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Diese
Anmeldung ist eine Continuation-in-part der Anmeldung US 08/504,032
(nicht erteilt) und eine Continuation-in-part von
US 5,707,829 .
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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft humane CTLA-8 Proteine, für derartige
Proteine kodierende Nukleinsäuren,
und die Verwendung davon zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
zur Behandlung von Krankheiten, wie in Anspruch 11 angegeben.
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Hintergrund
der Erfindung
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Cytokine
sind sezernierte Proteine, die auf spezifische hämopoetische Zielzellen wirken,
um ein Differenzierungsereignis hervorzurufen, oder auf andere Zielzellen,
um eine besondere physiologische Reaktion zu induzieren, wie etwa
die Sezernierung von Proteinen, welche für eine Entzündung charakteristisch sind.
Cytokine, verschiedentlich auch als Lymphokine, Hämopoetine,
Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren und dergleichen bekannt,
können
wichtige therapeutische Mittel sein, insbesondere für Krankheiten
oder Zustände, bei
denen eine spezifische T-Zell-Population abgereichert ist. Beispielsweise
sind Erythropoietin, G-CSF sowie GM-CSF für die Behandlung von Anämie bzw.
Leukopenie wichtig geworden. Andere Cytokine wie etwa Interleukin-3,
Interleukin-6, Interleukin-11 und Interleukin-12 sind viel versprechend
für die
Behandlung von Zuständen
wie etwa Thrombozytopenie und eine Modulation der Immunreaktion.
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Aus
diesen Gründen
wurden erhebliche Forschungsanstrengungen in der Suche nach neuen
Cytokinen und der Klonierung der für sie kodierenden DNA unternommen.
In der Vergangenheit wurden neue Cytokine identifiziert durch Testen
einer besonderen Zelle wie etwa einer Knochenmarkszelle auf eine
messbare Reaktion, wie etwa Proliferation. Die Suche nach neuen
Cytokinen war somit durch die zur Verfügung stehenden Assays beschränkt, und
wenn ein neues Cytokin eine Aktivität hat, welche durch einen bekannten
Assay nicht gemessen werden kann, bleibt das Cytokin unauffindbar.
In einem neueren Ansatz wurden für
Cytokine kodierende cDNA nachgewiesen durch die Verwendung der Polymerasekettenreaktion
(PCR) und von Oligonukleotidprimern, die eine Homologie zu gemeinsamen
Motiven von bekannten Cytokinen oder deren Rezeptoren aufweisen.
Der PCR-Ansatz ist ebenfalls durch die Notwendigkeit einer Kenntnis
von zuvor klonierten Cytokinen in der gleichen Proteinfamilie beschränkt. Cytokine
wurden auch durch die Verwendung von subtraktiver Hybridisierung
zum Konstruieren und Screenen von cDNA-Bibliotheken kloniert, oder
sie könnten
potentiell kloniert werden durch die Verwendung von PCR, gefolgt
von Gelelektrophorese, um differentiell exprimierte Gene nachzuweisen.
Die subtraktiven Hybridisierungsmethoden beruhen auf der Annahme,
dass die Cytokin-mRNA diejenigen sind, welche differentiell exprimiert
werden, und diese Methoden erfordern keine Vorabkenntnis der interessierenden
Sequenz. Viele Cytokine könnten
jedoch von mRNA kodiert werden, welche nicht differentiell exprimiert
werden, und sind somit durch die Verwendung dieser Methoden nicht
nachweisbar.
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Es
wäre wünschenswert,
neue Methoden zur Identifizierung von neuen Cytokinen und anderen
sezernierten Faktoren zu entwickeln, und die für sie kodierenden Polynukleotide
zu isolieren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Bei
der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurden Verfahren verwendet,
die selektiv Polynukleotide identifizieren, welche für sezernierte
Proteine kodieren. Ein derartiges Polynukleotid wurde isoliert,
das für "humanes CTLA-8" kodiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung
sind Polynukleotide, die für
humanes CTLA-8 und aktive Fragmente davon kodieren, offenbart. "CTLA-8" wird in der vorliegenden
Beschreibung verwendet um sowohl Proteine als auch Polynukleotide,
die für
diese Proteine kodieren, zu bezeichnen, und um Proteine und Polynukleotide
aus allen Säugerspezies
zu bezeichnen.
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In
einer bestimmten Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit,
umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus:
- (a) der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:
1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544,
- (b) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der in (a) definierten
Nukleotidsequenz infolge von Degeneriertheit des genetischen Codes
abweicht, wobei die Sequenz für
humanes CTLA-8 Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2
kodiert.
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Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid bereit, umfassend
eine allelische Variante der Nukleotidsequenz, welche SEQ ID NO:
1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544 umfasst, wobei die Nukleotidsequenz
für ein
CTLA-8 Protein mit CTLA-8 Aktivität kodiert, welche definiert
ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3,
IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität.
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Bevorzugt
kodiert das erfindungsgemäße Polynukleotid
für ein
Protein mit CTLA-8 Aktivität.
In anderen Ausführungsformen
ist das Polynukleotid operativ mit einer Expressionskontrollsequenz
verknüpft.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen
ist das Polynukleotid in einem zur in vivo Expression in einem Säuger geeigneten
Vektor enthalten. Polynukleotide, welche die Nukleotidsequenz von
SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 55 bis Nukleotid 544, die Nukleotidsequenz
von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 139 bis Nukleotid 544, oder die Nukleotidsequenz
von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 86 bis Nukleotid 544 umfassen, sind
besonders bevorzugt.
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Es
werden auch Wirtszellen bereitgestellt, die mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid
transformiert sind, umfassend Säugerzellen.
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Es
werden auch Verfahren zur Herstellung eines humanen CTLA-8 Proteins
bereitgestellt, wobei die Verfahren umfassen:
- (a)
Anziehen einer Kultur der erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten
Kulturmedium, und
- (b) Reinigen des humanen CTLA-8 Proteins aus der Kultur.
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Es
wird auch ein isoliertes humanes CTLA-8 Protein bereitgestellt,
umfassend eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2,
- (b) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure
11 bis 163,
- (c) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure
29 bis 163,
- (d) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure
31 bis 163, und
- (e) Fragmenten von (a), (b), (c) oder (d) mit CTLA-8 Aktivität, welche
definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung
von γ-IFN,
IL-3, IL-6, IL-8
oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische
Aktivität.
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Proteine,
welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 umfassen und die Sequenz von Aminosäure 29 bis
163, von Aminosäure
31 bis 163, oder von Aminosäure
11 bis 163 von SEQ ID NO: 2 umfassen, sind besonders bevorzugt.
Bevorzugt hat das Protein CTLA-8 Aktivität. Pharmazeutische Zusammensetzungen,
umfassend ein erfindungsgemäßes CTLA-8
Protein und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, werden ebenfalls bereitgestellt.
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Es
sind auch Zusammensetzungen offenbart, welche einen Antikörper umfassen,
der spezifisch mit einem erfindungsgemäßen humanen CTLA-8 Protein
reagiert.
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Die
Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend
ein erfindungsgemäßes humanes
CTLA-8 Protein und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, bereit.
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CTLA-8
aus Ratte und aktive Fragmente davon (d.h. mit CTLA-8 Aktivität) können ebenfalls
in derartigen Behandlungsverfahren verwendet werden. Bevorzugt wird
das Protein aus Ratte als eine Zusammensetzung verabreicht, umfassend
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Protein, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 4,
- (b) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 4 von Aminosäure
18 bis 150, und
- (c) Fragmenten von (a) oder (b) mit CTLA-8 Aktivität.
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Herpesvirus
Saimiri ORF 13, hierin als Herpes CTLA-8 bezeichnet, und aktive
Fragmente davon (d.h. mit CTLA-8 Aktivität) und aktive Fragmente davon
können
ebenfalls in derartigen Behandlungsverfahren verwendet werden. Bevorzugt
wird das Herpes CTLA-8 Protein als eine Zusammensetzung verabreicht,
umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Protein, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 6,
- (b) der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 6 von Aminosäure
19 bis 151, und
- (c) Fragmenten von (a) oder (b) mit CTLA-8 Aktivität.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers bereit,
umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer
Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und
IL-17 oder ein aktives Fragment davon.
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Die
Erfindung stellt auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen
Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
umfassend ein humanes CTLA-8 Protein, zur Herstellung eines Arzneimittels
für die
Inhibition von Angiogenese, Inhibition von Wachstum oder Proliferation
von vaskulären
Endothelzellen, Inhibition von Tumorwachstum, Inhibition von Angiogenese-abhängigem Gewebewachstum,
Proliferation von myeloischen Zellen oder Vorläufern, Proliferation von erythroiden
Zellen oder Vorläufern,
Proliferation von lymphoiden Zellen oder Vorläufern, Induktion einer Produktion
von IFNγ,
Induktion einer Produktion von IL-3 und Induktion einer Produktion
von GM-CSF bereit.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Vergleich von homologen Regionen der Aminosäuresequenzen von humanem CTLA-8 (bezeichnet
als "B18_F1"), CTLA-8 aus Ratte
(bezeichnet als "Musctla8") und Herpes CTLA-8
(bezeichnet als "Hsvie_2).
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2 bildet
Autoradiogramme ab, welche die Expression von humanem CTLA-8 in COS-Zellen zeigen.
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3 präsentiert
Daten, welche die Fähigkeit
von humanem CTLA-8, die Angiogenese zu inhibieren, betreffen.
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Die 4 und 5 präsentiert
Daten, welche die Fähigkeit
von humanem CTLA-8, hämopoetische Aktivität zu erzeugen
oder zu induzieren, betreffen.
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Die 6 und 7 präsentieren
Daten, welche die Fähigkeit
von humanem CTLA-8, die Produktion von IL-6 und IL-8 zu induzieren,
zeigen.
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Ausführliche
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
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Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben ein Polynukleotid, das
für ein
humanes CTLA-8 Protein kodiert, identifiziert und bereitgestellt.
SEQ ID NO: 1 stellt die Nukleotidsequenz einer cDNA bereit, welche für das humane
CTLA-8 Protein kodiert. SEQ ID NO: 2 stellt die Aminosäuresequenz
des humanen CTLA-8 Proteins bereit. Alternativ kann das Startmethionin
bei Aminosäure
11 von SEQ ID NO: 2 sein. Auf Basis Amino-terminaler Sequenzierung
wird angenommen, dass die reife Proteinsequenz an Aminosäure 31 von
SEQ ID NO: 2 beginnt (kodiert durch die mit Nukleotid 146 von SEQ
ID NO: 1 beginnende Sequenz).
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Die
Region von Aminosäure
29 bis Aminosäure
163 von humanem CTLA-8 (SEQ ID NO: 2) zeigt eine erhebliche Homologie
zu Abschnitten von CTLA-8 aus Ratte (Aminosäuren 18 bis 150 von SEQ ID
NO: 4) und Herpesvirus Saimiri ORF 13 ("Herpes CTLA-8") (Aminosäuren 19 bis 151 von SEQ ID
NO: 5). Eine für
CTLA-8 aus Ratte kodierende cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3 aufgelistet,
und ihre entsprechende Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 4 angegeben. Eine für Herpes CTLA-8 kodierende
cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 5 aufgelistet und ihre entsprechende
Aminosäuresequenz
ist in SEQ ID NO: 6 angegeben. Die Homologie zwischen CTLA-8 aus
Ratte und Herpes CTLA-8 wurde von Rouvier et al., J. Immunol. 1993,
150, 5445–5456 veröffentlicht.
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Die
Anmelder hatten zuvor fälschlicherweise
festgestellt, dass die Ratte-Sequenzen
von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 CTLA-8 aus Maus entsprächen. Das
humane CTLA-8 (B18) der Anmelder weist ebenfalls eine Homologie
zu der tatsächlichen
CTLA-8 Sequenz aus Maus auf.
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Golstein
et al. (WO 95/18826; Fossiez et al., Microbial Evasion and Subversion
of Immunity 544: 3222 (Zusammenfassung)) haben ebenfalls über eine
Spezies berichtet, die sie anfänglich
als "humanes CTLA-8" identifizierten.
Eine Untersuchung der Sequenz der Spezies von Golstein et al. und
der humanen CTLA-8 Sequenz (B18) der vorliegenden Erfindung zeigt
jedoch rasch, dass dies zwei unterschiedliche Proteine sind, obwohl
sie zueinander homolog sind und zu CTLA-8 aus Ratte und Herpes CTLA-8,
hierin identifiziert. Die Spezies von Golstein et al. wurde nunmehr
zu Interleukin-17 (IL-17) umbenannt.
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Aufgrund
der Homologie zwischen dem humanen CTLA-8 (B18) der Anmelder und
IL-17 wird erwartet, dass diese Proteine manche Aktivitäten gemeinsam
haben.
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Es
ist auch vorläufig
bestimmt worden, dass humanes CTLA-8 (B18) bei Expression Homodimere
bildet. Als ein Ergebnis können
humane CTLA-8 Proteine Aktivität
entweder in der monomeren oder der dimeren Form aufweisen. Humane
CTLA-8 Proteine können
auch als Heterodimere mit CTLA-8
Protein aus Ratte und Herpes CTLA-8 Protein, und mit humanem IL-17
produziert werden. Es wird erwartet, dass diese Heterodimere Aktivitäten der
Proteine, aus denen sie zusammengesetzt sind, aufweisen.
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Formen
von humanem CTLA-8 Protein mit einer Länge von weniger als Volllänge werden
von der vorliegenden Erfindung umfasst, und können produziert werden durch
Expression eines entsprechenden Fragments des für humanes CTLA-8 Protein kodierenden
Polynukleotids (SEQ ID NO: 1). Diese entsprechenden Polynukleotidfragmente
sind ebenfalls ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Modifizierte
Polynukleotide wie vorstehend beschrieben können durch molekularbiologische
Standardtechniken hergestellt werden, umfassend Stellen-gerichtete
Mutagenesemethoden, die in der Technik bekannt sind, oder durch
die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung geeigneter Oligonukleotidprimer.
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Im
Sinne der vorliegenden Erfindung hat ein Protein "CTLA-8 Aktivität", wenn es (1) in
einem Faktor-abhängigen
Zellproliferationsassay biologische Aktivität aufweist (bevorzugt in einem
Assay, in dem das Volllänge-CTLA-8
der entsprechenden Spezies aktiv ist) (umfassend ohne Einschränkung die
nachstehend beschriebenen Assays), oder (2) Expression oder Sezernierung
von γ-IFN
induziert, oder (3) chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität in einem
Chemoattraktionsassay oder einem Chemotaxisassay aufweist (bevorzugt
in einem Assay, in dem das Volllänge-CTLA-8
der entsprechenden Spezies aktiv ist), oder (4) Expression oder
Sezernierung von IL-3 oder GM-CSF
induziert.
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Humanes
CTLA-8 Protein oder Fragmente davon mit CTLA-8 Aktivität können an
Trägermoleküle wie etwa
Immunglobuline fusioniert werden. Beispielsweise kann humanes CTLA-8
Protein durch "Linker"-Sequenzen and den
Fc-Abschnitt eines
Immunglobulins fusioniert werden.
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Die
Erfindung umfasst auch allelische Varianten der in SEQ ID NO: 1
angegebenen Nukleotidsequenz, d.h. natürlich vorkommende alternative
Formen des isolierten Polynukleotids von SEQ ID NO: 1, welche ebenfalls
für humanes
CTLA-8 oder CTLA-8 Proteine mit CTLA-8 Aktivität kodieren. Ebenfalls sind
isolierte Polynukleotide von der Erfindung umfasst, welche an die
in SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleotidsequenz unter hoch stringenten
(0,2 × SSC
bei 65°C),
stringenten (z.B. 4 × SSC
bei 65°C
oder 50% Formamid und 4 × SSC
bei 42°C),
oder relaxierten Bedingungen (4 × SSC bei 50°C oder 30–40% Formamid
und 4 × SSC
bei 42°C)
hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, welche für humanes
CTLA-8 Protein kodieren, aber aufgrund der Degeneriertheit des genetischen
Codes von der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz abweichen,
sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Variationen
in der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 angegeben, welche verursacht
sind durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen,
welche die CTLA-8 Aktivität,
die Halbwertszeit oder das Produktionsniveau verstärken, sind
ebenfalls von der Erfindung umfasst.
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Die
isolierten Polynukleotide der Erfindung können operativ mit einer Expressionskontrollsequenz
verknüpft
sein, wie etwa den in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485–4490 (1991)
offenbarten Expressionsvektoren pMT2 oder pED, um das CTLA-8 Protein
rekombinant zu produzieren. In der Technik sind viele geeignete
Expressionskontrollsequenzen bekannt. Allgemeine Methoden zur Expression
rekombinanter Proteine sind ebenfalls bekannt und beispielhaft ausgeführt in R.
Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537–566 (1990). Wie hierin definiert
bedeute "operativ
verknüpft" enzymatisch oder
chemisch ligiert, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem isolierten
Polynukleotid der Erfindung und der Expressionskontrollsequenz gebildet
ist, in einer derartigen Weise, so dass das CTLA-8 Protein durch
eine Wirtszelle exprimiert wird, die mit der ligierten Polynukleotid/Expressionskontrollsequenz
transformiert (transfiziert) worden ist.
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Eine
Reihe von Zelltypen kann als geeignete Wirtszellen zur Expression
des humanen CTLA-8 Proteins verwendet werden. Es kann jeder Zelltyp
verwendet werden, der ein funktionales humanes CTLA-8 Protein exprimieren
kann. Geeignete Säugerwirtszellen
umfassen beispielsweise COS Affenzellen, Eierstockzellen von chinesischem
Hamster (CHO), humane 293 Nierenzellen, humane A431 Epidermiszellen,
humane Colo205-Zellen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primatenzelllinien,
normale diploide Zellen, aus der in vitro Kultur von Primärgewebe
abgeleitete Zelllinien, Primärexplantate,
HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D,
FDCP-1, PC12 oder C2C12 Zellen.
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Das
humane CTLA-8 Protein kann auch produziert werden, indem das isolierte
Polynukleotid der Erfindung operativ mit geeigneten Kontrollsequenzen
in einem oder mehreren Insektenexpressionsvektoren verknüpft wird
und ein Insektenexpressionssystem verwendet wird. Materialien und
Methoden für
Baculovirus/Insektenzelle-Expressionssysteme sind in Form eines
Kits kommerziell erhältlich,
z.B. von Invitrogen, San Diego, Kalifornien, USA (das MaxBac® Kit),
und derartige Methoden sind in der Technik gut bekannt, wie beschrieben
in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No. 1555 (1987), das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Lösliche Formen
des humanen CTLA-8 Proteins können
ebenfalls in Insektenzellen hergestellt werden, unter Verwendung
geeigneter isolierter Polynukleotide wie vorstehend beschrieben.
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Alternativ
kann das humane CTLA-8 Protein in niederen Eukaryonten wie etwa
Hefe oder in Prokaryonten wie etwa Bakterien hergestellt werden.
Geeignete Hefestämme
umfassen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-Stämme, Candida,
oder jeden beliebigen Hefestamm, welcher heterologe Proteine exprimieren
kann. Geeignete Bakterienstämme umfassen
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, oder
jeden beliebigen Bakterienstamm. welcher heterologe Proteine produzieren kann.
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Das
humane CTLA-8 Protein der Erfindung kann auch als ein Produkt von
transgenen Tieren produziert werden, d.h. als eine Komponente der
Milch von transgenen Kühen,
Ziegen, Schweinen oder Schafen, welche durch somatische Zellen oder
Keimbahnzellen gekennzeichnet sind, die eine für das humane CTLA-8 Protein
kodierende Polynukleotidsequenz enthalten.
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Das
humane CTLA-8 Protein der Erfindung kann hergestellt werden durch
Anziehen einer Kultur von transformierten Wirtszellen unter Bedingungen,
welche für
die Expression des gewünschten
Proteins erforderlich sind. Das resultierende exprimierte Protein
kann danach aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten gereinigt
werden. Lösliche
Formen des humanen CTLA-8 Proteins der Erfindung können aus
konditionierten Medien gereinigt werden. Membran-gebundene Formen
von humanem CTLA-8 Protein der Erfindung können gereinigt werden, indem
man eine Gesamtmembranfraktion aus der exprimierenden Zelle herstellt
und die Membranen mit einem nicht-ionischen Detergens wie etwa Triton
X-100 extrahiert.
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Das
humane CTLA-8 Protein kann unter Verwendung von Methoden, die dem
Fachmann bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise kann das
humane CTLA-8 Protein der Erfindung unter Verwendung eines kommerziell
erhältlichen
Konzentrationsfilters für
Proteine, beispielsweise einer Amicon oder Millipore Ultrafiltrationseinheit,
aufkonzentriert werden. Nach dem Aufkonzentrierungsschritt kann
das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie etwa ein Gelfiltrationsmedium
aufgetragen werden. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz verwendet
werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit Diethylaminoethyl-Seitengruppen
(DEAE). Die Matrices können
Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Typen sein, welche üblicherweise
bei der Reinigung von Proteinen verwendet werden. Alternativ kann
ein Kationenaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher
umfassen verschiedene unlösliche
Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen umfassen.
Sulfopropyl-Gruppen sind bevorzugt (z.B. S-Sepharose®-Säulen). Die
Reinigung des humanen CTLA-8 Proteins aus Kulturüberstand kann auch einen oder
mehrere Säulenschritte über Affinitätsharze
wie etwa Concavalin A-Agarose, Heparin-Toyopearl® oder
Cibachrom blue 3GA Sepharose® umfassen, oder hydrophobe-Wechselwirkung-Chromatographie
unter Verwendung von Harzen wie etwa Phenylether, Butylether oder
Propylether, oder Immunaffinität-Chromatographie.
Schließlich
können einer
oder mehrere Reversphase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie
(RP-HPLC) Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC Medien,
z.B. Silikagel mit Methylseitengruppen oder anderen aliphatischen Seitengruppen,
angewandt werden um das humane CTLA-8 Protein weiter zu reinigen.
Es können
auch manche oder alle der vorstehend genannten Reinigungsschritte
in verschiedenen Kombinationen oder in Kombination mit anderen bekannten
Methoden angewandt werden um ein im Wesentlichen gereinigtes isoliertes
rekombinantes Protein bereitzustellen.
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Bevorzugt
wird das humane CTLA-8 Protein gereinigt, so dass es im Wesentlichen
frei von anderen Säugerproteinen
ist.
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Es
wird angenommen, dass humanes CTLA-8, aktive Fragmente und Varianten
davon, und CTLA-8-verwandte Proteine (wie beispielsweise etwa CTLA-8
aus Ratte und Herpes CTLA-8) (kollektiv "CTLA-8 Proteine") Cytokin-Aktivitäten aufweisen oder induzieren.
Die Expression von humanem CTLA-8 korrelierte mit einer Expression
von γ-IFN
in induzierten Primärzellen,
und kann die Expression von IL-3 und/oder GM-CSF induzieren, wobei
diese Expression wiederum Effekte erzeugen kann, die mit dem induzierten
Cytokin assoziiert sind. Daher können
humanes CTLA-8 und CTLA-8-verwandte Proteine eine Wirkung auf die
Proliferation oder Funktion von myeloischen Zellen, erythroiden
Zellen, lymphoiden Zellen und deren Vorläufern haben. Humane CTLA-8
Proteine können
auch eine Rolle bei der Bildung von Plättchen oder deren Vorläufern haben.
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Ein
Protein der vorliegenden Erfindung könnte Cytokin-Aktivität, Zellproliferationsaktivität (entweder induzierend
oder inhibierend) oder Zelldifferenzierungsaktivität (entweder
induzierend oder inhibierend) aufweisen oder es könnte eine
Induktion von anderen Cytokinen in bestimmten Zellpopulationen induzieren.
Viele der bisher entdeckten Proteinfaktoren, einschließlich aller
bekannten Cytokine, haben in einem oder mehreren Faktor-abhängigen Zellproliferationsassays
eine Aktivität
gezeigt, und daher dienen diese Assays als eine bequeme Bestätigung von
Cytokin-Aktivität.
Die Aktivität
eines Proteins der vorliegenden Erfindung wird nachgewiesen durch
einen beliebigen einer Reihe von routinemäßigen Faktor-abhängigen Zellproliferationsassays
für Zelllinien,
umfassend ohne Einschränkung
32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5,
DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e und CMK.
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Die
Aktivität
eines Proteins der Erfindung kann unter Anderem durch die nachfolgenden
Methoden gemessen werden:
Assays für die Proliferation von T-Zellen
oder Thymozyten umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben
sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E.
Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober,
Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel
3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel
7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:
3494–3500,
1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706–1712, 1990; Bertagnolli et
al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Bertagnolli et
al., J. Immunol. 149: 3778–3783,
1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756–1761, 1994.
Assays für die Cytokin-Produktion
und/oder Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten umfassen
ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Polyclonal T cell stimulation,
Kruisbeek, A. M., und Shevach, E. M., in Current Protocols in Immunology,
Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 3.12.1–3.12.14,
John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurements of mouse and
human Interferon γ,
Schreiber, R. D., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber
J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.8.1–6.8.8, John Wiley and Sons,
Toronto, 1994.
Assays für
die Proliferation und Differenzierung von hämopoetischen und lymphopoetischen
Zellen umfassen ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Measurement of Human und
Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davies, L.
S., und Lipsky, P. E., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber
J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.3.1–6.3.12, John Wiley and Sons,
Toronto, 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173: 1205–1211, 1991;
Moreau et al., Nature 336: 690–692,
1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931–2938, 1983;
Measurements of mouse and human interleukin 6, Nordan, R., in Current
Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol.
1, Seiten 6.6.1–6.6.5,
John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83: 1857–1861,
1986; Measurement of human Interleukin 11, Bennett, F., Giannotti,
J., Clark, S. C., und Turner, K. J., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber
J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.15.1, John Wiley and Sons,
Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta,
A., Giannotti, J., Clark, S. C., und Turner, K. J., in Current Protocols in
Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.13.1,
John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
Assays für Reaktionen
von T-Zell-Klonen auf Antigene (welche unter Anderem Proteine identifizieren
werden, die APC-T-Zell-Interaktionen beeinflussen sowie direkte
Wirkungen von T-Zellen dirigieren, durch Messung von Proliferation
und Cytokin-Produktion) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben
sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E.
Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober,
Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel
3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines
and their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic Studies in
Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091–6095, 1980;
Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405–411, 1981; Takai et al., J.
Immunol. 137: 3494–3500,
1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988.
-
Ein
Protein der vorliegenden Erfindung kann auch immunstimulierende
oder immunsupprimierende Aktivität
aufweisen, umfassend ohne Einschränkung diejenigen Aktivitäten, für welche
Assays hierin beschrieben sind. Ein Protein kann bei der Behandlung
von verschiedenen Immundefizienzen und Immunstörungen (umfassend schwere kombinierte
Immundefizienz (SCID)) nützlich
sein, z.B. indem es das Wachstum und die Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten
reguliert (nach oben oder unten) sowie die cytolytische Aktivität von NK-Zellen
und anderen Zellpopulationen beeinflusst. Diese Immundefizienzen
können
genetisch bedingt sein oder durch virale (z.B. HIV) sowie bakterielle
Infektionen oder Pilzinfektionen verursacht sein, oder aus Autoimmunstörungen resultieren.
In genaueren Worten könnten
Infektionserkrankungen, hervorgerufen durch Viren, Bakterien, Pilze
oder eine andere Infektion, unter Verwendung eines Proteins der
vorliegenden Erfindung behandelbar sein, umfassend Infektionen durch
HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobakterien, Leishmania, Malaria,
und verschiedene Pilzinfektionen wie etwa Candida. Ein Protein der
vorliegenden Erfindung kann in dieser Hinsicht natürlich auch
nützlich
sein, wenn allgemein ein Boost für
das Immunsystem angezeigt ist, d.h. bei der Behandlung von Krebs.
-
Autoimmunerkrankungen,
die unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelt werden
können,
umfassen beispielsweise multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus,
rheumatoide Arthritis, Autoimmun-Lungenentzündung, Guillan-Barre-Syndrom,
Autoimmun-Thyreoiditis,
Insulin-abhängigen
Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-Wirt-Reaktion,
und Autoimmun-Augenentzündung. Ein
derartiges Protein der vorliegenden Erfindung kann auch bei der
Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen nützlich sein, wie etwa bei Asthma
oder anderen Atembeschwerden. Andere Zustände, bei denen eine Immunsuppression
erwünscht
ist (beispielsweise umfassend Asthma und verwandte Atembeschwerden)
könnten
ebenfalls unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung
behandelbar sein.
-
Ein
Protein der vorliegenden Erfindung könnte auch chronische oder akute
Entzündung
supprimieren, wie etwa beispielsweise die mit Infektion assoziierte (wie
etwa bei septischem Schock oder systemischem Entzündungsreaktionssyndrom
(SIRS)), entzündliche
Darmerkrankung, Morbus Crohn, oder die aus einer Überproduktion
von Cytokinen wie etwa TNF oder IL-1 resultierende (wie etwa die durch
IL-11 gezeigte Wirkung).
-
Die
Aktivität
eines erfindungsgemäßen Proteins
kann unter Anderem durch die nachfolgenden Methoden gemessen werden:
Geeignete
Assays für
die Cytotoxizität
von Thymozyten oder Splenozyten umfassen ohne Einschränkung diejenigen,
welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben
von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach,
W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience
(Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel
7, Immunologic Studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 78: 2488–2492,
1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al.,
J. Immunol. 135: 1564–1572,
1985, Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al.,
J. Immunol. 140: 508–512,
1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488c2492,
1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al.,
J. Immunol. 135: 1564–1572,
1985, Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bowman et al.,
J. Virology 61: 1992–1998; Takai
et al., J. Immunol. 140: 508–512,
1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Brown
et al., J. Immunol. 153: 3079–3092,
1994.
Assays für
T-Zell-abhängige
Immunglobulin-Reaktionen und Isotyp-Switching (welche unter Anderem
Proteine identifizieren werden, die T-Zell-abhängige Antikörperreaktionen modulieren und
Th1/Th2-Profile beeinflussen) umfassen ohne Einschränkung diejenigen,
welche beschrieben sind in: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028–3033, 1990;
und in Assays for B Cell function: in vitro antibody production,
Mond, J. J., und Brunswick, M., in Current Protocols in Immunology,
Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 3.8.1–3.8.16,
John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Assays für die gemischte
Lymphozyten-Reaktion (MLR) (welche unter Anderem Proteine identifizieren
werden, die vorwiegend Th1 und CTL Reaktionen erzeugen), umfassen
ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology,
herausgegeben von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies,
E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und
Wiley-Interscience (Kapitel 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1–3.19;
Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol.
137: 3494–3500,
1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et
al., J. Immunol. 149: 3778–3783,
1992.
Assays, die von Dendritenzellen abhängen (welche unter Anderem
Proteine identifizieren werden, welche von Dendritenzellen exprimiert
werden, die naive T-Zellen aktivieren), umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche
beschrieben sind in: Guery et al., J. Immunol. 134: 536–544, 1995;
Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549–559, 1991;
Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071–5079, 1995;
Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255–260, 1995;
Nair et al, Journal of Virology 67: 4062–4069, 1993; Huang et al, Science
264: 961–965,
1994, Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255–1264, 1989;
Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797–807, 1994;
und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631–640, 1990.
Assays
für das Überleben/die
Apoptose von Lymphozyten (welche unter Anderem Proteine identifizieren
werden, die eine Apoptose nach Induktion durch ein Superantigen
verhindern, und Proteine, welche die Homöostase von Lymphozyten regulieren)
umfassen ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Darzynkiewicz et al., Cytometry
13: 795–808,
1992; Gorczyka et al., Leukemia 7: 659–670, 1993, Gorczyka et al.,
Cancer Research 53: 1945–1951,
1993; Itoh et al., Cell 66: 233–243;
1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037–4045, 1990;
Zamai et al., Cytometry 14: 891–897,
1993; Gorczyka et al., International Journal of Oncology 1: 639–648, 1992.
Assays
für Proteine,
welche frühe
Stadien der Festlegung und Entwicklung von T-Zellen beeinflussen,
umfassen ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Antica et al., Blood 84:
111–117,
1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111–122, 1994; Galy et al., Blood
85: 2770–2778,
1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7548–7551, 1991.
-
Ein
Protein der vorliegenden Erfindung könnte bei der Regulation der
Hämopoese
nützlich
sein, und demzufolge bei der Behandlung von Defizienzen myeloischer
oder lymphoider Zellen. Sogar eine marginale unterstützende biologische
Aktivität
von Kolonie-bildenden Zellen oder von Faktor-abhängigen Zelllinien deutet auf
eine Beteiligung an der Regulation der Hämopoese hin, z.B. eine Unterstützung des
Wachstums oder der Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen
alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen, wodurch ein Nutzen
angezeigt wird, beispielsweise bei der Behandlung von verschiedenen
Anämien
oder zur Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie
zur Stimulation der Produktion von erythroiden Vorläuferzellen
und/oder erythroiden Zellen; zur Unterstützung des Wachstums und der
Proliferation von myeloischen Zellen wie etwa Granulozyten und Monozyten/Makrophagen
(d.h. traditionelle CSF Aktivität),
was beispielsweise in Verbindung mit Chemotherapie nützlich ist
um eine daraus resultierende Myelosuppression zu verhindern; zur
Unterstützung
des Wachstums und der Proliferation von Megakaryozyten und demzufolge
von Plättchen,
wodurch eine Prävention
oder Behandlung von verschiedenen Plättchenstörungen wie etwa Thrombozytopenie
ermöglicht
wird, und allgemein zur Verwendung anstatt oder als Ergänzung zu
Plättchen-Transfusionen;
und/oder zur Unterstützung
des Wachstums und der Proliferation von hämopoetischen Stammzellen, die fähig sind
zu allen den vorstehend genannten hämopoetischen Zellen zu reifen
und daher eine therapeutische Anwendung in verschiedenen Stammzellstörungen haben
(wie etwa diejenigen, welche üblicherweise
mit Transplantationen behandelt werden, umfassend ohne Einschränkung aplastische
Anämie
und krampfartige nächtliche
Hämoglobinurie)
sowie bei der Repopulation des Stammzellkompartments nach Bestrahlung/Chemotherapie,
entweder in vivo oder ex vivo (d.h. in Verbindung mit Knochenmarkstransplantation)
als normale Zellen oder genetisch manipulierte Zellen für eine Gentherapie.
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Die
Aktivität
eines erfindungsgemäßen Proteins
kann unter Anderem durch die nachfolgenden Methoden gemessen werden:
Geeignete
Assays für
die Proliferation und Differenzierung von verschiedenen hämopoetischen
Linien sind vorstehend zitiert.
Assays für die Proliferation und Differenzierung
embryonischer Stammzellen (welche unter Anderem Proteine identifizieren
werden, die hämopoetische
Differentiationshämopoese
beeinflussen) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben
sind in: Johansson et al., Cellular Biology 15: 141–151, 1995;
Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473–486, 1993;
McClanahan et al., Blood 81: 2903–2915, 1993.
Assays für das Überleben
und die Differenzierung von Stammzellen (welche unter Anderem Proteine
identifizieren werden, die Lympho-Hämopoese regulieren) umfassen
ohne Einschränkung
diejenigen, welche beschrieben sind in: Methylcellulose colony forming
assays, Freshney, M. G., in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber
R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 265–268, Wiley-Liss Inc., New
York, NY, 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5907–5911,
1992; Primitive hematopoietic colony forming celle with high proliferative
potential, McNiece, I. K., und Briddell, R. A., in Culture of Hematopoietic
cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 23–39, Wiley-Liss
Inc., New York, NY, 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:
353–359,
1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E., in
Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney et al.,
Vol., Seiten 1–21,
Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Long Term bone marrow cultures
in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M., und
Allen, T., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I.
Freshney et al., Vol., Seiten 163–179, Wiley-Liss Inc., New
York, NY, 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland,
H. J., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney
et al., Vol., Seiten 139–162,
Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994.
-
CTLA-8
Proteine sind nützlich
bei der Behandlung von verschiedenen Immundefizienzen und Immunstörungen (umfassend
SCID), z.B. durch Regulieren (nach oben oder unten) des Wachstums,
der Proliferation und/oder der Aktivität von T- und/oder B-Lymphozyten
sowie der zytolytischen Aktivität
von NK-Zellen. Diese Immundefizienzen können durch virale (z.B. HIV)
sowie bakterielle Infektionen verursacht sein, oder aus Autoimmunstörungen resultieren.
In genaueren Worten könnten
Infektionserkrankungen, hervorgerufen durch Viren, Bakterien, Pilze
oder eine andere Infektion, durch die Verwendung von CTLA-8 Proteinen
behandelbar sein, umfassend Infektionen durch HIV, Hepatitis, Influenza,
CMV, Herpes, Mycobakterien, Leishmania, Malaria, und verschiedene
Pilzinfektionen (wie etwa Candida). Die CTLA-8 Proteine können in
dieser Hinsicht natürlich
auch nützlich
sein, wenn allgemein ein Boost für
das Immunsystem angezeigt ist, d.h. bei der Behandlung von Krebs,
oder als ein Adjuvans für
Impfstoffe. Autoimmunerkrankungen, die unter Verwendung von Faktoren
der vorliegenden Erfindung behandelt werden könnten, umfassen beispielsweise
multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, rheumatoide
Arthritis, Autoimmun-Lungenentzündung,
Guillan-Barre-Syndrom, Autoimmun-Thyreoiditis,
Insulin-abhängigen
Diabetes mellitus, und Autoimmun-Augenentzündung. Es wird
auch erwartet, dass die CTLA-8 Proteine bei der Behandlung von allergischen
Reaktionen und Zuständen geeignet
sind.
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Es
wird auch erwartet, dass CTLA-8 Proteine chemotaktische Aktivität aufweisen.
Wie hierin verwendet hat ein Protein oder Peptid "chemotaktische Aktivität", wenn es direkt
oder indirekt die gerichtete Orientierung oder Bewegung von Zellen,
umfassend myeloische und lymphoide Zellen, stimulieren kann. Bevorzugt weist
das Protein oder Peptid die Fähigkeit
auf, eine gerichtete Bewegung von Zellen (insbesondere von T-Zellen)
direkt zu stimulieren. Ob ein besonderes Protein oder Peptid chemotaktische
Aktivität
für Zellen
aufweist, kann leicht bestimmt werden, indem ein derartiges Protein
oder Peptid in einem bekannten Assay für Zellchemotaxis eingesetzt
wird.
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CTLA-8
Proteine inhibieren auch das Wachstum und die Proliferation von
vaskulären
Endothelzellen. Als ein Ergebnis sind humane CTLA-8 Proteine wirksam,
die Angiogenese (d.h. Bildung von Gefäßen) zu inhibieren. Diese Aktivität wird auch
bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen, an denen Angiogenese
beteiligt ist, nützlich
sein. Eine Inhibition der Angiogenese durch humane CTLA-8 Proteine
wird auch dazu führen,
dass der Zustand, zu dem eine normale Angiogenese beitragen würde, inhibiert
oder verhindert wird.
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Isolierte
CTLA-8 Proteine, aus Zellen gereinigt oder rekombinant produziert,
können
als eine pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, wenn
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert. Eine derartige
Zusammensetzung kann, zusätzlich
zu CTLA-8 Protein und Träger,
Verdünnungsmittel, Füllstoffe,
Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel und andere
in der Technik gut bekannte Materialien enthalten. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet ein nicht-toxisches
Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des bzw.
der Wirkstoffe nicht beeinträchtigt.
Die charakteristischen Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg
ab. Die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann auch Cytokine, Lymphokine oder andere hämopoetische
Faktoren enthalten, wie etwa M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, γ-IFN, Stammzellenfaktor
und Erythropoietin. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann thrombolytische
oder anti-Thrombose-Faktoren enthalten, wie etwa Plasminogen-Aktivator
und Faktor VIII. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch andere
entzündungshemmende
Faktoren enthalten. Derartige zusätzliche Faktoren und/oder Mittel
können
in die pharmazeutische Zusammensetzung aufgenommen werden um mit
dem CTLA-8 Protein eine synergistische Wirkung zu erzeugen oder
um Nebenwirkungen, die durch das CTLA-8 Protein hervorgerufen werden,
zu minimieren. Umgekehrt kann CTLA-8 Protein in Formulierungen des
besonderen Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen
oder anti-Thrombose-Faktors, oder entzündungshemmenden Mittels aufgenommen
werden um Nebenwirkungen des Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen
Faktors, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktors, oder entzündungshemmenden
Mittels zu minimieren.
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Die
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung kann in Form eines Liposoms vorliegen, in dem CTLA-8
Protein zusätzlich
zu anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägern mit amphipathischen Mitteln,
wie etwa Lipiden, kombiniert ist, welche in wässriger Lösung in aggregierter Form als
Micellen, unlösliche Monoschichten,
Flüssigkristalle,
oder lamellare Schichten vorliegen. Geeignete Lipide zur Formulierung
von Liposomen umfassen ohne Einschränkung Monoglyzeride, Diglyzeride,
Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren, und
dergleichen. Die Herstellung derartiger liposomaler Formulierungen
gehört
zum üblichen
Fachwissen, wie beispielsweise in US Patent Nr. 4,235,871, US Patent
Nr. 4,501,728, US Patent Nr. 4,837,028 und US Patent Nr. 4,737,323
offenbart, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden.
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Wie
hierin verwendet bedeutet der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge
jedes Wirkstoffs der pharmazeutischen Zusammensetzung oder Methode,
welche ausreichend ist um einen bedeutungsvollen Nutzen für einen
Patienten zu zeigen, z.B. eine Verbesserung von Symptomen von derartigen
Zuständen,
eine Heilung davon, oder erhöhte
Heilungsrate. Bei Anwendung auf einen individuellen Wirkstoff bei alleiniger
Verabreichung bezieht sich der Begriff auf diesen Wirkstoff alleine.
Bei Anwendung auf eine Kombination bezieht sich der Begriff auf
die kombinierten Mengen an Wirkstoffen, welche zu der therapeutischen
Wirkung führen,
unabhängig
davon, ob in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht.
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Bei
der praktischen Durchführung
des Behandlungsverfahrens oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung
wird einem Säuger
eine therapeutisch wirksame Menge an CTLA-8 Protein verabreicht.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann CTLA-8 Protein entweder alleine oder in Kombination mit anderen
Therapien, wie etwa Behandlung unter Verwendung von Cytokinen, Lymphokinen
oder anderen hämopoetischen Faktoren,
verabreicht werden. Bei Verabreichung zusammen mit einem oder mehreren
Cytokinen, Lymphokinen, anderen hämopoetischen Faktoren oder
Impfstoffkomponenten (wie etwa Antigenen oder anderen Adjuvantien)
kann CTLA-8 Protein entweder gleichzeitig mit dem bzw. den Cytokinen, Lymphokinen,
anderen hämopoetischen
Faktoren, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktoren verabreicht werden,
oder zeitlich versetzt. Bei zeitlich versetzter Verabreichung wird
der behandelnde Arzt über
die geeignete Reihenfolge der Verabreichung von CTLA-8 Protein in
Kombination mit dem bzw. den Cytokinen, Lymphokinen, anderen hämopoetischen
Faktoren, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktoren entscheiden.
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Eine
Verabreichung von CTLA-8 Protein, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung
oder zur praktischen Ausführung
des Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann auf
eine Vielzahl von herkömmlichen
Wegen erfolgen, wie etwa orale Einnahme, Inhalation, oder kutane,
subkutane oder intravenöse
Injektion. Intravenöse
Verabreichung an den Patienten ist bevorzugt.
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Bei
oraler Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an CTLA-8
Protein wird das CTLA-8 Protein in Form einer Tablette, Kapsel,
eines Pulvers, einer Lösung
oder eines Elixirs vorliegen. Bei Verabreichung in Form einer Tablette
kann die erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung zusätzlich
einen festen Träger
wie etwa eine Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette,
Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95% CTLA-8 Protein,
und bevorzugt von etwa 25 bis 90% CTLA-8 Protein. Bei Verabreichung
in flüssiger
Form kann ein flüssiger
Träger
wie etwa Wasser, Petroleum; Öle
tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie etwa Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl, oder
synthetische Öle
zugegeben werden. Die flüssige
Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische
Salzlösung,
Dextrose oder eine andere Saccharidlösung, oder Glykole wie etwa
Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten.
Bei Verabreichung in flüssiger
Form enthält
die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% an
CTLA-8 Protein, und bevorzugt von etwa 1 bis 50% CTLA-8 Protein.
-
Bei
intravenöser,
kutaner oder subkutaner Injektion einer therapeutisch wirksamen
Menge an CTLA-8 Protein wird das CTLA-8 Protein in Form einer Pyrogen-freien
parenteral akzeptablen wässrigen
Lösung
vorliegen. Die Herstellung derartiger parenteral akzeptabler Proteinlösungen,
im Hinblick auf deren pH-Wert, Isotonizität, Stabilität und dergleichen, ist dem
Fachwissen zuzurechnen. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung
für intravenöse, kutane
oder subkutane Injektion sollte zusätzlich zu CTLA-8 Protein ein
isotonisches Vehikel wie etwa Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Dextrose-Injektionslösung Dextrose
und Natriumchlorid-Injektionslösung,
milchsaure Ringer-Injektionslösung,
oder ein anderes, in der Technik bekanntes Vehikel enthalten. Die
pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann
auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien
oder andere dem Fachmann bekannte Additive enthalten.
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Die
Menge an CTLA-8 Protein in der pharmazeutischen Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung wird von der Art und der Schwere des
zu behandelnden Zustands abhängen,
und von der Art früherer Behandlungen,
die der Patient durchgemacht hat. Letztendlich wird der behandelnde
Arzt über
die Menge an CTLA-8 Protein entscheiden, mit welcher ein individueller
Patient jeweils behandelt wird. Anfangs wird der behandelnde Arzt
niedrige Dosierungen an CTLA-8 Protein verabreichen und die Reaktion
des Patienten beobachten. Es können
größere Dosierungen
an CTLA-8 Protein verabreicht werden, bis die optimale therapeutische
Wirkung für
den Patienten erhalten wird, und an diesem Punkt wird die Dosierung
im Allgemeinen nicht weiter erhöht.
Es wird erachtet, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen,
welche in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, etwa 0.1 μg
bis etwa 100 mg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht enthalten sollten,
bevorzugt etwa 0.1 μg
bis etwa 10 mg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht, stärker bevorzugt
etwa 0.1 μg
bis etwa 100 μg
CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht, am
meisten bevorzugt etwa 0.1 μg
bis etwa 10 μg
CTLA-8 Protein pro
kg Körpergewicht.
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Die
Dauer einer intravenösen
Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung wird in Abhängigkeit von der Schwere der
zu behandelnden Erkrankung und des Zustands und der potentiellen Überempfindlichkeitsreaktion
jedes individuellen Patienten variieren. Es wird erachtet, dass
die Dauer jeder Anwendung des CTLA-8 Proteins im Bereich von 12
bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegen wird.
Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die geeignete Dauer einer
intravenösen
Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung entscheiden.
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Erfindungsgemäßes CTLA-8
Protein kann auch für
eine Immunisierung von Tieren verwendet werden, um polyklonale und
monoklonale Antikörper
zu erhalten, die spezifisch mit dem CTLA-8 Protein reagieren und eine
Bindung von CTLA-8 an dessen Rezeptor inhibieren können. Derartige
Antikörper
sind auch zur Durchführung
von diagnostischen Assays auf CTLA-8 gemäß bekannten Methoden nützlich.
Derartige Antikörper können erhalten
werden durch die Verwendung des vollständigen CTLA-8 Proteins als
ein Immunogen, oder durch die Verwendung von Fragmenten von humanem
CTLA-8 Protein. Die Peptid-Immunogene können an ihrem Carboxy-Terminus
zusätzlich
einen Cysteinrest enthalten, und sie werden an ein Hapten wie etwa
Keyhole Limpet Hämocyanin
(KLH) konjugiert. Zusätzliche
Peptid-Immunogene können
erzeugt werden, indem man Tyrosinreste durch sulfatierte Tyrosinreste
ersetzt. Methoden zur Synthese derartiger Peptide sind in der Technik
bekannt, beispielsweise in R. P. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85,
2149–2154
(1963); J. L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
-
Neutralisierende
oder nicht-neutralisierende Antikörper (bevorzugt monoklonale
Antikörper),
die an humanes CTLA-8 Protein binden, können ebenfalls nützliche
Therapeutika für
bestimmte Tumore und auch bei der Behandlung von vorstehend genannten
Zuständen
sein. Diese neutralisierenden Antikörper können die Bindung von Ligand
an das humane CTLA-8 Protein blockieren oder sie könnten die
Clearance von Protein aus dem Patienten fördern.
-
Aufgrund
ihrer Homologie zu humanem CTLA-8 werden auch CTLA-8 Proteine aus
Ratte, Herpes CTLA-8 Proteine und IL-17 Proteine (das "humane CTLA-8" von Golstein et
al., a.a.O.) CTLA-8 Aktivität
wie vorstehend beschrieben aufweisen. Als ein Ergebnis davon können Ratte-
und Herpes CTLA-8 Proteine und IL-17 Proteine sowie aktive Fragmente
und Varianten davon bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
und in Behandlungsverfahren, wie für das humane CTLA-8 beschrieben,
verwendet werden. Ratte- und Herpes CTLA-8 Proteine und aktive Fragmente
und Varianten davon können
wie vorstehend beschrieben hergestellt werden unter Verwendung der
Polynukleotide (oder von Fragmenten oder Varianten davon), die in SEQ
ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5 beschrieben sind. Ratte- und Herpes CTLA-8
können
auch wie in Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150, 5445–5456, beschrieben,
hergestellt werden. CTLA-8 Proteine anderer Spezies können ebenfalls
wie hierin beschrieben verwendet werden. cDNA, die für CTLA-8
aus Ratte und Herpes CTLA-8 kodieren, wurden am 6. Juli 1995 bei
der American Type Tissue Collection hinterlegt, und ihnen wurden die
Zugangsnummern ATCC 69867 bzw. ATCC 69866 zugeordnet. IL-17 Proteine
können
ebenfalls hergestellt werden wie in Golstein et al., a.a.O., beschrieben.
-
Aufgrund
ihrer Homologie zu IL-17 kann es sein, dass die humanen CTLA-8 (B18)
Proteine der vorliegenden Erfindung auch manche Aktivitäten mit
IL-17 gemeinsam haben.
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Für eine Behandlung
oder Therapie kann ein beliebiges der hierin diskutierten oder offenbarten
Proteine durch in vivo Expression des Proteins in einem Säuger verabreicht
werden. In solchen Fällen
wird ein für das
gewünschte
Protein kodierendes Polynukleotid gemäß bekannten Verfahren dem Lebewesen
in einer Weise verabreicht, die eine Expression ermöglicht,
umfassend ohne Einschränkung
die hierin offenbarten Adenovirus-Verfahren.
-
Beispiel 1
-
Isolierung von humaner
CTLA-8 cDNA
-
Ein
Partialklon für
humanes CTLA-8 wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus
RNA, isoliert von stimulierten mononuklearen Zellen aus humanem
peripheren Blut, hergestellt worden war. Dieser Partialklon wurde
als "B18" identifiziert. B18
wird hierin manchmal verwendet um das humane CTLA-8 der vorliegenden Erfindung
zu bezeichnen. Homologievergleiche ergaben, dass dieser Partialklon
zu den CTLA-8 Genen von Herpes und Ratte verwandt ist. Die DNA-Sequenz
dieses Partialklons wurde verwendet um den Volllänge-Klon zu isolieren.
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Um
eine Volllänge-cDNA
für B18
zu isolieren wurde eine direktionale Volllänge-cDNA-Bibliothek mittels Standardmethoden
im COS-Expressionsvektor pMV2 hergestellt. Die cDNA-Bibliothek wurde
mittels Elektroporation in E. coli transformiert. Der Großteil der
ursprünglich
transformierten cDNA-Bibliothek wurde bei –80°C in Glyzerin eingefroren. Ein
Aliquot wurde austitriert um die Konzentration an transformierten
E. coli zu bestimmen. Die E. coli wurden aufgetaut, auf 76.000/0,1
ml in Ampicillin-haltigem Medium verdünnt, und 0,1 ml wurden in die
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einer 8 × 8 Anordnung verteilt. Die
Mikrotiterplatte wurde über
Nacht bei 37°C
aufbewahrt um die E. coli wachsen zu lassen.
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Um
DNA für
eine PCR herzustellen wurden 20 μl
Aliquots der Kultur aus jeder Vertiefung entnommen und separat für jede Reihe
und Spalte von acht Vertiefungen gepoolt, wobei 16 Pools von jeweils
160 μl erhalten
wurden. Die E. coli wurden pelletiert, in 160 μl Standardlysepuffer, der 10
mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100 enthielt, erneut
aufgenommen und durch 10-minütiges Erwärmen auf
95°C lysiert.
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Um
diejenigen Vertiefungen zu identifizieren, die mit B18 transformierte
E. coli enthielten, wurde zunächst
eine PCR mit den DNA-Präparationen,
welche den acht Spalten entsprachen, durchgeführt. Die PCR bestand aus zwei
Reaktionen nacheinander mit "nested" Oligonukleotiden
unter Verwendung von Standardbedingungen. Die für die PCR-Reaktion verwendeten
Oligonukleotide waren von der Sequenz des B18-Partialklons abgeleitet.
Sie waren:
B185: CACAGGCATACACAGGAAGATACATTCA (SEQ ID NO: 7)
B183:
TCTTGCTGGATGGGAACGGAATTCA (SEQ ID NO: 8)
B18N: ATACATTCACAGAAGAGCTTCCTGCACA
(SEQ ID NO: 9)
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Die
PCR-Bedingungen waren 2,5 mM MgCl2 und 95°C × 2 min
für einen
Zyklus, 95°C × 1 min
plus 68°C × 1 min
für 30
Zyklen, und 68°C × 10 min
für einen
Zyklus. Jede Reaktion hatte 20 μl.
Die erste Reaktion enthielt die Oligonukleotide B185 und B183 und
1 μl der
DNA-Präparationen.
Die zweite Reaktion enthielt die Oligonukleotide B183 und B18N und
1 μl der
ersten Reaktion.
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DNA-Präparationen,
die möglicherweise
einen Volllänge-B18-cDNA-Klon
enthielten, wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese eines Aliquots
der zweiten PCR-Reaktion identifiziert. Es wurde angenommen, dass
eine DNA-Bande mit
der korrekten Mobilität
von einer B18-cDNA abgeleitet wäre.
Danach wurde die gleiche Abfolge von PCR-Reaktionen und Gelanalyse
mit den DNA-Präparationen
durchgeführt,
welche den acht Reihen entsprachen. Die Schnittstelle einer Reihe
und einer Spalte identifizierte die Vertiefung A2 als potentiell B18-enthaltend,
was eine Einengung auf die 76.000 ursprünglich in dieser Vertiefung
angeimpften E. coli ergab.
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Um
diejenigen individuellen E. coli, welche den mutmaßlichen
Vollänge-B18-cDNA-Klon enthielten weiter
zu reinigen, wurde die Konzentration an E. coli in der Vertiefung
A2 durch Austitrieren und Plattieren von Verdünnungen der Vertiefung bestimmt.
Danach wurden 7600 E. coli in die Vertiefungen einer zweiten Mikrotiterplatte
in einer 8 × 8
Anordnung angeimpft. Die E. coli wurden über Nacht wachsen gelassen,
Vertiefungen wurden gepoolt, und DNA wurde präpariert wie vorstehend beschrieben.
Um zu identifizieren, welche von diesen Vertiefungen E. coli enthielten,
die mit B18 transformiert waren, wurden aufeinander folgende PCR-Reaktionen
durchgeführt,
im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Agarose-Gelelektrophorese
identifizierte die Vertiefung B2 als potentiell eine B18-cDNA-enthaltend.
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Diejenigen
E. coli, welche diese cDNA enthielten, wurden weiter gereinigt durch
Animpfen von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 253 E. coli
pro Vertiefung, und weiterem Vorgehen wie für die Reinigung der E. coli
in der Vertiefung A2. Es wurde bestimmt, dass die Vertiefung C3
einen mutmaßlichen
Volllänge-B18-cDNA-Klon enthielt.
Das exakte E. coli wurde identifiziert durch Plattieren des Inhalts
der Vertiefung auf Bakterienkulturmedium und danach Screenen der
E. coli Kolonien nach anerkannten Protokollen. Die Sonde für diese Hybridisierungen
war ein PCR-Fragment, welches erzeugt worden war mittels Durchführung einer
PCR-Reaktion mit dem B18-Klon unter Verwendung der vorstehend beschriebenen
Oligonukleotide (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9) als Primer.
Sobald eine Einzelkolonie identifiziert war, wurde DNA gemäß Standardverfahren
präpariert
und sequenziert. Ein Vergleich dieser Sequenz mit der Sequenz des
ursprünglichen
Partialklons bestätigte
die Identität,
und dass die isolierte cDNA Volllänge hatte.
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Der
Volllänge-Klon
wurde am 6. Juli 1995 bei der American Type Tissue Collection hinterlegt,
und ihm wurde die Zugangsnummer ATCC 69868 zugeordnet.
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Beispiel 2
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Expression von humanem
CTLA-8
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Der
Volllänge-B18-Klon
für humanes
CTLA-8 wurde in COS-Zellen transfiziert, die danach mit 35S-Methionin markiert wurden. Ein Aliquot
konditioniertes Medium von der transfizierten Zellkultur wurde eingeengt, denaturiert
und einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Autoradiogramme
dieser Gele sind in 2 wiedergegeben. Die durch den
Pfeil angezeigte Bande zeigt eine Expression von humanem CTLA-8.
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Beispiel 3
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Inhibition von Angiogenese
durch humanes CTLA-8
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Die
Fähigkeit
von humanem CTLA-8, die Angiogenese zu inhibieren, wurde in einem
angiostatischen Aktivitätsassay
(Endothelzellen-Proliferationsassay) untersucht. Der Assay wurde
in einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Primäre humane Nabelzellen (HUVECs)
wurden in einer Konzentration von 2 × 103 Zellen
pro Vertiefung in EGM-Medium (Clonetics)/20% FCS angeimpft und 24
Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden danach in M199-Medium (GIBCO BRL),
enthaltend 10% Aktivkohle-behandeltes Serum (M199-CS) während 48
Stunden bei 37°C
ausgehungert. Konditioniertes, B-18 (humanes CTLA-8) enthaltendes
Medium wurde von transfizierten COS-Zellen oder stabil exprimierenden
CHO-Zellen erhalten, und 1:10, 1:50, 1:250 und 1:1250 Verdünnungen
wurden in M199-CS-Medium, enthaltend 100 ng/ml FGF, hergestellt. Die
B18-Verdünnungen
wurden zu den ausgehungerten Zellen zugegeben und es wurde 72 h
bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden danach 6 Stunden mit [3H]-Thymidin
radiomarkiert. Radiomarkierte Zellen wurden mit PBS gewaschen und
für eine
Flüssigscintillationsauszählung trypsiniert.
Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Kaleidograph-Software
graphisch ausgewertet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
In der Figur ist "Med" die Negativkontrolle, "B18" und "B18-1" waren konditioniertes
Medium aus zwei unabhängigen
Transfektionen von COS-Zellen mit DNA, die für humanes CTLA-8 (B18) kodiert.
IFN-γ wurde
als eine Positivkontrolle für
angiostatische Aktivität
(d.h. Inhibition der Angiogenese) verwendet. Diese Daten zeigen,
dass humanes CTLA-8 (B18) die Angiogenese inhibiert.
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Beispiel 4
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Hämopoetische Aktivität von humanem
CTLA-8
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Die
hämopoetische
Aktivität
von in vivo exprimiertem humanem CTLA-8 (B18) wurde durch Konstruktion
eines rekombinanten Adenovirus-Vektors untersucht.
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Die
B18-cDNA im Expressionsplasmid Adori 2-12 B18 wurde durch den unmittelbaren
frühen
Promoter und Enhancer von Cytomegalovirus (CMV) angetrieben.
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Der
Vektor Adori 2-12 war durch Hinzufügen eines SV40 Ursprungs und
Enhancers zu einem bekannten Adenovirus-Vektor erzeugt worden (Barr
et al., Gene Therapy 1: 51 (1994); Davidson et al., Nature Genetics
3: 219 (1993)). Das für
den SV40 Ursprung und Enhancer kodierende HindIII/BamHI-Fragment
war von dem Säugerexpressionsvektor
pMT2 isoliert worden, mit Klenow glatt gemacht worden und in die
NatI-Stelle (mit Klenow glatt gemacht) des Expressionsvektors Ad5
kloniert worden.
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Der
Vektor wurde erhalten durch Verdauen von pNOT-B18-cDNA mit SalI,
Auffüllen
des 5'-Überhangs mit
Klenow um ein glattes Ende zu erzeugen, und Verdau mit EcoRI um
die B18-cDNA zu isolieren. Das glattgemachte EcoRI-B18-Fragment wurde
in die Restriktionsstellen EcoRV-EcoRI des Adenovirus-Vektors Adori 2-12
insertiert. Die CMV-B18-Expressionskassette war stromabwärts vom
SV40 Ursprung und Enhancer lokalisiert, und 0–1 Karteneinheiten am linken
Ende des Adenovirus Typ 5 (Ad5). Der SV40 Spleißdonor und -akzeptor waren
zwischen dem CMV-Promoter und der B18-cDNA lokalisiert. Nach dem Insert folgte
eine SV40 Poly-A-Stelle, 9–16
Karteneinheiten von Ad5 und vom pUC-Ursprung.
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Ein
rekombinanter Adenovirus wurde mittels homologer Rekombination in
293-Zellen erzeugt.
AscI-linearisierter Adori 2-12 B18 und ClaI-verdauter AdCMVlacZ
wurden unter Verwendung von Lipofectamin in die 293-Zellen eingebracht.
Rekombinanter Adenovirus wurde isoliert und in 293-Zellen amplifiziert.
Das Virus wurde von infizierten 293-Zellen durch 3 Gefrier-Auftau-Zyklen freigesetzt.
Das Virus wurde durch zwei Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugationen
und Dialyse bei 4°C
gegen PBS weiter gereinigt. Nach Dialyse des Virus wurde Glyzerin
bis zu einer Konzentration von 10% zugegeben, und das Virus wurde
bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt.
Das Virus wurde charkterisiert durch Expression des Transgens, Plaque-bildende Einheiten
mit 293-Zellen, Partikel/ml und Southern-Analyse des Virus.
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Eine
Einzeldosis von 5 × 1010 Partikeln rekombinantes, für B18 kodierendes
Adenovirus wurde in die Schwanzvene von männlichen C57/bl6-Mäusen mit
einem Alter von 7–8
Wochen injiziert. Kontrollmäuse
empfingen ein für
B-Galactosidase
kodierendes Adenovirus. An den Tagen 7 und 14 wurden 4 Mäuse jeder
Versuchsgruppe geopfert. Blut wurde gesammelt, und eine automatisierte
hämatologische
Analyse wurde unter Verwendung eines Baker 9000 durchgeführt. Mit
Blutabstrichen wurden differentielle Auszählungen durchgeführt. Gewebe
wurde geerntet, in Formalin fixiert und für die Histopathologie mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt.
Im ersten Satz Experimente wurden Serum und Gewebe 1 und 14 Tage
nach der Injektion analysiert. In den Auszählungen von peripheren Plättchen wurde
ein leichter Anstieg festgestellt. Die Tiere, die B18 erhalten hatten,
zeigten eine geringe Vergrößerung der
Milz. Makroskopische Analyse der Milz zeigte eine Zunahme der extramedullären Hämopoese
der Milz an Tag 7 im Vergleich zur Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigten
eine mit B18 assoziierte hämopoetische
Wachstumsaktivität.
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In
einem zweiten Satz Experimente wurden 5 × 1010 Partikel
rekombinantes, für
B18 kodierendes Adenovirus in die Schwanzvene von männlichen
C57/bl6-Mäusen mit
einem Alter von 17–18
Wochen injiziert. Kontrollmäuse
empfingen ein für
B-Galactosidase kodierendes Adenovirus. An den Tagen 2, 5, 7, 10,
14 und 21 wurden über
die retro-orbitalen Höhlen
Blutproben entnommen. Die hämatologischen
Analysen wurden unter Verwendung einer automatisierten Zellauszählvorrichtung
Baker 9000 mit für
Maus spezifischen Einstellungen durchgeführt. Die Analysen umfassten
Auszählungen
von WBC, RBC, HCT und PLT. Blutabstriche wurden hergestellt und
mit Wright-Giemsa für
WBC-Differentiale,
auf Basis einer Zellauszählung
von 100 angefertigt. Retikulozyten und retikuläre Plättchen wurden unter Verwendung
von Durchflusscytometrie quantifiziert. Vier Mäuse jeder Gruppe wurden an
den Tagen 7, 14 und 21 geopfert. Zusätzlich zu Analyse von peripherem
Blut wurde mittels Herzpunktion Serum gesammelt, für eine Quantifizierung
von systemischem IL-6
unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Endogen). Milz und Leber
wurden für
Histopathologie entnommen, hämopoetische
Vorläufer
aus Milz und Knochenmark wurden quantifiziert, und Knochenmarkabstriche
wurden präpariert
und für
Zellauszählungen
mit Wright-Giemsa angefärbt.
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Die
Verabreichung des für
B18 kodierenden Adenovirus führte
zu einem beachtlichen Anstieg an peripheren Blut-Neutrophilen und
WBC (4). Maximale Anstiege von Neutrophilen
wurden an Tag 5 und Tag 7 beobachtet. Die Kontrollmäuse zeigten
an Tag 5 und Tag 7 wenig Unterschiede. An Tag 21 waren Neutrophile aus
peripherem Blut in den Kontrollmäusen
und in Mäusen,
die B18 empfingen, ähnlich.
Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der B18-Gruppe wurde auch ein Anstieg von weißen Blutzellen
beobachtet. Die Mäuse, die
B18 empfangen hatten, hatten zwischen Tag 2 und Tag 7 einen größeren Anstieg
an WBC. An Tag 21 wurde in der B-Gal-Gruppe ein deutlicherer Anstieg
beobachtet. Es wurden keine Veränderungen
in anderen Zellchemien beobachtet (Tabelle I).
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Der
Zellaufbau des Knochenmarks wurde aus gepoolten Oberschenkelknochen
in jeder Gruppe berechnet (Tabelle III). In keiner Gruppe wurden
signifikante Unterschiede festgestellt. Bei hämopoetischen Vorläufern aus
Knochenmark von den Tagen 7, 14 und 21 wurden keine signifikanten
Veränderungen
festgestellt. Die CFU-GM, BFU-E und CFU-MEG in den B18-Mäusen waren ähnlich zu
denen der B-Gal-Kontrolle (Tabelle II).
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Die
Verabreichung des für
B18 kodierenden Adenovirus führte
zu an Tag 7 zu einem Anstieg an CFU-GM (myeloischen) und BFU-E (erythroiden)
Vorläufern
in der Milz, im Vergleich zu Tieren, die das B-Gal-Virus empfangen
hatten. Der Anstieg an Vorläufern
in den B18-Mäusen
war 11-fach für
CFU-GM und 52-fach
für BFU-E
(Tabelle II). Für
die B18-Mäuse
gab es einen 2-fachen Anstieg von CFU-MEG an Tag 7. An Tag 21 wurden
zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede an CFU-MEG
oder BFE-U aus Milz festgestellt (Tabelle II). Bei Mäusen, die
den für
B18 kodierenden Adenovirus empfangen hatten, wurde eine 3-fache
Abnahme an CFU-GM festgestellt. In der B18-Gruppe wurde an Tag 7 eine leichte Vergrößerung der Milz
festgestellt. Dies ist konsistent mit einer Zunahme des Zellaufbaus
in der Milz. An Tag 14 und Tag 21 waren die Gewichte der Milz ähnlich zu
denen der Kontrollgruppe (Tabelle III). Makroskopische Analyse der
Milz zeigte eine Zunahme der extramedullären Hämopoese der Milz in den B18-Mäusen an
Tag 7 im Vergleich zur Kontrolle.
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Die
Verhältnisse
myeloisch:erythroid in Knochenmark (Tabelle IV) legen eine granulozytische
Hyperplasie mit einer möglichen
erythroiden Hyperplasie in Mäusen,
die den B18-Adenovirus empfangen hatten, an Tag 7 nahe. An Tag 21
war das Verhältnis
in der B-Gal-Gruppe höher.
In den IL-6 Serumkonzentrationen wurden keine Veränderungen
festgestellt.
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Diese
Ergebnisse zeigen eine hämopoetische
Aktivität,
die mit der Verabreichung von für
B18 (humanes CTLA-8) kodierendem Adenovirus assoziiert ist. In Tieren,
die den B18-Adenovirus empfangen hatten, wurden an Tag 7 Anstiege
an Neutrophilen und weißen
Blutzellen beobachtet. Die Daten zeigten, dass B18 im Vergleich
zu den Kontrolltieren an Tag 7 zu einer Zunahme an CFU-GM und BFU-E
aus Milz führte.
Die extramedulläre
Hämopoese
der Milz an Tag 7 legt nahe, dass B18 eine hämopoetische Wachstumsaktivität hat. Diese
Daten legen nahe, dass B18 frühe
hämopoetische
Vorläufer
mobilisieren könnte.
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Tabelle
I: Periphere Hämatologie
für die
Tage 2, 5, 7, 10, 14 und 21
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Tabelle
II: Hämopoetische
Vorläufer
aus Knochenmark und Milz
-
Hämopoetische
Vorläufer
wurden aus gepoolten Milz- und Knochenmarksproben von vier Tieren
in jeder Gruppe bestimmt. Für
die Quantifizierung von CFU-GM und BFU-E wurden entweder 1 × 104 Knochenmarkszellen oder 1 × 105 Milzzellen zu alpha-Methylcellulose-Komplettmedium (0,9%
Methylcellulose in alpha-Medium, 30% fötales Rinderserum, 1% Rinderserumalbumin,
10-4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin,
2% konditioniertes Maus-Milzzell-Medium und 3 U/ml Erythropoietin)
zugegeben und in einem Endvolumen von 1,0 ml in 35 mm Gewebekulturschalen
aliquotiert. Die Kulturen wurden 7 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.
Mikroskopische Kolonien waren als Cluster von 50 oder mehr Zellen
definiert. Für
die Quantifizierung von CFU-MEG wurden entweder 1 × 105 Knochenmarkszellen oder 1 × 106 Milzzellen zu alpha-Methylcellulose-Komplettmedium zugegeben
und inkubiert, wie vorstehend beschrieben. Megakaryozyten-Kolonien
waren definiert als eine Gruppe von 3 oder mehr Zellen.
- *
Vorläufer
aus Knochenmark sind angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichung
der Anzahl von Kolonien pro 105 Zellen.
- ** Vorläufer
aus Milz sind angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichung der Anzahl
von Kolonien pro 106 Zellen.
-
Tabelle
III: Milzgewichte und Zellaufbau von Oberschenkelknochen
-
Milzgewichte
wurden zum Zeitpunkt der Opferung bestimmt und sind angegeben als
der Mittelwert ± Standardabweichung
von vier Tieren.
-
Tabelle
IV: Verhältnisse
myeloisch:erythroid in Knochenmark
-
Alle
Einträge
stellen die Anzahl von myeloischen Zellen pro 1 erythroide Zelle
dar. Normale Verhältnisse
in der Maus liegen bei annähernd
1:1 bis 2:1.
-
Beispiel 5
-
Zusätzliche
Experimente bezüglich
der hämopoetischen
Aktivität
von humanem CTLA-8
-
B18
(humanes CTLA-8) wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Produktion
von Faktoren mit hämopoetischer
Aktivität
in einem Faktor-abhängigen
Zell-Proliferationsassay
unter Verwendung der humanen erythroleukämischen Zelllinie TF1 (Kitamura
et al., J. Cell. Physiol. 140: 323 (1989)) zu induzieren. Die Zellen
wurden anfangs in der Gegenwart von rhGMCSF (100 U/ml) angezogen.
Die Zellen wurden drei Tage vor dem Einrichten des Assays gefüttert. Die
Assaybedingungen waren wie folgt:
Zellen/Vertiefung | 5000/200 μl |
Inkubationszeitraum | 3
Tage |
Pulsdauer | 4
Stunden |
Menge
an tritiiertem Thymidin | 0,5 μCi-Vertiefung |
Auszählzeitraum | 1
Minute |
Replica | 2 |
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B18
alleine, konditioniertes Medium (CM) aus B18-induzierten HS-5-Zellen
wurden getestet. Puffer alleine, CM aus mit Puffer induzierten HS-5-Zellen
und CM aus nicht-induzierten HS-5-Zellen wurden als Kontrollen getestet.
Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. B18 (humanes CTLA-8)
zeigte eine Fähigkeit,
die Produktion von Faktoren zu induzieren, welche eine Proliferation
von TF-1 induzierten. Diese Aktivität wurde durch eine Zugabe von
anti-GMCSF-Antikörpern im
Wesentlichen eliminiert. Diese Daten zeigen, dass das humane CTLA-8
(B18) fähig
ist, eine Hämopoese
zu induzieren. Ohne sich an eine Theorie zu binden scheint es insbesondere,
dass humanes CTLA-8 (B18) eine Produktion von GM-CSF und/oder IL-3
induziert.
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Beispiel 6
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Fähigkeit von humanem CTLA-8,
eine Produktion von IL-6 und IL-8 zu induzieren
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MRC5-Zellen
wurden in der Gegenwart von humanem CTLA-8 (B18) inkubiert, und
die Produktion von IL-6 und IL-8 wurde gemessen. Herpes CTLA-8 (IL-17)
wurde als eine positive Kontrolle verwendet. Das humane CTLA-8 (B18)
der Anmelder zeigte eine austitrierbare Produktion von sowohl IL-6
als auch IL-8 (siehe die 6 und 7).
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