immunol. 137: 3494-3500,1986; Takai et al.,
J. Immunol. 140: 508-512, 1988.
Una proteína de la presente invención también
puede mostrar actividad inmunoestimulante o inmunosupresora,
incluyendo sin limitación las actividades para las que se describen
ensayos en el presente documento. Una proteína puede ser útil en el
tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunitarios
(incluyendo inmunodeficiencia combinada grave (SCID)), por ejemplo,
en la regulación (por incremento o disminución) del crecimiento y
proliferación de linfocitos T y/o B, así como afectando a la
actividad citolítica de células NK y otras poblaciones celulares.
Estas inmunodeficiencias pueden ser genéticas o producidas por
infecciones víricas (por ejemplo, VIH) así como bacterianas o
fúngicas, o pueden resultar de trastornos autoinmunitarios. Más
específicamente, las enfermedades infecciosas producidas por
infección vírica, bacteriana, fúngica u otra infección pueden se
tratables usando una proteína de la presente invención, incluyendo
infecciones por VIH, virus de la hepatitis, herpesvirus,
micobacterias, Leishmania spp., malaria spp. y
diversas infecciones fúngicas tales como candidiasis. Por supuesto,
a este respecto, una proteína de la presente invención también puede
ser útil cuando puede desearse generalmente un refuerzo del sistema
inmunitario, es decir, en el tratamiento del cáncer.
Los trastornos autoinmunitarios que pueden
tratarse usando una proteína de la presente invención incluyen, por
ejemplo, enfermedad del tejido conjuntivo, esclerosis múltiple,
lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación
pulmonar autoinmunitaria, síndrome de
Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria,
diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia grave,
enfermedad de injerto contra el huésped y enfermedad ocular
inflamatoria autoinmunitaria. Tal proteína de la presente invención
también puede ser útil en el tratamiento de reacciones y estados
alérgicos, tales como asma (particularmente asma alérgica) u otros
problemas respiratorios. Otros estados, en los que se desea una
supresión inmunitaria (incluyendo, por ejemplo, trasplante de
órganos), también pueden tratarse usando una proteína de la
presente invención.
Usando las proteínas de la invención, también
puede ser posible regular las respuestas inmunitarias de varias
formas. La regulación por disminución puede ser en forma de
inhibición o bloqueo de una respuesta inmunitaria ya en progreso o
puede implicar impedir la inducción de una respuesta inmunitaria.
Las funciones de las células T activadas pueden inhibirse
suprimiendo las respuestas de células T o induciendo tolerancia
específica en células T, o ambas. La inmunosupresión de las
respuestas de células T es generalmente un proceso activo, no
específico de antígeno que requiere una exposición continua de las
células T al agente supresor. La tolerancia, que implica inducir
una no receptividad o anergia en las células T, puede distinguirse
de la inmunosupresión porque ésta es generalmente específica de
antígeno y persiste después de que haya cesado la exposición al
agente de tolerancia. Operacionalmente, la tolerancia puede
demostrarse mediante la carencia de una respuesta de células T tras
la reexposición a un antígeno específico en ausencia del agente de
tolerancia.
La regulación por disminución o prevención de
una o más funciones de antígeno (incluyendo sin limitación funciones
de antígeno para linfocitos B (tales como, por ejemplo, B7), por
ejemplo, impidiendo altos niveles de síntesis de linfocinas
mediante células T activadas, será útil en situaciones de trasplante
de tejido, piel y órgano y en enfermedad de injerto contra el
huésped (EICH). Por ejemplo, el bloqueo de la función de células T
debe dar como resultado una reducción en la destrucción de tejido
en el trasplante de tejido. Normalmente, en trasplantes de tejido,
el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento
como extraño por células T, seguido por una reacción inmunitaria
que destruye el trasplante. La administración de una molécula que
inhibe o bloquea la interacción de un antígeno para linfocitos B7
con su(s) ligando(s) natural(es) o células
inmunitarias (tales como una forma monomérica, soluble de un
péptido que tiene actividad B7-2 solo o junto con
una forma monomérica de un péptido que tiene una actividad de otro
antígeno para linfocitos B (por ejemplo, B7-1,
B7-3) o un anticuerpo bloqueante, antes del
trasplante, puede conducir a la unión de la molécula al/a los
ligando(s) natural(es) en las células inmunitarias
sin trasmitir la correspondiente señal coestimuladora. El bloqueo de
la función de antígeno para linfocitos B en esta materia impide la
síntesis de citocinas por células inmunitarias, tales como células
T, y por tanto actúa como un inmunosupresor. Además, la falta de
coestimulación también puede ser suficiente para provocar la
anergia de las células T, induciendo de ese modo tolerancia en un
sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo mediante reactivos
bloqueantes del antígeno para linfocitos B puede evitar la
necesidad de una administración repetida de estos reactivos
bloqueantes. Para lograr una inmunosupresión o tolerancia
suficientes en un sujeto, también puede ser necesario bloquear la
función de una combinación de antígenos de linfocitos B.
La eficacia de los reactivos bloqueantes
particulares en la prevención del rechazo de trasplantes de órganos
o EICH puede evaluarse usando modelos animales que son predictivos
de la eficacia en seres humanos. Los ejemplos de sistemas
apropiados que pueden usarse incluyen injertos cardiacos alogénicos
en ratas e injertos xenogénicos de células de los islotes
pancreáticos en ratones, ambos de los cuales se han usado para
examinar los efectos inmunosupresores de las proteínas de fusión
CTLA4Ig in vivo tal como se describe en Lenschow et
al., Science 257: 789-792 (1992) y Turka et
al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 11102-11105
(1992). Además, pueden usarse modelos murinos de EICH (véase Paul
ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs
846-847) para determinar el efecto del bloqueo de la
función de antígeno para linfocitos B in vivo sobre el
desarrollo de esa enfermedad.
El bloqueo de la función de antígeno también
puede ser terapéuticamente útil para tratar enfermedades
autoinmunitarias. Muchos trastornos autoinmunitarios son el
resultado de una activación inapropiada de las células T que son
reactivas frente al propio tejido y que fomentan la producción de
citocinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las
enfermedades. La prevención de la activación de células T
autorreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de la
enfermedad. Puede usarse la administración de reactivos que bloquean
la coestimulación de células T alterando las interacciones
receptor:ligando de los antígenos de linfocitos B para inhibir la
activación de células T y prevenir la producción de autoanticuerpos
o citocinas derivadas de células T que pueden estar implicadas en
el proceso de la enfermedad. Adicionalmente, los reactivos
bloqueantes pueden inducir tolerancia específica de antígeno de
células T autorreactivas que podría conducir a un alivio a largo
plazo de la enfermedad. La eficacia de los reactivos bloqueantes en
la prevención o alivio de los trastornos autoinmunitarios puede
determinarse usando varios modelos animales bien caracterizados de
enfermedades autoinmunitarias humanas. Los ejemplos incluyen
encefalitis autoinmunitaria experimental murina, lupus eritematoso
sistémico en ratones MRL/lpr/lpr o ratones híbridos NZB, artritis
del colágeno autoinmunitaria murina, diabetes mellitus en ratones
NOD y ratas BB, y miastenia grave experimental murina (véase Paul
ed., Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, páginas
840-856).
La regulación por incremento de una función de
antígeno (preferiblemente una función de antígeno para linfocitos
B), como medio para regular por incremento respuestas inmunitarias,
también puede ser útil en terapia. La regulación por incremento de
las respuestas inmunitarias puede ser en forma de potenciación de
una respuesta inmunitaria existente o de provocación de una
respuesta inmunitaria inicial. Por ejemplo, la potenciación de una
respuesta inmunitaria mediante la estimulación de una función de
antígeno para linfocitos B puede ser útil en casos de infección
vírica. Además, las enfermedades víricas sistémicas tales como
gripe, resfriado común y encefalitis podrían aliviarse mediante la
administración sistémica de formas estimuladoras de formas de
antígenos de linfocitos B.
Como alternativa, pueden potenciarse las
respuestas inmunitarias antivirales en un paciente infectado
eliminando células T del paciente, coestimulando las células T
in vitro con APC pulsadas con antígenos virales que expresan
un péptido de la presente invención o bien junto con una forma
estimuladora de un péptido soluble de la presente invención y
reintroduciendo las células T activadas in vitro en el
paciente. Otro procedimiento para potenciar las respuestas
inmunitarias antivirales será aislar células infectadas de un
paciente, transfectarlas con un ácido nucleico que codifica una
proteína de la presente invención tal como se describe en el
presente documento de modo que las células expresen toda o una
parte de la proteína sobre su superficie, y reintroducir la células
transfectadas en el paciente. Las células infectadas ahora pueden
administrar una señal coestimuladora a, y activar de ese modo, las
células T in vivo.
En otra aplicación, la regulación por incremento
o potenciación de una función de antígeno (preferiblemente una
función de antígenos para linfocitos B) puede ser útil en la
inducción de inmunidad tumoral. Pueden administrarse células
tumorales (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia,
neuroblastoma, carcinoma) transfectadas con un ácido nucleico que
codifica al menos un péptido de la presente invención a un sujeto
para superar la tolerancia específica de tumor en el sujeto. Si se
desea, la célula tumoral puede transfectarse para expresar una
combinación de péptidos. Por ejemplo, las células tumorales
obtenidas de un paciente pueden transfectarse ex vivo con un
vector de expresión que dirige la expresión de un péptido que tiene
actividad de tipo B7-2 solo, o junto con un péptido
que tiene actividad de tipo BT-1 y/o actividad de
tipo BT-3. Las células tumorales transfectadas se
devuelven al paciente para dar como resultado la expresión de los
péptidos sobre la superficie de la célula transfectada. Como
alternativa, pueden usarse técnicas de terapia génica para dirigirse
a una célula tumoral para la transfección in vivo.
La presencia del péptido de la presente
invención que tiene la actividad de un(os) antígeno(s)
para linfocitos B sobre la superficie de la célula tumoral
proporciona la señal de coestimulación necesaria a las células T
para inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T frente
a las células tumorales transfectadas. Además, pueden transfectarse
células tumorales que carecen de las moléculas del MHC de clase I o
del MHC de clase II, o que no pueden reexpresar cantidades
suficientes de las moléculas del MHC de clase I o del MHC de clase
II, con un ácido nucleico que codifica toda o una parte (por
ejemplo, una parte truncada de un dominio citoplasmático) de una
proteína de cadena a del MHC de clase I y una proteína de
\beta_{2} microglobulina o una proteína de cadena a del MHC de
clase II y una proteína de cadena \beta del MHC de clase II para
expresar de ese modo proteínas del MHC de clase I o del MHC de
clase II sobre la superficie celular. La expresión del MHC de clase
I o de clase II apropiado junto con un péptido que tiene la
actividad de un antígeno para linfocitos B (por ejemplo,
B7-1, B7-2, B7-3)
induce una respuesta inmunitaria mediada por células T frente a la
célula tumoral transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica un
constructo antisentido que bloquea la expresión de una proteína
asociada al MHC de clase II, tal como la cadena invariante, también
puede cotransfectarse con un ADN que codifica un péptido que tiene
la actividad de un antígeno para linfocitos B para fomentar la
presentación de antígenos asociados a tumor e inducir inmunidad
específica de tumor. Por tanto, la inducción de una respuesta
inmunitaria mediada por células T en un sujeto humano puede ser
suficiente para superar la tolerancia específica de tumor en el
sujeto.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos adecuados para determinar la
citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitación,
los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E.
Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober,
Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (capítulo 3, In vitro
assays for Mouse Linfocyte Function 3.1-3.19;
capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492,1981;
Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974,
1982; Handa et al., J. Immunol. 135:
1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol.
137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J.
Immunol. 140: 508-512, 1988; Herrmann et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981;
Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974,
1982; Handa et al., J. Immunol.135:
1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol.
137: 3494-3500, 1986; Bowman et al., J.
Virology 61: 1992-1998; Takai et al., J.
Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et
al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991;
Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092,
1994.
Los ensayos para determinar respuestas de
inmunoglobulina dependientes de células T y cambio de isotipo (que
identificarán, entre otras, proteínas que modulan las respuestas de
anticuerpo dependientes de células T y que afectan a los perfiles
de Th1/Th2) incluyen, sin limitación, los descritos en: Maliszewski,
J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; y Assays for B
cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. y
Brunswick, M. en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan
eds. volumen 1 págs. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and
Sons, Toronto. 1994.
Los ensayos de reacción mixta de linfocitos
(MLR) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan
predominantemente respuestas de Th1 y CTL) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed
por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek. D.H. Margulies, E.M. Shevach, W
Strober, Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (capítulo 3, In vitro
assays for Mouse Linfocyte Function 3.1-3.19;
capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J.
Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al.,
J. Immunol. 140: 508=512, 1988; Bertagnolli et al., J.
Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
Los ensayos dependientes de células dendríticas
(que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células
dendríticas que activan células T vírgenes) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134:
536-544, 1995; Inaba et al., Journal of
Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia
et al., Journal of Immunology 154:
5071-5079,1995; Porgador et al., Journal of
Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair
et al., Journal of Virology 67: 4062-4069,
1993; Huang et al., Science 264: 961-965,
1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:
1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of
Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; e Inaba
et al., Journal of Experimental Medicine 172:
631-640, 1990.
Los ensayos para determinar la
supervivencia/apoptosis de linfocitos (que identificarán, entre
otras, proteínas que impiden la apoptosis tras la inducción por un
superantígeno y proteínas que regulan la homeostasis de linfocitos)
incluyen, sin limitación, los descritos en: Darzynkiewicz et
al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca
et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca
et al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993;
Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991;
Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045,
1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897,
1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1:
639-648, 1992.
Los ensayos para detectar proteínas que influyen
en las etapas tempranas del compromiso y desarrollo de células T
incluyen, sin limitación, los descritos en: Antica et al.,
Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al.,
Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et
al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et
al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88: 7548-7551,
1991.
Una proteína de la presente invención puede ser
útil en la regulación de la hematopoyesis y, en consecuencia, en el
tratamiento de deficiencias de células mieloides o linfoides.
Incluso una actividad biológica marginal en apoyo de células
formadoras de colonias o de líneas celulares dependientes de factor
indica una implicación en la regulación de la hematopoyesis, por
ejemplo, para apoyar el crecimiento y proliferación de células
progenitoras eritroides solas o en combinación con otras citocinas,
indicando de ese modo utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de
diversas anemias o para su uso junto con irradiación/quimioterapia
para estimular la producción de precursores eritroides y/o células
eritroides; para apoyar el crecimiento y proliferación de células
mieloides tales como granulocitos y monocitos/macrófagos (es decir,
actividad de CSF tradicional) útiles, por ejemplo, junto con
quimioterapia para impedir o tratar la mielosupresión consecuente;
para apoyar el crecimiento y proliferación de megacariocitos y en
consecuencia de plaquetas permitiendo de ese modo la prevención o
tratamiento de diversos trastornos plaquetarios tales como
trombocitopenia y en general para su uso en lugar de, o
complementario a, transfusiones de plaquetas; y/o para apoyar el
crecimiento y proliferación de células madre hematopoyéticas que
pueden madurar para dar todas y cada una de las células
hematopoyéticas mencionadas anteriormente y por tanto encuentran
utilidad terapéutica en diversos trastornos de células madre (tales
como los tratados normalmente con trasplante, incluyendo, sin
limitación, anemia aplásica y hemoglobinuria nocturna paroxismal),
así como en la repoblación del compartimiento de células madre tras
la irradiación/quimioterapia, in vivo o bien ex vivo
(es decir, junto con trasplante de médula ósea o con trasplante de
células progenitoras periféricas (homólogas o heterólogas)) como
células normales o manipuladas genéticamente para terapia
génica.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos adecuados para determinar la
proliferación y diferenciación de diversas líneas hematopoyéticas
se citaron anteriormente.
Los ensayos para determinar la diferenciación de
células madre embrionarias (que identificarán, entre otras,
proteínas que influyen en la hematopoyesis de diferenciación
embrionaria) incluyen, sin limitación, los descritos: Johansson
et al. Cellular Biology 15: 141-151, 1995;
Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:
473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81:
2903-2915, 1993.
Los ensayos para determinar la supervivencia y
diferenciación de células madre (que identificarán, entre otras,
proteínas que regulan la linfohematopoyesis) incluyen, sin
limitación, los descritos en: Methylcellulose colony forming
assays, Freshney, M.G. en Culture of Hematopoietic Cells. R.I.
Freshney, et al. eds. volumen págs. 265-268,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Hirayama
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony
forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. y
Briddell, R.A. en Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney,
et al. eds. volumen págs. 23-39,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Neben et
al., Experimental Hematology 22: 353-359, 1994;
Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. en Culture of
Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. volumen págs.
1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva York,
NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal
cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. en Culture of
Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. volumen
págs. 163-179, Wiley-Liss, Inc.,
Nueva York, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay,
Sutherland, H.J. en Culture of Hematopoietic Cells. R.I.Freshney,
et al. eds. volumen págs. 139-162,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994.
Una proteína de la presente invención también
puede tener utilidad en composiciones usadas para el crecimiento o
regeneración de huesos, cartílagos, tendones, ligamentos y/o tejido
nervioso, así como para la cicatrización de heridas y reparación y
sustitución de tejidos, y en el tratamiento de quemaduras,
incisiones y úlceras.
Una proteína de la presente invención, que
induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en
las que normalmente no se forma hueso, tiene aplicación en la
curación de fracturas óseas y daño o defectos en el cartílago en
seres humanos y otros animales. Tal preparación que emplea una
proteína de la invención puede tener uso profiláctico en la
reducción de fracturas cerradas así como abiertas y también en la
fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación de
huesos de novo inducida por un agente osteogénico contribuye
a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por
traumatismo o inducidos por resección oncológica, y también es útil
en la cirugía plástica estética.
También puede usarse una proteína de la
invención en el tratamiento de enfermedad periodontal y en otros
procedimientos de reparación dental. Tales agentes pueden
proporcionar un entorno para atraer células formadoras de huesos,
estimular el crecimiento de células formadoras de huesos o inducir
la diferenciación de progenitores de células formadoras de huesos.
Una proteína de la invención también puede ser útil en el
tratamiento de la osteoporosis o artrosis, tal como mediante la
estimulación de la reparación de huesos y/o cartílagos o bloqueando
la inflamación o los procesos de destrucción de tejido (actividad
colagenasa, actividad de osteoclasto, etc) mediados por procesos
inflamatorios.
Otra categoría de actividad de regeneración de
tejido que puede ser atribuible a la proteína de la presente
invención es la formación de tendones/ligamentos. Una proteína de la
presente invención, que induce la formación de tejido de tipo
tendón/ligamento u otro tejido en circunstancias en las que no se
forma normalmente tal tejido, tiene aplicación en la curación de
desgarros de tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos
de tendones o ligamentos en seres humanos y otros animales. Tal
preparación que emplea una proteína inductora de tejido de tipo
tendón/ligamento puede tener uso profiláctico para prevenir el daño
al tejido de tendón o ligamento, así como un uso en la fijación
mejorada del tendón o ligamento al hueso y otros tejidos, y en la
reparación de defectos en tejido de tendón o ligamento. La formación
de novo de tejido de tipo tendón/ligamento inducida por una
composición de la presente invención contribuye a la reparación de
defectos de tendones o ligamentos congénitos, inducidos por
traumatismos u otros de otro origen, y también es útil en la cirugía
plástica estética para unir o reparar tendones o ligamentos. Las
composiciones de la presente invención pueden proporcionar un
entorno para atraer células formadoras de tendones o ligamentos,
estimular el crecimiento de las células formadoras de tendones o
ligamentos, inducir la diferenciación de progenitores de células
formadoras de tendones o ligamentos, o inducir el crecimiento de
células de tendones/ligamentos o progenitores ex vivo para
devolverlas in vivo para efectuar la reparación de tejidos.
Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el
tratamiento de la tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros
defectos de tendones o ligamentos. Las composiciones también pueden
incluir una matriz y/o agente secuestrante apropiados como vehículo
tal como se conoce bien en la técnica.
La proteína de la presente invención también
puede ser útil para la proliferación de células neurales y para la
regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el
tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso
central y periférico, así como de trastornos mecánicos y por
traumatismo, que implican degeneración, muerte o traumatismo en
células neurales o tejido nervioso. Más específicamente, puede
usarse una proteína en el tratamiento de enfermedades del sistema
nervioso periférico, tales como lesiones de nervio periférico,
neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del
sistema nervioso central, tales como enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis
lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager. Otros
estados que pueden tratarse según la presente invención incluyen
trastornos mecánicos y por traumatismo, tales como trastornos de la
médula espinal, traumatismo craneoencefálico y enfermedades
cerebrovasculares tales como accidente cerebrovascular. Las
neuropatías periféricas que resultan de quimioterapia u otras
terapias médicas también pueden tratarse usando una proteína de la
invención.
Las proteínas de la invención también pueden ser
útiles para fomentar un mejor o más rápido cierre de heridas no
cicatrizadas, incluyendo sin limitación úlceras por presión, úlceras
asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y por
traumatismo y similares.
Se espera que una proteína de la presente
invención también muestre actividad para la generación o
regeneración de otros tejidos, tales como órganos (incluyendo, por
ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio),
músculo (liso, esquelético o cardiaco) y tejido vascular (incluyendo
endotelio vascular), o para fomentar el crecimiento de células que
comprenden tales tejidos. Parte de los efectos deseados pueden ser
mediante la inhibición o modulación de la cicatrización fibrótica
para permitir que se regenere el tejido normal. Una proteína de la
invención también puede mostrar actividad angiogénica.
Una proteína de la presente invención también
puede ser útil para la protección o regeneración intestinal y para
el tratamiento de fibrosis pulmonar o hepática, lesión por
reperfusión en diversos tejidos y estados que resultan del daño
sistémico por citocinas.
Una proteína de la presente invención también
puede ser útil para fomentar o inhibir la diferenciación de los
tejidos descritos anteriormente a partir de células o tejidos
precursores; o para inhibir el crecimiento de los tejidos descritos
anteriormente.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos para determinar la actividad de
generación de tejidos incluyen, sin limitación, los descritos en:
publicación de patente internacional número WO95/16035 (hueso,
cartílago, tendón); publicación de patente internacional número
WO95/05846 (nervio, neuronal); publicación de patente internacional
número WO91/07491 (piel, endotelio).
Los ensayos para determinar la actividad de
curación de heridas incluyen, sin limitación, los descritos en:
Winter, Epidermal Wound Healing, págs. 71-112
(Maibach, HI y Rovee, DT, eds.), Year Book Medical Publishers,
Inc., Chicago, modificado por Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol
71: 382-84 (1978).
Una proteína de la presente invención también
puede mostrar actividades relacionadas con activina o inhibina. Las
inhibinas se caracterizan por su capacidad para inhibir la
liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH), mientras
que las activinas se caracterizan por su capacidad para estimular la
liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH). Por tanto,
una proteína de la presente invención, sola o en heterodímeros con
un miembro de la familia de las inhibinas, puede ser útil como
anticonceptivo basándose en la capacidad de las inhibinas de
reducir la fertilidad en mamíferos hembra y reducir la
espermatogénesis en mamíferos macho. La administración de
cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir esterilidad
en estos mamíferos. Como alternativa, la proteína de la invención,
como un homodímero o como un heterodímero con otras subunidades
proteicas del grupo de la inhibina \beta, puede ser útil como un
compuesto terapéutico inductor de fertilidad, basándose en la
capacidad de las moléculas de activina para estimular la liberación
de FSH a partir de células de la hipófisis anterior. Véase, por
ejemplo, la patente estadounidense 4.798.885. Una proteína de la
invención también puede ser útil para el avance de la aparición de
fertilidad en mamíferos sexualmente inmaduros, de modo que se
aumenta el rendimiento reproductor durante toda la vida de animales
domésticos tales como vacas, ovejas y cerdos.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos para determinar la actividad de
activina/inhibina incluyen, sin limitación, los descritos en: Vale
et al., Endocrinology 91: 562-572,1972; Ling
et al., Nature 321: 779-782, 1986; Vale et
al., Nature 321: 776-779, 1986; Mason et
al., Nature 318: 659-663, 1985; Forage et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3091-3095,
1986.
Una proteína de la presente invención puede
tener actividad quimiotáctica o quimiocinética (por ejemplo, actúa
como una quimiocina) para células de mamífero, incluyendo, por
ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T,
mastocitos, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales.
Pueden usarse las proteínas quimiotácticas o quimiocinéticas para
movilizar o atraer una población celular deseada hasta un sitio de
acción deseado. Las proteínas quimiotácticas o quimiocinéticas
proporcionan ventajas particulares en el tratamiento de heridas y
otros traumatismos en tejidos, así como en el tratamiento de
infecciones localizadas. Por ejemplo, la atracción de linfocitos,
monocitos o neutrófilos hasta tumores o sitios de infección puede
dar como resultado respuestas inmunitarias mejoradas frente al
tumor o el agente infeccioso.
Una proteína o péptido tiene actividad
quimiotáctica para una población celular particular si puede
estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento
dirigido de tal población celular. Preferiblemente, la proteína o
péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento
de las células. Puede determinarse fácilmente si una proteína
particular tiene actividad quimiotáctica para una población de
células empleando tal proteína o péptido en cualquier ensayo
conocido para determinar la quimiotaxis celular.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos para determinar la actividad
quimiotáctica (que identificarán proteínas que inducen o impiden la
quimiotaxis) consisten en ensayos que miden la capacidad de una
proteína para inducir la migración de células a través de una
membrana así como la capacidad de una proteína para inducir la
adhesión de una población celular a otra población celular. Los
ensayos adecuados para determinar el movimiento y adhesión incluyen,
sin limitación, los descritos en: Current Protocols in Immunology,
Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach,
W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (capítulo 6.12, Measurement of
alpha and beta Chemokines 6.12.1-6.12.28; Taub et
al. J. Clin. Invest. 95: 1370-1376,1995; Lind
et al. APMIS 103: 140-146, 1995; Muller
et al Eur. J. Immunol. 25: 1744-1748; Gruber
et al. J. de Immunol.152: 5860-5867, 1994;
Johnston et al. J. of Immunol. 153:
1762-1768, 1994.
Una proteína de la invención también puede
mostrar actividad hemostásica o trombolítica. Como resultado, se
espera que tal proteína sea útil en el tratamiento de diversos
trastornos de coagulación (incluyendo trastornos hereditarios,
tales como hemofilias) o para potenciar la coagulación y otros
acontecimientos hemostásicos para tratar heridas que resultan de
traumatismos, cirugía y otras causas. Una proteína de la invención
también puede ser útil para disolver o inhibir la formación de
trombos y para el tratamiento y prevención de estados que resultan
de los mismos (tales como, por ejemplo, infarto de los vasos del
sistema nervioso central y cardiacos (por ejemplo, accidente
cerebrovascular)).
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos para determinar la actividad
hemostásica y trombolítica incluyen, sin limitación, los descritos
en: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26:
131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis
Res. 45: 413-419, 1987; Humphrey et al.,
Fibrinolysis 5: 71-79 (1991); Schaub, Prostaglandins
35: 467-474, 1988.
Una proteína de la presente invención también
puede mostrar actividad como receptores, ligandos de receptor o
inhibidores o agonistas de las interacciones receptor/ligando. Los
ejemplos de tales receptores y ligandos incluyen, sin limitación,
receptores de citocina y sus ligandos, cinasas de receptor y sus
ligandos, fosfatasas de receptor y sus ligandos, receptores
implicados en interacciones célula-célula y sus
ligandos (incluyendo sin limitación, moléculas de adhesión celular
(tales como selectinas, integrinas y sus ligandos) y pares de
receptor/ligando implicados en la presentación de antígenos,
reconocimiento de antígenos y desarrollo de respuestas inmunitarias
celulares y humorales). Los receptores y ligandos también son útiles
para la selección de posibles inhibidores de molécula pequeña o
peptídicos de la interacción relevante receptor/ligando. Una
proteína de la presente invención (incluyendo, sin limitación,
fragmentos de receptores y ligandos) puede ser útil por sí misma
como inhibidor de las interacciones receptor/
ligando.
ligando.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
procedimientos:
Los ensayos adecuados para determinar la
actividad receptor-ligando incluyen sin limitación
los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J.E.
Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober,
Pub. Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience (capítulo 7.28, Measurement of
Cellular Adhesion under static conditions
7.28.1-7.28.22), Takai et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 6864-6868, 1987; Bierer et
al., J. Exp. Med. 168: 1145-1156, 1988;
Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169: 149-160
1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:
59-68, 1994; Stitt et al., Cell 80:
661-670, 1995.
Las proteínas de la presente invención también
pueden mostrar actividad antiinflamatoria. La actividad
antiinflamatoria puede lograrse proporcionando un estímulo a las
células implicadas en la respuesta inflamatoria, inhibiendo o
fomentando las interacciones célula-célula (tal
como, por ejemplo, la adhesión celular), inhibiendo o fomentando la
quimiotaxis de las células implicadas en el proceso inflamatorio,
inhibiendo o fomentando la extravasación celular, o estimulando o
suprimiendo la producción de otros factores que inhiben o fomentan
más directamente una respuesta inflamatoria. Pueden usarse
proteínas que muestran tales actividades para tratar estados
inflamatorios incluyendo estados crónicos o agudos, que incluyen
sin limitación inflamación asociada con infección (tal como choque
séptico, septicemia o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica
(SIRS)), lesión por isquemia-reperfusión,
mortalidad por endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por
el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocina o
quimiocina, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de
Crohn o que resulta de la sobreproducción de citocinas tales como
TNF o IL-1. Las proteínas de la invención también
son útiles para tratar la anafilaxis e hipersensibilidad a una
sustancia o material antigénico.
Las cadherinas son moléculas de adhesión
dependientes de calcio que parecen desempeñar papeles importantes
durante el desarrollo, particularmente en la definición de tipos
celulares específicos. La pérdida o alteración de la expresión
normal de cadherina puede conducir a cambios en las propiedades de
adhesión celular unidas al crecimiento tumoral y la metástasis. El
mal funcionamiento de las cadherinas también está implicado en
otras enfermedades humanas, tales como pénfigo vulgar y pénfigo
foliaceo (enfermedades autoinmunitarias cutáneas con ampollas),
enfermedad de Crohn y algunas anomalías del desarrollo.
La superfamilia de la cadherina incluye bastante
más de cuarenta miembros, cada uno con un patrón de expresión
diferenciado. Todos los miembros de la superfamilia tienen en común
repeticiones extracelulares conservadas (dominios de cadherina),
pero se encuentran diferencias estructurales en otras partes de la
molécula. Los dominios de cadherina se unen al calcio para formar
su estructura terciaria y por tanto se requiere calcio para mediar
su adhesión. Sólo unos pocos aminoácidos en el primer dominio de
cadherina proporcionan la base de la adhesión homófila; la
modificación de este sitio de reconocimiento puede cambiar la
especificidad de una cadherina de modo que en lugar de reconocerse
sólo a sí misma, la molécula mutante ahora puede unirse también a
una cadherina diferente. Además, algunas cadherinas participan en
adhesión heterófila con otras cadherinas.
La E-cadherina, un miembro de la
superfamilia de la cadherina, se expresa en tipos de células
epiteliales. Patológicamente, si se pierde la expresión de
E-cadherina en un tumor, las células malignas se
vuelven invasivas y el cáncer experimenta metástasis. La
transfección de líneas de células cancerígenas con polinucleótidos
que expresan E-cadherina ha invertido los cambios
asociados al cáncer, devolviendo las formas celulares alteradas a
las normales, restaurando la adhesividad de las células entre sí y
con su sustrato, disminuyendo la tasa de crecimiento celular, y
reduciendo drásticamente el crecimiento celular independiente del
anclaje. Por tanto, la reintroducción de la expresión de
E-cadherina invierte los carcinomas a un estadio
menos avanzado. Es probable que otras cadherinas tengan el mismo
papel supresor de la invasión en carcinomas derivados de otros tipos
de tejido. Por tanto, las proteínas de la presente invención con
actividad de cadherina, y los polinucleótidos de la presente
invención que codifican tales proteínas, pueden usarse para tratar
el cáncer. La introducción de tales proteínas o polinucleótidos en
células cancerígenas puede reducir o eliminar los cambios
cancerígenos observados en estas células proporcionando una
expresión normal de
cadherina.
cadherina.
También se ha mostrado que las células
cancerígenas expresan cadherinas de un tipo de tejido diferente que
su origen, permitiendo así a estas células invadir y experimentar
metástasis en un tejido diferente en el organismo. En estas células
las cadherinas expresadas de manera inapropiada pueden sustituirse
por las proteínas de la presente invención con actividad de
cadherina, y los polinucleótidos de la presente invención que
codifican tales proteínas, restaurando las propiedades adhesivas
celulares normales y reduciendo o eliminando la tendencia de las
células a la metástasis.
Adicionalmente, las proteínas de la presente
invención con actividad de cadherina, y los polinucleótidos de la
presente invención que codifican tales proteínas, pueden usarse para
generar anticuerpos que reconocen y se unen a las cadherinas. Tales
anticuerpos pueden usarse para bloquear la adhesión de cadherinas de
células tumorales expresadas de manera inapropiada, impidiendo que
las células formen un tumor en otra parte. Tal anticuerpo
anti-cadherina también puede usarse como un marcador
del grado, tipo patológico y pronóstico de un cáncer, es decir,
cuanto más avanzado esté el cáncer, menos expresión de cadherina
habrá, y esta disminución en la expresión de cadherina puede
detectarse mediante el uso de un anticuerpo de unión a
cadherina.
Los fragmentos de proteínas de la presente
invención con actividad de cadherina, preferiblemente un polipéptido
que comprende un decapéptido del sitio de reconocimiento de la
cadherina, y los polinucleótidos de la presente invención que
codifican tales fragmentos de proteínas, también pueden usarse para
bloquear la función de la cadherina uniéndose a las cadherinas e
impidiendo que se unan en formas que produzcan efectos no deseados.
Adicionalmente, los fragmentos de proteínas de la presente invención
con actividad de cadherina, preferiblemente fragmentos de cadherina
solubles truncados, que se ha descubierto que son estables en la
circulación de pacientes con cáncer, y los polinucleótidos que
codifican tales fragmentos de proteínas, pueden usarse para alterar
la adhesión célula-célula apropiada.
Los ensayos para determinar la actividad
adhesiva de cadherina y la actividad supresora invasiva incluyen,
sin limitación, los descritos en: Hortsch et al. J Biol Chem
270 (32): 18809-18817, 1995; Miyaki et al.
Oncogene 11: 2547-2552, 1995; Ozawa et al.
Cell 63: 1033-1038,1990.
Además de las actividades descritas
anteriormente para el tratamiento inmunológico o prevención de
tumores, una proteína de la presente invención puede mostrar otras
actividades antitumorales. Una proteína puede inhibir el
crecimiento tumoral directa o indirectamente (tal como, por ejemplo,
mediante citotoxicidad mediada por células dependiente de
anticuerpos (ADCC)). Una proteína puede mostrar su actividad
inhibidora de tumores actuando sobre el tejido tumoral o el tejido
precursor de tumores, inhibiendo la formación de tejidos necesarios
para soportar el crecimiento tumoral (tales como, por ejemplo,
inhibiendo la angiogénesis), provocando la producción de otros
factores, agentes o tipos celulares que inhiben el crecimiento
tumoral, o suprimiendo, eliminando o inhibiendo factores, agentes o
tipos celulares que fomentan el crecimiento tumoral.
Una proteína de la invención también puede
mostrar una o más de las siguientes actividades o efectos
adicionales: inhibición del crecimiento, infección o función de, o
destrucción de, agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación,
bacterias, virus, hongos y otros parásitos; afectación (supresión o
potenciación) de características corporales, incluyendo, sin
limitación, altura, peso, color del pelo, color de los ojos, piel,
proporción de grasa a magro u otra pigmentación de tejido, o el
tamaño o la forma de un órgano o parte del cuerpo (tal como, por
ejemplo, aumento o disminución de pecho, cambio en la forma o
conformación ósea), afectación de los biorritmos o ciclos o ritmos
circadianos; afectación de la fertilidad de sujetos macho o hembra;
afectación del metabolismo, catabolismo, anabolismo, procesamiento,
utilización, almacenamiento o eliminación de grasas, lípidos,
proteínas, hidratos de carbono, vitaminas, minerales, cofactores
dietéticos u otros factores o componente(s) nutricionales;
afectación de características de comportamiento, incluyendo, sin
limitación, apetito, líbido, estrés, cognición (incluyendo
trastornos cognitivos), depresión (incluyendo trastornos depresivos)
y comportamientos violentos; proporcionamiento de efectos
analgésicos u otros efectos de reducción del dolor; fomento de la
diferenciación y crecimiento de células madre embrionarias en
linajes diferentes de los linajes hematopoyéticos; actividad
hormonal o endocrina; en el caso de enzimas, corrección de
deficiencias de la enzima y tratamiento de enfermedades
relacionadas con la deficiencia; tratamiento de trastornos
hiperproliferativos (tales como, por ejemplo, psoriasis); actividad
de tipo inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, la capacidad de
unirse a antígenos o al complemento); y la capacidad de actuar como
un antígeno en una composición de vacuna para producir una
respuesta inmunitaria frente a tal proteína u otro material o entidad que tiene reactividad cruzada con tal proteína.
respuesta inmunitaria frente a tal proteína u otro material o entidad que tiene reactividad cruzada con tal proteína.
Una proteína de la presente invención (derivada
de cualquier fuente, incluyendo sin limitación de fuentes
recombinantes y no recombinantes) puede usarse en una composición
farmacéutica cuando se combina con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Tal composición también puede contener (además de una
proteína y un vehículo) diluyentes, cargas, sales, tampones,
estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en
la técnica. La expresión "farmacéuticamente aceptable"
significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia
de la actividad biológica del/de los principio(s)
activo(s). Las características del vehículo dependerán de la
vía de administración. La composición farmacéutica de la invención
también puede contener citocinas, linfocinas u otros factores
hematopoyéticos tales como M-CSF,
GM-CSF, TNF, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, IL-13,
IL-14, IL-15, IFN, TNF0, TNF1, TNF2,
G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina,
factor de células madre y eritropoyetina. La composición
farmacéutica puede contener además otros agentes que potencian la
actividad de la proteína o bien complementan su actividad o uso en
el tratamiento. Tales factores y/o agentes adicionales pueden
incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto
sinérgico con la proteína de la invención, o para minimizar los
efectos secundarios. A la inversa, puede incluirse una proteína de
la presente invención en las formulaciones de citocina, linfocina,
otro factor hematopoyético, factor trombolítico o antitrombótico o
agente antiinflamatorio particulares para minimizar los efectos
secundarios de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético,
factor trombolítico o antitrombótico o agente antiinflamatorio.
Una proteína de la presente invención puede ser
activa en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o
complejos consigo misma u otras proteínas. Como resultado, las
composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una
proteína de la invención en tal forma multimérica o complejada.
La composición farmacéutica de la invención
puede estar en forma de un complejo de la(s)
proteína(s) de la presente invención junto con antígenos
proteicos o peptídicos. El antígeno proteico y/o peptídico
administrará una señal estimuladora tanto a linfocitos B como T.
Los linfocitos B responderán al antígeno a través de su receptor de
inmunoglobulina de superficie. Los linfocitos T responderán al
antígeno a través del receptor de células T (TCR) tras la
presentación del antígeno por proteínas del MHC. Las proteínas del
MHC y estructuralmente relacionadas incluyendo las codificadas por
los genes del MHC de clase I y de clase II sobre células huésped
servirán para presentar el/los antígeno(s)
peptídico(s) a los linfocitos T. Los componentes antigénicos
también pueden suministrarse como complejos
MHC-péptido purificados solos o con moléculas
coestimuladoras que pueden señalizar directamente células T. Como
alternativa, pueden combinarse anticuerpos que pueden unirse a
inmunoglobulinas de superficie y otras moléculas sobre células B
así como anticuerpos que pueden unirse al TCR y otras moléculas
sobre células T, con la composición farmacéutica de la
invención.
La composición farmacéutica de la invención
puede estar en forma de un liposoma en el que la proteína de la
presente invención se combina, además de con otros vehículos
farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como
lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas
insolubles, cristales líquidos o capas lamelares en disolución
acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposomial
incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidas,
lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares.
La preparación de tales formulaciones liposomiales está dentro del
conocimiento en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en
la patente estadounidense número 4.235.871; la patente
estadounidense número 4.501.728; la patente estadounidense número
4.837.028 y la patente estadounidense número 4.737.323, todas las
cuales se incorporan al presente documento por referencia.
Tal como se usa en el presente documento, la
expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la
cantidad total de cada principio activo de la composición
farmacéutica o procedimiento que es suficiente para mostrar un
beneficio significativo al paciente, es decir, tratamiento,
curación, prevención o mejora del estado médico relevante, o un
aumento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o
mejora de tales estados. Cuando se aplica a un principio activo
individual, administrado solo, la expresión se refiere a ese
principio solo. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se
refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan
como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en
combinación, en serie o de manera simultánea.
En la práctica del procedimiento de tratamiento
o uso de la presente invención, se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de la proteína de la presente invención a un
mamífero que tiene un estado que ha de tratarse. La proteína de la
presente invención puede administrarse según el procedimiento de la
invención solo o bien en combinación con otras terapias tales como
tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otros factores
hematopoyéticos. Cuando se administra conjuntamente con una o más
citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos, la proteína
de la presente invención puede administrarse de manera simultánea
con la(s) citocina(s), linfocina(s) u
otro(s) fac-
tor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos, o bien de manera secuencial. Si se administra de manera secuencial, el médico encargado decidirá la secuencia apropiada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos.
tor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos, o bien de manera secuencial. Si se administra de manera secuencial, el médico encargado decidirá la secuencia apropiada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos.
La administración de la proteína de la presente
invención usada en la composición farmacéutica o para poner en
práctica el procedimiento de la presente invención puede llevarse a
cabo de una variedad de formas convencionales, tales como ingestión
oral, inhalación, aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea,
intraperitoneal, parenteral o intravenosa. Se prefiere la
administración intravenosa al paciente.
Cuando se administra por vía oral una cantidad
terapéuticamente eficaz de una proteína de la presente invención,
la proteína de la presente invención estará en forma de un
comprimido, cápsula, polvo, disolución o elixir. Cuando se
administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la
invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como
gelatina o un adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen
desde aproximadamente el 5% hasta el 95% de proteína de la presente
invención, y preferiblemente desde aproximadamente el 25% hasta el
90% de proteína de la presente invención. Cuando se administra en
forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua,
petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de
cacahuete, aceite mineral, aceite de semilla de soja o aceite de
sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición
farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica,
dextrosa u otra disolución de sacárido, o glicoles tales como
etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se
administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene
desde aproximadamente el 0,5% en peso hasta el 90% en peso de
proteína de la presente invención, y preferiblemente desde
aproximadamente el 1% hasta el 50% de proteína de la presente
invención.
Cuando se administra mediante inyección
intravenosa, cutánea o subcutánea una cantidad terapéuticamente
eficaz de proteína de la presente invención, la proteína de la
presente invención estará en forma de una disolución acuosa
parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de
tales disoluciones de proteína parenteralmente aceptables, con la
debida atención al pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está
dentro del conocimiento en la técnica. Una composición farmacéutica
preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe
contener, además de una proteína de la presente invención, un
vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio,
inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y
cloruro de sodio, inyección de Ringer con lactato u otro vehículo
tal como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la
presente invención también puede contener estabilizantes,
conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos
por los expertos en la técnica.
La cantidad de proteína de la presente invención
en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá
de la naturaleza y gravedad del estado que va a tratarse, y de la
naturaleza de los tratamientos anteriores a los que se ha sometido
el paciente. En última instancia, el médico encargado decidirá la
cantidad de proteína de la presente invención con la que tratar a
cada paciente individual. Inicialmente, el médico encargado
administrará dosis bajas de la proteína de la presente invención y
observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis
mayores de la proteína de la presente invención hasta que se obtenga
el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto no se
aumentará más la dosificación. Se contempla que las diversas
composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el
procedimiento de la presente invención deben contener de
aproximadamente 0,01 \mug a aproximadamente 100 mg
(preferiblemente de aproximadamente 0,1 ng a aproximadamente 10 mg,
más preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente
1 mg) de proteína de la presente invención por kg de peso
corporal.
La duración del tratamiento intravenoso usando
la composición farmacéutica de la presente invención variará
dependiendo de la gravedad de la enfermedad que está tratándose y el
estado y posible respuesta idiosincrática de cada paciente
individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la
proteína de la presente invención estará en el intervalo de 12 a 24
horas de administración intravenosa continua. En última instancia,
el médico encargado decidirá la duración apropiada del tratamiento
intravenoso usando la composición farmacéutica de la presente
invención.
La proteína de la invención también puede usarse
para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y
monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína. Tal
como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo"
incluye sin limitación un anticuerpo policlonal, un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena
sencilla, un anticuerpo con injerto de CDR, un anticuerpo
humanizado, o fragmentos de los mismos que se unen a la proteína
indicada. Tal término también incluye cualquier otra especie
derivada de un anticuerpo o secuencia de anticuerpo que puede unirse
a la proteína indicada.
Pueden producirse anticuerpos frente a una
proteína particular mediante procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos
monoclonales mediante generación de hibridomas que producen
anticuerpos según procedimientos conocidos (véase por ejemplo,
Goding, 1983, Monoclonal Antibodies: principles and practice,
Academic Press Inc., Nueva York; y Yokoyama, 1992, "Production of
Monoclonal Antibodies" en Current Protocols in Immunology, Unit
2.5, Greene Publishing Assoc. y John Wiley & Sons). Pueden
producirse anticuerpos y sueros policlonales mediante inoculación de
un sujeto mamífero con la proteína relevante o fragmentos de la
misma según procedimientos conocidos. Pueden producirse fragmentos
de anticuerpos, receptores u otros péptidos reactivos a partir de
los anticuerpos correspondientes mediante rotura, y recogida, de los
fragmentos deseados según procedimientos conocidos (véase por
ejemplo, Goding, mencionado anteriormente; y Andrew et al.,
1992, "Fragmentation of Immunoglobulins" en Current Protocols
in Immunology, Unit 2.8, Greene Publishing Assoc. y John Wiley
& Sons). También pueden producirse anticuerpos quiméricos y
anticuerpos de cadena sencilla según procedimientos recombinantes
conocidos (véanse por ejemplo, los documentos 5.169.939, 5.194.594
y 5.576.184). También pueden prepararse anticuerpos humanizados a
partir de anticuerpos murinos correspondientes según procedimientos
bien conocidos (véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses
números 5.530.101, 5.585.089 y 5.693.762). Adicionalmente, pueden
producirse anticuerpos humanos en animales no humanos tales como
ratones que se han alterado genéticamente para expresar moléculas de
anticuerpo humano (véase por ejemplo Fishwild et al., 1996,
Nature Biotechnology 14: 845-851; Mendez et
al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156 (fe de
errata de Nature Genetics 16: 410); y las patentes estadounidenses
5.877.397 y 5.625.126). Tales anticuerpos pueden obtenerse usando
la proteína entera o bien fragmentos de la misma como inmunógeno.
Adicionalmente, los inmunógenos de péptido pueden contener un
residuo de cisteína en el extremo
carboxilo-terminal, y se conjugan con un hapteno
tal como hemocianina de lapa californiana (KLH). Los procedimientos
para sintetizar tales péptidos se conocen en la técnica, por
ejemplo, como en R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85,
2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky, et al.,
FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos monoclonales que se unen a la
proteína de la invención pueden ser agentes de diagnóstico útiles
para la inmunodetección de la proteína. Los anticuerpos monoclonales
neutralizantes que se unen a la proteína también pueden ser agentes
terapéuticos útiles tanto para estados asociados con la proteína
como también en el tratamiento de algunas formas de cáncer en las
que está implicada la expresión anómala de la proteína. En el caso
de células cancerosas o células leucémicas, los anticuerpos
monoclonales neutralizantes contra la proteína pueden ser útiles
para detectar y prevenir la expansión metastásica de las células
cancerosas, que puede estar mediada por la proteína.
Para las composiciones de la presente invención
que son útiles para la regeneración de huesos, cartílagos, tendones
o ligamentos, el procedimiento terapéutico incluye administrar la
composición por vía tópica, sistemática o local como un implante o
dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para
su uso en esta invención está, por supuesto, en una forma libre de
pirógenos, fisiológicamente aceptable. Además, la composición puede
estar de manera deseable encapsulada o inyectarse en una forma
viscosa para su administración al sitio del daño en el hueso,
cartílago o tejido. La administración tópica puede ser adecuada para
la cicatrización de heridas y reparación de tejidos. Como
alternativa o adicionalmente, en los procedimientos de la invención,
pueden administrarse simultánea o secuencialmente con la
composición, agentes terapéuticamente útiles distintos de una
proteína de la invención que también pueden incluirse opcionalmente
en la composición tal como se describió anteriormente.
Preferiblemente, para la formación de huesos y/o cartílagos, la
composición incluirá una matriz que puede administrar la
composición que contiene proteína al sitio del daño en el hueso y/o
cartílago, proporcionando una estructura para desarrollar hueso y
cartílago que de manera óptima puede resorberse en el cuerpo. Tales
matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso
para otras aplicaciones médicas implantadas.
La elección del material de la matriz se basa en
la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas,
aspecto cosmético y propiedades de superficie de contacto. La
aplicación particular de las composiciones definirá la formulación
apropiada. Las posibles matrices para las composiciones pueden ser
sulfato de calcio, fosfato de tricalcio, hidroxiapatita, poli(ácido
láctico), poli(ácido glicólico) y polianhídridos biodegradables y
químicamente definidos. Otros posibles materiales son biodegradables
y están biológicamente bien definidos, tales como colágeno óseo o
dérmico. Otras matrices están compuestas por proteínas puras o
componentes de matriz extracelular. Otras posibles matrices no son
biodegradables y están químicamente definidas, tales como
hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otras
cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas por combinaciones
de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente,
tales como poli(ácido láctico) e hidroxiapatita o colágeno y
fosfato de tricalcio. Las biocerámicas pueden tener su composición
alterada, tales como en aluminato-fosfato de calcio
y procesarse para alterar el tamaño de poro, tamaño de partícula,
forma de partícula y biodegradabilidad.
En el presente documento, se prefiere un
copolímero 50:50 (peso molecular) de ácido láctico y ácido glicólico
en forma de partículas porosas que tienen diámetros que oscilan
entre 150 micrómetros y 800 micrómetros. En algunas aplicaciones,
será útil utilizar un agente secuestrante, tal como
carboximetilcelulosa o coágulo de sangre autóloga, para evitar que
las composiciones de proteína se disocien de la matriz.
Una familia preferida de agentes secuestrantes
son los materiales celulósicos tales como alquilcelulosas
(incluyendo hidroxialquilcelulosas), incluyendo metilcelulosa,
etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa, siendo las más
preferidas las sales catiónicas de carboximetilcelulosa (CMC).
Otros agentes secuestrantes preferidos incluyen ácido hialurónico,
alginato de sodio, poli(etilenglicol), poli(óxido de
oxietileno), polímero de carboxivinilo y poli(alcohol
vinílico). La cantidad de agente secuestrante útil en el presente
documento es del 0,5-20% en peso, preferiblemente
del 1-10% en peso basándose en el peso de
formulación total, que representa la cantidad necesaria para impedir
la desorción de la proteína de la matriz polimérica y para
proporcionar un manejo apropiado de la composición, pero no tanto
como para que se impida que las células progenitoras se infiltren
en la matriz, proporcionando así a la proteína la oportunidad de
ayudar en la actividad osteogénica de las células progenitoras.
En otras composiciones, las proteínas de la
invención pueden combinarse con otros agentes beneficiosos para el
tratamiento del defecto en huesos y/o cartílagos, heridas o tejidos
en cuestión. Estos agentes incluyen diversos factores de
crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF),
factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factores
transformadores de crecimiento (TGF-\alpha y
TGF-\beta) y factor de crecimiento similar a
insulina (IGF).
Las composiciones terapéuticas también son
valiosas en el presente documento para aplicaciones veterinarias.
Particularmente, los animales domésticos y caballos de pura sangre,
además de los seres humanos, son pacientes deseados para tal
tratamiento con proteínas de la presente invención.
El régimen de dosificación de una composición
farmacéutica que contiene proteína que debe usarse en la
regeneración de tejidos se determinará por el médico encargado
considerando diversos factores que modifican la acción de las
proteínas, por ejemplo, cantidad de peso de tejido que se desea
formar, el sitio del daño, el estado del tejido dañado, el tamaño
de una herida, tipo de tejido dañado (por ejemplo, hueso), la edad,
sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección,
momento de administración y otros factores clínicos. La
dosificación puede variar con el tipo de matriz usada en la
reconstitución y con la inclusión de otras proteínas en la
composición farmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores
de crecimiento conocidos, tales como IGF I (factor I de crecimiento
similar a insulina), en la composición final, también puede afectar
a la dosificación. Puede controlarse el progreso mediante
evaluaciones periódicas del crecimiento y/o reparación del
tejido/hueso, por ejemplo, rayos X, determinaciones
histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.
Los polinucleótidos de la presente invención
también pueden usarse para la terapia génica. Tales polinucleótidos
pueden introducirse in vivo o bien ex vivo en células
para su expresión en un sujeto mamífero. Los polinucleótidos de la
invención también pueden administrarse mediante otros procedimientos
conocidos para la introducción de ácido nucleico en una célula u
organismo (incluyendo, sin limitación, en forma de vectores virales
o ADN
desnudo).
desnudo).
También pueden cultivarse células ex vivo
en presencia de proteínas de la presente invención con el fin de
hacerlas proliferar o producir un efecto deseado sobre, o actividad
en, tales células. Las células tratadas pueden introducirse
entonces in vivo para fines terapéuticos.
Esta invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como
limitantes. En el presente documento se incorpora el contenido del
listado de secuencias.
Se ha identificado un polinucleótido de la
presente invención como el clon
"hGIL-19/AE289". Se aisló el clon
hGIL-19/AE289 según el siguiente procedimiento. Se
identificó una EST murina a partir de una biblioteca de ADNc murino
preparada a partir de esplenocitos activados tanto con ConA como con
células dendríticas derivadas de médula ósea. Se identificó la EST
usando procedimientos que son selectivos para ADNc que codifican
proteínas secretadas (véase la patente estadounidense número
5.536.637). Se usó la secuencia EST murina para aislar un clon
murino de longitud completa de la misma biblioteca de ADNc. El
análisis de la secuencia del clon murino reveló una homología
significativa con interleucina-10
(IL-10).
Con el fin de aislar un homólogo humano del clon
murino, se construyeron cebadores de PCR basándose en la región de
la secuencia murina que mostraba homología con
IL-10. El uso de tales cebadores para la
amplificación en una biblioteca de CMSP humanas produjo un producto
de PCR de tamaño significativo. El análisis de la secuencia del
producto de PCR confirmó que era un homólogo de ADNc murino. Se
construyeron oligonucleótidos a partir de la secuencia del clon
humano parcial y se usaron para aislar un clon humano de longitud
completa a partir de la biblioteca de CMSP.
La hGIL-19/AE289 es un clon
humano de longitud completa, que incluye toda la secuencia
codificante de una proteína secretada (también denominada en el
presente documento proteína "hGIL-19/AE289").
El análisis de su secuencia de aminoácidos indicó que tenía
aproximadamente el 23% de homología con hIL-10.
Basándose en los supuestos motivos de unión a receptor en
IL-10, se propusieron tres motivos implicados con
una función análoga en hGIL-19/AE289 mediante
modelización informática. Éstos son las regiones de SEC ID NO: 2
desde el residuo 50 hasta el 60, desde el residuo 63 hasta el 81 y
desde el residuo 168 hasta el 177. El análisis de bases de datos
reveló que hGIL-19 también muestra niveles similares
de homología con IL-10 de otras especies.
La secuencia de nucleótidos de
hGIL-19/AE289 tal como se determinó por el presente
documento se notifica en SEC ID NO: 1, e incluye una cola de
poli(A). La secuencia de aminoácidos de la proteína
hGIL-19/AE289 correspondiente a la secuencia de
nucleótidos anterior se notifica en SEC ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se crearon líneas celulares que expresaban de
manera estable y secretaban proteína hGIL-19/AE289
de longitud completa, transfectando células CHO con ADNc de
hGIL-19/AE289 en vectores de expresión apropiados.
Se usaron células COS transitoriamente transfectadas usando
vectores de expresión de hGIL-19/AE289 apropiados
para preparar proteína hGIL-19/AE289 para el
análisis. Las transfecciones se lograron usando el reactivo
Lipofectamine (Gibco) disponible comercialmente. De manera
interesante, se observó que las células COS que expresaban
hGIL-19 se separaban de manera no uniforme,
formando agujeros en la monocapa de cultivo celular. Se usaron
medios condicionados mediante células COS transfectadas para
demostrar actividad de tipo citocina de la proteína
hGIL-19/AE289. El análisis de inmunotransferencia
de tipo Western de lisados celulares mostró que el
Stat-3 se fosforila (activa) en una línea celular
derivada de tejido mesangial del riñón que mostraban calidades de
tipo macrófago (MES-13; véase, Dumoutier et
al (2000) J. of Immunology 164: 1814-1819) tras
exponerse la célula a medios condicionados mediante células que
expresaban hGIL-19/AE289. Además se induce la
fosforilación de Stat-3 en células COS no
transfectadas que se tratan con proteína
hGIL-19.
El análisis electroforético de proteína
hGIL-19/AE289 (derivada a partir de líneas de
células COS transfectadas descritas en el presente documento)
indicó que la proteína expresada existe en un intervalo de tamaños.
El tratamiento de proteína hGIL-19 derivada de COS
con N-glucanasa antes de la electroforesis da como
resultado una única banda que corresponde a la especie de mayor
movilidad (por ejemplo el menor peso molecular) observada en
hGIL-19/AE289 sin tratar. Esto es coherente con los
acontecimientos de glucosilación propuestos que pueden producirse
en los supuestos sitios de glucosilación unida a N identificados en
la secuencia de aminoácidos de hGIL-19/AE289
(residuos de aminoácidos 54-56,
68-70, 97-99 y
176-178 de SEC ID NO: 2).
La secuenciación N-terminal de
Edman determinó que el extremo N-terminal de la
proteína hGIL-19/AE289 madura comienza en el
residuo en la posición 34 de SEC ID NO: 2 (alanina). Se crearon
vectores de expresión que fusionan una etiqueta de afinidad de
"6x histidina" y una etiqueta de epítopo FLAG con el extremo
N-terminal de la proteína
hGIL-19/AE289 madura. (La etiqueta de aminoácidos
añadida se facilita en SEC ID NO: 3 y tiene la siguiente secuencia
de aminoácidos:
MKFLVNVALVFMVVYISYIYAGSGHHHHHHGSGDYKDDDDKAPISSHCR).
Se usaron estos constructos marcados con
etiqueta para crear líneas de células CHO que expresaban de manera
estable y líneas de células CHO que expresaban de manera
transitoria. Las etiquetas proporcionaron un medio conveniente para
detectar hGIL-19/AE289 (por ejemplo, anticuerpos
anti-6xhis; anticuerpos anti-FLAG),
y para purificar la proteína a partir de medios condicionados
(usando resina Ni^{+2}). La proteína GIL-19 humana
purificada mediante esta etiqueta a partir de las líneas de células
COS que expresaban hGIL-19/AE289 pudieron usarse
para inducir la activación de Stat-3 en células
MES-13.
La comparación de transcritos de ARNm de
hGIL-19 en células Th1 y Th2 activadas (véase, por
ejemplo, Syrbe et al, (1999) Springer Seminars in
Immunopathology, 21: 263-85) indicó un nivel
sustancialmente superior de expresión de GIL-19 en
células Th1 activadas que en células Th2 activadas. El análisis de
ARNm de GIL-19 se logró con ensayos de protección
con ARNasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron los efectos inmunológicos de
GIL-19 en un contexto metazoario mediante
introducción viral del ADNc de GIL-19 murina en
ratones. Se usó un vector adenoviral para expresar un ADNc de
GIL-19 murina en ratones hembra C57/B6 de 8 semanas
de edad mediante inyección de 5x10^{10} partículas virales. Se
sacrificaron los ratones de prueba a los 7 y 14 días tras la
inyección y se compararon con ratones control a los que se inyectó
tampón solo o con adenovirus que expresaba proteína verde
fluorescente (GFP). En los días 7 y 14, se observó que los pesos
tímicos absolutos y relativos estaban reducidos significativamente
en los ratones que expresaban la GIL-19 murina
viral. El peso medio absoluto del bazo estaba reducido en el día 14
y los pesos del hígado estaban ligeramente aumentados en el día 7.
Una atrofia generalizada macroscópica del timo así como depleción
linfocítica (observada microscópicamente) resulto aparente en los
días 7 y 14.
Además, hubo varios efectos hematológicos que
resultaron aparentes el día 7, incluyendo reducción del hemograma,
hemoglobina y hematocritos. Estos efectos tomados juntos indicaron
anemia en los animales. Además, hubo un aumento de las plaquetas
así como un aumento de la fórmula leucocítica debido a un aumento de
neutrófilos. A la luz de estas observaciones no hubo evidencias de
una respuesta regenerativa, lo que indicó que los efectos pueden
ser a nivel de la médula ósea.
Además, hubo un ligero descenso de los niveles
de albúmina en el día 7 y el día 14. Una posible causa para ésto es
la pérdida de moléculas pequeñas a través del riñón o el
intestino.
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán
determinar usando tan sólo la experimentación rutinaria, muchos
equivalentes de las realizaciones específicas de la invención
descritas en el presente documento. Se pretende que las siguientes
reivindicaciones abarquen tales equivalentes.
<110> GENETICS INSTITUTE
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNAS
GIL-19/AE289 HUMANAS Y POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN
LAS MISMAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GIN-5358CPPC
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/131.473
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
28-04-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (43)
1. Un polinucleótido que comprende una secuencia
de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65 hasta el nucleótido 601;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína de longitud completa del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia que codifica proteína madura del clon HGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2;
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179; y
- (g)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-177 de SEC ID NO: 2.
2. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que dicho polinucleótido está operativamente unido a al menos
una secuencia control de la expresión.
3. Una célula huésped transformada con el
polinucleótido según la reivindicación 2.
4. La célula huésped según la reivindicación 3,
en la que dicha célula es una célula de mamífero.
5. Un procedimiento para producir una proteína
codificada por el polinucleótido según la reivindicación 2,
procedimiento que comprende:
- (a)
- hacer crecer un cultivo de una célula huésped transformada con el polinucleótido según la reivindicación 2 en un medio de cultivo adecuado; y
- (b)
- purificar dicha proteína del cultivo.
6. Una proteína producida según el procedimiento
de la reivindicación 5.
7. Un polinucleótido que codifica la proteína
según la reivindicación 6.
8. El polinucleótido según la reivindicación 7,
en el que el polinucleótido comprende la secuencia que codifica la
proteína de longitud completa, o madura, del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
9. Una proteína que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2;
- (b)
- un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-177 de SEC ID NO: 2;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia que codifica proteína de longitud completa del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia que codifica proteína madura del clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231; y
- (e)
- la secuencia de aminoácidos según la SEC ID NO: 2 desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179.
10. La proteína según la reivindicación 9, en la
que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID
NO: 2.
11. Una composición que comprende la proteína
según la reivindicación 9 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
12. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos
de SEC ID NO: 1.
13. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos
de SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 65 hasta el nucleótido 601.
14. El polinucleótido según la reivindicación
1, en el que el nucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de
una secuencia que codifica proteína de longitud completa del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
15. El polinucleótido según la reivindicación
14, en el que la secuencia que codifica proteína de longitud
completa está codificada por el inserto de ADNc del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
16. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos
de una secuencia que codifica proteína madura de
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
17. El polinucleótido según la reivindicación
16, en el que la secuencia que codifica proteína madura está
codificada por el inserto de ADNc del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
18. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido codifica una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2.
19. El polinucleótido según la reivindicación 1,
en el que el polinucleótido codifica una proteína que comprende un
fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2,
comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por los aminoácidos 50-60,
63-81 y 168-177 de SEC ID NO: 2.
20. La proteína según la reivindicación 9, en la
que la proteína comprende un fragmento de la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 2, comprendiendo el fragmento una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por los
aminoácidos 50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2.
21. La proteína según la reivindicación 9, en la
que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos codificada
por una secuencia que codifica proteína de longitud completa del
clon hGIL-19/AE289 depositado con el número de
acceso ATCC 207231.
22. Un anticuerpo o fragmento del mismo que se
une a una proteína según la reivindicación 9, 10, 20 ó 39.
23. El anticuerpo según la reivindicación 22,
que es un anticuerpo neutralizante.
24. El anticuerpo según la reivindicación 22,
que se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo
monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un
anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo con injerto de CDR y
un anticuerpo humanizado.
25. El anticuerpo según la reivindicación 22,
que es un anticuerpo humano.
26. El anticuerpo según la reivindicación 24 ó
25, que es un anticuerpo monoclonal.
27. Uso de un anticuerpo según cualquiera de
las reivindicaciones 22-26, para la preparación de
una composición farmacéutica para tratar o prevenir la
artritis.
28. El uso según la reivindicación 27, en el que
la artritis es artritis reumatoide.
29. El polinucleótido según la reivindicación
1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEC ID NO: 2 desde aproximadamente el aminoácido 34
hasta el 179.
30. La proteína según la reivindicación 21, en
la que la secuencia que codifica proteína de longitud completa está
codificada por el inserto de ADNc del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
31. La proteína según la reivindicación 9, en la
que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos codificada
por una secuencia que codifica proteína madura del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 207231.
32. La proteína según la reivindicación 31, en
la que la secuencia que codifica proteína madura está codificada
por el inserto de ADNc del clon hGIL-19/AE289
depositado con el número de acceso ATCC 207231.
33. La proteína según la reivindicación 9, en la
que la proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:
2 desde aproximadamente el aminoácido 34 hasta el 179.
34. Un polinucleótido que comprende una
secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones sumamente
rigurosas con SEC ID NO: 1 o un complemento de la misma.
35. Una proteína codificada por una secuencia de
nucleótidos que se hibrida en condiciones sumamente rigurosas con
el complemento de SEC ID NO: 1.
36. Un polinucleótido que codifica un fragmento
o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por los aminoácidos
50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2.
37. Un fragmento de una proteína que comprende
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por
los aminoácidos 50-60, 63-81 y
168-177 de SEC ID NO: 2.
38. Una composición que comprende el anticuerpo
o fragmento del mismo según la reivindicación 22.
39. Una proteína de fusión que comprende la
proteína según la reivindicación 20 fusionada a una molécula
vehículo.
40. La proteína de fusión según la
reivindicación 39, en la que la molécula vehículo es una
inmunoglobulina o la parte Fc de una inmunoglobulina.
41. La proteína de fusión según la
reivindicación 40, en la que la proteína según la reivindicación 20
está fusionada con la molécula vehículo a través de una secuencia
conectora.
42. La proteína de fusión según la
reivindicación 40, en la que la inmunoglobulina es una
inmunoglobulina IgG o una IgM.
43. La proteína de fusión según la
reivindicación 42, en la que la inmunoglobulina es una
inmunoglobulina IgG.
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