DE60036937T2

DE60036937T2 - HUMANE GIL-19/AE289 PROTEINE UND DAFüR KODIERENDE POLYNUKLEOTIDE

Info

Publication number: DE60036937T2
Application number: DE60036937T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Newton JACOBS; Lynette Acton FOUSER; Vikki Lowell SPAULDING; Dejun Boston XUAN
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: EP2357193B1; CY1107138T1; WO2000065027A2; PT1177312E; MXPA01010883A; WO2000065027A3; DE60036937D1; NZ515678A; HK1041021A1; EP1177312A4; JP2011160804A; EP1177312A2; HK1118576A1; ES2530857T3; EP1177312B1; CA2367965A1; CA2367965C; ZA200109270B; JP2003527078A; DK1177312T3

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung stellt neue Proteine, die Homologie zu Interleukin-10 (IL-10) zeigen, sowie Polynucleotide, die für solche Proteine kodieren, zusammen mit therapeutischen, diagnostischen und Forschungshilfsmitteln für diese Polynucleotide und Proteine bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technologie, die auf die Entdeckung von Proteinfaktoren (einschließlich z. B. Cytokinen wie z. B. Lymphokinen, Interferonen, CSFs und Interleukinen) abzielt, hat sich im letzten Jahrzehnt rasch weiterentwickelt. Mittlerweile sind Hybridisierungsklonierungs- und Expressionsklonierungstechniken Routine, mit denen neue Polynucleotide „direkt" kloniert werden, insofern sie sich direkt auf Informationen beziehen, die mit dem entdeckten Protein zusammenhängen (d. h. partielle DNA-/Aminosäuresequenz des Proteins im Falle von Hybridisierungsklonieren; Proteinaktivität im Falle des Expressionsklonierens). Erst kürzlich haben „indirekte" Klonierungstechniken wie z. B. Signalsequenz-Klonierung, mit der DNA-Sequenzen isoliert werden, die auf der Gegenwart einer jetzt wohlbekannten sekretorischen Leadersequenzeinheit beruhen, sowie verschiedene auf PCR basierende Klonierungstechniken oder solche mit Hybridisierung bei geringer Stringenz, den Stand der Technik vorangebracht, indem sie eine große Anzahl an DNA-/Aminosäuresequenzen für Proteine zugänglich gemacht haben, von denen eine biologische Aktivität aufgrund ihrer sezernierten Natur im Falle des Leadersequenz-Klonierens oder aufgrund der Zell- oder Gewebequelle im Falle der auf PCR beruhenden Techniken bekannt ist. Auf diese Proteine sowie für diese kodierende Polynucleotide ist die vorliegende Erfindung gerichtet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynucleotid bereit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst;
(b) einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601 umfasst;
(c) einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz einer für ein Volllängen-Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231, umfasst;
(d) einem Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz einer für ein reifes Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231, umfasst;
(e) einem Polynucleotid, das für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst;
(f) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179 umfasst; und
(g) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, das ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.

Vorzugsweise umfasst ein solches Polynucleotid die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601; die Nucleotidsequenz der für das Volllängen- Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231; oder die Nucleotidsequenz der für ein reifes Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231 (z. B. Nucleotide 1–1177 von SEQ ID NO: 1). In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Polynucleotid für das Volllängen- oder ein reifes Protein, das durch den cDNA-Einschub von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231, kodiert wird (z. B. Aminosäuren 1–179 von SEQ ID NO: 2). Es werden hierin auch Polynucleotide beschrieben, die für ein Protein kodieren, das ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 mit biologischer Aktivität umfasst, wobei das Fragment vorzugsweise acht (mehr bevorzugt zwanzig, am meisten bevorzugt dreißig) zusammenhängende Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 umfasst, oder ein Polynucleotid, das für ein Protein kodiert, das ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 mit biologischer Aktivität umfasst, wobei das Fragment die Aminosäuresequenz von Aminosäure 84 bis Aminosäure 93 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Andere Ausführungsformen stellen das Gen bereit, das der cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 entspricht.
Hierin ebenfalls beschrieben, werden isolierte Polynucleotide, die gemäß einem Verfahren hergestellt werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Verfahren, umfassend die Schritte:
(i) Herstellen von einer oder mehreren Polynucleotidsonden, die in 6 × SSC bei 65°C an eine Nucleotidsequenz hybridisieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(aa) SEQ ID NO: 1, aber ohne den Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1; und
(ab) der Nucleotidsequenz des cDNA-Einschubs von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231;
(ii) Hybridisieren dieser Sonde(n) an humane genomische DNA unter mindestens so stringenten Bedingungen wie 4 × SSC bei 50°C; und
(iii) Isolieren der DNA-Polynucleotide, die mit der/den Sonde(n) nachgewiesen wurden; und
(b) einem Verfahren, umfassend die Schritte:
(i) Herstellen von einem oder mehreren Polynucleotidprimern, die in 6 × SSC bei 65°C an eine Nucleotidsequenz hybridisieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
(ba) SEQ ID NO: 1, aber ohne den Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende von SEQ ID NO: NO: 1; und
(bb) der Nucleotidsequenz des cDNA-Einschubs von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231;
(ii) Hybridisieren dieses/dieser Primer an humane genomische DNA unter mindestens so stringenten Bedingungen wie 4 × SSC bei 50°C;
(iii) Amplifizieren der humanen DNA-Sequenzen; und
(iv) Isolieren der Polynucleotidprodukte aus Schritt (b)(iii).

Vorzugsweise umfasst das nach dem obigen Verfahren isolierte Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die der cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 entspricht und sich zusammenhängend von einer Nucleotidsequenz, die dem 5'-Ende von SEQ ID NO: 1 entspricht, bis zu einer Nucleotidsequenz erstreckt, die dem 3'-Ende von SEQ ID NO: 1 entspricht, aber ohne den Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende von SEQ ID NO: 1. Ebenso umfasst das nach dem obigen Verfahren isolierte Polynucleotid vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, die der cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601 entspricht und sich zusammenhängend von einer Nucleotidsequenz, die dem 5'-Ende dieser Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601 entspricht, bis zu einer Nucleotidsequenz erstreckt, die dem 3'-Ende dieser Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601 entspricht.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein Protein umfasst, wobei dieses Protein eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2.
(b) einem Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
(c) der Aminosäuresequenz, die durch eine für ein Volllängen-Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231, kodiert wird;
(d) der Aminosäuresequenz, die durch eine für ein reifes Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231, kodiert wird;
(e) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179,

In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid funktionell mit einer die Expression kontrollierenden Sequenz verbunden. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Wirtszelle, einschließlich bakterieller, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen bereit, die mit solchen Polynucleotidzusammensetzungen transformiert sind. Durch die vorliegende Erfindung werden auch Organismen bereitgestellt, die eine verstärkte, verminderte oder modifizierte Expression des/der Gens/Gene aufweisen, die der hierin offenbarten Polynucleotidsequenz entsprechen.
Es werden auch Verfahren zur Herstellung eines Proteins bereitgestellt, die umfassen:

(a) Züchten einer Kultur der Wirtszelle, die mit solchen Polynucleotidzusammensetzungen transformiert wurde, in einem geeigneten Kulturmedium; und
(b) Reinigen dieses Proteins aus der Kultur. Das Protein, das gemäß solcher Verfahren hergestellt wurde, wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.

Proteinzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können des Weiteren einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon, der an ein Protein bindet, wie es hierin beschrieben und beansprucht wird. Der Antikörper kann ein neutralisierender Antikörper sein und kann aus der Gruppe bestehend aus einem monoklonalen Antikörper, einem polyklonalen Antikörper, einem Chimären Antikörper, einem einkettigen Antikörper, einem CDR-grafted Antikörper und einem humanisierten Antikörper ausgewählt werden. Es kann sich auch um einen humanen Antikörper handeln.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, wie er hierin beschrieben und beansprucht wird, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Arthritis in einem Subjekt. In einer Ausführungsform ist die Arthritis rheumatoide Arthritis.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Polynucleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die unter hoch stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 1 oder ein Komplement davon hybridisiert. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Protein, das durch eine Nucleotidsequenz kodiert wird, die unter hoch stringenten Bedingungen an das Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, wobei das Protein im Wesentlichen frei von anderen Säugetierproteinen ist.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein isoliertes Polynucleotid, das für ein Fragment eines Proteins kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2 ausgewählt wird. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Fragment eines im wesentlichen gereinigten Proteins, das eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein, das ein Protein, wie es hierin beschrieben und beansprucht wird, fusioniert an ein Trägermolekül umfasst. Das Trägermolekül kann ein Immunglobulin oder der Fc-Teil eines Immunglobulins sein. Das Immunglobulin kann ein IgG- oder ein IgM-Immunglobulin sein. Das Protein kann des Weiteren durch eine Linkersequenz an das Trägermolekül fusioniert sein.
Zusammensetzungen, die einen Antikörper enthalten, der spezifisch mit dem hierin beschriebenen und beanspruchten Protein reagiert, werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
Ebenso werden hierin Verfahren zur Vorbeugung, Behandlung oder Verbesserung eines medizinischen Zustandes beschrieben, welche die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Protein der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch zulässigen Träger umfasst, an ein Säugetiersubjekt umfassen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Isolierte Proteine und Polynucleotide
Nucleotide und Aminosäuresequenzen, wie derzeit bestimmt, werden unten für jeden in der vorliegenden Anmeldung offenbarten Klon und jedes offenbarte Protein berichtet. Die Nucleotidsequenz von jedem Klon kann ohne Weiteres durch die Sequenzierung des hinterlegten Klons gemäß bekannter Verfahren bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz (sowohl Volllängen- wie auch reife Formen) können dann aus einer solchen Nucleotidsequenz bestimmt werden. Die Aminosäuresequenz des durch einen bestimmten Klon kodierten Proteins kann ebenfalls durch die Expression des Klons in einer geeigneten Wirtszelle, Sammeln des Proteins und Bestimmung seiner Sequenz bestimmt werden.
Wie hierin verwendet ist ein „sezerniertes" Protein ein solches, das, wenn es in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird, über oder durch eine Membran transportiert wird, einschließlich eines Transport in Folge der Signalsequenz in seiner Aminosäuresequenz. „Sezernierte" Proteine umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Proteine, die als ganzes (z. B. lösliche Proteine) oder teilweise (z. B. Rezeptoren) von der Zelle, in denen sie exprimiert werden, sezerniert werden. „Sezernierte" Proteine umfassen auch, ohne auf diese beschränkt zu sein, Proteine, die über die Membran des endoplasmatischen Retikulums transportiert werden.
Klon „hGIL-19/AE289"
Ein Polynucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung wurde anfänglich als Klon „hTIF/AE289" identifiziert, der später neu benannt wurde und hierin auch als „hGIL-19/AE289" und „hGIL-19" bezeichnet wird. Klon hGIL-19/AE289 wurde gemäß dem folgenden Verfahren isoliert. Eine murine EST wurde aus einer murinen cDNA-Bibliothek isoliert, die aus Splenozyten, die sowohl mit ConA als auch mit aus Knochenmark stammenden dendritischen Zellen aktiviert wurden, hergestellt wurde. Die EST wurde unter Verwendung von Verfahren identifiziert, die für cDNAs, die für sezernierte Proteine kodieren, selektiv sind (siehe U.S. Pat. Nr. 5,536,637 ). Die murine EST-Sequenz wurde verwendet, um einen murinen Volllängen-Klon aus der gleichen cDNA-Bibliothek zu isolieren (SEQ ID NO: 4; 1 zeigt die Sequenz der murinen GIL-19cDNA). Analyse der Sequenz des murinen Klons zeigte eine signifikante Homologie zu Interleukin-10 (IL-10).
Um ein humanes Homolog des murinen Klons zu isolieren, wurden PCR-Primer konstruiert, die auf der Region der murinen Sequenz basieren, die Homologie zu IL-10 zeigt. Die Verwendung von solchen Primern für die Amplifizierung in einer humanen PBMC-Bibliothek ergab ein PCR-Produkt mit signifikanter Größe. Die Analyse der Sequenz des PCR-Produkts bestätigte, dass es sich um ein Homolog der murinen cDNA handelte. Aus der Sequenz des teilweisen humanen Klons wurden Oligonucleotide konstruiert und verwendet, um einen humanen Volllängen-Klon aus der PBMC-Bibliothek zu isolieren.
hGIL-19/AE289 ist ein humaner Volllängen-Klon, einschließlich der gesamten kodierenden Sequenz eines sezernierten Proteins (hierin auch als „hTIF/AE289-Protein", „hGIL-19/AE289-Protein" und „hGIL-19-Protein" bezeichnet). Analyse seiner Sequenz bestätigte seine Homologie zu IL-10.
Die Nucleotidsequenz von hGIL-19, wie derzeit bestimmt, wird in SEQ ID NO: 1 berichtet und umfasst einen Poly(A)-Schwanz. Der offene Leserahmen und die Aminosäuresequenz des Volllängenproteins hGIL-19, die der vorangegangenen Nucleotidsequenz entspricht, wird in SEQ ID NO: 2 berichtet. Die Aminosäuresequenz des reifen hGIL-19 entspricht den Aminosäuren 34–179 von SEQ ID NO: 2.
Klon „hGIL-19/AE289" wurde am 28. April 1999 bei der American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 U.S.A.) als eine Originalhinterlegung unter dem Budapester Vertrag hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer ATCC 207231. Alle Einschränkungen bezüglich der Zugänglichkeit für die Öffentlichkeit des hinterlegten Materials werden bei Erteilung des Patents unwiderruflich gelöscht, mit Ausnahme der Anforderungen, die in 37 C. F. R. § 1.808 (b) spezifiziert sind, und die Frist für die Hinterlegung wird 37 C. F. R. § 1.806 entsprechen.
Fragmente der Proteine der vorliegenden Erfindung (z. B. Fragmente, die biologische Aktivität aufweisen können) sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Fragmente des Proteins können in linearer Form vorliegen oder sie können, unter Verwendung bekannter Verfahren, zum Beispiel wie beschrieben in H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773–778, (1992) und in R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245–9253 (1992), cyclisiert werden. Solche Fragmente können für viele Zwecke an Trägermoleküle wie z. B. Immunglobuline fusioniert werden, einschließlich der Erhöhung der Valenz der Proteinbindungsstellen. Zum Beispiel können Fragmente des Proteins durch „Linkersequenzen" an den Fc-Teil eines Immunglobulins fusioniert werden. Für eine zweiwertige Form des Proteins könnte solch eine Fusion an den Fc-Teil eines IgG-Moleküls stattfinden. Es können auch andere Immunglobulinisotypen verwendet werden, um solche Fusionen zu erzeugen. Zum Beispiel würde eine Protein-IgM-Fusion eine zehnwertige Form des erfindungsgemäßen Proteins erzeugen.
Die vorliegende Erfindung stellt daneben sowohl Volllängen- als auch reife Formen der offenbarten Proteine bereit. Die Volllängenform dieser Proteine wird im „Sequence Listing" durch die Translation der Nucleotidsequenz von jedem offenbarten Klon identifiziert. Die reife(n) Form(en) eines solchen Proteins können durch Expression des offenbarten Volllängen-Polynucleotids (vorzugsweise denen, die bei der ATCC hinterlegt sind) in einer geeigneten Säugetierzelle oder anderen Wirtszelle erhalten werden. Die Sequenz(en) der reifen Formen) des Proteins können auch aus der Aminosäuresequenz der Volllängenform bestimmbar sein und sind hierein, zum Beispiel, als Aminosäuren 1–179 von SEQ ID NO: 2 dargelegt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Gene bereit, die den hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen entsprechen. „Korrespondierende Gene" sind die Regionen auf dem Genom, die transkribiert werden, um die mRNAs herzustellen, aus denen cDNA-Polynucleotidsequenzen gewonnen werden, und sie können zusammenhängende Regionen des Genoms umfassen, die für die regulierte Expression solcher Gene erforderlich sind. Korrespondierende Gene können daher kodierende Sequenzen, 5'- und 3'-untranslatierte Regionen, alternativ gespleißte Exons, Introns, Promotoren, Enhancer und Silencer oder Suppressorelemente umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die korrespondierenden Gene können in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren isoliert werden, unter Verwendung der hierin beschriebenen Sequenzinformationen. Solche Verfahren umfassen die Herstellung von Sonden oder Primern aus den beschriebenen Sequenzinformationen zur Identifizierung und/oder Amplifizierung von Genen in geeigneten Genombibliotheken oder anderen Quellen von genomischem Material. Ein „isoliertes Gen" ist ein Gen, das von den benachbarten kodierenden Sequenzen getrennt wurde, die gegebenenfalls in dem Genom des Organismus vorkommen, aus dem das Gen isoliert wurde.
Der Chromosomenort, der den hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen entspricht, kann ebenfalls bestimmt werden, zum Beispiel durch Hybridisierung von auf geeignete Weise markierten Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung an Chromosome in situ. Es kann auch möglich sein, den entsprechenden Chromosomenort für ein offenbartes Polynucleotid zu bestimmen, indem deutlich ähnliche Nucleotidsequenzen in öffentlichen Datenbanken identifiziert werden, wie zum Beispiel exprimierte sequenzmarkierte Stellen (ESTs), die bereits auf bestimmte Chromosomenorte kartiert wurden. Für mindestens einige der hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen wurden Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken mit mindestens einiger Ähnlichkeit zum Polynucleotid der vorliegenden Erfindung nach Datenbank-Zugangsnummer aufgeführt. Recherchen unter Verwendung der GenBank-Zugangsnummern dieser Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken können dann auf einer Internetseite durchgeführt werden, die durch das National Center for Biotechnology Information unter der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ bereitgestellt wird, um „UniGene-Cluster" von überlappenden Sequenzen zu identifizieren. Viele der so identifizierten „UniGene-Cluster" wurden bereits auf bestimmte Chromosomenorte kartiert.
Organismen, die eine verstärkte, verminderte oder modifizierte Expression des/der Gens/Gene aufweisen, die den hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen entsprechen, werden bereitgestellt. Die gewünschte Veränderung bei der Genexpression kann durch die Verwendung von Antisense-Polynucleotiden oder Ribozymen erreicht werden, welche die aus dem Gen transkribierte mRNA binden und/oder spalten (Albert und Morris, 1994, Trends Pharmacol. Sci. 15(7): 250–254; Lavarosky et al., 1997, Biochem. Mol. Med. 62(1): 11–22; und Hampel, 1998, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 58: 1–39). Nicht humane, transgene Tiere, die über multiple Kopien des/der Gens/Gene verfügen, die den hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen entsprechen, die vorzugsweise durch Transformation von Zellen mit genetischen Konstrukten hergestellt werden, die stabil innerhalb der transformierten Zellen und ihrer Nachkommen erhalten bleiben, werden bereitgestellt. Nicht humane, transgene Tiere, die über modifizierte genetische Kontrollregionen verfügen, die Expressionsspiegel von Genen erhöhen oder senken, oder die zeitlichen oder räumlichen Muster von Genexpression verändern, werden ebenfalls bereitgestellt (siehe Europäisches Patent Nr. 0 649 464 B1 ). Außerdem werden nicht humane Organismen bereitgestellt, in denen das/die Gen(e), die den hierin offenbarten Polynucleotidsequenzen entsprechen, durch Insertion von fremden Sequenzen in das/die entsprechende(n) Gen(e) oder durch Deletion aller oder Teile des/der entsprechenden Gens bzw. Gene teilweise oder vollständig inaktiviert werden. Teilweise oder vollständige Geninaktivierung kann durch Insertion erreicht werden, vorzugsweise gefolgt von einem ungenauen Ausschneiden, von transponierbaren Elementen (Plasterk, 1992, Bioessays 14(9): 629–633; Zwaal et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(16): 7431–7435; Clark et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91(2): 719–722), oder durch homologe Rekombination, vorzugsweise nachgewiesen durch positive/negative genetische Selektionsstrategien (Mansour et al., 1988, Nature 336: 348–352; U.S. Patent Nr. 5,464,764 ; 5,487,992 ; 5,627,059 ; 5,631,153 ; 5,614,396 ; 5,616,491 und 5,679,523 ). Diese Organismen mit veränderter Genexpression sind vorzugsweise Eukaryoten und mehr bevorzugt sind es nicht humane Säugetiere. Solche Organismen sind für die Entwicklung von nicht humanen Modellen für die Untersuchung von Störungen, an denen das/die entsprechende(n) Gen(e) beteiligt sind, und für die Entwicklung von Assaysystemen für die Identifizierung von Molekülen von Nutzen, die mit dem/den Proteinprodukt(en) des/der entsprechenden Gens bzw. Gene Wechselwirken.
Hierin beschriebene Proteine und Proteinfragmente umfassen Proteine mit Aminosäuresequenzlängen, die mindestens 25% (mehr bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt mindestens 75%) der Länge eines offenbarten Proteins besitzen und eine Sequenzidentität von mindestens 60% (mehr bevorzugt mindestens 75% Identität, am meisten bevorzugt mindestens 90% oder 95% Identität) mit dem offenbarten Protein aufweisen, wobei die Sequenzidentität durch Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine bestimmt wird, wenn ein Alignment für eine maximale Überlappung und Identität bei Minimierung der Sequenzlücken durchgeführt wird. Ebenfalls eingeschlossen sind Proteine und Proteinfragmente, die ein Segment umfassen, das vorzugsweise 8 oder mehr (vorzugsweise 20 oder mehr, am meisten bevorzugt 30 oder mehr) zusammenhängende Aminosäuren umfasst und eine Sequenzidentität von mindestens 75% (mehr bevorzugt mindestens 85% Identität, am meisten bevorzugt mindestens 95% Identität) mit einem beliebigen solchen Segment von einem beliebigen offenbarten Protein teilt.
In einer Ausführungsform umfassen Proteine, Proteinfragmente und rekombinante Proteine der vorliegenden Erfindung solche, die basierend auf der Gegenwart von mindestens einer „HGIL-19/AE299-Rezeptor-Bindungseinheit" identifiziert werden können. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit" Aminosäuresequenzen oder Reste, die für die Bindung von hGIL-19 an seinen erforderlichen Rezeptor von Bedeutung sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein hGIL-19-Protein eine hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit, die etwa die Aminosäuren 50–60 von SEQ ID NO: 2 umfasst. In einer weiteren Ausführungsform enthält ein GIL-19-Protein eine hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit, die etwa die Aminosäuren 63–81 von SEQ ID NO: 2 umfasst. In noch einer weiteren Ausführungsform enthält ein GIL-19-Protein eine hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit, die etwa die Aminosäuren 168–177 von SEQ ID NO: 2 umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein GIL-19-Protein eine hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit, die mindestens eine der Aminosäuren 50–60, 63–81 und/oder etwa Aminosäuren 168–177 von SEQ ID NO: 2 umfasst.
In noch einer weiteren Ausführungsform hat eine hGIL-19/AE289-Rezeptor-Bindungseinheit eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, oder mehr mit einer Aminosäuresequenz identisch ist, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 50–60 von SEQ ID NO: 2, den Aminosäuren 63–81 von SEQ ID NO: 2 und den Aminosäuren 168–177 von SEQ ID NO: 2.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen Proteine, Proteinfragmente und rekombinante Proteine der vorliegenden Erfindung solche, die basierend auf der Gegenwart von mindestens einer, zwei, drei, vier oder mehr Stellen für N-verknüpfte Glykosylierung identifiziert werden können.
Insbesondere kann die Sequenzidentität unter Verwendung der WU-BLAST-Software (Washington University BLAST) Version 2.0 bestimmt werden, die auf WU-BLAST Version 1.4 aufbaut, die ihrerseits auf der Public Domain NCBI-BLAST Version 1.4 aufbaut (Altschul und Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle Hg., Methods in Enzymology 266: 460–480; Altschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology 215: 403–410; Gish und States, 1993, Identification of Protein coding regions by database similarity search, Nature Genetics 3: 266–272; Karlin und Altschul, 1993, Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90: 5873–5877). Ausführbare Programme der WU-BLAST Version 2.0 für mehrere UNIX-Plattformen können heruntergeladen werden unter ftp://blast.wustl.edu/bast/executables. Die vollständige Suchprogramm-Suite (BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX) wird, zusätzlich zu mehreren Support-Programmen, auf dieser Seite bereitgestellt. WU-BLAST 2.0 ist urheberrechtlich geschützt und darf ohne die ausdrückliche schriftliche Zustimmung des Autors nicht verkauft oder auf irgendeine Art und Weise weiterverbreitet werden, aber die aufgeführten ausführbaren Dateien dürfen ansonsten frei für kommerzielle, nicht kommerzielle oder akademische Zwecke verwendet werden. In allen Suchprogrammen der Suite – BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX – sind die Alignment-Routinen mit Einfügen von Lücken für die Datenbanksuche selbst wesentlich und ergeben so eine viel bessere Empfindlichkeit und Selektivität, während gleichzeitig eine leichter interpretierbare Ausgabe erzeugt wird. Wenn gewünscht, kann das Einfügen von Lücken in all diesen Programmen gegebenenfalls abgestellt werden. Die vorgegebene Strafe (Q) für eine Lücke der Länge eins ist Q = 9 für Proteine und BLASTP, und Q = 10 für BLASTN, kann aber zu jedem beliebigen ganzzahligen Wert einschließlich Null, Eins bis Acht, Neun, Zehn, Elf, Zwölf bis Zwanzig, Einundzwanzig bis Fünfzig, Einundfünfzig bis Einhundert usw. verändert werden. Die vorgegebene Strafe pro Rest für die Ausweitung einer Lücke (R) ist R = 2 für Proteine und BLASTP, und R = 10 für BLASTN, kann aber zu jedem beliebigen ganzzahligen Wert einschließlich Null, Eins, Zwei, Drei, Vier, Fünf, Sechs, Sieben, Acht, Neun, Zehn, Elf, Zwölf bis Zwanzig, Einundzwanzig bis Fünfzig, Einundfünfzig bis Einhundert usw. verändert werden. Beliebige Kombinationen aus Werten für Q und R können verwendet werden, um Sequenzen so anzuordnen, dass die Überlappung und Identität maximiert wird, während die Sequenzlücken minimiert werden. Die vorgegebene Aminosäure-Vergleichsmatrix ist BLOSUM62, aber es können andere Aminosäure-Vergleichsmatrizes wie z. B. PAM verwendet werden.
Spezieshomologe der offenbarten Polynucleotide und Proteine werden hier ebenfalls beschrieben. Wie hier verwendet ist ein „Spezieshomolog" ein Protein oder Polynucleotid, das aus einer unterschiedlichen Spezies als der eines gegebenen Proteins oder Polynucleotids stammt, aber mit deutlicher Sequenzähnlichkeit zu dem gegebenen Protein oder Polynucleotid. Vorzugsweise weisen Spezieshomologe bei Polynucleotiden mindestens 60% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) zu dem gegebenen Polynucleotid auf, und Spezieshomologe bei Proteine weisen mindestens 30% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%) mit dem gegeben Protein auf, wobei die Sequenzidentität durch Vergleich der Nucleotidsequenzen der Polynucleotide oder der Aminosäuresequenzen der Proteine bestimmt wird, wenn ein Alignment für eine maximale Überlappung und Identität bei Minimierung der Sequenzlücken durchgeführt wird. Spezieshomologe können isoliert und identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer aus den hier bereitgestellten Sequenzen hergestellt werden und eine geeignete Nucleinsäurequelle aus der gewünschten Spezies gescreent wird. Vorzugsweise sind Spezieshomologe solche, die aus Säugetierspezies isoliert werden. Am meisten bevorzugt sind Spezieshomologe solche, die aus bestimmten Säugetierspezies isoliert werden, wie zum Beispiel Pan troglodytes, Gorilla gorilla, Pongo pygmaeus, Hylobates concolor, Macaca mulatta, Papio papio, Papio hamadryas, Cercopithecus aethiops, Cebus capucinus, Aotus trivirgarus, Sanguinus oedipus, Microcebus murinus, Mus musculus, Rattus norvegicus, Cricetulus griseus, Felis catus, Mustela vison, Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus, Bos taurus, Ovis aries, Sus scrofa und Equus caballus, für die genetische Karten erstellt wurden, was die Identifizierung von syntenischen Beziehungen zwischen der genomischen Organisation von Genen in einer Spezies und der genomischen Organisation der verwandten Gene in einer anderen Spezies ermöglicht (O'Brien und Seuánez, 1988, Ann. Rev. Genet. 22: 323–351; O'Brien et al., 1993, Nature Genetics 3: 103–112; Johansson et al., 1995, Genomics 25: 682–690; Lyons et al., 1997, Nature Genetics 15: 47–56; O'Brien et al., 1997, Trends in Genetics 13(10): 393–399; Carver und Stubbs, 1997, Genome Research 7: 1123–1137).
Hierin ebenfalls beschrieben werden Allelvarianten der offenbarten Polynucleotide oder Proteine; das heißt natürlich vorkommende alternative Formen der isolierten Polynucleotide, die auch für Proteine kodieren, die mit denen, die durch die offenbarten Polynucleotide kodiert werden, identisch sind oder signifikant ähnliche Sequenzen mit ihnen aufweisen. Vorzugsweise haben Allelvarianten mindestens 60% Sequenzidentität (mehr bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) mit dem gegebenen Polynucleotid, wobei die Sequenzidentität durch Vergleich der Nucleotidsequenzen der Polynucleotide bestimmt wird, wenn ein Alignment für eine maximale Überlappung und Identität bei Minimierung der Sequenzlücken durchgeführt wird. Allelvarianten können isoliert und identifiziert werden, indem geeignete Sonden oder Primer aus den hier bereitgestellten Sequenzen hergestellt werden und eine geeignete Nucleinsäurequelle aus Individuen der gewünschten Spezies gescreent wird.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide mit Sequenzen, die zu denen der hierin offenbarten Polynucleotide komplementär sind.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polynucleotide, die unter hoch stringenten Bedingungen an die hierin beschriebenen Polynucleotide hybridisieren. Ebenfalls hierin beschrieben werden Polynucleotide, die unter vermindert stringenten oder stringenten Bedingungen an die hierin beschriebenen Polynucleotide hybridisieren. Beispiele für stringente Bedingungen sind in der unten folgenden Tabelle aufgeführt: hoch stringente Bedingungen sind solche, die mindestens so stringent sind wie, zum Beispiel, die Bedingungen A–F; stringente Bedingungen sind mindestens so stringent wie, zum Beispiel, die Bedingungen G–L; und verminderte stringente Bedingungen sind mindestens so stringent wie, zum Beispiel, die Bedingungen M–R.

Stringente Bedingungen	Polynucleotidhybrid	Hybridlänge (bp)^‡	Hybridisierungstemperatur und Puffer^†	Waschtemperatur und Puffer^†
A	DNA:DNA	≥ 50	65°C; 1 × SSC – oder – 42°C; 1 × SSC, 50% Formamid	65°C; 0,3 × SSC
B	DNA:DNA	< 50	T_B*; 1 × SSC	T_B*; 1 × SSC
C	DNA:RNA	≥ 50	67°C; 1 × SSC – oder – 45°C; 1 × SSC, 50% Formamid	67°C; 0,3 × SSC
D	DNA:RNA	< 50	T_D*; 1 × SSC	T_D*; 1 × SSC
E	RNA:RNA	≥ 50	70°C; 1 × SSC – oder – 50°C; 1 × SSC, 50% Formamid	70°C; 0,3 × SSC
F	RNA:RNA	< 50	T_F*; 1 × SSC	T_F*; 1 × SSC
G	DNA:DNA	≥ 50	65°C; 4 × SSC – oder – 42°C; 4 × SSC, 50% Formamid	65°C; 1 × SSC
H	DNA:DNA	< 50	T_H*; 4 × SSC	T_H*; 4 × SSC
I	DNA:RNA	≥ 50	67°C; 4 × SSC – oder – 45°C; 4 × SSC, 50% Formamid	67°C; 1 × SSC
J	DNA:RNA	< 50	T_j*; 4 × SSC	T_j* 4 × SSC
K	RNA:RNA	≥ 50	70°C; 4 × SSC – oder – 50°C; 4 × SSC, 50% Formamid	67°C; 1 × SSC
L	RNA:RNA	< 50	T_L*; 2 × SSC	T_L*; 2 × SSC
M	DNA:DNA	≥ 50	50°C; 4 × SSC – oder – 40°C; 6 × SSC, 50% Formamid	50°C; 2 × SSC
N	DNA:DNA	< 50	T_N*; 6 × SSC	T_N*; 6 × SSC
O	DNA:RNA	≥ 50	55°C; 4 × SSC – oder – 42°C; 6 × SSC, 50% Formamid	55°C; 2 × SSC
P	DNA:RNA	< 50	T_P*; 6 × SSC	T_P*; 6 × SSC
Q	RNA:RNA	≥ 50	60°C; 4 × SSC – oder – 45°C; 6 × SSC, 50% Formamid	60°C; 2 × SSC
R	RNA:RNA	< 50	T_R*; 4 × SSC	T_R*; 4 × SSC
‡: Die Hybridlänge ist, was für die hybridisierte(n) Region(en) der hybridisierenden Polynucleotide angenommen wird. Wenn ein Polynucleotid an ein Zielpolynucleotid mit unbekannter Sequenz hybridisiert wird, wird angenommen, dass die Hybridlänge die des hybridisierenden Polynucleotids ist. Wenn Polynucleotide mit bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge durch Anordnen der Sequenzen der Polynucleotide und Identifizieren der Region oder Regionen mit einer optimalen Sequenzkomplementarität bestimmt werden. SSPE (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kann bei der Hybridisierung und den Waschpuffern SSC ersetzen (1 × SSC ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat); das Waschen wird jeweils 15 Minuten lang ausgeführt, nachdem die Hybridisierung abgeschlossen ist. *T_B–T_R: Die Hybridisierungstemperatur für Hybride, die voraussichtlich eine Länge von weniger als 50 Basenpaaren haben, sollte 5–10°C weniger sein als die Schmelztemperatur (T_m) des Hybrids, wobei T_m gemäß den folgenden Gleichungen bestimmt wird. Für Hybride mit einer Länge von weniger als 18 Basenpaaren, T_m (°C) = 2(# der A + T Basen) + 4(# der G + C Basen). Für Hybride mit einer Länge zwischen 18 und 49 Basenpaaren. T_m (°C) = 81,5 + 16,6(log₁₀[Na⁺]) + 0,41 (%G + C) – (600/N), wobei N die Anzahl an Basen im Hybrid ist und [Na⁺] die Konzentration an Natriumionen im Hybridisierungspuffer ist ([Na⁺] für 1 × SSC = 0,165 M).

Zusätzliche Beispiele für stringente Bedingungen für die Hybridisierung von Polynucleotiden werden gegeben in Sambrook, J., E. F. Fritsch, und T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Kapitel 9 und 11, und Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Inc., Abschnitte 2.10 und 6.3–6.4.
Vorzugsweise hat jedes solches hybridisierende Polynucleotid eine Länge, die mindestens 25% (mehr bevorzugt mindestens 50% und am meisten bevorzugt mindestens 75%) der Länge des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung beträgt, an das es hybridisiert, und weist mindestens eine Sequenzidentität von 60% (mehr bevorzugt mindestens 75% Identität, am meisten bevorzugt mindestens 90% oder 95% Identität) mit dem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung auf, an das es hybridisiert, wobei die Sequenzidentität durch Vergleich der Sequenzen der hybridisierenden Polynucleotide bestimmt wird, wenn ein Alignment für eine maximale Überlappung und Identität bei Minimierung der Sequenzlücken durchgeführt wird.
Die isolierten, erfindungsgemäßen Polynucleotide können funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden werden, wie die pMT2- oder pED-Expressionsvektoren, die in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485–4490 (1991) beschrieben werden, um das Protein rekombinant herzustellen. Auf dem Fachgebiet sind viele geeignete Expressionskontrollsequenzen bekannt. Allgemeine Verfahren zur Expression von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und in R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537–566 (1990) beispielhaft beschrieben. Wie hierin definiert, meint „funktionell verbunden", dass das isolierte, erfindungsgemäße Polynucleotid und eine Expressionskontrollsequenz innerhalb eines Vektors oder einer Zelle auf eine solche Weise angeordnet sind, dass das Protein durch eine Wirtszelle exprimiert wird, die mit der mit dem ligierten Polynucleotid/Expressionskontrollsequenz transformiert (transfiziert) wurde.
Es können eine Anzahl an Zellarten als geeignete Wirtszellen für die Expression des Proteins dienen. Säugetierwirtszellen umfassen, zum Beispiel, Affen-COS-Zellen, Chinese Hamster Ovary-(CHO)-Zellen, humane 293-Nierenzellen, humane epidermale A431-Zellen, humane Colo205-Zellen 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primatenzelllinien, normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus In-vitro-Kultur von Primärgewebe abstammen, primäre Explantate, HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen BHK-, HL-60-, U937-, Hak- oder Jurkat-Zellen.
Alternativ kann es möglich sein, das Protein in niederen Eukaryoten wie beispielsweise Hefe oder in Prokaryoten wie beispielsweise Bakterien herzustellen. Potenziell geeignete Hefe-Stämme umfassen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-Stämme, Candida, oder jeglichen Hefestamm, der heterologe Proteine exprimieren kann. Potentiell geeignete Bakterienstämme umfassen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, oder jeglichen Bakterienstamm, der heterologe Proteine exprimieren kann. Wenn das Protein in Hefe oder Bakterien hergestellt wird, kann es notwendig sein, das darin hergestellte Protein zu modifizieren, zum Beispiel durch Phosphorylierung oder Glykosylierung der geeigneten Stellen, um das funktionale Protein zu erhalten. Solche kovalenten Verknüpfungen können unter Verwendung bekannter chemischer oder enzymatischer Verfahren ausgeführt werden.
Das Protein kann auch hergestellt werden, indem ein erfindungsgemäßes Polynucleotid funktionell mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insektenexpressionsvektoren verknüpft wird und ein Insektenexpressionssystem eingesetzt wird. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellexpressionssysteme sind kommerziell erhältlich in Form eines Kits von, z. B., Invitrogen, San Diego, Kalifornien, USA (das MaxBac^®-Kit), und solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, wie beschrieben von Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Wie hierin verwendet ist eine Insektenzelle, die ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung exprimieren kann, „transformiert".
Das erfindungsgemäße Protein kann durch Kultivieren von transformierten Wirtszellen unter Kulturbedingungen hergestellt werden, die geeignet sind, um das rekombinante Protein zu exprimieren. Das resultierende, exprimierte Protein kann anschließend aus einer solchen Kultur (d. h. aus Kulturmedium oder Zellextrakten) unter Verwendung von Reinigungsverfahren wie z. B. Gelfiltration oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Die Reinigung des Proteins kann auch eine Affinitätssäule, die Mittel enthält, die an das Protein binden werden; ein oder mehrere Säulenstufen über solchen Affinitätsharzen wie Concanavalin A-Agarose, Heparin Toyopearl^® oder Cibacrom blue 3GASepharose^®; ein oder mehrere Stufen, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung solcher Harze wie Phenylether, Butylether oder Propylether umfassen; oder Immunaffinitätschromatographie umfassen.
Alternativ kann das erfindungsgemäße Protein auch in einer Form exprimiert werden, welche eine Reinigung erleichtern wird. Zum Beispiel kann es als ein Fusionsprotein exprimiert werden, wie solche mit Maltose-Bindungsprotein (MBP), Glutathion-S-Transferase (GST) oder Thioredoxin (TRX). Kits für die Expression und Reinigung von solchen Fusionsproteine sind von New England BioLab (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ), bzw. Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA) kommerziell erhältlich. Das Protein kann auch mit einem Epitop markiert werden und nachfolgend unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers, der auf ein solches Epitop gerichtet ist, gereinigt werden. Ein solches Epitop („Flag") ist kommerziell von der Firma Eastman Kodak (New Haven, CT) erhältlich.
Außerdem können eine oder mehrere Stufen der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) angewandt werden, bei der hydrophobe RP-HPLC-Medien eingesetzt werden, z. B., Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, um das Protein weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorgenannten Reinigungsstufen, in verschiedenen Kombinationen, können auch eingesetzt werden, um ein im Wesentlichen homogenes, isoliertes, rekombinantes Protein zu ergeben. Das so gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen Säugetierproteinen und wird gemäß der vorliegenden Erfindung als „isoliertes Protein" definiert.
Das erfindungsgemäße Protein kann auch als ein Produkt von nicht humanen transgenen Tieren exprimiert werden, z. B., als ein Bestandteil der Milch von transgenen Kühen, Ziegen, Schweinen oder Schafen, die durch somatische oder Keimzellen gekennzeichnet sind, die eine Nucleotidsequenz enthalten, die für das Protein kodiert.
Das Protein kann auch durch bekannte herkömmliche chemische Synthese hergestellt werden. Verfahren zur Konstruktion der Proteine der vorliegenden Erfindung durch synthetische Mittel sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Die synthetisch konstruierten Proteinsequenzen können, da sie primäre, sekundäre oder tertiäre strukturelle und/oder Konformationseigenschaften mit Proteinen teilen, biologische Eigenschaften besitzen, die sie mit diesen gemeinsam haben, einschließlich der Proteinaktivität. So können sie als biologisch aktive oder immunologische Stellvertreter für natürliche, gereinigte Proteine beim Screening von therapeutischen Verbindungen und in immunologischen Prozessen zur Entwicklung von Antikörpern eingesetzt werden.
Die hierin bereitgestellten Proteine umfassen auch Proteine, die durch Aminosäuresequenzen charakterisiert werden, die denen der gereinigten Proteine gleichen, aber in denen Modifizierungen natürlich eingebaut oder mit Absicht gentechnisch eingebracht wurden. Zum Beispiel können Modifizierungen in den Peptid- oder DNA-Sequenzen von Fachleuten unter Verwendung von bekannten Techniken gemacht werden. Modifizierungen von Interesse in den Proteinsequenzen können die Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion eines ausgewählten Aminosäurerests in der kodierenden Sequenz umfassen. Zum Beispiel können eine oder mehrere der Cysteinreste deletiert werden oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um die Konformation des Moleküls zu verändern. Techniken für eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt (siehe z. B., U.S. Patent Nr. 4,518,584 ). Vorzugsweise bewahrt eine solche Veränderung, Substitution, Ersetzung, Insertion oder Deletion die gewünschte Aktivität des Proteins.
Andere Fragmente und Derivate der Sequenzen der Proteine, von denen zu erwarten wäre, dass sie Proteinaktivität insgesamt oder teilweise beibehalten und so für Screening oder andere immunologische Verfahren von Nutzen sein könnten, können ebenfalls ohne Weiteres von einem Fachmann in Anbetracht der Offenbarungen hierin hergestellt werden. Es wird angenommen, dass solche Modifizierungen in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
VERWENDUNGEN UND BIOLOGISCHE AKTIVITÄT
Die Polynucleotide und Proteine der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere der Verwendungen oder biologischen Aktivitäten (einschließlich derer, die mit den hierin genannten Assays in Zusammenhang stehen) zeigen, die unten identifiziert werden. Verwendungen oder Aktivitäten, die für Proteine der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, können durch Verabreichung oder Verwendung solcher Proteine oder durch Verabreichung oder Verwendung von für solche Proteine kodierenden Polynucleotiden bereit gestellt werden (wie zum Beispiel in Gentherapien oder Vektoren, die für die Einführung von DNA geeignet sind).
hGIL-19 Verwendungen
Aufgrund seiner Homologie zu IL-10 kann humanes GIL-19/AE289 als ein Mitglied der allgemeinen Familie der Cytokine betrachtet werden und kann, als solches, ähnliche Aktivitäten wie IL-10 aufweisen. Cytokine spielen wichtige Rollen sowohl in Gesundheit als auch in Krankheit und haben eine Vielzahl an klinischen Indikationen. Daher wird dieses Molekül (und andere Moleküle der vorliegenden Erfindung) als ein Agonist in bestimmten klinischen Indikationen von Nutzen sein und Antagonisten von diesem Molekül werden in anderen klinischen Situationen von Nutzen sein, insbesondere in solche, in denen IL-10 als ein Agonist wirkt oder IL-10-Antagonisten als ein Antagonist wirken. Ob der Agonist oder der Antagonist der bevorzugte Wirkstoff ist, wird von den bestimmten Aspekten der Krankheitspathologie abhängen, wie zum Beispiel den beteiligten Zellarten, der Art des Stimulus und der zellulären Mikroumgebung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine hGIL-19-Aktivität mindestens eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: (1) Modulieren, zum Beispiel antagonisieren eines Signaltransduktionswegs (z. B. eines von GIL-19 abhängigen Wegs); (2) Modulieren der Cytokinproduktion und/oder -sekretion (z. B. Produktion und/oder Sekretion eines proinflammatorischen Cytokins); (3) Modulieren der Lymphokinproduktion und/oder -sekretion; (4) Modulieren der Produktion von Adhäsionsmolekülen und/oder der zellulären Adhäsion; (5) Modulieren der Expression oder Aktivität der nukleären Transkriptionsfaktoren; (7) Modulieren der Sekretion von IL-1; (8) Konkurrieren mit Rezeptoren für andere Cytokinen; (9) Konkurrieren mit anderen Mitgliedern der hGIL-19-Proteinfamilie um die Bindung eines hGIL-19-Rezeptors; (10) Modulieren der nukleären Translokation des internalisierten Rezeptors für hGIL-19 oder eines anderen Cytokin- oder ligandenkomplexierten Rezeptors; (11) Modulieren der Zellproliferation, -entwicklung oder -differenzierung, zum Beispiel Cytokin stimulierte oder hGIL-19-Protein stimulierte Proliferation, Entwicklung oder Differenzierung (z. B. einer Epithelzelle, zum Beispiel, einer Plattenepithelzelle des Ösophagus oder einer Hautzelle, z. B. einem Keratinozyten); (12) Modulieren der Zellproliferation, -entwicklung oder -differenzierung einer osteogenen Zellen (z. B. einer Osteoklasten-Vorläuferzelle, eines Osteoklasten und/oder eines Osteoblasten); (13) Modulierung der Knochenbildung, des Knochenmetabolismus und/oder Knochenhomöostase (z. B. Inhibierung der Knochenresorption); (15) Modulieren der zellulären Immunantworten; (16) Modulieren der Cytokin vermittelten proinflammatorischen Wirkungen (zum Beispiel Inhibierung der Proteinsynthese der akuten Phase durch Hepatocyten, Fieber und/oder Prostaglandinsynthese, zum Beispiel PGE₂ Synthese); und (17) Förderung und/oder Verstärkung der Wundheilung.
Im Hinblick auf ihre offensichtlich immunmodulierende Rolle können humane GIL-19/AE289-Proteine auf die folgenden Zellarten einwirken: T-Zellen, B-Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen/Monozyten, neutrophile Zellen, Mastzellen, basophile Zellen, eosinophile Zellen, antigenpräsentierende Zellen des Nervensystems und antigenpräsentierenden Zellen der Niere. Basierend auf ihrer Homologie zu IL-10 können humane GIL-19/AE289-Proteine (oder Agonisten oder Antagonisten davon) die folgenden Aktivitäten und Verwendungen haben:

(a) Hochregulierung der humoralen Immunantworten und Abschwächung der zellvermittelten Immunantworten;
(b) Funktion als ein entzündungshemmendes Mittel durch Inhibierung der Synthese von proinflammatorischen Cytokinen und Chemokinen;
(c) Modulation von entzündlichen Reaktionen, die mit einer Verletzung, Sepsis, gastrointestinalen und kardiovaskulären Erkrankungen und Entzündungen nach einem chirurgischen Eingriff einhergehen;
(d) Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, Knochenmarkstransplantation zur Behandlung des Empfängers vor der Verpflanzung, Knochenmarkstransplantation zur Behandlung von Stammzellen des Donors vor der Transplantation und zur Verbesserung der Graft-versus-host-Reaktionen im Anschluss an eine Knochenmarkstransplantation;
(e) Behandlung von zellvermittelten Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose, Diabetes, rheumatoider Arthritis, Myasthenia gravis pseudoparalytica, systemischem Lupus erythematodes, Nephrotoxizität, die mit Glomerulonephritis einhergeht, entzündlichen Darmerkrankungen, Morbus Crohn, Pankreatitis und Asthma.

Humane GIL-19/AE289-Agonisten umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, humane GIL-19/AE289-Proteine und Fragmente, Deletionsmutanten und Additionsmutanten davon und Peptid- und kleinmolekülige Verbindungen, die mit dem Rezeptor oder einem anderen Ziel, auf das humanes GIL-19/AE289 gerichtet ist, Wechselwirken. Humane GIL-19/AE289-Antagonisten umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Antikörper, die gegen humane GIL-19/AE289-Proteine gerichtet sind; lösliche Formen des Rezeptors oder eines anderen Ziels, auf das GIL-19/AE289 gerichtet ist; Antikörper, die auf den Rezeptor oder ein anderes Ziel, auf das humanes GIL-19/AE289 gerichtet ist, gerichtet sind; sowie Peptid- und kleinmolekülige Verbindungen, welche die Wechselwirkung des humanen GIL-19/AE289 mit seinem Rezeptor oder einem anderen Ziel inhibieren oder diese stören.
Forschungsverwendungen und -hilfsmittel
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Polynucleotide können von der Forschungsgemeinschaft für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Die Polynucleotide können verwendet werden, um rekombinantes Protein für die Analyse, Charakterisierung oder therapeutische Verwendung zu exprimieren; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Protein vorzugsweise exprimiert wird (entweder konstitutiv oder bei einem bestimmten Schritt der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in Krankheitszuständen); als Marker für das Molekulargewicht auf Gelen für Southern Blot; als Chromosommarker oder Tags (wenn markiert) zur Identifizierung von Chromosomen oder zur Kartierung von verwandten Genpositionen; zum Vergleich mit endogenen DNA-Sequenzen in Patienten zur Identifizierung von möglichen genetischen Störungen; als Sonden zum Hybridisieren und so zur Entdeckung neuer, verwandter DNA-Sequenzen; als eine Informationsquelle, um PCR-Primer für genetische Fingerabdrücke abzuleiten; als eine Sonde, um bekannte Sequenzen beim Prozess der Entdeckung neuer Polynucleotide „auszusubtrahieren"; zur Selektion und Herstellung von Oligomeren für die Bindung an einen „Gen-Chip" oder einen anderen Träger, einschließlich der Untersuchung von Expressionsmustern; um Anti-Protein-Antikörper unter Verwendung von DNA-Immunisierungstechniken zu vermehren; und als ein Antigen, um Anti-DNA-Antikörper zu vermehren oder eine andere Immunantwort hervorzurufen. Wo das Polynucleotid für ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet oder potenziell bindet (wie, zum Beispiel, bei einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung) kann das Polynucleotid auch in Wechselwirkungsfallenassays verwendet werden (wie, zum Beispiel, solchen, die beschrieben wurden in Gyuris et al., 1993, Cell 75: 791–803 und in Rossi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8405–8410), um Polynucleotide zu identifizieren, die für das andere Protein kodieren, mit dem Bindung auftritt, oder um Inhibitoren der Bindungswechselwirkung zu identifizieren.
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Proteine können gleichfalls in Assays verwendet werden, um die biologische Aktivität zu bestimmen, einschließlich in einem Panel aus multiplen Proteinen für Hochdurchsatz-Screening; um Antikörper zu vermehren oder eine andere Immunantwort hervorzurufen; als ein Reagenz (einschließlich dem markierten Reagenz) in Assays, die für einen quantitativen Nachweis der Proteinspiegel (oder seines Rezeptors) in biologischen Flüssigkeiten entworfen wurden; als Marker für Gewebe, in denen das jeweilige Protein vorzugsweise exprimiert wird (entweder konstitutiv oder in einem bestimmten Stadium der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in einem Krankheitszustand) und, selbstverständlich, um korrelative Rezeptoren oder Liganden zu isolieren. Wo das Protein an ein anderes Protein bindet oder potenziell bindet (wie, zum Beispiel; bei einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung) kann das Protein verwendet werden, um das andere Protein zu identifizieren, mit dem Bindung auftritt, oder um Inhibitoren der Bindungswechselwirkung zu identifizieren. Proteine, die an diesen Bindungswechselwirkungen beteiligt sind, können auch verwendet werden, um nach Peptid- oder kleinmoleküligen Inhibitoren oder nach Agonisten für die Bindungswechselwirkung zu screenen.
Ein beliebiges oder alle dieser Forschungshilfsmittel können zu einem Reagenzgrad oder einem Kitformat für die Kommerzialisierung als Forschungsprodukte weiterentwickelt werden.
Verfahren zur Ausführung der oben aufgeführten Verwendungen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Literatur, die solche Verfahren beschreibt, umfasst, ohne auf diese beschränkt zu sein, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatiseds., 1989, und „Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S. L und A. R. Kimmel Hrsg., 1987.
Ernährungsverwendungen
Polynucleotide und Proteine der vorliegenden Erfindung können auch als Nahrungsquellen oder -ergänzungsmittel verwendet werden. Solche Verwendungen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, die Verwendung als ein Protein- oder Aminosäureergänzungsmittel, die Verwendung als eine Kohlenstoffquelle, die Verwendung als eine Stickstoffquelle und die Verwendung als eine Kohlenhydratquelle. In solchen Fällen kann das erfindungsgemäße Protein oder Polynucleotid dem Futter eines bestimmten Organismus beigefügt werden oder kann als getrenntes festes oder flüssiges Präparat verabreicht werden, wie z. B. in der Form von Pulver, Tabletten, Lösungen, Suspensionen oder Kapseln. Im Falle von Mikroorganismen kann das erfindungsgemäße Protein oder Polynucleotid dem Medium zugefügt werden, in dem oder auf dem der Mikroorganismus kultiviert wird.
Cytokin- und Zellproliferations-/Zelldifferenzierungsaktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann Cytokin-, Zellproliferations-(entweder induzierend oder inhibierend) oder Zelldifferenzierungsaktivität (entweder induzierend oder inhibierend) aufweisen oder kann die Produktion von anderen Cytokinen in bestimmten Zellpopulationen induzieren. Viele bis heute gefundene Proteinfaktoren, einschließlich aller bekannten Cytokine, haben Aktivität in einem oder mehreren faktorabhängigen Zellproliferationsassays gezeigt, und daher dienen diese Assays als eine geeignete Bestätigung für Cytokinaktivität. Die Aktivität eines Proteins der vorliegenden Erfindung wird durch ein beliebiges einer Anzahl an routinemäßigen faktorabhängigen Zellproliferationsassays für Zelllinien nachgewiesen, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mole und CMK. Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays für T-Zell- oder Thymozytenproliferation umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1705–1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756–1761, 1994.
Assays für Cytokinproduktion und/oder -proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. und Shevach E. M. In Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 3.12.1–1.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurement of mouse and human Interferon 7, Schreiber, R. D. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan Hrsg. Vol 1 pp., 6.8.1–6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Assays für Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen und lymphopoetischen Zellen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. und Lipsky, P. E., In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 6.3.1–6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205–1211, 1991, Moreau et al., Nature 336: 690, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2931–2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6, Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp.. 6.6.1–6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857–1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11 – Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. und Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto. 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta A., Giannotti, J., Clark, S. C. und Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto. 1991.
Assays für T-Zellklon-Reaktionen auf Antigene (was unter anderem Proteine identifizieren wird, die sich auf APC-T-Zell-Wechselwirkungen sowie direkte T-Zell-Wirkungen auswirken, durch Messung der Proliferation und Cytokinproduktion) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines and their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091–6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405–411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988.
Immunstimulierende oder immununterdrückende Aktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch eine immunstimulierende oder immununterdrückende Aktivität zeigen, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, der Aktivitäten, für die hierin Assays beschrieben werden. Ein Protein kann bei der Behandlung von verschiedenen Immundefizienzen und -Störungen von Nutzen sein (einschließlich der schweren kombinierten Immundefizienz (SCID)), z. B. bei der Regulierung (hoch oder herunter) von Wachstum und Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten, sowie bei Auswirkungen auf die cytolytische Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen. Diese Immundefizienzen können genetisch sein oder durch einen Virus (z. B., HIV), und auch bakteriell oder durch Pilzinfektionen verursacht werden, oder können eine Folge von autoimmunen Störungen sein. Insbesondere können Infektionskrankheiten, die durch Viren, Bakterien, Pilze oder andere Infektionen verursacht werden, unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelbar sein, einschließlich Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesvieren, Mykobakterien, Leishmania spp., Malaria spp. und verschiedener Pilzinfektionen wie z. B. Candidiasis. Selbstverständlich kann in dieser Hinsicht ein Protein der vorliegenden Erfindung auch von Nutzen sein, wo eine Verstärkung des Immunsystems allgemein erwünscht sein kann, d. h. bei der Behandlung von Krebs.
Autoimmune Störungen, die unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen zum Beispiel, Bindegewebserkrankungen, Multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungenentzündungen, Guillain-Barré-Syndrom, autoimmune Thyroiditis, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Myasthenia gravis pseudoparalytica, Graft-versus-Host-Erkrankungen und autoimmune entzündliche Augenerkrankungen. Solch ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen, wie zum Beispiel Asthma (insbesondere allergisches Asthma) oder anderen Atemwegsproblemen von Nutzen sein. Andere Zustände, in denen eine Immununterdrückung gewünscht wird (einschließlich zum Beispiel, Organtransplantation) können ebenfalls unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine kann es auch möglich sein, die Immunantworten auf eine Vielzahl an Wegen zu regulieren. Herunterregulierung kann in der Form von Inhibierung oder Blockierung einer Immunantwort geschehen, die bereits im Gange ist, oder kann das Verhindern der Induktion einer Immunantwort umfassen. Die Funktionen der aktivierten T-Zellen können durch Unterdrückung der T-Zellantworten oder durch Induzierung einer spezifischen Toleranz in T-Zellen, oder beides inhibiert werden. Die Immununterdrückung von T-Zellantworten ist im Allgemeinen ein aktiver nicht Antigen spezifischer Prozess, der es erfordert, dass T-Zellen dem Unterdrückungsmittel dauerhaft ausgesetzt werden. Toleranz, welche die Induzierung einer Nicht-Reaktionsfähigkeit oder Anergie in T-Zellen umfasst, kann von Immununterdrückung unterschieden werden, insofern sie im Allgemeinen antigenspezifisch ist und fortdauert, nachdem sie dem Toleranz hervorrufenden Mittel nicht länger ausgesetzt sind. In der Ausführung kann Toleranz durch das Fehlen an T-Zellantwort, wenn sie dem spezifischen Antigen in der Abwesenheit des Toleranz erzeugenden Mittels erneut ausgesetzt werden, nachgewiesen werden.
Herunterregulierung oder Verhindern von einer oder mehreren Antigenfunktionen (einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, der B-Lymphozyten-Antigenfunktionen (wie zum Beispiel B7)), z. B. Verhindern von hohen Spiegeln an Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen, wird bei der Transplantation von Gewebe, Haut und Organen und bei Graft-versus-Host-Erkrankungen (GVHD) von Nutzen sein. Zum Beispiel sollte die Blockierung der T-Zellfunktion eine verminderte Gewebezerstörung bei der Gewebetransplantation zur Folge haben. Typischerweise wird bei Gewebetransplantaten die Abstoßung des Transplantats durch seine Erkennung als fremd durch T-Zellen initiiert, worauf sich eine Immunreaktion anschließt, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines Moleküls, das Wechselwirkung eines B7-Lymphozytenantigens mit seinem/seinen natürlichen Liganden auf Immunzellen (wie z. B. eine lösliche, monomere Form eines Peptids mit B7-2-Aktivität allein oder in Verbindung mit einer monomeren Form eines Peptids mit einer Aktivität eines weiteren B-Lymphozytenantigens (z. B. B7-1, B7-3)) oder eines blockierenden Antikörpers inhibiert oder blockiert, vor der Transplantation kann zu der Bindung des Moleküls an den/die natürlichen Liganden der Immunzellen ohne Übermittlung des zugehörigen costimulierenden Signals führen. Die Blockierung der Funktion des B-Lymphozytenantigens in dieser Sache verhindert die Cytokinsynthese durch Immunzellen, wie zum Beispiel T-Zellen, und wirkt so als ein Immunsuppressor. Darüber hinaus kann das Fehlen der Costimulierung auch ausreichend sein, um bei T-Zellen Anergie zu erzeugen, wodurch bei einem Subjekt Toleranz induziert wird. Die Induktion einer langfristigen Toleranz durch B-Lymphozytenantigen blockierende Reagenzien kann die Notwendigkeit einer wiederholten Verabreichung dieser blockierenden Reagenzien vermeiden. Um eine ausreichende Immununterdrückung oder Toleranz in einem Subjekt zu erreichen, kann es auch notwendig sein, die Funktion einer Kombination von B-Lymphozytenantigenen zu blockieren.
Die Wirksamkeit von bestimmten blockierenden Reagenzien bei der Verhinderung einer Abstoßung eines Organtransplantats oder GVHD kann unter Verwendung von Tiermodellen bewertet werden, die eine Vorhersagekraft zur Effizienz in Menschen haben. Beispiele für geeignete Systeme, die verwendet werden können, umfassen allogene Herztransplantationen in Ratten und xenogene Pankreasinselzelltransplantationen bei Mäusen, die beide verwendet worden sind, um die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig-Fusionsproteinen in vivo zu untersuchen, wie beschrieben in Lenschow et al., Science 257: 789–792 (1992) und Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 11102–11105 (1992). Außerdem können murine Modelle der GVHD (siehe Paul Hg., Fundamental Immunology, Rauen Press, New York, 1989, pp. 846–847) verwendet werden, um die Wirkung der Blockierung der Funktion von B-Lymphozytenantigen in vivo auf die Entwicklung dieser Krankheit zu bestimmen.
Blockierung der Antigenfunktion kann auch für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen therapeutisch von Nutzen sein. Viele Autoimmunstörungen sind eine Folge einer ungeeigneten Aktivierung von T-Zellen, die auf eigenes Gewebe reagieren und die Produktion von Cytokinen und Autoantikörpern, die an der Pathologie der Erkrankung beteiligt sind, begünstigen. Die Verhinderung der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen kann möglicherweise Krankheitssymptome vermindern oder beseitigen. Die Verabreichung von Reagenzien, die Costimulierung von T-Zellen durch Unterbrechen der Rezeptor:Liganden-Wechselwirkungen von B-Lymphozytenantigenen blockieren, kann verwendet werden, um T-Zellaktivierung zu inhibieren und die Produktion von Autoantikörpern oder von T-Zellen abstammenden Cytokinen, die am Krankheitsverlauf beteiligt sein können, zu verhindern. Außerdem können blockierende Reagenzien antigenspezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen induzieren, was zu einer langfristigen Linderung der Krankheit führen könnte. Die Wirksamkeit von blockierenden Reagenzien bei der Verhinderung oder Linderung von Autoimmunstörungen kann unter Verwendung einer Anzahl von gut charakterisierten Tiermodellen der menschlichen Autoimmunerkrankungen bestimmt werden. Beispiele umfassen murine experimentelle autoimmune Enzephalitis, systemischen Lupus erythematosus in MRL/lpr/lpr Mäusen oder NZB-Hybridmäusen, murine autoimmune Kollagenarthritis, Diabetes mellitus in NOD-Mäusen und BB-Ratten und murine experimentelle Myasthenia gravis pseudoparalytica (siehe Paul Hg., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, pp. 840–856).
Hochregulierung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer Funktion des B-Lymphozytenantigens) als Mittel für eine Hochregulierung von Immunantworten kann ebenfalls in der Therapie von Nutzen sein. Eine Hochregulierung von Immunantworten kann in der Form einer Verstärkung einer bestehenden Immunantwort oder im Hervorrufen einer anfänglichen Immunantwort bestehen. Zum Beispiel kann eine Verstärkung einer Immunantwort durch Stimulierung der Funktion des B-Lymphozytenantigens in Fällen von viraler Infektion von Nutzen sein. Außerdem können systemische virale Erkrankungen wie Influenza, die gewöhnliche Erkältung und Enzephalitis durch die Verabreichung von stimulierenden Formen der B-Lymphozytenantigene systemisch gemildert werden.
Alternativ können antivirale Immunantworten in einem infizierten Patienten verstärkt werden, indem dem Patienten T-Zellen entnommen werden, die T-Zellen in vitro mit viralen antigen-gepulsten APCs, die entweder ein Peptid der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder zusammen mit einer stimulierenden Form eines löslichen Peptids der vorliegenden Erfindung costimuliert werden und die in vitro aktivierten T-Zellen dem Patienten wieder zugeführt werden. Ein weiteres Verfahren zur Verstärkung von antiviralen Immunantworten wäre es, aus einem Patienten infizierte Zellen zu isolieren, diese mit einer Nucleinsäure, die für ein hierin beschriebenes Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, zu transfizieren, so dass die Zellen das gesamte oder einen Teil des Proteins auf ihrer Oberfläche exprimieren, und die transfizierten Zellen dem Patienten wieder zuzuführen. Die infizierten Zellen wären nun in der Lage, ein Costimulierungssignal an T-Zellen in vivo zu liefern und diese dadurch zu aktivieren.
In einer weiteren Anwendung kann eine Hochregulierung oder Verstärkung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer Funktion des B-Lymphozytenantigens) bei der Induktion von Tumorimmunität von Nutzen sein. Tumorzellen (z. B. Sarkom, Melanom, Lymphom, Leukämie, Neuroblastom, Karzinom), die mit einer Nucleinsäure, die für mindestens ein Peptid der vorliegenden Erfindung kodiert, transfiziert wurden, können einem Subjekt verabreicht werden, um die tumorspezifische Toleranz in dem Subjekt zu überwinden. Wenn gewünscht können die Tumorzellen transfiziert werden, um eine Kombination aus Peptiden zu exprimieren. Zum Beispiel können Tumorzellen, die von einem Patienten erhalten wurden, ex vivo mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der die Expression eines Peptids mit B7-2-ähnlicher Aktivität allein oder in Verbindung mit einem Peptid mit B7-1-ähnlicher Aktivität und/oder B7-3-ähnlicher Aktivität steuert. Die transfizierten Tumorzellen werden dem Patienten wieder zugeführt, was eine Expression der Peptide auf der Oberfläche der transfizierten Zelle zur Folge hat. Alternativ können Gentherapie-Techniken verwendet werden, um eine Tumorzelle für eine Transfektion in vivo anzusteuern.
Die Gegenwart des Peptids der vorliegenden Erfindung mit der Aktivität eines B-Lymphozytenantigens(e) auf der Oberfläche der Tumorzelle liefert das notwendige Costimulierungssignal an T-Zellen, um eine T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen die transfizierten Tumorzellen zu induzieren. Zusätzlich können Tumorzellen, denen MHC-Klasse I- oder MHC-Klasse II-Moleküle fehlen, oder die nicht genügend Mengen an MHC-Klasse I- oder MHC-Klasse II-Molekülen reexprimieren können, mit Nucleinsäure, die für das gesamte oder einen Teil (z. B. einen Teil, dem eine cytoplasmatische Domäne abgeschnitten wurde) eines MHC-Klasse Iα-Kettenproteins und eines β2- Mikroglobulinproteins oder eines MHC-Klasse IIα-Kettenproteins und eines MHC-Klasse IIβ-Kettenproteins kodiert, transfiziert werden, um dadurch MHC-Klasse I- oder MHC-Klasse II-Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Expression des geeigneten Klasse I- oder Klasse II-MHCs in Verbindung mit einem Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozytenantigens (z. B. B7-1, B7-2, B7-3) induziert eine T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen die transfizierte Tumorzelle. Gegebenenfalls kann ein Gen, das für ein Antisense-Konstrukt kodiert, das die Expression eines MHC-Klasse II assoziierten Proteins blockiert, wie die invariante Kette, auch mit einer DNA cotransfiziert werden, die für ein Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozytenantigens kodiert, um die Präsentation von tumorassoziierten Antigenen zu begünstigen und tumorspezifische Immunität zu induzieren. So kann die Induktion einer T-Zell-vermittelten Immunantwort in einem menschlichen Subjekt ausreichend sein, um die tumorspezifische Toleranz in dem Subjekt zu überwinden.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Geeignete Assays für Thymozyten- oder Splenozytencytotoxizität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 78: 2488–2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bowman et al., J. Virology 61: 1992–1998; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079–3092, 1994.
Assays für T-Zell-abhängige Immunglobulinantworten und Isotypswitching (was unter anderem Proteine identifizieren wird, die T-Zell-abhängige Antikörperantworten modulieren und die Th1/Th2-Profile beeinflussen) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028–3033, 1990; und Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. und Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan Hrsg. Vol 1 pp. 3.8.1–3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.
Gemischte Lymphozytenreaktions-(MLR)-Assays (welche unter anderem, Proteine identifizieren werden, welche vorwiegend Th1- und CTL-Reaktionen erzeugen) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek. D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992.
Assays, die von dendritischen Zellen abhängen, (welche unter anderem Proteine identifizieren werden, die durch dendritische Zellen exprimiert werden, die naive T-Zellen aktivieren) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Guery et al., J. Immunol. 134: 536–544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549–559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071–5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255–260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062–4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961–965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255–1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797–807, 1994; and Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631–640, 1990.
Assays für Lymphozytenüberleben/Apoptose (welche unter anderem Proteine identifizieren werden, die Apoptose nach Superantigeninduktion verhindern, sowie Proteine, die Lymphozytenhomöostase regulieren) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795–808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659–670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945–1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233–243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037–4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891–897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1: 639–648, 1992.
Assays für Proteine, die frühe Schritte der T-Zellfestlegung und -entwicklung beeinflussen, umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Antica et al., Blood 84: 111–117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111–122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770–2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7548–7551, 1991.
Hämatopoese regulierende Aktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann bei der Regulierung der Hämatopoese und, demzufolge, bei der Behandlung von myeloischen oder Lymphoidzelldefizienzen von Nutzen sein. Sogar marginale biologische Aktivität bei der Unterstützung von koloniebildenden Zellen oder von faktorabhängigen Zelllinien deutet auf eine Beteiligung bei der Regulierung von Hämatopoese hin, z. B. bei der Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von erythroiden Progenitorzellen allein oder in Verbindung mit anderen Cytokinen, was auf einen Nutzen, z. B. bei der Behandlung von verschiedenen Anämien oder für die Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie zur Stimulierung der Produktion von erythroiden Vorläufern und/oder erythroiden Zellen hinweist, bei der Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von myeloischen Zellen wie z. B. Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (d. h. traditionelle CSF-Aktivität), die, zum Beispiel, in Verbindung mit Chemotherapie zur Verhinderung oder Behandlung der nachfolgenden Myelounterdrückung von Nutzen sind; bei der Unterstützung des Wachstums und Proliferation von Megakaryozyten und demzufolge von Thrombozyten, wodurch die Vorbeugung oder Behandlung von verschiedenen Thrombozytenstörungen wie z. B. Thrombozytopenie ermöglicht wird, und im Allgemeinen für die Verwendung an Stelle von oder ergänzend zu Thrombozytentransfusionen und/oder bei der Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen, die zu einer beliebigen und allen der oben genannten hämatopoetischen Zellen reifen können und daher therapeutischen Nutzen bei verschiedenen Stammzellstörungen finden (wie zum Beispiel solchen, die gewöhnlich mit Transplantation behandelt werden, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, der aplastischen Anämie und paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie), sowie bei der Wiederauffüllung des Stammzellkompartments nach einer Bestrahlung/Chemotherapie, entweder in vivo oder ex vivo (d. h. in Verbindung mit Knochenmarkstransplantation oder mit Transplantation peripherer Progenitorzellen (homolog oder heterolog)) als normale Zellen oder genetische manipuliert für eine Gentherapie.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Geeignete Assays für Proliferation und Differenzierung von verschiedenen hämatopoetischen Linien werden oben genannt.
Assays für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (welche unter anderem Proteine identifizieren werden, die Hämatopoese bei embryonaler Differenzierung beeinflussen) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Johansson et al. Cellular Biology 15: 141–151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473–486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903–2915, 1993.
Assays für Stammzellüberleben und -differenzierung (welche unter anderem Proteine identifizieren werden, die Lympho-Hämatopoese regulieren) umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M. G. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. Hrsg. Vol pp. 265–268, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5907–5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I. K. und Briddell, R. A. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. Hrsg. Vol pp. 23–39, Wiley-Lins, Inc., New York, N.Y. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353–359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. Hrsg. Vol pp. 1–21, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. Hrsg. Vol pp. 163–179, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. In Culture of Hematopoietic Cells. R. I. Freshney, et al. Hrsg. Vol pp. 139–162, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. 1994.
Gewebewachstumsaktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch in Zusammensetzungen Nutzen haben, die für Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Bänder- und/oder Nervengewebewachstum oder -regeneration, sowie für Wundheilung und Gewebereparatur und -ersatz und bei der Behandlung von Verbrennungen, Schnitten und Geschwüren verwendet werden.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das Knorpel- und/oder Knochenwachstum unter Umständen induziert, in denen normalerweise kein Knochen gebildet wird, hat Anwendung bei der Heilung von Knochenfrakturen und Knorpelschäden oder -defekten bei Menschen und anderen Tieren. Solch ein Präparat, das ein erfindungsgemäßes Protein einsetzt, kann prophylaktische Verwendung bei der Reduktion von geschlossenen und auch offenen Frakturen und auch bei der verbesserten Fixierung von künstlichen Gelenken haben. De novo Knochenbildung, die durch ein osteogenes Mittel induziert wird, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder durch onkologische Resektion hervorgerufenen Defekten im Gesichtsschädel bei und ist auch in der kosmetischen, plastischen Chirurgie von Nutzen.
Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch bei der Behandlung von Parodontose und bei anderen Zahnreparaturprozessen verwendet werden. Solche Mittel können eine Umgebung bieten, um knochenbildende Zellen anzuziehen, Wachstum von knochenbildenden Zellen zu stimulieren oder Differenzierung von Progenitoren von knochenbildenden Zellen zu induzieren. Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch bei der Behandlung von Osteoporose oder Osteoarthrits von Nutzen sein, wie z. B. durch Stimulierung von Knochen- und/oder Knorpelreparatur oder durch Blockierung von Entzündungen oder Prozessen der Gewebezerstörung (Kollagenaseaktivität, Osteoklastenaktivität, usw.), die durch entzündliche Prozesse vermittelt werden.
Eine weitere Kategorie von Geweberegenerationsaktivität, die dem Protein der vorliegenden Erfindung zugeschrieben werden kann, ist die Bildung von Sehnen/Bändern. Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das sehnen-/bänderähnliche Gewebe oder andere Gewebebildung unter Umständen induziert, in denen ein solches Gewebe normalerweise nicht gebildet wird, hat Anwendung bei der Heilung von Sehnen- oder Bänderrissen, Verformungen und anderen Defekten von Sehnen oder Bändern bei Menschen und anderen Tieren. Ein solches Präparat, das ein sehnen-/bänderähnliches Gewebe induzierendes Protein einsetzt, kann prophylaktische Verwendung bei der Verhinderung von Schäden am Sehnen- oder Bändergewebe und auch Verwendung bei der verbesserten Fixierung von Sehnen oder Bändern an Knochen oder anderen Geweben und bei der Reparatur von Defekten am Sehnen- oder Bändergewebe haben. De novo Bildung von sehnen-/bänderähnlichem Gewebe, die durch eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung induziert wird, trägt zur Reparatur von angeborenen, traumainduzierten oder anderen Sehnen- oder Bänderdefekten anderen Ursprungs bei, und ist auch in der kosmetischen, plastischen Chirurgie für die Befestigung oder Reparatur von Sehnen oder Bändern von Nutzen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine Umgebung bieten, um sehnen- oder bänderbildende Zellen anzuziehen, das Wachstum der sehnen- oder bänderbildenden Zellen zu stimulieren, Differenzierung von Progenitoren von sehnen- oder bänderbildenden Zellen zu induzieren oder Wachstum von Sehnen-/Bänderzellen oder Progenitoren ex vivo für eine Rückführung in vivo zu induzieren, um eine Gewebereparatur zu bewirken. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch bei der Behandlung von Tendinitis, Karpaltunnel-Syndrom und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten von Nutzen sein. Die Zusammensetzungen können auch ein geeignetes Matrix- und/oder Sequestrierungsmittel als einen Träger enthalten, wie es auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist.
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann auch für die Proliferation von Nervenzellen und für die Regeneration von Nerven- und Gehirngewebe von Nutzen sein, d. h. für die Behandlung von zentralen und peripheren Nervensystemserkrankungen und Neuropathien, und auch mechanischen und traumatischen Störungen, die Degenration, Tod oder Trauma von Nervenzellen oder Nervengewebe umfassen. Insbesondere kann ein Protein bei der Behandlung von Erkrankungen des peripheren Nervensystems verwendet werden, wie zum Beispiel peripheren Nervenverletzungen, peripherer Neuropathie und lokalisierten Neuropathien, und Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Morbus Alzheimer, Parkinson, Chores Huntington, Amyothropher Lateralsklerose und Shy-Drager-Syndrom. Weitere Zustände, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen mechanische und traumatische Störungen, wie zum Beispiel Störungen des Rückenmarks, Kopftraumata und zerebrovaskulären Erkrankungen wie z. B. Schlaganfall. Periphere Neuropathien, die eine Folge einer Chemotherapie oder anderer medizinischer Therapien sind, können auch unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins behandelbar sein.
Erfindungsgemäße Proteine können auch von Nutzen sein, um eine bessere oder schnellere Verschließung von nicht heilenden Wunden zu begünstigen, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Druckgeschwüren, Geschwüren, die mit vaskulärer Insuffizienz einhergehen, chirurgischen und traumatischen Wunden, und dergleichen.
Es wird erwartet, dass ein Protein der vorliegenden Erfindung auch Aktivität für die Erzeugung oder Regeneration anderer Gewebe zeigen kann, wie zum Beispiel Organen (einschließlich, zum Beispiel, Pankreas, Leber, Darm, Niere, Haut, Endothel), Muskel (glatt, Skelett- oder Herzmuskel) und vaskulärem (einschließlich vaskulärem Endothel) Gewebe, oder für die Begünstigung des Wachstums von Zellen, aus denen diese Gewebe bestehen. Ein Teil der gewünschten Wirkungen kann durch Inhibierung oder Modulierung der fibrotischen Vernarbung sein, um einem normalen Gewebe die Regeneration zu ermöglichen. Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch angiogenische Aktivität aufweisen.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch für den Schutz des Darms oder zur Regeneration und Behandlung von Lungen- oder Leberfibrose, Reperfusionsverletzungen in verschiedenen Geweben und Zuständen, die aus einem systemischen Cytokinschaden resultieren, von Nutzen sein.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch für die Begünstigung oder Inhibierung der Differenzierung von oben beschriebenen Geweben aus Vorläufergeweben oder -zellen von Nutzen sein; oder für die Inhibierung des Wachstums der oben beschriebenen Gewebe.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays für Gewebeerzeugungsaktivität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/16035 (Knochen, Knorpel, Sehne); Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/05846 (Nerven, neuronal); Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/07491 (Haut, Endothel).
Assays für Wundheilungsaktivität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Winter, Epidermal Wound Healing, pps. 71–112 (Maibach, HI und Rovee, DT, Hrsg.), Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, modifiziert von Eaglstein und Mertz, J. Invest. Dermatol 71: 382–84 (1978).
Activin-/Inhibin-Aktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch mit Activin oder Inhibin verbundene Aktivitäten aufweisen. Inhibine sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, die Freisetzung des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu inhibieren, während Activine durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet sind, die Freisetzung des follikelstimulierenden Hormons (FSH) zu stimulieren. So kann ein Protein der vorliegenden Erfindung, allein oder in Heterodimeren mit einem Mitglied der Inhibin-a-Familie, als ein Verhütungsmittel von Nutzen sein, basierend auf der Fähigkeit von Inhibinen, die Fruchtbarkeit in weiblichen Säugetieren zu vermindern und die Spermatogenese in männlichen Säugetieren zu vermindern. Die Verabreichung von ausreichenden Mengen anderer Inhibine kann in diesen Säugetieren Unfruchtbarkeit induzieren. Alternativ kann das erfindungsgemäße Protein, als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit anderen Proteinsubunits der Inhibin-β-Gruppe als ein Fruchtbarkeit induzierendes Therapeutikum verwendet werden, basierend auf der Fähigkeit von Activinmolekülen, die FSH-Freisetzung aus Zellen des Hypophysenvorderlappens zu stimulieren. Siehe, zum Beispiel, U.S. Patent 4,798,885 . Ein erfindungsgemäßes Protein kann für die Vorverlagerung des Beginns der Fruchtbarkeit in sexuell unreifen Säugetieren von Nutzen sein, um zum Beispiel die reproduktive Leistung während der Lebensdauer von Haustieren wie zum Beispiel Kühen, Schafen und Schweinen zu erhöhen.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays für Activin-/Inhibinaktivität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Vale et al., Endocrinology 91: 562–572, 1972; Ling et al., Nature 321: 779–782, 1986; Vale et al., Nature 321: 776–779, 1986; Mason et al., Nature 318: 659–663, 1985; Forage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3091–3095, 1986.
Chemotaktische/Chemokinetische Aktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann chemotaktische oder chemokinetische Aktivität (z. B. als ein Chemokin wirken) für Säugetierzellen, einschließlich, zum Beispiel, Monozyten, Fibroblasten, neutrophile Zellen, T-Zellen, Mastzellen, eosinophile Zellen, Epithel- und/oder Endothelzellen besitzen. Chemotaktische und chemokinetische Proteine können verwendet werden, um eine gewünschte Zellpopulation zu mobilisieren oder sie an einem gewünschten Wirkort anzuziehen. Chemotaktische oder chemokinetische Proteine bieten besondere Vorteile bei der Behandlung von Wunden oder anderem Trauma auf Geweben, und auch bei der Behandlung von lokalisierten Infektionen. Zum Beispiel kann die Anziehung von Lymphozyten, Monozyten oder neutrophilen Zellen an Tumor- oder Infektionsstellen verbesserte Immunantworten gegen den Tumor oder das Infektionsmittel zur Folge haben.
Ein Protein oder Peptid hat eine chemotaktische Aktivität für eine bestimmte Zellpopulation, wenn es die gerichtete Orientierung oder Bewegung einer solchen Zellpopulation direkt oder indirekt stimulieren kann. Vorzugsweise hat das Protein oder Peptid die Fähigkeit, die gerichtete Bewegung der Zellen direkt zu stimulieren. Ob ein bestimmtes Protein chemotaktische Aktivität für eine Zellpopulation aufweist, kann ohne weiteres durch den Einsatz eines solchen Proteins oder Peptids in jeglichem bekannten Assay für Zellchemotaxis bestimmt werden.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays für eine chemotaktische Aktivität (die Proteine identifizieren werden, die Chemotaxis induzieren oder verhindern) bestehen aus Assays, welche die Fähigkeit eines Proteins, die Migration der Zellen durch eine Membran zu induzieren, und auch die Fähigkeit eines Proteins, die Haftung einer Zellpopulation auf einer anderen Zellpopulation zu induzieren, messen. Geeignete Assays für Bewegung und Haftung umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 6.12, Measurement of alpha and beta Chemokines 6.12.1–6.12.28; Taub et al. J. Clin. Invest. 95: 1370–1376, 1995; Lind et al. APMIS 103: 140–146, 1995; Muller et al. Eur. J. Immunol. 25: 1744–1748; Gruber et al. J. of Immunol. 152: 5860–5867, 1994; Johnston et al., J. of Immunol, 153: 1762–1768, 1994.
Hämostatische und thrombolytische Aktivität
Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch hämostatische oder thrombolytische Aktivität zeigen. Als Folge wird von einem solchen Protein erwartet, dass es bei der Behandlung von verschiedenen Koagulationsstörungen (einschließlich erblicher Störungen wie z. B. Hämophilien) von Nutzen ist oder die Koagulation und andere hämostatische Ereignisse bei der Behandlung von Wunden, die durch Traumata, Chirurgie oder andere Ursachen verursacht wurden, verstärkt. Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch für die Auflösung oder Inhibierung der Bildung von Thrombosen und für die Behandlung und Vorbeugung von Zuständen, die daraus resultieren (wie zum Beispiel Infarkte am Herzen und den Gefäßen des zentralen Nervensystems (z. B. Schlaganfall) von Nutzen sein.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Assays für hämostatische und thrombolytische Aktivität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Linet et al., J. Clin. Pharmacol. 26: 131–140, 1986; Burdick et al., Thrombosis Res. 45: 413–419, 1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5: 71–79 (1991); Schaub, Prostaglandins 35: 467–474, 1988.
Rezeptor-/Ligandenaktivität
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch Aktivität als Rezeptoren, Rezeptorliganden oder Inhibitoren oder Agonisten von Rezeptor/Liganden-Wechselwirkungen zeigen. Beispiele für solche Rezeptoren und Liganden umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Cytokinrezeptoren und ihre Liganden, Rezeptorkinasen und ihre Liganden, Rezeptorphosphatasen und ihre Liganden, Rezeptoren, die an Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt sind, und ihre Liganden (einschließlich ohne auf diese beschränkt zu sein, zelluläre Adhäsionsmoleküle (wie z. B. Selektine, Integrine und ihre Liganden) sowie Rezeptor/Liganden-Paare, die an Antigenpräsentation, Antigenerkennung und Entwicklung von zellulären und humoralen Immunantworten beteiligt sind). Rezeptoren und Liganden sind auch für das Screening von potentiellen Peptid- oder kleinmoleküligen Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Liganden-Wechselwirkung von Nutzen. Ein Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Fragmenten von Rezeptoren und Liganden) kann selbst als Inhibitoren von Rezeptor/Liganden-Wechselwirkungen von Nutzen sein.
Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann, unter anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
Geeignete Assays für Rezeptor-Liganden-Aktivität umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Current Protocols in Immunology, Hg. von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Kapitel 7.28, Measurement of Cellular Adhesion under static conditions 7.28.1–7.28.22), Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6864–6868, 1987; Bierer et al., J. Exp. Med. 168: 1145–1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp. Med. 169: 149–160 1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175: 5 59–68, 1994; Stitt et al., Cell 80: 661–670, 1995.
Entzündungshemmende Aktivität
Proteine der vorliegenden Erfindung können auch eine entzündungshemmende Aktivität aufweisen. Die entzündungshemmende Aktivität kann erreicht werden, indem Zellen, die an der entzündlichen Reaktion beteiligt sind, durch Inhibierung oder Begünstigung von Zell-Zell-Wechselwirkungen (wie, zum Beispiel, Zelladhäsion), durch Inhibierung oder Begünstigung der Chemotaxis von Zellen, die am entzündlichen Prozess beteiligt sind, durch Inhibierung oder Begünstigung von Zellextravasation, oder durch Stimulierung oder Unterdrückung der Produktion von anderen Faktoren, die eine entzündliche Reaktion direkter inhibieren oder begünstigen, ein Stimulans geboten wird. Proteine, die solche Aktivitäten zeigen, können verwendet werden, um entzündliche Zustände (einschließlich chronischer oder akuter Zustände), einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Entzündungen, die mit Infektionen einhergehen (wie z. B. septischer Schock, Sepsis, systemisches inflammatorisches Reponse-Syndrom (SIRS)), Ischämie-Reperfusionsverletzung, Endotoxinletalität, Arthritis, Komplement vermittelter hyperakuter Abstoßung, Nephritis, Cytokin- oder Chemokin induzierter Lungenverletzung, entzündlicher Darmerkrankung, Morbus Crohn oder resultierend aus einer Überproduktion von Cytokinen wie z. B. TNF oder IL-1, zu behandeln. Erfindungsgemäße Proteine können auch bei der Behandlung von Anaphylaxie und Überempfindlichkeit gegenüber einer antigenen Substanz oder einem antigenen Material von Nutzen sein.
Cadherin-/Tumorinvasionssuppressoraktivität
Cadherine sind von Calcium abhängige Adhäsionsmoleküle, die wesentliche Rollen bei der Entwicklung, insbesondere bei der Definierung von spezifischen Zellarten zu spielen scheinen. Verlust oder Veränderung der normalen Cadherinexpression kann zu Veränderung der Zelladhäsionseigenschaften führen, die mit Tumorwachstum und Metastasierung zusammenhängen. Eine Cadherin-Fehlfunktion ist auch an anderen menschlichen Erkrankungen wie Pemphigus vulgaris und Pemphigus foliaceus (blasenbildende Autoimmunerkrankungen der Haut), Morbus Crohn und einigen Entwicklungsanormalitäten beteiligt.
Die Cadherin-Superfamilie umfasst weit mehr als vierzig Mitglieder, die jeweils ein anderes Expressionsmuster aufweisen. Alle Mitglieder der Superfamilie haben konservierte extrazelluläre Repeats (Cadherindomänen) gemeinsam, aber in anderen Teilen des Moleküls werden strukturelle Unterschiede gefunden. Die Cadherindomänen binden Calcium, um ihre tertiäre Struktur zu bilden und daher wird Calcium benötigt, um ihre Adhäsion zu vermitteln. Nur einige wenige Aminosäuren in der ersten Cadherindomäne liefern die Grundlage für homophile Adhäsion; Modifizierung dieser Erkennungsstelle kann die Spezifizität eines Cadherins verändern, so dass anstatt, dass es nur sich selbst erkennt, das mutierte Molekül nun auch an ein anderes Cadherin binden kann. Außerdem sind einige Cadherine an der heterophilen Adhäsion mit anderen Cadherinen beteiligt.
E-Cadherin, ein Mitglied der Cadherin-Superfamilie, wird in Epithelzellarten exprimiert. Pathologisch werden, wenn E-Cadherinexpression in einem Tumor verloren geht, die malignen Zellen invasiv und der Krebs metastasiert. Transfektion von Krebszelllinien mit E-Cadherin exprimierenden Polynucleotiden hat die mit Krebs einhergehenden Veränderungen umgekehrt, indem veränderte Zellformen zu normalen zurückgewandelt wurden, was das Haftvermögen der Zellen aneinander und an ihrem Substrat wiederherstellte, die Zellwachstumsgeschwindigkeit verminderte und das von der Verankerung unabhängige Zellwachstum drastisch verminderte. So führt die Wiedereinführung von E-Cadherinexpression Karzinome in ein weniger weit fortgeschrittenes Stadium zurück. Es ist wahrscheinlich, dass andere Cadherine die gleiche Invasionssuppressorrolle in Karzinomen spielen, die von anderen Gewebearten stammen. Daher können Proteine der vorliegenden Erfindung mit Cadherinaktivität und für solche Proteine kodierende Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Krebs verwendet werden. Die Einführung solcher Proteine oder Polynucleotide in Krebszellen kann die Veränderungen durch Krebs, die in diesen Zellen beobachtet werden, durch das Ermöglichen einer normalen Cadherinexpression vermindern oder beseitigen.
Es wurde auch gezeigt, dass Krebszellen Cadherin einer anderen Gewebeart als ihrer Herkunft exprimieren, was diesen Zellen eine Invasion und Metastasierung in einem anderen Gewebe im Körper ermöglicht. Proteine der vorliegenden Erfindung mit Cadherinaktivität und für solche Proteine kodierende Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in diesen Zellen anstelle der ungeeignet exprimierten Cadherine ersetzt werden, was die normalen zelladhäsiven Eigenschaften wiederherstellt und die Neigung der Zellen, zu metastasieren, vermindert oder beseitigt.
Demzufolge können Proteine der vorliegenden Erfindung mit Cadherinaktivität und für solche Proteine kodierende Polynucleotide der vorliegenden Erfindung zur Erzeugung von Antikörpern, die Cadherine erkennen und an diese binden, verwendet werden. Solche Antikörper können verwendet werden, um die Adhäsion von ungeeignet exprimierten Tumorzell-Cadherinen zu blockieren, was die Zellen daran hindert, andernorts einen Tumor zu bilden. Solch ein Anti-Cadherin-Antikörper kann auch als ein Marker für den Grad, den pathologischen Typ und die Prognose eines Krebses verwendet werden, d. h. je weiter der Krebs fortgeschritten ist, desto geringer wird die Cadherinexpression sein, und diese Verminderung bei der Cadherinexpression kann durch Verwendung eines Cadherin-bindenden Antikörpers nachgewiesen werden.
Fragmente der Proteine der vorliegenden Erfindung mit Cadherinaktivität, vorzugsweise ein Polypeptid, das ein Decapeptid der Cadherin-Erkennungsstelle umfasst, und für solche Proteinfragmente kodierende Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch zur Blockierung der Cadherinfunktion verwendet werden, indem sie an Cadherine binden und diese an einer Bindung einer Art hindern, die unerwünschte Effekte erzeugt. Außerdem können Fragmente der Proteine der vorliegenden Erfindung mit Cadherinaktivität, vorzugsweise trunkierte, lösliche Cadherinfragmente, von denen man herausgefunden hat, dass sie im Kreislauf von Krebspatienten stabil sind, sowie solche Proteinfragmente kodierende Polynucleotide verwendet werden, um die richtige Zell-Zell-Adhäsion zu stören.
Assays für adhäsive und invasive Suppressoraktivität von Cadherin umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, solche, die beschrieben werden in: Hortsch et al., J Biol. Chem. 270 (32): 18809–18817, 1995; Miyaki et al. Oncogene 11: 2547–2552, 1995; Ozawa et al. Cell 63: 1033–1038, 1990.
Tumorinhibierungsaktivität
Zusätzlich zu den oben für eine immunologische Behandlung oder Vorbeugung von Tumoren beschriebenen Aktivitäten kann ein erfindungsgemäßes Protein andere Antitumoraktivitäten aufweisen. Ein Protein kann Tumorwachstum direkt oder indirekt (wie zum Beispiel über Antikörper abhängige, zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC)) inhibieren. Ein Protein kann seine tumorinhibierende Aktivität zeigen, indem es auf Tumorgewebe oder Tumorvorläufergewebe wirkt, indem es die Bildung von Geweben inhibiert, die für die Unterstützung des Tumorwachstums notwendig sind (wie, zum Beispiel, durch Inhibierung der Angiogenese), indem es die Produktion von anderen Faktoren, Mitteln oder Zellarten verursacht, die Tumorwachstum inhibieren, oder indem es Faktoren, Mittel oder Zellarten unterdrückt, eliminiert oder inhibiert, die Tumorwachstum begünstigen.
Andere Aktivitäten
Ein erfindungsgemäßes Protein kann auch eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten oder Wirkungen ausüben: Inhibierung des Wachstums, der Infektion oder Funktion, oder der Tötung, von Krankheitserregern, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Bakterien, Viren, Pilzen und anderen Parasiten; Bewirken (Unterdrücken oder Verstärken) von körperlichen Eigenschaften, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Größe, Gewicht, Haarfarbe, Augenfarbe, Haut, Fett-zu-Muskel-Verhältnis oder andere Hautpigmentierung, oder Organ- oder Körperteilgröße oder -form (wie, zum Beispiel, Brustvergrößerung oder -verkleinerung, Veränderung der Knochenform oder -gestalt); Auswirkung auf Biorhythmen oder zirkadiane Zyklen oder Rhythmen; Auswirkung auf die Fruchtbarkeit von männlichen oder weiblichen Subjekten; Auswirkung auf den Metabolismus, Katabolismus, Anabolismus, die Verarbeitung, Verwendung, Speicherung oder Eliminierung von diätischem Fett, Lipid, Protein, Kohlenhydrat, Vitaminen, Mineralstoffen, Cofaktoren oder anderen Ernährungsfaktoren oder Bestandteil(en); Auswirkung auf Verhaltenseigenschaften, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, Appetit, Libido, Stress, Erkennung (einschließlich kognitiven Störungen), Depression (einschließlich depressiver Störungen) und gewalttätigem Verhalten; Bereitstellung von analgetischen Wirkungen oder anderen schmerzvermindernden Wirkungen; Begünstigen der Differenzierung und des Wachstums von embryonalen Stammzellen in anderen Zelllinien als hämatopoetischen Linien; hormonale oder endokrine Aktivität; im Falle von Enzymen, Korrektur von Mängeln des Enzyms und Behandlung von mit dem Mangel einhergehenden Erkrankungen; Behandlung von hyperproliferativen Störungen (wie, zum Beispiel, Psoriasis); Immunglobulin-ähnliche Aktivität (wie, zum Beispiel, die Fähigkeit, Antigen oder Komplement zu binden); und die Fähigkeit als ein Antigen in einer Impfstoffzusammensetzung zu wirken, um eine Immunantwort gegen ein solches Protein oder ein anderes Material oder eine andere Einheit zu bewirken, die mit einem solchen Protein kreuzreaktiv ist.
Verabreichung und Dosierung
Ein Protein der vorliegenden Erfindung (aus welcher Quelle auch immer stammend, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, aus rekombinanten und nicht rekombinanten Quellen) kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, wenn es mit einem pharmazeutisch zulässigen Träger kombiniert wird. Eine solche Zusammensetzung kann auch (zusätzlich zum Protein und einem Träger) Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler und andere auf dem Fachgebiet wohlbekannte Materialien enthalten. Der Begriff „pharmazeutisch zulässig" meint ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des/der aktiven Bestandteils/Bestandteile nicht beeinträchtigt. Die Eigenschaften des Trägers werden vom Verabreichungsweg abhängen. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Cytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Faktoren wie beispielsweise M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, Thrombopoietin, Stammzellfaktor und Erythropoietin enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann des Weiteren andere Mittel enthalten, die entweder die Aktivität des Proteins verstärken oder seine Aktivität oder Verwendung bei der Behandlung komplementieren. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Mittel können in der pharmazeutischen Zusammensetzung eingeschlossen sein, um eine synergistische Wirkung mit einem erfindungsgemäßen Protein zu erzeugen oder Nebenwirkungen zu minimieren. Umgekehrt kann ein Protein der vorliegenden Erfindung in Formulierungen eines bestimmten Cytokins Lymphokins oder eines anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder anti-Thrombosefaktors oder entzündungshemmenden Mittels eingeschlossen sein, um Nebenwirkungen des Cytokins, Lymphokins, der anderen hämatopoetische Faktoren, thrombolytischen oder anti-Thrombosefaktoren oder entzündungshemmenden Mittel zu minimieren.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann in Multimeren (z. B., Heterodimeren oder Homodimeren) oder in Komplexen mit sich selbst oder anderen Proteinen aktiv sein. Als Folge können erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen ein erfindungsgemäßes Protein in solch einer multimeren oder komplexierten Form enthalten.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in der Form eines Komplexes des/der Protein(s/e) der vorliegenden Erfindung zusammen mit anderen Protein- oder Peptidantigenen vorliegen. Das Protein- und/oder Peptidantigen wird ein stimulatorisches Signal sowohl an B- als auch an T-Lymphozyten senden. B-Lymphozyten werden auf das Antigen durch ihre Immunglobulinrezeptoren auf der Oberfläche reagieren. T-Lymphozyten werden auf das Antigen durch die T-Zellrezeptoren (TCR) im Anschluss an die Präsentation des Antigens durch MHC-Proteine reagieren. MHC und strukturell verwandte Proteine, einschließlich solcher, die durch die MHC-Klasse I- und Klasse II-Gene kodiert werden, auf Wirtszellen werden dazu dienen, das/die Peptidantigen(e) T-Lymphozyten zu präsentieren. Die Antigenbestandteile könnten auch als gereinigte MHC-Peptidkomplexe allein oder mit costimulierenden Molekülen bereitgestellt werden, die den T-Zellen direkt signalisieren können. Alternativ können Antikörper, die Oberflächenimmunglobulin und andere Moleküle auf B-Zellen binden können, und auch Antikörper, die den TCR und andere Moleküle auf T-Zellen binden können, mit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in der Form eines Liposoms vorliegen, in dem das Protein der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu anderen pharmazeutisch zulässigen Trägern, mit amphipatischen Mitteln wie z. B. Lipiden kombiniert ist, die in aggregierter Form als Mizellen, unlösliche Monolagen, Flüssigkristalle oder lamelläre Schichten in wässriger Lösung vorkommen. Geeignete Lipide für liposomale Formulierung umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Die Herstellung von solchen liposomalen Formulierungen liegt innerhalb des Könnens eines Fachmanns auf dem Gebiet, wie, zum Beispiel, beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,235,871 ; U.S. Patent Nr. 4,501,728 ; U.S. Patent Nr. 4,837,028 ; und U.S. Patent Nr. 4,737,323 , die alle durch Bezugnahme hier aufgenommen sind.
Wie hier verwendet meint der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge an jedem aktiven Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Verfahrens, die ausreichend ist, dem Patienten einen sinnvollen Nutzen zu zeigen, z. B. die Behandlung, Heilung, Vorbeugung oder Verbesserung des betreffenden medizinischen Zustands oder eine Erhöhung der Geschwindigkeit der Behandlung, Heilung, Vorbeugung oder Verbesserung solcher Zustände. Wird der Begriff auf einen einzelnen, allein verabreichten aktiven Bestandteil angewandt, so bezieht er sich auf den Bestandteil allein. Wird er auf eine Kombination angewandt, bezieht sich der Begriff auf die vereinigten Mengen der aktiven Bestandteile, die zu der therapeutischen Wirkung führen, gleich ob in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht.
In der Ausführung des Verfahrens zur Behandlung oder Verwendung der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutisch wirksame Menge an Protein der vorliegenden Erfindung einem Säugetier verabreicht, das einen zu behandelnden Zustand hat. Das Protein der vorliegenden Erfindung kann gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien wie zum Beispiel Behandlungen, die Cytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetischen Faktoren einsetzen, verabreicht werden. Wenn mit einem oder mehreren Cytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen Faktoren co-verabreicht, kann das Protein der vorliegenden Erfindung entweder gleichzeitig mit dem/den Cytokin(en), Lymphokin(en), anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder anti-thromoblytischen Faktor(en) verabreicht werden, oder nacheinander. Wenn nacheinander verabreicht, wird der behandelnde Arzt über die geeignete Abfolge der Verabreichung von Protein der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Cytokin(en), Lymphokin(en), dem/den anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder anti-thromoblytischen Faktor(en) entscheiden.
Verabreichung des Proteins der vorliegenden Erfindung, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird oder zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, kann auf eine Vielzahl von herkömmlichen Wegen, wie orale Einnahme, Inhalation, topische Anwendung oder kutane, subkutane, intraperitoneale, parenterale oder intravenöse Injektion erfolgen. Intravenöse Verabreichung an den Patienten ist bevorzugt.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge an Protein der vorliegenden Erfindung oral verabreicht wird, wird das Protein der vorliegenden Erfindung in der Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vorliegen. Wenn es in Tablettenform verabreicht wird, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen festen Träger wie eine Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95% an Protein der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 25 bis 90% an Protein der vorliegenden Erfindung. Wenn es in flüssiger Form verabreicht wird, kann ein flüssiger Träger wie beispielsweise Wasser, Petroleum, aus Tieren oder Pflanzen gewonnene Öle wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl oder synthetische Öle zugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann des Weiteren physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder andere Saccharidlösungen oder Glykole wie zum Beispiel Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% an Protein der vorliegenden Erfindung und vorzugsweise von etwa 1 bis 50% an Protein der vorliegenden Erfindung.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins der vorliegenden Erfindung durch intravenöse, kutane oder subkutane Injektion verabreicht wird, wird das Protein der vorliegenden Erfindung in der Form einer pyrogenfreien, parenteral zulässigen, wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung von solchen parenteral zulässigen Proteinlösungen unter gebührender Beachtung des pH-Werts, der Isotonizität, Stabilität und dergleichen, liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachgebiets. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse, kutane oder subkutane Injektion sollte zusätzlich zu einem Protein der vorliegenden Erfindung ein isotonisches Vehikel wie eine Natriumchloridinjektion, Ringer-Injektion, Dextroseinjektion, Dextrose- und Natriumchloridinjektion, Ringer-Lactat-Injektion oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Vehikel enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere Additive enthalten, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Die Menge an Protein der vorliegenden Erfindung in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird von der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands und von der Art der früheren Behandlungen, denen sich der Patient unterzogen hat, abhängen. Letztlich wird der behandelnde Arzt über die Menge an Protein der vorliegenden Erfindung entscheiden, mit der jeder einzelne Patient behandelt werden soll. Anfangs wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen des Proteins der vorliegenden Erfindung verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Größere Dosen des Proteins der vorliegenden Erfindung können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erreicht wird und an diesem Punkt wird die Dosierung nicht weiter erhöht. Es wird in Erwägung gezogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet werden, etwa 0,01 μg bis etwa 100 mg (vorzugsweise etwa 0,1 ng bis etwa 10 mg, mehr bevorzugt etwa 0,1 μg bis etwa 1 mg) eines Proteins der vorliegenden Erfindung pro kg Körpergewicht enthalten sollten.
Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in Abhängigkeit von der Schwere der behandelten Krankheit und dem Zustand und einer möglichen idiosynkratischen Reaktion von jedem einzelnen Patienten variieren. Es ist zu erwägen, dass die Dauer von jeder Anwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung in einem Bereich von 12 bis 24 Stunden einer kontinuierlichen intravenösen Verabreichung liegt. Letztlich wird der behandelnde Arzt über die angemessene Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung entscheiden.
Das erfindungsgemäße Protein kann auch verwendet werden, um Tiere zu immunisieren, um polyklonale und monoklonale Antikörper zu erhalten, die spezifisch mit dem Protein reagieren. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Antikörper", ohne auf diese beschränkt zu sein, einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen Antikörper, einen Chimären Antikörper, einen einkettigen Antikörper, einen CDR-grafted Antikörper, einen humanisierten Antikörper oder Fragmente davon, die an das angegebene Protein binden. Ein solcher Begriff umfasst auch beliebige andere Spezies, die von einem Antikörper oder einer Antikörpersequenz, die das angegeben Protein binden kann, abstammen.
Antikörper für ein bestimmtes Protein können durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper durch Erzeugung von antikörperproduzierenden Hybridomas gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden (siehe zum Beispiel, Goding, 1983, Monoclonal antibodies: principles and practice, Academic Press Inc., New York; und Yokoyama, 1992, „Production of Monoclonal Antibodies" in Current Protocols in Immunology, Unit 2.5, Greene Publishing Assoc. and John Wiley & Sons). Polyklonale Seren und Antikörper können durch Inokulation eines Säugetiersubjekts mit dem relevanten Protein oder Fragmenten davon gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden. Fragmente von Antikörpern, Rezeptoren oder anderen reaktiven Peptiden können aus den entsprechenden Antikörpern durch deren Spaltung und Sammeln der gewünschten Fragmente gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden (siehe zum Beispiel, Goding, supra; und Andrew et al., 1992, „Fragmentation of Immunglobulins" in Current Protocols in Immunology, Unit 2.8, Greene Publishing Assoc. and John Wiley & Sons). Chimäre Antikörper und einkettige Antikörper können auch gemäß bekannter rekombinanter Verfahren hergestellt werden (siehe zum Beispiel, 5,169,939, 5,194,594 und 5,576,184). Humanisierte Antikörper können außerdem aus korrespondierenden murinen Antikörpern gemäß wohlbekannter Verfahren hergestellt werden (siehe zum Beispiel, U.S. Patente Nr. 5,530,101 , 5,585,089 und 5,693,762 ). Außerdem können humane Antikörper in nicht humanen Tieren hergestellt werden wie zum Beispiel Mäusen, die genetisch verändert wurden, um humane Antikörpermoleküle zu exprimieren (siehe, zum Beispiel, Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845–851; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146–156 (erratum Nature Genetics 16: 410); und U.S. Patente 5,877,397 und 5,625,126 ). Solche Antikörper können erhalten werden, indem entweder das gesamte Protein oder Fragmente davon als ein Immunogen verwendet werden. Die Peptidimmunogene können zusätzlich einen Cysteinrest am Carboxylterminus enthalten und sind an ein Hapten konjugiert wie zum Beispiel Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Verfahren zur Synthese solcher Peptide sind im Fachgebiet bekannt, zum Beispiel wie in R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); J. L. Krstenansky, et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Monoklonale Antikörper, die an das erfindungsgemäße Protein binden, können nützliche diagnostische Mittel für den immunologischen Nachweis des Proteins sein. Neutralisierende monoklonale Antikörper, die ans das Protein binden, können auch nützliche Therapeutika sowohl für Zustände sein, die mit dem Protein einhergehen, als auch bei der Behandlung von einigen Formen von Krebs, wo eine anormale Expression des Proteins beteiligt ist. Im Falle von Krebszellen oder Leukämiezellen können neutralisierende monoklonale Antikörper gegen das Protein beim Nachweis und der Vorbeugung der metastatischen Ausbreitung der Krebszellen von Nutzen sein, die durch das Protein vermittelt werden kann.
Für Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die für die Regeneration von Knochen, Knorpel, Sehne oder Bändern von Nutzen sind, umfasst das therapeutische Verfahren die topische, systemische oder lokale Verabreichung als ein Implantat oder eine Vorrichtung. Wird die therapeutische Zusammensetzung für eine Verwendung in dieser Erfindung verabreicht, liegt diese, selbstverständlich, in einer pyrogenfreien, physiologisch zulässigen Form vor. Des Weiteren kann die Zusammensetzung wünschenswerterweise verkapselt sein oder in einer viskosen Form zum Transport zur Stelle der Knochen-, Knorpel- oder Gewebeschädigung injiziert werden. Topische Verabreichung kann für Wundheilung und Gewebereparatur geeignet sein. Andere therapeutisch nützliche Mittel als ein erfindungsgemäßes Protein, die gegebenenfalls auch in der Zusammensetzung wie oben beschrieben eingeschossen werden können, können alternativ oder zusätzlich gleichzeitig oder aufeinander folgend mit der Zusammensetzung in den erfindungsgemäßen Verfahren verabreicht werden. Für Knochen- und/oder Knorpelbildung würde die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix umfassen, welche die Protein enthaltende Zusammensetzung zur Stelle der Knochen- und/oder Knorpelschädigung transportieren kann, eine Struktur für den sich entwickelnden Knochen und Knorpel bietet und optimalerweise im Körper resorbiert werden kann. Solche Matrizes können aus Materialien gebildet werden, die für andere implantierte medizinische Anwendungen verwendet werden.
Die Wahl des Matrixmaterials basiert auf biologischer Verträglichkeit, biologischer Abbaubarkeit, mechanischen Eigenschaften, kosmetischem Aussehen und Eigenschaften der Grenzfläche. Die bestimmte Anwendung der Zusammensetzungen wird die geeignete Formulierung definieren. Mögliche Matrizes für die Zusammensetzungen können biologisch abbaubares und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polyanhydride sein. Andere mögliche Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch wohldefiniert, wie zum Beispiel Knochen oder dermales Kollagen. Weitere Matrizes bestehen aus reinen Proteinen oder Bestandteilen der extrazellulären Matrix. Andere mögliche Matrizes sind nicht biologisch abbaubar und chemisch definiert wie z. B. gesintertes Hydroxylapatit, Bioglas, Aluminate oder andere Keramiken. Matrizes können aus Kombinationen von jeglichem der oben genannten Arten von Material bestehen, wie beispielsweise Polymilchsäure und Hydroxylapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Die Biokeramiken können in der Zusammensetzung verändert werden, wie z. B. in Calcium-Aluminat-Phosphat, und verarbeitet werden, um Porengröße, Partikelgröße, Partikelform und biologische Abbaubarkeit zu verändern.
Derzeit ist ein 50:50 (Molgewicht) Copolymer aus Milchsäure und Glykolsäure in der Form von porösen Partikeln mit Durchmessern im Bereich von 150 bis 800 Mikrometern bevorzugt. In einigen Anwendungen wird es von Nutzen sein, ein Sequestrierungsmittel, wie z. B. Carboxymethylcellulose oder autologe Blutgerinnsel zu nutzen, um die Proteinzusammensetzungen an einer Ablösung von der Matrix zu hindern.
Eine bevorzugte Familie an Sequestrierungsmitteln sind Cellulosematerialien wie z. B. Alkylcellulosen (einschließlich Hydroxyalkylcellulosen), einschließlich Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, und Carboxymethylcellulose, wobei kationische Salze von Carboxymethylcellulose (CMC) am meisten bevorzugt sind. Andere bevorzugte Sequestrierungsmittel umfassen Hyaluronsäure, Natriumalginat, Poly(ethylenglykol), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Poly(vinylalkohol). Die hierin nützliche Menge an Sequestrierungsmittel beträgt 0,5–20 Gew.-%, vorzugsweise 1–10 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Formulierung, welche die Menge darstellt, die für eine Verhinderung der Desorption des Proteins von der Polymermatrix und eine Bereitstellung einer geeigneten Handhabung der Zusammensetzung notwendig ist, aber nicht so viel, dass die Progenitorzellen daran gehindert werden, in die Matrix einzufiltrieren, wodurch dem Protein die Möglichkeit gegeben wird, die osteogene Aktivität der Progenitorzellen zu unterstützen.
In weiteren Zusammensetzungen können erfindungsgemäße Proteine mit anderen Mitteln kombiniert werden, die für die Behandlung der fraglichen Knochen- und/oder Knorpeldefekte, Wunden oder des fraglichen Gewebes von Nutzen sind. Diese Mittel umfassen verschiedene Wachstumsfaktoren wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), und den insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF).
Die therapeutischen Zusammensetzungen sind derzeit auch für tierärztliche Anwendungen wertvoll. Insbesondere Haustiere und Vollblutpferde sind, zusätzlich zu Menschen, erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit Proteinen der vorliegenden Erfindung.
Der Dosierungsplan für eine Protein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung, die bei einer Geweberegeneration verwendet werden soll, wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, unter Berücksichtung von Faktoren, welche die Wirkung der Proteine modifizieren, z. B. Menge an Gewebe, das gebildet werden soll, dem Ort der Schädigung, dem Zustand des beschädigten Gewebes, der Größe einer Wunde, Art des beschädigten Gewebes (z. B. Knochen), dem Alter des Patienten, dessen Geschlecht und Ernährung, der Schwere einer beliebigen Infektion, Zeit der Verabreichung und anderer klinischer Faktoren. Die Dosierung kann mit der Art der bei der Rekonstituierung verwendeten Matrix und mit dem Einschluss von anderen Proteinen in der pharmazeutischen Zusammensetzung variieren. Zum Beispiel kann der Zusatz von anderen bekannten Wachstumsfaktoren, wie z. B. IGF I (insulinähnlicher Wachstumsfaktor I), zu der Endzusammensetzung auch die Dosierung beeinflussen. Der Fortschritt kann überwacht werden, indem periodisch das Gewebe-/Knochenwachstum und/oder die Wiederherstellung untersucht wird, zum Beispiel, durch Röntgenstrahlung, histomorphometrische Bestimmungen und Tetracyclinmarkierung.
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch für eine Gentherapie verwendet werden. Solche Polynucleotide können entweder in vivo oder ex vivo in Zellen für Expression in einem Säugetiersubjekt eingeführt werden. Erfindungsgemäße Polynucleotide können auch durch andere bekannte Verfahren zur Einführung von Nucleinsäuren in eine Zelle oder einen Organismus verabreicht werden (einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein, in der Form von viralen Vektoren oder nackter DNA).
Zellen können auch ex vivo in der Gegenwart der Proteine der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, um zu proliferieren oder um eine gewünschte Wirkung auf solche Zellen oder Aktivität in diesen zu erzeugen. Behandelte Zellen können dann in vivo für therapeutische Zwecke eingeführt werden.
Diese Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele erläutert, die nicht als einschränkend ausgelegt werden sollten. Die Inhalte des „Sequence Listing" sind hierin eingeschlossen.
BEISPIELE
Identifizierung und Charakterisierung von Klon „hGIL-19/AE289"
Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung wurde als Klon „hGIL-19/AE289" identifiziert. Klon hGIL-19/AE289 wurde gemäß dem folgenden Verfahren isoliert. Eine murine EST wurde aus einer murinen cDNA-Bibliothek isoliert, die aus Splenozyten, die sowohl mit ConA als auch mit aus Knochenmark stammenden dendritischen Zellen aktiviert wurden, hergestellt wurde. Die EST wurde unter Verwendung von Verfahren identifiziert, die für cDNAs, die für sezernierte Proteine kodieren, selektiv sind (siehe U.S. Pat. Nr. 5,536,637 ). Die murine EST-Sequenz wurde verwendet, um einen murinen Volllängenklon aus der gleichen cDNA-Bibliothek zu isolieren. Analyse der Sequenz des murinen Klons zeigte eine signifikante Homologie zu Interleukin-10 (IL-10).
Um ein humanes Homolog des murinen Klons zu isolieren, wurden PCR-Primer konstruiert, die auf der Region der murinen Sequenz basierten, die Homologie zu IL-10 zeigt. Die Verwendung von solchen Primern für die Amplifizierung in einer humanen PBMC-Bibliothek ergab ein PCR-Produkt mit signifikanter Größe. Die Analyse der Sequenz des PCR-Produkts bestätigte, dass es sich um ein Homolog der murinen cDNA handelte. Aus der Sequenz des teilweise humanen Klons wurden Oligonucleotide konstruiert und verwendet, um einen humanen Volllängen-Klon aus der PBMC-Bibliothek zu isolieren.
hGIL-19/AE289 ist ein humaner Volllängen-Klon, einschließlich der gesamten kodierenden Sequenz eines sezernierten Proteins (hierin auch als „hGIL-19/AE289-Protein" bezeichnet). Analyse seiner Aminosäuresequenz deutete darauf hin, dass etwa 23% Homologie zu hIL-10 besteht. Basierend auf den putativen Rezeptorbindungseinheiten in IL-10 wurden durch Computermodelling drei Einheiten in hGIL-19/AE289 vorgeschlagen, die an analogen Funktionen beteiligt sind. Dies sind die Regionen von SEQ ID NO: 2 von Rest 50 bis 60, von Rest 63 bis 81 und von Rest 168 bis 177. Analysen der Datenbanken ergaben, dass hGIL-19 auch ähnliche Niveaus an Homologie mit IL-10 von anderen Spezies zeigt.
Die Nucleotidsequenz von hGIL-19/AE289 wie derzeit bestimmt, wird in SEQ ID NO: 1 berichtet und umfasst einen Poly(A)-Schwanz. Die Aminosäuresequenz des Proteins hGIL-19/AE289, die der vorangegangenen Nucleotidsequenz entspricht, wird in SEQ ID NO: 2 berichtet.
Charakterisierung des hGIL-19/AE289-Proteins
Zelllinien, die das Volllängen-hGIL-19/AE289-Protein stabil exprimieren und sezernieren, wurden durch Transfektion von CHO-Zellen mit hGIL-19/AE289-cDNA in geeigneten Expressionsvektoren geschaffen. Transient transfizierte COS-Zellen, bei denen geeignete hGIL-19/AE289-Expressionsvektoren verwendet wurden, wurden verwendet, um hGIL-19/AE289-Protein für die Analyse herzustellen. Transfektionen wurde erreicht, indem das kommerziell erhältliche Lipofectamine-Reagenz (Gibco) verwendet wurde. Interessanterweise wurde beobachtet, dass COS-Zellen, die hGIL-19 exprimieren, sich nicht gleichmäßig ablösen und Löcher in der Zellkulturmonolayer bilden. Medien, die durch transfizierte COS-Zellen konditioniert wurden, wurden verwendet, um die Cytokin-ähnliche Aktivität des hGIL-19/AE289-Proteins nachzuweisen. Western Blot Analyse der Zelllysate zeigte, dass Stat-3 phosphoryliert (aktiviert) wird in einer Zelllinie, die von Mesangiumgewebe der Niere abstammt und Makrophagen ähnliche Eigenschaften zeigt (MES-13; siehe, Dumoutier et al. (2000) J. of Immunology 164: 1814–1819), wenn diese Zellen Medium ausgesetzt werden, das durch hGIL-19/AE289 exprimierende Zellen konditioniert wurde. Zusätzlich wird Phosphorylierung von Stat-3 in nicht transfizierten COS-Zellen induziert, die mit hGIL-19-Protein behandelt werden.
Elektrophoretische Analyse des hGIL-19/AE289-Proteins (das von den hierin beschriebenen transfizierten COS-Zelllinien gewonnen wurde) deutet darauf hin, dass das exprimierte Protein in verschiedenen Größen existiert. Die Behandlung des von COS abstammendem hGIL-19-Proteins mit N-Glykanase vor der Elektrophorese führt zu einer einzelnen Bande, die der Spezies mit der höchsten Mobilität entspricht (z. B. dem geringsten Molekulargewicht), die in unbehandeltem hGIL-19/AE289 gesehen wird. Dies stimmt mit den vorhergesagten Glykosylierungsereignissen überein, die an den in der Aminosäuresequenz von hGIL-19/AE289 (Aminosäurereste 54–56, 68–70, 97–99 und 176–178 von SEQ ID NO: 2) identifizierten, putativen N-verknüpften Glykosylierungsstellen auftreten können.
N-terminale Edman-Sequenzierung zeigte, dass der N-Terminus des reifen hGIL-19/AE289-Proteins mit dem Rest an Position 34 von SEQ ID NO: 2 (Alanin) beginnt. Es wurden Expressionsvektoren geschaffen, die einen „6x-Histidin"-Affinitätstag und ein FLAG-Epitoptag an den N-Terminus des reifen hGIL-19/AE289-Proteins fusionieren. (Der angehängte Aminosäuretag ist in SEQ ID NO: 3 gegeben und hat die folgenden Aminosäuresequenz:
Diese getaggten Konstrukte wurden verwendet, um stabil exprimierende CHO-Zelllinien und transient exprimierende COS-Zelllinien zu erschaffen. Die Tags bieten ein geeignetes Mittel zum Nachweis von hGIL-19/AE289 (z. B. Anti-6x-His-Antikörper, Anti-FLAG-Antikörper) und für die Reinigung des Proteins aus dem konditionierten Medium (unter Verwendung von Ni²⁺-Harz). Humanes GIL-19-Protein, das durch diesen Tag von den hGIL-19/AE289 exprimierenden COS-Zelllinien gereinigt wurde, konnte verwendet werden, um Stat-3-Aktivierung in MES-13-Zellen zu induzieren.
Vergleich von hGIL-19-mRNA-Transkripten in aktivierten Th1- und Th2-Zellen (siehe, zum Beispiel, Syrbe et al, (1999) Springer Seminars in Immunopathology, 21: 263–85) deuteten auf einen wesentlich höheren Expressionsspiegel an GIL-19 in aktivierten Th1-Zellen als in aktivierten Th2-Zellen hin. Eine Analyse von GIL-19-mRNA wurde mit RNAse-Protektionsassays erreicht.
Immunologische Wirkungen von GIL-19
Die immunologischen Wirkungen von GIL-19 wurden in einem Metazoenkontext durch virale Einführung der cDNA von murinem GIL-19 in Mäuse untersucht. Es wurde ein Adenovirusvektor verwendet, um eine cDNA von murinem GIL-19 in 8 Wochen alten, weiblichen C57/B6-Mäusen durch Injektion von 5 × 10¹⁰ viralen Partikel zu exprimieren. Die Testmäuse wurden 7 bzw. 14 Tage nach der Injektion geopfert und mit Kontrollmäusen verglichen, denen nur Puffer oder nur Grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimierender Adenovirus injiziert wurde. An Tagen 7 und 14 wurde gefunden, dass die absoluten und relativen Gewichte des Thymus in den Mäusen, die das virale murine GIL-19 exprimierten, deutlich vermindert war. Das absolute mittlere Gewicht der Milz war an Tag 14 vermindert und die Lebergewichte waren an Tag 7 geringfügig erhöht. Eine grob verallgemeinerte Atrophie des Thymus und auch eine Verarmung an Lymphozyten (mikroskopisch beobachtet) wurde an Tag 7 und 14 offensichtlich.
Außerdem gab es eine Anzahl an hämatologischen Auswirkungen, die an Tag 7 offensichtlich waren, einschließlich einer verminderten Anzahl an roten Blutkörperchen, Hämoglobin und Hämatokrit. Diese Wirkungen deuten, zusammen genommen, auf Anämie in diesen Tieren hin. Darüber hinaus gab es einen Anstieg der Thrombozyten und auch eine Zunahme der Anzahl an weißen Blutkörperchen, aufgrund einer Zunahme der neutrophilen Zellen. Im Hinblick auf diese Beobachtungen gab es keinen Beweis für eine regenerative Antwort, was darauf hindeutet, dass die Wirkungen auf dem Niveau des Knochenmarks sein könnten.
Darüber hinaus gab es eine geringfügige Abnahme der Albuminspiegel an Tag 7 und Tag 14. Eine mögliche Ursache dafür ist der Verlust an kleinen Molekülen durch die Niere oder den Darm.
Äquivalente
Fachleute auf diesem Gebiet werden erkennen oder in der Lage sein, sicherzustellen, das unter Verwendung von nur routinemäßigen Experimenten viele Äquivalente der spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung möglich sind. Solche Äquivalente sollen in den folgenden Ansprüchen eingeschlossen sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1; (b) der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601; (c) der Nucleotidsequenz einer für ein Volllängen-Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231; (d) der Nucleotidsequenz einer für ein reifes Protein kodierenden Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231; (e) der Nucleotidsequenz, kodierend für ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst; (f) der Nucleotidsequenz, kodierend für ein Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179 umfasst; und (g) der Nucleotidsequenz, kodierend für ein Protein, das ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei dieses Polynucleotid funktionell mit mindestens einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist.
Wirtszelle, transformiert mit dem Polynucleotid nach Anspruch 2.
Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei diese Zelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das durch das Polynucleotid nach Anspruch 2 kodiert wird, wobei das Verfahren umfasst: (a) Züchten einer Kultur aus einer Wirtszelle, transformiert mit dem Polynucleotid nach Anspruch 2, in einem geeigneten Kulturmedium; und (b) Reinigen dieses Proteins aus der Kultur.
Protein, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 5.
Polynucleotid, kodierend für das Protein nach Anspruch 6.
Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei das Polynucleotid die für das Volllängen- oder das reife Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289 umfasst, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2. (b) einem Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2. (c) der Aminosäuresequenz, kodiert durch eine für ein Volllängen-Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231; (d) der Aminosäuresequenz, kodiert durch eine für ein reifes Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231; und (e) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179.
Protein nach Anspruch 9, wobei dieses Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Zusammensetzung, enthaltend das Protein nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 65 bis Nucleotid 601 umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid die Nucleotidsequenz für eine das Volllängen-Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289 umfasst, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Polynucleotid nach Anspruch 14, wobei die für das Volllängen-Protein kodierende Sequenz kodiert wird durch den cDNA-Einschub von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid die Nucleotidsequenz für eine das reife Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289 umfasst, niedergelegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Polynucleotid nach Anspruch 16, wobei die für das reife Protein kodierende Sequenz kodiert wird durch den cDNA-Einschub von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid für ein Protein kodiert, das ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
Protein nach Anspruch 9, wobei das Protein ein Fragment der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst, wobei das Fragment eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
Protein nach Anspruch 9, wobei das Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine für ein Volllängen-Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289 kodiert wird, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Antikörper oder Fragment davon, dass an ein Protein nach Anspruch 9, 10, 20 oder 39 bindet.
Antikörper nach Anspruch 22, wobei es sich um einen neutralisierenden Antikörper handelt.
Antikörper nach Anspruch 22, der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem monoklonalen Antikörper, einem polyklonalen Antikörper, einem chimären Antikörper, einem einkettigen Antikörper, einem CDR-grafted Antikörper und einem humanisierten Antikörper.
Antikörper nach Anspruch 22, wobei es sich um einen menschlichen Antikörper handelt.
Antikörper nach Anspruch 24 oder 25, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 22–26 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Vorbeugung von Arthritis.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Arthritis rheumatoide Arthritis ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Protein kodiert mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179.
Protein nach Anspruch 21, wobei die für das Volllängen-Protein kodierende Sequenz kodiert wird durch den cDNA-Einschub von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Protein nach Anspruch 9, wobei das Protein die Aminosäuresequenz umfasst, die durch eine für ein reifes Protein kodierende Sequenz von Klon hGIL-19/AE289 kodiert wird, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Protein nach Anspruch 31, wobei die für das reife Protein kodierende Sequenz kodiert wird durch den cDNA-Einschub von Klon hGIL-19/AE289, hinterlegt unter der Zugangsnummer ATCC 207231.
Protein nach Anspruch 9, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von etwa Aminosäure 34 bis 179 umfasst.
Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die unter hoch stringenten Bedingungen an SEQ ID NO: 1 oder ein Komplement davon hybridisiert.
Protein, kodiert durch eine Nucleotidsequenz, die unter hoch stringenten Bedingungen an das Komplement von SEQ ID NO: 1 hybridisiert.
Polynucleotid, kodierend für ein Fragment eines Proteins, das eine Aminosäuresequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
Fragment eines Proteins, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren 50–60, 63–81 und 168–177 von SEQ ID NO: 2.
Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 22.
Fusionsprotein, umfassend das Protein nach Anspruch 20, fusioniert an ein Trägermolekül.
Fusionsprotein nach Anspruch 39, wobei das Trägermolekül ein Immunglobulin oder der Fc-Teil eines Immunglobulins ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 40, wobei das Protein nach Anspruch 20 an ein Trägermolekül durch eine Linkersequenz fusioniert ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 40, wobei das Immunglobulin ein IgG- oder ein IgM-Immunglobulin ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 42, wobei das Immunglobulin ein IgG-Immunglobulin ist.