DE69929019T2

DE69929019T2 - Mu-1, ein mitglied der zytokinrezeptor-familie

Info

Publication number: DE69929019T2
Application number: DE69929019T
Authority: DE
Inventors: Debra Donaldson; Michelle Ungar
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1998-03-17
Filing date: 1999-03-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-03-18
Also published as: AU3009399A; WO1999047675A1; DE69929019D1; EP1688495A1; EP2228448A1; US6057128A; AU758824B2; US7994292B2; EP0994947A1; JP2013188214A; EP0994947B1; JP2001527423A; ATE313626T1; US20080167241A1; US20100130729A1; DK0994947T3; US7705123B2; ES2253879T3; EP1681348A1; JP2010057489A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Mitglieder der in Säugetieren vorkommenden Zytokinrezeptor-Familie von Proteinen (mit Einschluss von und ohne Limitierung auf Rezeptorproteine des Menschen und der Maus), Fragmente davon sowie rekombinante Polynukleotide und Zellen, die für die Expression solcher Proteine brauchbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene regulatorische Proteine, die als Hämatopoetine bekannt sind und bei der Entwicklung und Proliferation der verschiedenen Populationen von hämatopoetischen Blutzellen eine Rolle spielen, sind bereits identifiziert worden. Die meisten Hämatopoetine zeigen bestimmte biologische Aktivitäten, indem sie mit einem Rezeptor auf der Oberfläche von Zielzellen (target cells) in Wechselwirkung treten. Zytokinrezeptoren bestehen üblicherweise aus ein, zwei oder drei Ketten. Viele Zytokinrezeptoren und einige Zytokine, wie z.B. IL-12 p40, sind Mitglieder der Superfamilie der Hämatopoetin-Rezeptoren von Proteinen. Die Identifizierung von neuen Mitgliedern der Großfamilie der Hämatopoetin-Rezeptoren kann bei der Hämatopoese, bei der Regulierung von Immunantworten und bei der Identifizierung von anderen Mitgliedern der Hämatopoetin-Superfamilie, mit Einschluss von Zytokinen und Rezeptoren, von Nutzen sein. Der Eintrag in die EMBL Datenbank Nr. HSAC2303 vom 26. Juni 1991, Zugangsnummer (accession number) AC 002303, betrifft eine genomische DNS-Sequenz aus einem BAC Klon, der DNS vom humanen Chromosom 16 enthält.
Es wäre wünschenswert, die DNS- und die Proteinsequenzen von bislang unbekannten Mitgliedern der Superfamilie von Hämatopoetin-Rezeptoren zu identifizieren und zu bestimmen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Nach der vorliegenden Erfindung werden Polynukleotide offenbart, die für die Kette des MU-1 Hämatopoetin-Superfamilie Rezeptors kodieren, mit Einschluss von denjenigen und ohne Limitierung auf diejenigen, die in der Maus und im Menschen vorkommen.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, das eine Nukleotidsequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1;
(b) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 vom Nukleotid 238 bis zum Nukleotid 852;
(c) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 vom Nukleotid 301 bis zum Nukleotid 852;
(d) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 vom Nukleotid 301 bis zum Nukleotid 945 oder vom Nukleotid 238 bis zum Nukleotid 945;
(e) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der Nukleotidsequenz, die in einem der Anspruchsteile (a) bis (d) spezifiziert ist, infolge der Degeneration des genetischen Codes abweicht; und
(f) einer Nukleotidsequenz, die für ein Spezies-Homologes der Sequenz gemäß SEQ ID NO:2 kodiert, wobei besagte Nukleotidsequenz für ein Protein kodiert, welches die biologische Aktivität des MU-1 Proteins, wie in SEQ ID NO:2 dargestellt, in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzt.

Die Nukleotidsequenz kann mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell (operably linked) verbunden sein.
Die Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, das eine Nukleotidsequenz enthält, die für ein Peptid oder Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2;
(b) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 538;
(c) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 236;
(d) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 1 bis 236; und
(e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a) bis (d), die die biologische Aktivität des MU-1 Proteins gemäß (a) bis (d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzen.

Wirtszellen, vorteilhaft Säugetierzellen, die mit den Polynukleotiden transformiert sind, werden ebenfalls zur Verfügung gestellt.
Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines MU Proteins zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst:

(a) die Kultivierung einer Wirtszelle nach der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Kulturmedium; und
(b) die Reinigung des humanen MU-1 Proteins aus der Kultur.

Weiterhin werden Proteine zur Verfügung gestellt, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes MU-1 Protein zur Verfügung, das eine Aminosäuresequenz enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2;
(b) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 538;
(c) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 236;
(d) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 1 bis 236;
(e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a) bis (d), die die biologische Aktivität des MU-1 Proteins gemäß (a) bis (d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzen; und
(f) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter hoch stringenten Bedingungen von 0.1 × SSC bei 65°C mit einer Nukleotidsequenz, die in einem der Ansprüche 1(a) bis (c) spezifiziert ist, oder mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 vom Nukleotid 301 bis zum Nukleotid 945 zu hybridisieren.

Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die spezifizierte Aminosäuresequenz ein Teil eines Fusionsproteins (mit einer weiteren, nicht von MU-1 abgeleiteten Aminosäuresequenz). Bevorzugte Fusionsproteine enthalten ein Antikörper-Fragment, beispielsweise ein Fc-Fragment.
Auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Protein nach der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff enthalten, werden zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen zur Verfügung, die einen Antikörper enthalten, der spezifisch mit einem Protein nach der vorliegenden Erfindung reagiert.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben zum ersten Mal Polynukleotide identifiziert und zur Verfügung gestellt, die für DIE Kette des MU-1 Hämatopoetin-Superfamilie Rezeptors (in der Folge als „MU-1" oder „MU-1 Protein" bezeichnet) kodieren, mit Einschluss von und ohne Limitierung auf Polynukleotide, die für humanes MU-1 kodieren.
Eine Aminosäureregion des humanen IL5 Rezeptors mit 70 Aminosäuren (LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFV IVIMATICFILLIL; SEQ ID NO:3) wurde verwendet, um die EST Datenbank GenBank zu durchsuchen, wobei der TBLASTN Algorithmus verwendet wurde. Eine Sequenz innerhalb des genomischen BAC Klons AC002303, der von dem humanen Chromosom 16p12 stammte, wurde als homolog zu dieser Region identifiziert, was die Vermutung nahe legte, dass dieses Segment für ein Gen für einen neuen Hämatopoetin-Rezeptor kodieren könnte.
Eine Überprüfung des offenen Leserasters innerhalb von 1.000 bp vom Nukleotid 40.886 ergab ein offenes Raster von 270 bp, das bei Verwendung im einer BLAST Suche von GenPept ausschließlich Mitglieder der Zytokinrezeptor-Familie identifizierte. Ein Stopcodon am Ende dieses Leserasters wurde als Anzeichen für einen Übergang über eine Grenze zwischen einem Exon und einem Intron interpretiert.
Es wurde dann untersucht, ob RNA von einem Gen transscribiert wurde, das innerhalb dieses BAC Klons vom Chromosom 16p12 vorhanden war. PCR Primer wurden auf der Grundlage des größten ORF Segments synthetisiert, das eine Peptidsequenz enthielt, die in der Cytokinrezeptor-Familie konserviert ist. Die Primer GAGTCCGAGGAGAAAGCTGATCTCA (5p) (SEQ ID NO:4) und GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEQ ID NO:5) wurden in PCRs verwendet, um Phagenbibliotheken von verschiedenen humanen Geweben (Clontech) zu durchsuchen. PCR Produkte der erwarteten Größe von 164 bp, die spezifisch mit einem mit 32-P markierten Oligonukleotid mit der Sequenz ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID NO:6) hybridisierten, wurden in Phagen aus Lunge, Niere, Plazenta und Herz gefunden. Bei Verwendung des Oligonukleotids ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID NO:7) wurde ein cDNA Klon mit voller Länge NN14-1b (MU-1) identifiziert, gereinigt und sequenziert. Die DNS Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 dargestellt. Der offene Leseraster kodiert für ein neues Mitglied der Familie der Hämatopoetinrezeptoren. Es verfügt über eine Leader-Sequenz sowie über konservierte Cysteinpaare, PP, WSXWS (SEQ ID NO:8), das heißt Merkmale, die für die Familie charakteristisch sind, ebenso wie über eine Transmembran-Domäne und eine extensive cytoplasmische Domäne. Die nachfolgende ASTA Abgleichung dieser Sequenz mit GenPept ergab sehr große Homologie mit dem humanen IL-2Rb. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Rezeptorkette schließt eine mutmaßliche Signalsequenz aus den Aminosäuren 1 bis 21 ein. Es wird angenommen, dass das reife (mature) MU-1 die Sequenz der Aminosäuren 24 bis 538 der SEQ ID NO:2 hat. Eine Transmembran-Domäne findet sich bei den Aminosäuren 237 bis 254.
Die cDNA von MU-1 Wurde am 10. März 1998 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und hat die Zugangsnummer.
Alle Formen von MU-1 Proteinen mit weniger als der vollen Länge sind in die Erfindung einbezogen und werden zusammen mit den reifen Formen mit voller Länge als „MU-1" oder aber „MU-1 Proteine" bezeichnet. MU-1 Proteine mit weniger als der vollen Länge können hergestellt werden, indem man ein entsprechendes Fragment des Polynukleotids exprimiert, das für das MU-1 Protein mit der vollen Länge kodiert (SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6). Diese entsprechenden Polynukleotid-Fragmente sind auch ein Teil der vorliegenden Erfindung. Modifizierte Polynukleotide, wie zuvor beschrieben, können nach Standardverfahren der Molekularbiologie hergestellt werden, mit Einschluss der Konstruktion von Deletions-Mutanten und selektionsspezifischer Methoden zur Mutagenese, oder durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von geeigneten Polynukleotid-Primern.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat ein Protein die „biologische Aktivität einer Kette der Superfamilie der Hämatopoetin-Rezeptoren", wenn es eine oder mehrere Aktivitäten des entsprechenden reifen MU-1 Proteins zeigt.
MU-1 oder aktive Fragmente davon (MU-1 Proteine) können mit Trägermolekülen, wie z.B. Immunoglobulinen, fusioniert werden. Beispielsweise können lösliche Formen des MU-1 mittels Verbindungssequenzen („linker") mit dem Fc-Teil eines Immunglobulins fusioniert werden. Andere Fusionsproteine, wie z.B. diejenigen mit GST, Lex-A oder MBP, können ebenfalls verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch allelische Varianten der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten Nukleotidsequenz ein, das heißt natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids gemäß SEQ ID NO:1, die auch für MU-1 Proteine kodieren, insbesondere für diejenigen Proteine, die eine biologische Aktivität von MU-1 aufweisen. Ebenfalls einbezogen in die vorliegende Erfindung sind isolierte Polynukleotide, die unter hoch stringenten Bedingungen (z.B. 0,1 × SSC bei 65°C) mit der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten Polynukleotidsequenz hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, welche für MU-1 Proteine kodieren, aber infolge der Degeneration des genetischen Codes von der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten Nukleotidsequenz abweichen, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung einbezogen. Weiterhin sind auch Variationen der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen verursacht sind, in die Erfindung einbezogen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotide zur Verfügung, die für Homologe des humanen MU-1 in anderen, tierischen Spezies, insbesondere in anderen Säugetierspezies kodieren. Homologe in diesen Spezies können identifiziert und isoliert werden, indem man Sonden (grobes) oder Primer aus den murinen oder humanen Sequenzen herstellt, die hierin offenbart sind, und damit eine Bibliothek der betreffenden Spezies durchsucht, z.B. eine Bibliothek, die aus PBMCs, Thyrnus oder Hoden der betreffenden Spezies gewonnen wurden.
Die isolierten Polynukleotide nach der Erfindung können mit einer Expressionskontrollsequenz, wie z.B. den Expressionsvektoren MT2 oder pED, die von Kaufman et al. in Nucleic Acid Res. 19, 4485-4490 (1991) beschrieben wurden, funktionell verbunden (operably linked) werden, um das betreffende MU-1 Protein rekombinant herzustellen. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind in der Technik bekannt. Allgemeine Methoden zur Expression von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und beispielhaft von Kaufman in Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) beschrieben. Im Sinne dieser Erfindung bedeutet „funktionell verbunden" („operably linked") enzymatisch oder chemisch unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem isolierten Polynukleotid nach der Erfindung und der Expressionskontrollsequenz auf eine solche Weise verbunden (ligated), dass das MU-1 Protein in einer Wirtszelle, die mit diesem Konstrukt aus Polynukleotid und Kontrollsequenz transformiert (transfiziert) wurde, exprimiert wird.
Eine Anzahl von Zelltypen können als Wirtszellen für die Expression von MU-1 Proteinen dienen. Jeder Zelltyp, in dem funktionale MU-1 Proteine exprimiert werden können, kann verwendet werden. Zu den geeigneten Säugetierwirtszellen zählen z.B. COS-Zellen von Affen, ovariale Zellen von chinesischen Hamstern (CHO Zellen), humane Nieren-293 Zellen, humane Epidermial-431 Zellen, humane Colo205 Zellen, CV-1 Zellen, andere transformierte Zelllinien von Primaten, normale diploide Zellen, aus in vitro Kulturen von primärem Gewebe oder primären Explantaten gewonnene Zelllinien, HeLa Zellen, L-Zellen der Maus, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x oder C2C12 Zellen.
Die MU-1 Proteine können auch hergestellt werden, indem man die isolierten Polynukleotide nach der Erfindung wirksam mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insektenexpressionsvektoren verbindet und ein Insektenexpressionssystem benutzt. Materialien und Methoden für die Verwendung von Expressionssystemen auf Basis von Baculovirus/Insekten-Zellen sind im Handel erhältlich in Form eines Kits, z.B. von Invitrogen, San Diego, California, U.S.A. (das MaxBac^® Kit), und solche Methoden sind in der Technik gut bekannt und z.B. beschrieben in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Lösliche Formen von MU-1 Proteinen können auch in Insektenzellen unter Verwendung von geeigneten isolierten Polynucleotiden, wie zuvor beschrieben, hergestellt werden.
Alternativ können die MU-1 Proteine in niederen Eukaryoten, wie z.B. Hefe, oder in Prokaryoten, wie z.B. Bakterien, hergestellt werden. Zu den geeigneten Hefestämmen zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Stämme von Kluyveromyces, Candida oder beliebige andere Hefestämme mit der Fähigkeit, heterologe Proteine zu exprimieren. Zu den geeigneten Bakterienstämmen zählen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium oder andere Bakterienstämme, die heterologe Proteine zu exprimieren vermögen.
Die Expression in Bakterien kann zur Bildung von Einschlusskörpern (inclusion bodies) führen, die das rekombinante Protein enthalten. Somit kann eine Umfaltung des rekombinanten Proteins erforderlich sein, um aktives oder aktiveres Material zu gewinnen. Verschiedene Methoden zur Gewinnung von richtig gefalteten heterologen Proteinen aus bakteriellen Einschlusskörpern sind in der Technik bekannt. Bei diesen Methoden macht man im allgemeinen das Protein aus den Einschlusskörpern löslich und denaturiert dann das Protein vollständig unter Verwendung eines chaotropen Agens. Wenn Cysteinmoleküle in der primären Aminosäuresequenz des Proteins vorhanden sind, ist es oft erforderlich, die Umfaltung in einer Umgebung vorzunehmen, die die korrekte Bildung von Disulfidbrücken ermöglicht (d.h. in einem Redoxsystem). Allgemeine Methoden zur Umfaltung sind in Kohno, Meth. Enzym., 185, 187-195 (1990) offenbart. EP 0 433 225 und die gleichzeitig anhängige Anmeldung USSN 08/163,877 beschreiben andere geeignete Methoden.
Die MU-1 Proteine nach der Erfindung können auch als ein Produkt transgener Tiere exprimiert werden, z.B. als eine Komponente in der Milch von transgenen Kühen, Ziegen, Schweinen oder Schafen, die durch somatische Zellen oder Keimzellen charakterisiert sind, die Polynukleotidsequenzen enthalten, die für ein MU-1 Protein kodieren.
Die MU-1 Proteine nach der Erfindung können hergestellt werden, indem man transformierte Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die erforderlich sind, damit das gewünschte Protein exprimiert wird. Das entstandene, exprimierte Protein kann dann aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert und gereinigt werden. Lösliche Formen der MU-1 Proteine nach der Erfindung können aus den konditionierten Medien gewonnen und gereinigt werden. An Membranen gebundene Formen der MU-1 Proteine nach der Erfindung können gereinigt werden, indem man aus den exprimierenden Zellen die gesamte Membranfraktion abtrennt und die Membranen mit einem nicht ionischen Detergens, wie z.B. Triton X-100, extrahiert.
Die MU-1 Proteine können unter Verwendung von Methoden gereinigt werden, die dem Fachmann geläufig sind. Beispielsweise können die MU-1 Proteine nach der Erfindung unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, wie z.B. eines Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationsapparats, konzentriert werden. Nach der Konzentrationsstufe kann das Konzentrat einer Reinigungsmatrix zugeführt werden, z.B. einem Gelfiltrationsmedium. Alternativ kann man ein Anionenaustauschharz verwenden, z.B. eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl- (DEAE) oder Polyethylenimin-(PEI)Gruppen. Die Matrix kann aus Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder anderen Materialien bestehen, die üblicherweise für die Reinigung von Proteinen verwendet werden. Alternativ kann auch ein Kationenaustauschharz benutzt werden. Zu den geeigneten Kationenaustauschharzen zählen verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt (z.B. Säulen aus S-Sepharose^®). Die Reinigung der MU-1 Proteine aus Kulturüberständen kann auch eine oder mehrere Stufen mit Säulen aus solchen Affinitätsharzen wie Concanavalin A-Agarose, Heparin-Toyopearl^® oder Cibacrom Blau 3GA Sepharose^® einschließen; oder durch hydrophobe Interaktionschromatographie unter Verwendung solcher Harze, die z.B. Phenylether-, Butylether- oder Propylethergruppen enthalten, oder durch Immunoaffinitätschromatographie erfolgen. Schließlich kann man auch mit einer oder mehreren Stufen einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Phasenumkehr (RP-HPLC) arbeiten, um die MU-1 Proteine weiter zu reinigen, wobei man hydrophobe RP-HPLC Medien einsetzt, z.B. ein Siliziumdioxid-Gel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen. Weiterhin kann man nach gut bekannten Methoden Affinitätssäulen mit Antikörpern gegen das jeweilige MU-1 Protein zur Reinigung von MU-1 Proteinen verwenden. Einige oder alle der zuvor beschriebenen Reinigungsstufen, in verschiedenen Kombinationen oder mit anderen bekannten Methoden, können ebenfalls verwendet werden, um ein im wesentlichen reines isoliertes rekombinantes Protein herzustellen. Vorteilhaft wird das isolierte MU-1 Protein so weit gereinigt, dass es im wesentlichen frei von anderen aus Säugetieren stammenden Proteinen ist.
Die MU-1 Proteine nach der Erfindung können auch verwendet werden, um Stoffe zu suchen, die an MU-1 binden können. Bindungstests unter Verwendung eines gewünschten bindenden Proteins, immobilisiert oder nicht, sind in der Technik gut bekannt und können für diesen Zweck eingesetzt werden, wobei das MU-1 Protein nach der Erfindung verwendet wird. Suchtests auf der Basis von gereinigten Zellen oder von Proteinen (ohne Zellen) können verwendet werden, um solche Stoffe zu identifizieren. Beispielsweise kann ein MU-1 Protein in gereinigter Form auf einem Trägerstoff immobilisiert werden, und die Bindung von potentiellen Liganden an das gereinigte MU-1 Protein kann gemessen werden.
MU-1 Proteine, aus Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt, können auf einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff aufgebracht und in dieser Form als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können, neben dem MU-1 Protein oder einem Inhibitor und einem Trägerstoff, verschiedene Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Puffermaterialien, Salze, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel sowie andere Materialien enthalten, wie in der Technik gut bekannt ist. Die Bezeichnung „pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Wirkstoffs (oder der aktiven Wirkstoffe) nicht beeinträchtigt. Die Eigenschaften des Trägerstoffs hängen von der An der geplanten Anwendung ab.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Erfindung können auch Zytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Faktoren enthalten, wie z.B. M-CSF, GM-CSF, Il-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, Stammzellenfaktor und Erythropoetin. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch gegen ein Zytokin gerichtete Antikörper enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch thrombolytische oder antithrombolytische Faktoren aufweisen, wie z.B. Plasminogenaktivator und Faktor VIII. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können weiterhin andere entzündungshemmende Stoffe enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und bzw. oder Stoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um einen synergistischen Effekt mit dem darin enthaltenen isolierten MU-1 Protein zu erzeugen oder um Nebenwirkungen zu minimieren, die durch das isolierte MU-1 Protein verursacht werden könnten. Umgekehrt kann ein isoliertes MU-1 Protein in Formulierungen eines bestimmten Zytokins, Lymphokins oder anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder antithrombolytischen Stoffes oder entzündungshemmenden Stoffes enthalten sein, um Nebenwirkungen des Zytokins, Lymphokins oder anderen hämatopoetischen Faktors, des thrombolytischen oder antithrombolytischen Stoffes oder des entzündungshemmenden Stoffes zu minimieren.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung kann die Form eines Liposoms haben, in dem das isolierte MU-1 Protein, zusätzlich zu anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen, mit amphipatischen Stoffen, wie z.B. Lipiden, kombiniert ist, die in Gesamtform (aggregated form) als Micellen, unlösliche Monoschichten, flüssige Kristalle oder lamellare Schichten existieren. Zu den geeigneten Lipiden für liposomale Formulieren zählen, wenn auch nicht ausschließlich, Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäure und ähnliche Stoffe. Die Herstellung solcher liposomaler Formulierungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. offenbart im U.S. Patent Nr. 4,235,871, U.S. Patent Nr. 4,501,728, U.S. Patent Nr. 4,837,028 und U.S. Patent Nr. 4,737,323.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet die Bezeichnung „therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge jeder aktiven Komponente der pharmazeutischen Zusammensetzung oder Methode, die ausreicht, um einen signifikanten Nutzen für den Patienten zu erreichen, d.h. eine Milderung von Symptomen, eine Heilung von seiner Krankheit oder eine Beschleunigung der Heilung. Wenn nur der Wirkstoff allein dem Patienten zugeführt wird, bezieht sich die Bezeichnung auf den Wirkstoff allein. Wenn sich die Bezeichnung auf eine Kombination bezieht, betrifft sie die vereinigten Mengen der Wirkstoffe, die den therapeutischen Effekt bewirken, unabhängig davon, ob die Wirkstoffe in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig zugeführt werden.
Bei der Ausübung des Behandlungsverfahrens oder der Verwendung nach der vorliegenden Erfindung wird einem Säugetier eine therapeutisch wirksame Menge eines MU-1 Proteins zugeführt. Das isolierte MU-1 Protein kann nach dem Verfahren der Erfindung entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien, wie z.B. einer Behandlung mit Zytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen Faktoren, zugeführt werden. Wenn das MU-1 Protein zusammen mit einem oder mehreren Cytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen Faktor(en) eingesetzt wird, kann es entweder gleichzeitig mit dem oder den Cytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen Faktor(en) oder thrombolytischen oder antithrombolytischen Faktor(en) zugeführt werden, oder diese Komponenten können nacheinander (sequentiell) zugeführt werden. Wenn sie sequentiell zugeführt werden, muss der behandelnde Arzt entscheiden, in welcher Reihenfolge das MU-1 Protein in Verbindung mit dem oder den Zytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen Faktor(en) oder thrombolytischen oder antithrombolytischen Faktor(en) eingesetzt wird.
Die Verabreichung von MU-1 Protein, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, oder die Ausübung der Methode nach der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene konventionelle Art und Weise erfolgen, z.B. durch orales Einnehmen oder Inhalieren, durch die Haut (cutaneous), subkutane oder intravenöse Injektion. Die intravenöse Verabreichung an den Patienten wird bevorzugt.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge an MU-1 Protein oral verabfolgt wird, liegt das MU-1 Protein in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers vor. Bei Verabreichung in Tablettenform kann die pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung zusätzlich einen festen Trägerstoff, wie z.B. Gelatine, oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis etwa 95% MU-1 Protein und vorteilhaft von etwa 25 bis etwa 90% MU-1 Protein. Wenn das MU-1 Protein in flüssiger Form verabreicht wird, kann ein flüssiger Trägerstoff, wie z.B. Wasser, Petroleum, Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl oder ein synthetisches Öl, zugesetzt werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische Kochsalzlösung, die Lösung von Dextrose oder eines anderen Zuckers oder ein Glykol, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten. Wenn die pharmazeutische Zusammensetzung in flüssiger Form verabfolgt wird, enthält sie von etwa 0,5 bis 90 Gewichtsprozent MU-1 Protein, vorteilhaft von etwa 1 bis etwa 50% MU-1 Protein.
Wenn eine therapeutisch wirksame Menge eines MU-1 Proteins durch intravenöse, kutane oder subkutane Injektion verabfolgt wird, liegt das MU-1 Protein in Form einer von pyrogenen Stoffen freien, parenteral akzeptablen wässrigen Lösung vor. Die Herstellung solcher parenteral akzeptabler Proteinlösungen gehört hinsichtlich des pH, isotonischer Eigenschaften, Stabilität usw. zum Stand der Technik. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion sollte neben dem MU-1 Protein ein Isotonie erzeugendes Mittel, wie z.B. Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dextrose Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection Lactated Ringer's Injection oder andere in der Technik bekannte Mittel enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach der Erfindung können auch Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Puffer, oder andere dem Fachmann bekannte Stoffe enthalten.
Die Menge des in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen MU-1 Proteins hängt von der Art und der Schwere der zu behandelnden Krankheit ab sowie von der Art der vorhergehenden Behandlungen, denen der Patient unterzogen wurde. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt über die Menge an MU-1 Protein entscheiden, mit der der Patient individuell behandelt wird. Zu Anfang wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen MU-1 Protein verabfolgen und die Reaktion des Patienten beobachten. Dann können größere Dosen MU-1 Protein verabfolgt werden, bis der optimale therapeutische Effekt für den Patienten erreicht ist. Zu diesem Zeitpunkt wird die Dosierung im allgemeinen nicht mehr erhöht. Es wird erwogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Ausübung der Methode nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, von etwa 0,1 μg bis etwa 100 mg MU-1 Protein je kg Körpergewicht enthalten sollten.
Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung variiert in Abhängigkeit von der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, dem Befinden und der potentiell überempfindlichen Reaktion jedes einzelnen Patienten. Es wird erwogen, dass die Dauer jeder Anwendung des MU-1 Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabfolgung liegt. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt über die angemessene Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung entscheiden.
Es wird erwartet, dass die Polynukleotide und Proteine nach der vorliegenden Erfindung sich für eine oder mehrere der in der Folge identifizierten Verwendungen oder biologischen Aktivitäten (einschließlich der mit den hierin zitierten Assays verbundenen Aktivitäten) eignen. Verwendungen oder Aktivitäten, wie sie für die Proteine nach der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden bzw. werden, können durch Verabfolgung oder Verwendung dieser Proteine oder durch Verabfolgung oder Verwendung der Polynukleotide, die für diese Proteine kodieren, realisiert werden (beispielsweise bei Gentherapien oder Vektoren, die sich für die Einführung von DNS eignen).
Zytokin-Aktivität und Aktivität bei der Proliferation/Differenzierung von Zellen
Die Proteine nach der vorliegenden Erfindung können Zytokin-Aktivität, Aktivität bei der Proliferation (entweder induzierend oder inhibierend) oder Differenzierung (wiederum induzierend oder inhibierend) von Zellen zeigen oder können die Produktion von anderen Zytokinen in bestimmten Zellpopulationen induzieren. Viele bis heute entdeckte Proteinfaktoren, einschließlich aller bekannten Zytokine, haben Aktivität in einem oder mehreren Faktor-abhängigen Zellproliferations-Assays gezeigt, und daher dienen diese Assays als ein gut geeignetes Mittel, um Zytokin-Aktivität festzustellen. Die Aktivität eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung wird bestimmt unter Verwendung eines der mehrerer routinemäßig verwendeter Faktor-abhängiger Zellproliferations-Assays für Zelllinien, zu denen, ohne Limitierung hierauf, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/B11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RBS, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e und CMK gehören.
Die Aktivität eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung kann neben anderen Verfahren nach den folgenden Methoden bestimmt werden:
Zu den Assays für T-Zell- oder Thymocytenproliferation zählen ohne Beschränkung hierauf, die in den folgenden Referenzen beschriebenen Assays: Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates sowie Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1 bis 3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); weiterhin Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1882; und Bowman et al., J. Immunol. 152:1756-1761, 1994.
Zu den Assays für die Produktion von Zytokinen und/oder die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymocyten zählen, ohne Beschränkung hierauf, die Assays, die beschrieben werden in: Polyklonal Stimulation of T-Cells, Kruisbeek A.M. und Shevach E.M. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J.E. Coligan et al., Band 1 pp. 3.12.1 bis 3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; und Measurement of Mouse and Human Interferon-?, Schreiber R.D. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.8.1 bis 6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Zu den Assays für die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen und lymphopoetischen Zellen gehören, ohne Beschränkung hierauf, die in den folgenden Referenzen beschriebenen Assays: Measurement of Human and Murine Interleukin-2 and Interleukin-4, Bottomly, K, Davis, L.S. und Lipsky, P.E. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.3.1 bis 6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of Mouse and Human Interleukin-6, Nordan, R. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.6.1 bis 6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of Human Interleukin-11, Bennett, F., Giannetti, J., Clark, S.C. und Turner, K.J. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of Mouse and Human Interleukin-9, Ciarletta, A., Gianotti, J., Clark, S.C. und Turner, K.J. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
Zu den Assays für die Reaktion von T-Zellklonen auf Antigene (die u.a. Proteine, die die Wechselwirkungen von APC mit T-Zellen beeinflussen, ebenso wie direkte T-Zelleneffekte identifizieren, indem sie die Proliferation und die Produktion von Zytokinen messen) gehören, ohne Beschränkung hierauf, die Assays, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates sowie Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines and their Cellular Receptors; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai et al. J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140, 508-512, 1988.
Die Immunantwort stimulierende oder suppressive Aktivität
Ein Protein nach der gegenwärtigen Erfindung kann auch eine immunstimulierende oder immunsuppressive Aktivität aufweisen, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf diejenigen Aktivitäten, für die hierin Assays beschrieben sind. Ein Protein kann für die Behandlung von verschiedenen Immundefekten oder krankheiten brauchbar sein (mit Einschluss von schweren kombinierten Immundefekten (SCID)), z.B. für die Regulierung (hoch oder herunter) des Wachstums und Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten, und ebenso die zytolytische Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen bewirken. Diese Immundefekte können angeboren sein oder durch virale (z.B. mittels HIV), bakterielle oder durch Pilze verursachte Infektionen oder aber durch Autoimmunkrankheiten ausgelöst werden. Genauer gesagt können ansteckende Krankheiten, die durch Viren, Bakterien oder Pilze oder auf andere Weise ausgelöst wurden, durch Verwendung eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung behandelbar sein. Dazu zählen Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobakterien, Leishmania pp., Malaria pp. und verschiedene durch Pilze verursachte Infektionen, wie z.B. Candidiasis. Natürlich kann ein Protein nach der vorliegenden Erfindung in dieser Beziehung auch nützlich sein, wenn eine allgemeine Stärkung des Immunsystems erwünscht ist, das heißt bei der Behandlung von Krebs.
Zu den Autoimmunkrankheiten, die unter Verwendung eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, gehören z.B. Bindegewebekrankheiten, multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungenentzündung, Guillain-Barre Syndrom, autoimmune Thyroiditis, Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Graft-versus-Host Krankheit und autoimmune entzündliche Augenkrankheiten. Ein solches Protein nach der vorliegenden Erfindung kann auch für die Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen nützlich sein, z.B. von Asthma (insbesondere von allergischem Asthma) oder anderen mit der Atmung zusammenhängenden Problemen. Auch in anderen Situationen, in denen eine Unterdrückung des Immunsystems erwünscht ist (z.B. bei Organtransplantationen), kann ein Patient mit einem Protein nach der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
Die MU-1 DNS ist auch der chromosomale Ort für Morbus Crohn. Infolgedessen können Proteine nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Morbus Crohn und andere entzündliche Krankheiten der Eingeweide zu behandeln.
Eine Verwendung der Proteine nach der Erfindung kann auch möglich sein, wenn man die Immunantwort auf verschiedene Weise regulieren will. Man kann sie heruntenegeln, indem man eine bereits im Aufbau befindliche Immunantwort inhibiert oder blockiert. Oder man kann die Induzierung einer Immunantwort von vornherein verhindern. Die Funktionen von aktivierten T-Zellen können inhibiert werden, indem man die Immunantwort der T-Zellen unterdrückt oder indem man spezifische Toleranzen in T-Zellen induziert, oder auf beiderlei Art und Weise. Die Unterdrückung der Immunantwort von T-Zellen ist ganz allgemein ein aktiver, nicht Antigen-spezifischer Prozess, der eine kontinuierliche Einwirkung des unterdrückenden Agens auf die T-Zellen erfordert. Eine Toleranz, bei der ein Ausbleiben der Immunantwort oder eine Anergie in T-Zellen induziert wird, ist von einer Immunosuppresseion dadurch unterscheidbar, dass sie ganz allgemein Antigen-spezifisch ist und andauert, nachdem die Einwirkung des die Toleranz bewirkenden Agens beendet ist. Das Vorliegen von Toleranz kann dadurch demonstriert werden, dass in Abwesenheit des die Toleranz bewirkenden Agens bei erneuter Einwirkung eines spezifischen Antigens die Immunantwort der T-Zellen ausbleibt.
Das Herunterregeln oder Ausschalten einer oder mehrerer Antigen-Funktionen (einschließlich von, aber nicht beschränkt auf B-Lymphozyten-Antigenfunktionen (wie z.B. B7)), beispielsweise die Verhinderung der Synthese von großen Mengen an Lymphokinen durch aktivierte T-Zellen, wird bei Transplantationen von Gewebe, Haut und Organen und bei Graft-versus-Host Krankheit (GVHD) nützlich sein. Beispielsweise sollte die Blockierung der T-Zellenfunktion dazu führen, dass bei Gewebetransplantationen weniger Gewebe zerstört wird. Typischerweise wird bei Gewebetransplantationen die Abstoßung des transplantierten Gewebes dadurch initiiert, dass die T-Zellen es als fremd erkennen, worauf eine Immunreaktion folgt, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines Moleküls vor der Transplantation, das die Wechselwirkung eines Antigens von B-Lymphozyten mit seinem oder seinen natürlichen Liganden auf Immunzellen (wie z.B. die lösliche, monomere Form eines Peptids mit B7-2 Aktivität, allein oder in Verbindung mit einer monomeren Form eines Peptids mit einer Aktivität eines anderen B-Lymphozyten Antigens (wie z.B. B7-3) oder ein blockierender Antikörper) inhibiert oder blockiert, kann dazu führen, dass das Molekül an den oder die natürlichen Liganden auf den Immunzellen bindet, ohne das entsprechende co-stimulierende Signal zu transmittieren. Die so bewirkte Blockierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion verhindert die Synthese von Zytokinen durch Immunzellen, wie z.B. T-Zellen, und unterdrückt somit die Immunantwort. Darüber hinaus kann das Ausbleiben einer Co-stimulation dazu ausreichen, die T-Zellen zu anergisieren (anergize), wodurch in einem Subjekt Toleranz induziert wird. Die Induktion von Langzeittoleranz durch B-Lym-phocyten-Antigene blockierende Reagenzien kann es unnötig machen, diese blockierenden Reagenzien wiederholt zu verabfolgen. Es kann auch erforderlich sein, die Funktion einer Kombination mehrerer B-Lymphozyten-Antigene zu blockieren, um eine ausreichende Immunosuppression- oder -toleranz in einem Patienten zu erreichen.
Die Wirksamkeit eines bestimmten blockierenden Reagenz für die Verhinderung der Abstoßung eines transplantierten Organs oder von GVHD kann durch Verwendung eines Tiermodells abgeschätzt werden, das Vorhersagen für die Wirksamkeit in Menschen gestattet. Beispiele für zweckentsprechende Systeme, die verwendet werden können, schließen allogenische Herztransplantate in Ratten und xenogenische Transplantate von Pankreasinselzellen in Mäusen ein. Beide Modelle sind verwendet worden, um die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig Fusionsproteinen in vivo zu untersuchen, wie von Lenschow et al. in Science 257: 789-792 (1992) und Turka et al. in Proc. Natl. Acad. Sc. U.S.A., 11102-11105 (1992) beschrieben wurde. Weiterhin können Maus-Modelle von GVHD (siehe Paul als Herausgeber von Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, Seiten 846-847) verwendet werden, um die Wirkung der Blockierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion auf die Entwicklung dieser Krankheit in vivo zu bestimmen.
Die Blockierung der Antigenfunktion kann auch für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen therapeutisch brauchbar sein. Viele Autoimmunkrankheiten sind das Ergebnis einer nicht normalen Aktivierung von T-Zellen, die gegen körpereigenes Gewebe reaktiv sind und die die Produktion von Zytokinen und Autoantikörpern fördern, die in die Pathologie dieser Krankheiten involviert sind. Symptome dieser Krankheiten können gemildert oder beseitigt werden, wenn man die Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen verhindert. Reagenzien, die die Co-Stimulation von T-Zellen durch Unterbrechung der Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung von B-Lymphozyten-Antigenen blockieren, können verabfolgt werden, um die Aktivierung von T-Zellen zu inhibieren und die Produktion von Autoantikörpern oder von von T-Zellen abgeleiteten Zytokinen zu verhindern, die in dieses Krankheitsgeschehen involviert sein können. Weiterhin können blockierende Reagenzien eine Antigen-spezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen inhibieren, wodurch eine langfristige Erleichterung für den Patienten erreicht werden könnte. Die Wirksamkeit von blockierenden Reagenzien für die Verhinderung oder Milderung von Autoimmunerkrankungen kann durch Verwendung einer Reihe von gut charakterisierten Tiermodellen für humane Autoimmunkrankheiten bestimmt werden. Zu den Modellen zählen experimentelle autoimmune Autoencephalitis der Maus, systemischer Lupus erythematodes in MKLpr/lpr Mäusen oder NZB Hybridmäusen, autoimmune Kollagenarthritis der Maus, Diabetes mellitus in NOD Mäusen oder BB Ratten und experimentelle Myasthenia gravis der Maus (siehe Paul als Herausgeber von Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, Seiten 840-856).
Die Hochregelung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphocyten-Antigenfunktion) als ein Mittel zur Hochregelung von Immunantworten kann ebenfalls in der Therapie nützlich sein. Die Hochregelung von Immunantworten kann in der Form geschehen, dass eine bestehende Immunantwort verstärkt oder eine neue, anfängliche Immunantwort hervorgerufen wird. Beispielsweise kann die Verstärkung einer Immunantwort durch Stimulierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion im Fall von Viruserkrankungen nützlich sein. Weiterhin könnten systemische virale Krankheiten, wie z.B. Influenza, gewöhnliche Erkältungen und Enzephalitis, durch Verabfolgung von stimulierenden Formen von B-Lymphozyten-Antigenen systemisch gemildert werden.
Alternativ können antivirale Immunantworten in einem infizierten Patienten verstärkt werden, indem man dem Patienten T-Zellen entnimmt, die T-Zellen in vitro mit viralen Antigen-gepulsten APCs, die entweder ein Peptid nach der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder zusammen mit einer stimulierenden Form eines löslichen Peptids nach der vorliegenden Erfindung co-stimuliert und die in vitro aktivierten T-Zellen in den Patienten zurückführt. Ein anderes Verfahren zur Verstärkung von antiviralen Immunantworten würde darin bestehen, dass man infizierte Zellen aus einem Patienten isoliert, sie mit einer Nukleinsäure transfiziert, die für ein Protein nach der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben, kodiert, so dass die Zellen das Protein ganz oder zum Teil auf ihrer Oberfläche exprimieren, und die transfizierten Zellen in den Patienten zurückführt. Die infizierten Zellen würden dann in der Lage sein, ein co-stimulierendes Signal an T-Zellen zu geben und diese dadurch in vivo zu aktivieren.
Bei einer anderen Anwendung kann die Hochregelung oder Verstärkung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphozyten-Antigenfunktion) nützlich bei der Induzierung einer Tumorimmunität sein. Tumorzellen (wie z.B. Sarkom-, Melanom-, Lymphom-, Leukämie-, Neuroblastom- oder Karzinomzellen), die mit einer Nukleinsäure transfiziert sind, die für mindesteins ein Protein nach der vorliegenden Erfindung kodiert, können einem Patienten verabfolgt werden, um eine Tumor-spezifische Toleranz dieses Patienten zu überwinden. Die Tumorzelle kann so transfiziert werden, dass sie eine Kombination von Peptiden exprimiert, wenn dies gewünscht wird. Beispielsweise können von einem Patienten entnommene Tumorzellen ex vivo mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, der die Expression eines Peptids mit B7-2-artiger Aktivität allein oder in Kombination mit einem Peptid mit B7-1-artiger Aktivität und/oder B7-3-artiger Aktivität bewirkt. Die transfizierten Tumorzellen werden in den Patienten zurückgeführt, um die Expression der Peptide auf der Oberfläche der Zelle zu bewirken. Alternativ können Techniken der Gentherapie angewandt werden, um Tumorzellen zur Transfizierung in vivo zu ermitteln.
Die Anwesenheit eines Peptids nach der vorliegenden Erfindung mit der Aktivität eines oder mehrerer B-Lymphozyten-Antigene auf der Oberfläche der Tumorzelle ergibt das nötige costimulierende Signal an T-Zellen, um eine durch T-Zellen vermittelte Immunantwort gegen die Tumorzellen zu induzieren. Weiterhin können Tumorzellen, denen MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle fehlen oder die nicht genügende Mengen an MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle reexprimieren, mit Nukleinsäure transfiziert werden, die ganz oder teilweise (z.B. beschränkt auf die cytoplasmatische Domäne) für ein MHC Klasse I-a-Kettenprotein und ein β₂-Microglobulin-Protein oder für ein MHC Klasse IIa-Kettenprotein und ein MHC Klasse II β-Kettenprotein kodieren, wodurch MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Proteine auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Die Expression der geeigneten MHC der Klassen I oder II in Verbindung mit einem Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens (wie z.B. B7-1, B7-2 oder B7-3) induziert eine durch T-Zellen vermittelte Immunantwort gegen die transfizierte Tumorzelle. Wahlweise kann ein Gen, das für ein Antisensekonstrukt kodiert, welches die Expression eines mit MHC der Klasse II assoziierten Proteins blockiert, wie z.B. die invariante (invariant) Kette, ebenfalls mit einer DNS co-transfiziert werden, die für ein Peptid codiert, das die Aktivität eines B-Lymnphozyten-Antigens zeigt, um die Präsentation von Tumor-assoziierten Antigenen zu fördern und eine Tumor-spezifische Immunität zu induzieren. Die Induzierung einer durch T- Zellen vermittelten Immunantwort in einem menschlichen Patienten kann somit ausreichend sein, um die Tumor-spezifische Toleranz des Patienten zu überwinden.
Die Aktivität eines Proteins nach der Erfindung kann, neben anderen Verfahren, mittels der folgenden Methoden bestimmt werden:
Zu den geeigneten Assays für Zytotoxizität gegen Thymus- und Milzzellen zählen, wenn auch nicht ausschließlich, diejenigen, die beschriebenen sind in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates und Wiley Interscience (Kapitel 3, InVitro Assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1 bis 3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 78: 2488-2492; Hemnan et al., J. Immunol. 128:1968.1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J.Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2488-2492, 1981; Herrman et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowmanet et al., J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991 und Brown et al., J. Immunology 153:3079-3092, 1994.
Zu den Assays für von T-Zellen abhängige Immunglobulinantworten und Isotypwechsel (isotype switching) (wodurch u.a. Proteine identifiziert werden, die von T-Zellen abhängige Antikörperantworten modulieren und die Th1/Th2-Profile beeinflussen) gehören, ohne Beschränkung darauf, diejenigen, die beschrieben wurden von Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; und Assays für die Funktion von B-Zellen: In vitro Antibody Production, Mond J.J. und Brunswick, M. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J.E. Coligan et al., Band 1, Seiten 3.8.1 bis 3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Zu den gemischten Lymphozytenreaktions (MLR)-Assays (welche u.a. Proteine identifizieren, die vorwiegend Th1- und CTL-Antworten generieren) zählen, aber nicht ausschließlich, diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von L. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W.
Strober, Verlag Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunology Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; und Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992.
Von dendritischen Zellen abhängige Assays identifizieren u.a. Proteine, die von dendritischen Zellen exprimiert werden und naive (naive) T-Zellen aktivieren. Zu diesen Assays gehören, ohne Beschränkung hierauf, diejenigen, die beschrieben sind in: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990.
Zu den Assays für das Überleben oder die Apoptose von Lymphocyten (die u.a. Proteine identifizieren, welche die Homöostase von Lymphozyten regulieren) zählen, ohne Beschränkung hierauf, diejenigen, die beschrieben sind in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Onkology 1:639-648, 1992.
Assays für Proteine, die die frühen Stadien der Reifung und Entwicklung von T-Zellen beeinflussen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben sind in: Anica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, q995; und Toki et al., Proc. Natl. Acad. Schi. USA 88:7548-7551, 1991.
Hämatopoese regulierende Aktivität
Proteine nach der vorliegenden Erfindung können für die Regulierung von Hämatopoese und daher für die Behandlung von myeloiden oder lymphoiden Zelldefekten nützlich sein. Selbst marginale biologische Aktivitäten zur Unterstützung von Kolonie-bildenden Zellen oder von Faktor-abhängigen Zelllinien sind ein Anzeichen für eine Beteiligung an der Regulierung von Hämatopoese, z.B. durch Unterstützung des Wachstums und der Vermehrung von erythroiden Vorläuferzellen, allein oder in Verbindung mit anderen Zytokinen, wodurch z.B. eine Brauchbarkeit für die Behandlung von verschiedenen Anämien oder zur Verwendung in Verbindung mit Strahlen- oder Chemotherapie zur Stimulierung der Produktion von erythroiden Vorläufern und/oder erythroiden Zellen angezeigt wird; durch Unterstützung des Wachstums und der Vermehrung von myeloiden Zellen, wie z.B. Granulocyten und Monocyten oder Makrophagen (d.h. eine traditionelle CSF Aktivität), was z.B. in Verbindung mit einer Chemotherapie nützlich ist, um eine nachfolgende Myelosuppression zu verhindern oder zu behandeln; durch Unterstützung des Wachstums und der Vermehrung von Megakaryocyten und dementsprechend von Blutplättchen, was die Verhinderung oder Behandlung verschiedener Blutplättchenkrankheiten, wie z.B. Thrombozytopenie, erlaubt, oder allgemein zur Verwendung an Stelle von oder zusätzlich zu Blutplättchentransfusionen; und/oder durch Unterstützung des Wachstums und der Vermehrung von hämatopoetischen Stammzellen, die zu jeder und allen der zuvor erwähnten hämatopoetischen Zellen zu reifen vermögen und daher bei verschiedenen Stammzellenkrankheiten (wie z.B. bei Krankheiten, die üblicherweise durch eine Transplantation behandelt werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf aplastische Anämie und paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie) therapeutische Verwendung finden können, ebenso wie bei der Wiederauffüllung des Vorrats an Stammzellen nach Strahlungs- und/oder Chemotherapie, entweder in vivo oder ex vivo (d.h. in Verbindung mit Knochenmarktransplantation oder Transplantation von peripheren Vorläuferzellen (homologen oder heterologen)) als normale Zellen oder genetisch veränderte Zellen zur Gentherapie.
Die Aktivität eines Proteins nach der Erfindung kann u.a. mittels der folgenden Methoden gemessen werden:
Geeignete Assays für die Proliferation und Differenzierung von verschiedenen hämatopoetischen Zellen sind zuvor zitiert worden.
Zu den Assays für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (die u.a. Proteine identifizieren, welche die embryonale Differenzierungshämatopoese beeinflussen) zählen, jedoch nicht ausschließlich, diejenigen, die beschrieben sind in: Johansson et al., Cellular Biology, 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13:473-486, 1993; und McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915, 1993.
Zu den Assays für das Überleben und die Differenzierung von Stammzellen (die u.a. Proteine identifizieren, welche die Lymphocyten-Hämatopoese regulieren) zählen, ohne Beschränkung hierauf diejenigen, welche beschrieben sind in: Methylcellulose Colony Forming Assays, Freshney, M.G. in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. und Briddell, R.A., in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 23-39, Wiley-Liss, Inc. Newe York, N.Y. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 1-21, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994; Long-term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. und Allen, T. in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994; Long-term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994.
Verwendbarkeit und Nutzen in der Forschung
Durch die vorliegende Erfindung verfügbar gewordene Polynukleotide können in der Forschung für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Die Polynukleotide können verwendet werden, um rekombinante Proteine zur Analyse, Chrakterisierung oder therapeutischen Verwendung zu exprimieren; als Marker in Geweben, in denen das entsprechende Protein bevorzugt exprimiert wird (entweder der Konstitution entsprechend oder in einem bestimmten Stadium der Differenzierung oder Entwicklung des Gewebes oder im Krankheitsfall); als Molekulargewichtsmarker auf Southern Gelen; als Marker oder Anhängsel (tags) von Chromosomen (wenn diese markiert sind), um Chromosomen zu identifizieren oder um zugehörige (related) Genpositionen zu kartieren; zum Vergleich mit endogenen DNS-Sequenzen von Patienten, um potentielle genetische Krankheiten zu identifizieren; als Sonden zur Hybridisierung mit und somit zur Entdeckung von neuen, verwandten DNS-Sequenzen; als Informationsquelle für die Konstruktion von Primern für genetische Fingerabdrücke; als Sonden zum Aussondern von bekannten Sequenzen bei einem Verfahren zur Entdeckung neuer Polynukleotide; zur Selektion und Herstellung von Oligomeren zur Anbringung auf einem „Genchip" oder anderem Träger, einschließlich zur Untersuchung von Expressionsmustern; und als Antigen zur Generierung von Anti-DNS-Antikörpern oder um eine andere Immunantwort hervorzurufen. Wenn das Polynukleotid für ein Protein kodiert, das erwiesenermaßen oder möglicherweise an ein anderes Protein bindet (beispielsweise in einer Wechselwirlung zwischen Rezeptor und Ligand), kann das Polynukleotid auch in dem Wechselwirkungsfallen-Assay (interaction trap assay) eingesetzt werden, der von Gyuris et al. in Cell 75:791-803, 1993 beschrieben wurde und Polynukleotide zu identifizieren gestattet, die für das andere Protein kodieren, an das das Protein bindet, oder um Inhibitoren für die Bindung zu identifizieren.
Die Proteine, die durch die vorliegende Erfindung verfügbar geworden sind, können in ähnlicher Weise in einem Assay zur Bestimmung von biologischer Aktivität verwendet werden, einschließlich der biologischen Aktivitäten eines Satzes (panel) von mehreren Proteinen zur Durchmusterung mit hohem Durchsatz. Die Proteine können weiterhin verwendet werden, um Antikörper zu generieren oder eine andere Immunantwort hervorzurufen; als Reagenz (mit Einschluss des markierten Reagenz) in einem Assay zur Bestimmung des Gehalts an dem Protein in biologischen Flüssigkeiten; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Protein bevorzugt exprimiert wird (entweder der Konstitution entsprechend oder in einem bestimmten Stadium der Differenzierung oder Entwicklung oder im Krankheitsfall); und natürlich um entsprechende Rezeptoren und Liganden zu isolieren. Wenn das Protein erwiesenermaßen oder potentiell an ein anderes Protein bindet (wie z.B. bei einer Wechselwirkung von Rezeptor und Ligand), kann das Protein verwendet werden, um das andere Protein zu identifizieren, an das es bindet, oder um Inhibitoren für die Wechselwirkung zu identifizieren. Proteine, die an dieser Bindungswechselwirkung teilnehmen, können auch verwendet werden, um Peptid- oder Small-Molecule-Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu suchen.
Jede oder alle dieser Verwendungen in der Forschung kann bzw. können bis zum Reagenz oder Kit für den kommerziellen Einsatz als Forschungswerkzeuge entwickelt werden.
Verfahren zur Nutzung der zuvor aufgeführten Verwendungen sind dem Fachmann gut bekannt. Zu den Druckschriften, die solche Verfahren offenbaren, zählen, ohne Beschränkung hierauf, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, herausgegeben von Sambrook, J., E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989; und „Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, herausgegeben von Berger, S.L. und A.R. Kimmel, 1987.
Verwendungen auf dem Gebiet der Nahrungsmittel
Polynukleotide und Proteine nach der vorliegenden Erfindung können auch als Quellen für Nahrungsmittel oder Nahrungsergänzungsprodukte Verwendung finden. Zu diesen Verwendungen zählen, jedoch nicht ausschließlich, die Verwendung als zusätzliches Protein oder zusätzliche Aminosäure oder als Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff oder Kohlenhydrate. In solchen Fällen können die Proteine oder Polynukleotide nach der Erfindung der Nahrung für einen bestimmten Organismus zugesetzt oder als getrennte feste oder flüssige Zubereitung verabreicht werden, wie z.B. in Form von Pulver, Pillen, Lösungen, Suspensionen oder Kapseln. Im Falle von Mikroorganismen können die Proteine oder Polynukleotide nach der Erfindung dem Medium zugesetzt werden, in dem oder auf dem der Mikroorganismus kultiviert wird.
MU-1 Proteine nach der Erfindung können auch verwendet werden, um Tiere zu immunisieren, um polyklonale und monoklonale Antikörper herzustellen, die mit dem MU-1 Protein spezifisch reagieren und die die Bindung von Liganden an Rezeptoren inhibieren können. Solche Antikörper können erhalten werden, indem man als Immunogen das gesamte MU-1 oder Fragmente davon als Antigen benutzt. Kleinere Fragmente von MU-1 können auch verwendet werden, um Tiere zu immunisieren. Die als Immunogen eingesetzten Peptide können zusätzlich einen Cysteinrest am Carboxy-Terminus aufweisen und sind mit einem Hapten konjugiert, z.B. mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH). Weitere Peptidimmunogene können erzeugt werden, indem man Tyrosinmoleküle durch sulfatierte Tyrosinmoleküle ersetzt. Methoden zur Synthese solcher Peptide sind in der Technik gut bekannt und z.B. beschrieben von R.P. Merryfield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963; und J.L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211:10, 1987.
Neutralisierende oder nicht neutralisierende Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper), die an MU-1 Proteine binden, können auch brauchbare Therapeutika für Tumore sein und auch zur Behandlung der zuvor beschriebenen Zustände dienen. Diese neutralisierenden monoklonalen Antikörper können in der Lage sein, die Bindung von Liganden an die MU-1-Rezeptorenkette zu blockieren.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1; (b) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 von Nukleotid 238 bis Nukleotid 1852; (c) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 von Nukleotid 301 bis Nukleotid 1852; (d) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 von Nukleotid 301 bis Nukleotid 945 oder Nukleotid 238 bis Nukleotid 945; (e) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der Nukleotidsequenz, die in einem der Anspruchsteile (a)-(d) spezifiziert ist, infolge der Degeneration des genetischen Codes abweicht; und (f) einer Nukleotidsequenz, die für ein Spezieshomolog der Sequenz gemäß SEQ ID NO:2 kodiert, wobei besagte Nukleotidsequenz für ein Protein kodiert, welches die biologische Aktivität des MU-1-Proteins, wie in SEQ ID NO:2 dargestellt, in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzt.
Das Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei besagte Nukleotidsequenz funktionell mit einer Sequenz, die die Expression kontrolliert, verknüpft ist.
Eine Wirtszelle, die mit einem Polynukleotid gemäß Anspruch 2 transformiert ist.
Die Wirtszelle gemäß Anspruch 3, wobei besagte Zelle eine Säugerzellen ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines MU-1-Proteins, wobei besagtes Verfahren (a) das Wachstum einer Kultur aus der Wirtszelle gemäß Anspruch 3 in einem geeigneten Kulturmedium; und (b) die Reinigung des MU-1-Proteins aus der Kultur umfasst.
Ein isoliertes MU-1-Protein umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2; (b) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 538; (c) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 236; (d) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 1 bis 236; (e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a)-(d), die die biologische Aktivität des MU-1-Proteins gemäß (a)-(d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzen; und (f) einer Aminosäuresequenz, die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit besitzt, unter hoch stringenten Bedingungen von 0.1 × SSC bei 65°C mit der Nukleotidsequenz, die in einem der Ansprüche 1(a)-(c) spezifiziert ist, oder mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 von Nukleotid 301 bis Nukleotid 945 zu hybridisieren.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein gemäß Anspruch 6 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Ein Antikörper, der spezifisch mit einem Protein gemäß Anspruch 6 reagiert.
Der Antikörper gemäß Anspruch 8, wobei der Antikörper ein neutralisierender Antikörper ist.
Der Antikörper gemäß den Ansprüchen 8 oder 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Eine Zusammensetzung umfassend einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10.
Ein isoliertes Polynukleotid umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Peptid oder ein Protein kodiert, welches eine Aminosäuresequenz bestehend aus der Gruppe ausgewählt aus: (a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2; (b) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 538; (c) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 22 bis 236; (d) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 von den Aminosäuren 1 bis 236; und (e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a)-(d), die die biologische Aktivität des Peptids oder Proteins gemäß (a)-(d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten besitzen, umfasst.
Das Protein gemäß Anspruch 6, wobei besagte Aminosäuresequenz Teil eines Fusionsproteins ist.
Das Protein gemäß Anspruch 13, wobei besagte Aminosäuresequenz an ein Fc-Fragment fusioniert ist.
Das Protein gemäß Anspruch 14, wobei besagte Aminosäuresequenz über Linker-Sequenzen an besagtes Fc-Fragment fusioniert ist.
Das Protein gemäß einem der Ansprüche 6 oder 13 bis 15, oder der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, zur Verwendung in der Therapie.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 16 zur dort spezifizierten Verwendung, wobei besagtes Protein oder besagter Antikörper zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, einer(s) allergischen Reaktion oder Zustandes oder einer Gewebe-, Haut- oder Organtransplantationsabstoßung oder Transplantat-Wirt-Reaktion dient.
Verwendung des Proteins gemäß einem der Ansprüche 6 oder 13 bis 15, oder der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, einer(s) allergischen Reaktion oder Zustandes oder einer Gewebe-, Haut- oder Organtransplantationsabstoßung oder Transplantat-Wirt-Reaktion.
Der Antikörper gemäß den Ansprüchen 16 oder 17 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Antikörpers gemäß Anspruch 18, wobei der Antikörper ein neutralisierender monoklonaler Antikörper ist, der die Fähigkeit besitzt, die Bindung eines Liganden an die MU-1-Rezeptorkette, die in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, zu blockieren.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 17 oder 19 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Proteins oder des Antikörpers gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei besagte Autoimmunerkrankung eine ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bindegewebserkrankung, multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematosus, rheumatoider Arthritis, autoimmuner pulmonaler Entzündung, Guillain-Barre-Syndrom, autoimmuner Thyroiditis, insulin-abhängigem Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-Wirt-Reaktion, autoimmuner entzündlicher Augenerkrankung und entzündlicher Darmerkrankung, insbesondere Morbus Crohn.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 20 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Proteins oder des Antikörpers gemäß Anspruch 20, wobei besagte Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 20 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Proteins oder des Antikörpers gemäß Anspruch 20, wobei besagte Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematosus ist.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 20 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Proteins oder des Antikörpers gemäß Anspruch 20, wobei besagte Autoimmunerkrankung entzündliche Darmerkrankung, insbesondere Morbus Crohn, ist.
Das Protein oder der Antikörper gemäß Anspruch 17 oder 19 zur dort spezifizierten Verwendung oder die Verwendung des Proteins oder des Antikörpers gemäß Anspruch 18 oder 19, wobei besagter) allergischer) Reaktion oder Zustand Asthma oder ein anderes respiratorisches Problem ist.