DE69634726T2 - Menschliche ctla-8 und verwendung von ctla-8 ähnlichen proteinen - Google Patents

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Description

  • Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der Anmeldung US 08/504,032 (nicht erteilt) und eine Continuation-in-part von US 5,707,829 .
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft humane CTLA-8 Proteine, für derartige Proteine kodierende Nukleinsäuren, und die Verwendung davon zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten, wie in Anspruch 11 angegeben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Cytokine sind sezernierte Proteine, die auf spezifische hämopoetische Zielzellen wirken, um ein Differenzierungsereignis hervorzurufen, oder auf andere Zielzellen, um eine besondere physiologische Reaktion zu induzieren, wie etwa die Sezernierung von Proteinen, welche für eine Entzündung charakteristisch sind. Cytokine, verschiedentlich auch als Lymphokine, Hämopoetine, Interleukine, Kolonie-stimulierende Faktoren und dergleichen bekannt, können wichtige therapeutische Mittel sein, insbesondere für Krankheiten oder Zustände, bei denen eine spezifische T-Zell-Population abgereichert ist. Beispielsweise sind Erythropoietin, G-CSF sowie GM-CSF für die Behandlung von Anämie bzw. Leukopenie wichtig geworden. Andere Cytokine wie etwa Interleukin-3, Interleukin-6, Interleukin-11 und Interleukin-12 sind viel versprechend für die Behandlung von Zuständen wie etwa Thrombozytopenie und eine Modulation der Immunreaktion.
  • Aus diesen Gründen wurden erhebliche Forschungsanstrengungen in der Suche nach neuen Cytokinen und der Klonierung der für sie kodierenden DNA unternommen. In der Vergangenheit wurden neue Cytokine identifiziert durch Testen einer besonderen Zelle wie etwa einer Knochenmarkszelle auf eine messbare Reaktion, wie etwa Proliferation. Die Suche nach neuen Cytokinen war somit durch die zur Verfügung stehenden Assays beschränkt, und wenn ein neues Cytokin eine Aktivität hat, welche durch einen bekannten Assay nicht gemessen werden kann, bleibt das Cytokin unauffindbar. In einem neueren Ansatz wurden für Cytokine kodierende cDNA nachgewiesen durch die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und von Oligonukleotidprimern, die eine Homologie zu gemeinsamen Motiven von bekannten Cytokinen oder deren Rezeptoren aufweisen. Der PCR-Ansatz ist ebenfalls durch die Notwendigkeit einer Kenntnis von zuvor klonierten Cytokinen in der gleichen Proteinfamilie beschränkt. Cytokine wurden auch durch die Verwendung von subtraktiver Hybridisierung zum Konstruieren und Screenen von cDNA-Bibliotheken kloniert, oder sie könnten potentiell kloniert werden durch die Verwendung von PCR, gefolgt von Gelelektrophorese, um differentiell exprimierte Gene nachzuweisen. Die subtraktiven Hybridisierungsmethoden beruhen auf der Annahme, dass die Cytokin-mRNA diejenigen sind, welche differentiell exprimiert werden, und diese Methoden erfordern keine Vorabkenntnis der interessierenden Sequenz. Viele Cytokine könnten jedoch von mRNA kodiert werden, welche nicht differentiell exprimiert werden, und sind somit durch die Verwendung dieser Methoden nicht nachweisbar.
  • Es wäre wünschenswert, neue Methoden zur Identifizierung von neuen Cytokinen und anderen sezernierten Faktoren zu entwickeln, und die für sie kodierenden Polynukleotide zu isolieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurden Verfahren verwendet, die selektiv Polynukleotide identifizieren, welche für sezernierte Proteine kodieren. Ein derartiges Polynukleotid wurde isoliert, das für "humanes CTLA-8" kodiert. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Polynukleotide, die für humanes CTLA-8 und aktive Fragmente davon kodieren, offenbart. "CTLA-8" wird in der vorliegenden Beschreibung verwendet um sowohl Proteine als auch Polynukleotide, die für diese Proteine kodieren, zu bezeichnen, und um Proteine und Polynukleotide aus allen Säugerspezies zu bezeichnen.
  • In einer bestimmten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544,
    • (b) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der in (a) definierten Nukleotidsequenz infolge von Degeneriertheit des genetischen Codes abweicht, wobei die Sequenz für humanes CTLA-8 Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert.
  • Die Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid bereit, umfassend eine allelische Variante der Nukleotidsequenz, welche SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544 umfasst, wobei die Nukleotidsequenz für ein CTLA-8 Protein mit CTLA-8 Aktivität kodiert, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität.
  • Bevorzugt kodiert das erfindungsgemäße Polynukleotid für ein Protein mit CTLA-8 Aktivität. In anderen Ausführungsformen ist das Polynukleotid operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynukleotid in einem zur in vivo Expression in einem Säuger geeigneten Vektor enthalten. Polynukleotide, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 55 bis Nukleotid 544, die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 139 bis Nukleotid 544, oder die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 86 bis Nukleotid 544 umfassen, sind besonders bevorzugt.
  • Es werden auch Wirtszellen bereitgestellt, die mit dem erfindungsgemäßen Polynukleotid transformiert sind, umfassend Säugerzellen.
  • Es werden auch Verfahren zur Herstellung eines humanen CTLA-8 Proteins bereitgestellt, wobei die Verfahren umfassen:
    • (a) Anziehen einer Kultur der erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium, und
    • (b) Reinigen des humanen CTLA-8 Proteins aus der Kultur.
  • Es wird auch ein isoliertes humanes CTLA-8 Protein bereitgestellt, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2,
    • (b) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 11 bis 163,
    • (c) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 29 bis 163,
    • (d) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 31 bis 163, und
    • (e) Fragmenten von (a), (b), (c) oder (d) mit CTLA-8 Aktivität, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität.
  • Proteine, welche die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfassen und die Sequenz von Aminosäure 29 bis 163, von Aminosäure 31 bis 163, oder von Aminosäure 11 bis 163 von SEQ ID NO: 2 umfassen, sind besonders bevorzugt. Bevorzugt hat das Protein CTLA-8 Aktivität. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein erfindungsgemäßes CTLA-8 Protein und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Es sind auch Zusammensetzungen offenbart, welche einen Antikörper umfassen, der spezifisch mit einem erfindungsgemäßen humanen CTLA-8 Protein reagiert.
  • Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes humanes CTLA-8 Protein und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, bereit.
  • CTLA-8 aus Ratte und aktive Fragmente davon (d.h. mit CTLA-8 Aktivität) können ebenfalls in derartigen Behandlungsverfahren verwendet werden. Bevorzugt wird das Protein aus Ratte als eine Zusammensetzung verabreicht, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4,
    • (b) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 von Aminosäure 18 bis 150, und
    • (c) Fragmenten von (a) oder (b) mit CTLA-8 Aktivität.
  • Herpesvirus Saimiri ORF 13, hierin als Herpes CTLA-8 bezeichnet, und aktive Fragmente davon (d.h. mit CTLA-8 Aktivität) und aktive Fragmente davon können ebenfalls in derartigen Behandlungsverfahren verwendet werden. Bevorzugt wird das Herpes CTLA-8 Protein als eine Zusammensetzung verabreicht, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6,
    • (b) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 von Aminosäure 19 bis 151, und
    • (c) Fragmenten von (a) oder (b) mit CTLA-8 Aktivität.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Säugers bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und IL-17 oder ein aktives Fragment davon.
  • Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, umfassend ein humanes CTLA-8 Protein, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Inhibition von Angiogenese, Inhibition von Wachstum oder Proliferation von vaskulären Endothelzellen, Inhibition von Tumorwachstum, Inhibition von Angiogenese-abhängigem Gewebewachstum, Proliferation von myeloischen Zellen oder Vorläufern, Proliferation von erythroiden Zellen oder Vorläufern, Proliferation von lymphoiden Zellen oder Vorläufern, Induktion einer Produktion von IFNγ, Induktion einer Produktion von IL-3 und Induktion einer Produktion von GM-CSF bereit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Vergleich von homologen Regionen der Aminosäuresequenzen von humanem CTLA-8 (bezeichnet als "B18_F1"), CTLA-8 aus Ratte (bezeichnet als "Musctla8") und Herpes CTLA-8 (bezeichnet als "Hsvie_2).
  • 2 bildet Autoradiogramme ab, welche die Expression von humanem CTLA-8 in COS-Zellen zeigen.
  • 3 präsentiert Daten, welche die Fähigkeit von humanem CTLA-8, die Angiogenese zu inhibieren, betreffen.
  • Die 4 und 5 präsentiert Daten, welche die Fähigkeit von humanem CTLA-8, hämopoetische Aktivität zu erzeugen oder zu induzieren, betreffen.
  • Die 6 und 7 präsentieren Daten, welche die Fähigkeit von humanem CTLA-8, die Produktion von IL-6 und IL-8 zu induzieren, zeigen.
  • Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben ein Polynukleotid, das für ein humanes CTLA-8 Protein kodiert, identifiziert und bereitgestellt. SEQ ID NO: 1 stellt die Nukleotidsequenz einer cDNA bereit, welche für das humane CTLA-8 Protein kodiert. SEQ ID NO: 2 stellt die Aminosäuresequenz des humanen CTLA-8 Proteins bereit. Alternativ kann das Startmethionin bei Aminosäure 11 von SEQ ID NO: 2 sein. Auf Basis Amino-terminaler Sequenzierung wird angenommen, dass die reife Proteinsequenz an Aminosäure 31 von SEQ ID NO: 2 beginnt (kodiert durch die mit Nukleotid 146 von SEQ ID NO: 1 beginnende Sequenz).
  • Die Region von Aminosäure 29 bis Aminosäure 163 von humanem CTLA-8 (SEQ ID NO: 2) zeigt eine erhebliche Homologie zu Abschnitten von CTLA-8 aus Ratte (Aminosäuren 18 bis 150 von SEQ ID NO: 4) und Herpesvirus Saimiri ORF 13 ("Herpes CTLA-8") (Aminosäuren 19 bis 151 von SEQ ID NO: 5). Eine für CTLA-8 aus Ratte kodierende cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3 aufgelistet, und ihre entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 4 angegeben. Eine für Herpes CTLA-8 kodierende cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 5 aufgelistet und ihre entsprechende Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 6 angegeben. Die Homologie zwischen CTLA-8 aus Ratte und Herpes CTLA-8 wurde von Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150, 5445–5456 veröffentlicht.
  • Die Anmelder hatten zuvor fälschlicherweise festgestellt, dass die Ratte-Sequenzen von SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 CTLA-8 aus Maus entsprächen. Das humane CTLA-8 (B18) der Anmelder weist ebenfalls eine Homologie zu der tatsächlichen CTLA-8 Sequenz aus Maus auf.
  • Golstein et al. (WO 95/18826; Fossiez et al., Microbial Evasion and Subversion of Immunity 544: 3222 (Zusammenfassung)) haben ebenfalls über eine Spezies berichtet, die sie anfänglich als "humanes CTLA-8" identifizierten. Eine Untersuchung der Sequenz der Spezies von Golstein et al. und der humanen CTLA-8 Sequenz (B18) der vorliegenden Erfindung zeigt jedoch rasch, dass dies zwei unterschiedliche Proteine sind, obwohl sie zueinander homolog sind und zu CTLA-8 aus Ratte und Herpes CTLA-8, hierin identifiziert. Die Spezies von Golstein et al. wurde nunmehr zu Interleukin-17 (IL-17) umbenannt.
  • Aufgrund der Homologie zwischen dem humanen CTLA-8 (B18) der Anmelder und IL-17 wird erwartet, dass diese Proteine manche Aktivitäten gemeinsam haben.
  • Es ist auch vorläufig bestimmt worden, dass humanes CTLA-8 (B18) bei Expression Homodimere bildet. Als ein Ergebnis können humane CTLA-8 Proteine Aktivität entweder in der monomeren oder der dimeren Form aufweisen. Humane CTLA-8 Proteine können auch als Heterodimere mit CTLA-8 Protein aus Ratte und Herpes CTLA-8 Protein, und mit humanem IL-17 produziert werden. Es wird erwartet, dass diese Heterodimere Aktivitäten der Proteine, aus denen sie zusammengesetzt sind, aufweisen.
  • Formen von humanem CTLA-8 Protein mit einer Länge von weniger als Volllänge werden von der vorliegenden Erfindung umfasst, und können produziert werden durch Expression eines entsprechenden Fragments des für humanes CTLA-8 Protein kodierenden Polynukleotids (SEQ ID NO: 1). Diese entsprechenden Polynukleotidfragmente sind ebenfalls ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Modifizierte Polynukleotide wie vorstehend beschrieben können durch molekularbiologische Standardtechniken hergestellt werden, umfassend Stellen-gerichtete Mutagenesemethoden, die in der Technik bekannt sind, oder durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung geeigneter Oligonukleotidprimer.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung hat ein Protein "CTLA-8 Aktivität", wenn es (1) in einem Faktor-abhängigen Zellproliferationsassay biologische Aktivität aufweist (bevorzugt in einem Assay, in dem das Volllänge-CTLA-8 der entsprechenden Spezies aktiv ist) (umfassend ohne Einschränkung die nachstehend beschriebenen Assays), oder (2) Expression oder Sezernierung von γ-IFN induziert, oder (3) chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität in einem Chemoattraktionsassay oder einem Chemotaxisassay aufweist (bevorzugt in einem Assay, in dem das Volllänge-CTLA-8 der entsprechenden Spezies aktiv ist), oder (4) Expression oder Sezernierung von IL-3 oder GM-CSF induziert.
  • Humanes CTLA-8 Protein oder Fragmente davon mit CTLA-8 Aktivität können an Trägermoleküle wie etwa Immunglobuline fusioniert werden. Beispielsweise kann humanes CTLA-8 Protein durch "Linker"-Sequenzen and den Fc-Abschnitt eines Immunglobulins fusioniert werden.
  • Die Erfindung umfasst auch allelische Varianten der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz, d.h. natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids von SEQ ID NO: 1, welche ebenfalls für humanes CTLA-8 oder CTLA-8 Proteine mit CTLA-8 Aktivität kodieren. Ebenfalls sind isolierte Polynukleotide von der Erfindung umfasst, welche an die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleotidsequenz unter hoch stringenten (0,2 × SSC bei 65°C), stringenten (z.B. 4 × SSC bei 65°C oder 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C), oder relaxierten Bedingungen (4 × SSC bei 50°C oder 30–40% Formamid und 4 × SSC bei 42°C) hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, welche für humanes CTLA-8 Protein kodieren, aber aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz abweichen, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Variationen in der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 angegeben, welche verursacht sind durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen, welche die CTLA-8 Aktivität, die Halbwertszeit oder das Produktionsniveau verstärken, sind ebenfalls von der Erfindung umfasst.
  • Die isolierten Polynukleotide der Erfindung können operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft sein, wie etwa den in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485–4490 (1991) offenbarten Expressionsvektoren pMT2 oder pED, um das CTLA-8 Protein rekombinant zu produzieren. In der Technik sind viele geeignete Expressionskontrollsequenzen bekannt. Allgemeine Methoden zur Expression rekombinanter Proteine sind ebenfalls bekannt und beispielhaft ausgeführt in R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537–566 (1990). Wie hierin definiert bedeute "operativ verknüpft" enzymatisch oder chemisch ligiert, wobei eine kovalente Bindung zwischen dem isolierten Polynukleotid der Erfindung und der Expressionskontrollsequenz gebildet ist, in einer derartigen Weise, so dass das CTLA-8 Protein durch eine Wirtszelle exprimiert wird, die mit der ligierten Polynukleotid/Expressionskontrollsequenz transformiert (transfiziert) worden ist.
  • Eine Reihe von Zelltypen kann als geeignete Wirtszellen zur Expression des humanen CTLA-8 Proteins verwendet werden. Es kann jeder Zelltyp verwendet werden, der ein funktionales humanes CTLA-8 Protein exprimieren kann. Geeignete Säugerwirtszellen umfassen beispielsweise COS Affenzellen, Eierstockzellen von chinesischem Hamster (CHO), humane 293 Nierenzellen, humane A431 Epidermiszellen, humane Colo205-Zellen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primatenzelllinien, normale diploide Zellen, aus der in vitro Kultur von Primärgewebe abgeleitete Zelllinien, Primärexplantate, HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12 oder C2C12 Zellen.
  • Das humane CTLA-8 Protein kann auch produziert werden, indem das isolierte Polynukleotid der Erfindung operativ mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insektenexpressionsvektoren verknüpft wird und ein Insektenexpressionssystem verwendet wird. Materialien und Methoden für Baculovirus/Insektenzelle-Expressionssysteme sind in Form eines Kits kommerziell erhältlich, z.B. von Invitrogen, San Diego, Kalifornien, USA (das MaxBac® Kit), und derartige Methoden sind in der Technik gut bekannt, wie beschrieben in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), das durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Lösliche Formen des humanen CTLA-8 Proteins können ebenfalls in Insektenzellen hergestellt werden, unter Verwendung geeigneter isolierter Polynukleotide wie vorstehend beschrieben.
  • Alternativ kann das humane CTLA-8 Protein in niederen Eukaryonten wie etwa Hefe oder in Prokaryonten wie etwa Bakterien hergestellt werden. Geeignete Hefestämme umfassen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-Stämme, Candida, oder jeden beliebigen Hefestamm, welcher heterologe Proteine exprimieren kann. Geeignete Bakterienstämme umfassen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, oder jeden beliebigen Bakterienstamm. welcher heterologe Proteine produzieren kann.
  • Das humane CTLA-8 Protein der Erfindung kann auch als ein Produkt von transgenen Tieren produziert werden, d.h. als eine Komponente der Milch von transgenen Kühen, Ziegen, Schweinen oder Schafen, welche durch somatische Zellen oder Keimbahnzellen gekennzeichnet sind, die eine für das humane CTLA-8 Protein kodierende Polynukleotidsequenz enthalten.
  • Das humane CTLA-8 Protein der Erfindung kann hergestellt werden durch Anziehen einer Kultur von transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, welche für die Expression des gewünschten Proteins erforderlich sind. Das resultierende exprimierte Protein kann danach aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten gereinigt werden. Lösliche Formen des humanen CTLA-8 Proteins der Erfindung können aus konditionierten Medien gereinigt werden. Membran-gebundene Formen von humanem CTLA-8 Protein der Erfindung können gereinigt werden, indem man eine Gesamtmembranfraktion aus der exprimierenden Zelle herstellt und die Membranen mit einem nicht-ionischen Detergens wie etwa Triton X-100 extrahiert.
  • Das humane CTLA-8 Protein kann unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise kann das humane CTLA-8 Protein der Erfindung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Konzentrationsfilters für Proteine, beispielsweise einer Amicon oder Millipore Ultrafiltrationseinheit, aufkonzentriert werden. Nach dem Aufkonzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie etwa ein Gelfiltrationsmedium aufgetragen werden. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit Diethylaminoethyl-Seitengruppen (DEAE). Die Matrices können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Typen sein, welche üblicherweise bei der Reinigung von Proteinen verwendet werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt verwendet werden. Geeignete Kationenaustauscher umfassen verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen umfassen. Sulfopropyl-Gruppen sind bevorzugt (z.B. S-Sepharose®-Säulen). Die Reinigung des humanen CTLA-8 Proteins aus Kulturüberstand kann auch einen oder mehrere Säulenschritte über Affinitätsharze wie etwa Concavalin A-Agarose, Heparin-Toyopearl® oder Cibachrom blue 3GA Sepharose® umfassen, oder hydrophobe-Wechselwirkung-Chromatographie unter Verwendung von Harzen wie etwa Phenylether, Butylether oder Propylether, oder Immunaffinität-Chromatographie. Schließlich können einer oder mehrere Reversphase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC Medien, z.B. Silikagel mit Methylseitengruppen oder anderen aliphatischen Seitengruppen, angewandt werden um das humane CTLA-8 Protein weiter zu reinigen. Es können auch manche oder alle der vorstehend genannten Reinigungsschritte in verschiedenen Kombinationen oder in Kombination mit anderen bekannten Methoden angewandt werden um ein im Wesentlichen gereinigtes isoliertes rekombinantes Protein bereitzustellen.
  • Bevorzugt wird das humane CTLA-8 Protein gereinigt, so dass es im Wesentlichen frei von anderen Säugerproteinen ist.
  • Es wird angenommen, dass humanes CTLA-8, aktive Fragmente und Varianten davon, und CTLA-8-verwandte Proteine (wie beispielsweise etwa CTLA-8 aus Ratte und Herpes CTLA-8) (kollektiv "CTLA-8 Proteine") Cytokin-Aktivitäten aufweisen oder induzieren. Die Expression von humanem CTLA-8 korrelierte mit einer Expression von γ-IFN in induzierten Primärzellen, und kann die Expression von IL-3 und/oder GM-CSF induzieren, wobei diese Expression wiederum Effekte erzeugen kann, die mit dem induzierten Cytokin assoziiert sind. Daher können humanes CTLA-8 und CTLA-8-verwandte Proteine eine Wirkung auf die Proliferation oder Funktion von myeloischen Zellen, erythroiden Zellen, lymphoiden Zellen und deren Vorläufern haben. Humane CTLA-8 Proteine können auch eine Rolle bei der Bildung von Plättchen oder deren Vorläufern haben.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung könnte Cytokin-Aktivität, Zellproliferationsaktivität (entweder induzierend oder inhibierend) oder Zelldifferenzierungsaktivität (entweder induzierend oder inhibierend) aufweisen oder es könnte eine Induktion von anderen Cytokinen in bestimmten Zellpopulationen induzieren. Viele der bisher entdeckten Proteinfaktoren, einschließlich aller bekannten Cytokine, haben in einem oder mehreren Faktor-abhängigen Zellproliferationsassays eine Aktivität gezeigt, und daher dienen diese Assays als eine bequeme Bestätigung von Cytokin-Aktivität. Die Aktivität eines Proteins der vorliegenden Erfindung wird nachgewiesen durch einen beliebigen einer Reihe von routinemäßigen Faktor-abhängigen Zellproliferationsassays für Zelllinien, umfassend ohne Einschränkung 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+(preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e und CMK.
  • Die Aktivität eines Proteins der Erfindung kann unter Anderem durch die nachfolgenden Methoden gemessen werden:
    Assays für die Proliferation von T-Zellen oder Thymozyten umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706–1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756–1761, 1994.
    Assays für die Cytokin-Produktion und/oder Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M., und Shevach, E. M., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 3.12.1–3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurements of mouse and human Interferon γ, Schreiber, R. D., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.8.1–6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
    Assays für die Proliferation und Differenzierung von hämopoetischen und lymphopoetischen Zellen umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Measurement of Human und Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davies, L. S., und Lipsky, P. E., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.3.1–6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173: 1205–1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690–692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931–2938, 1983; Measurements of mouse and human interleukin 6, Nordan, R., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.6.1–6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1857–1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11, Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C., und Turner, K. J., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.15.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9, Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C., und Turner, K. J., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
    Assays für Reaktionen von T-Zell-Klonen auf Antigene (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die APC-T-Zell-Interaktionen beeinflussen sowie direkte Wirkungen von T-Zellen dirigieren, durch Messung von Proliferation und Cytokin-Produktion) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines and their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091–6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405–411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann auch immunstimulierende oder immunsupprimierende Aktivität aufweisen, umfassend ohne Einschränkung diejenigen Aktivitäten, für welche Assays hierin beschrieben sind. Ein Protein kann bei der Behandlung von verschiedenen Immundefizienzen und Immunstörungen (umfassend schwere kombinierte Immundefizienz (SCID)) nützlich sein, z.B. indem es das Wachstum und die Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten reguliert (nach oben oder unten) sowie die cytolytische Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen beeinflusst. Diese Immundefizienzen können genetisch bedingt sein oder durch virale (z.B. HIV) sowie bakterielle Infektionen oder Pilzinfektionen verursacht sein, oder aus Autoimmunstörungen resultieren. In genaueren Worten könnten Infektionserkrankungen, hervorgerufen durch Viren, Bakterien, Pilze oder eine andere Infektion, unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelbar sein, umfassend Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobakterien, Leishmania, Malaria, und verschiedene Pilzinfektionen wie etwa Candida. Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann in dieser Hinsicht natürlich auch nützlich sein, wenn allgemein ein Boost für das Immunsystem angezeigt ist, d.h. bei der Behandlung von Krebs.
  • Autoimmunerkrankungen, die unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen beispielsweise multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, Autoimmun-Lungenentzündung, Guillan-Barre-Syndrom, Autoimmun-Thyreoiditis, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-Wirt-Reaktion, und Autoimmun-Augenentzündung. Ein derartiges Protein der vorliegenden Erfindung kann auch bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen nützlich sein, wie etwa bei Asthma oder anderen Atembeschwerden. Andere Zustände, bei denen eine Immunsuppression erwünscht ist (beispielsweise umfassend Asthma und verwandte Atembeschwerden) könnten ebenfalls unter Verwendung eines Proteins der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung könnte auch chronische oder akute Entzündung supprimieren, wie etwa beispielsweise die mit Infektion assoziierte (wie etwa bei septischem Schock oder systemischem Entzündungsreaktionssyndrom (SIRS)), entzündliche Darmerkrankung, Morbus Crohn, oder die aus einer Überproduktion von Cytokinen wie etwa TNF oder IL-1 resultierende (wie etwa die durch IL-11 gezeigte Wirkung).
  • Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann unter Anderem durch die nachfolgenden Methoden gemessen werden:
    Geeignete Assays für die Cytotoxizität von Thymozyten oder Splenozyten umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488–2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985, Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488c2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968–1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564–1572, 1985, Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Bowman et al., J. Virology 61: 1992–1998; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327–341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079–3092, 1994.
    Assays für T-Zell-abhängige Immunglobulin-Reaktionen und Isotyp-Switching (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die T-Zell-abhängige Antikörperreaktionen modulieren und Th1/Th2-Profile beeinflussen) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028–3033, 1990; und in Assays for B Cell function: in vitro antibody production, Mond, J. J., und Brunswick, M., in Current Protocols in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan et al., Vol. 1, Seiten 3.8.1–3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
    Assays für die gemischte Lymphozyten-Reaktion (MLR) (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die vorwiegend Th1 und CTL Reaktionen erzeugen), umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, herausgegeben von J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Green Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1–3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494–3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508–512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778–3783, 1992.
    Assays, die von Dendritenzellen abhängen (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, welche von Dendritenzellen exprimiert werden, die naive T-Zellen aktivieren), umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Guery et al., J. Immunol. 134: 536–544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549–559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071–5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255–260, 1995; Nair et al, Journal of Virology 67: 4062–4069, 1993; Huang et al, Science 264: 961–965, 1994, Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255–1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797–807, 1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631–640, 1990.
    Assays für das Überleben/die Apoptose von Lymphozyten (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die eine Apoptose nach Induktion durch ein Superantigen verhindern, und Proteine, welche die Homöostase von Lymphozyten regulieren) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795–808, 1992; Gorczyka et al., Leukemia 7: 659–670, 1993, Gorczyka et al., Cancer Research 53: 1945–1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233–243; 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037–4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891–897, 1993; Gorczyka et al., International Journal of Oncology 1: 639–648, 1992.
    Assays für Proteine, welche frühe Stadien der Festlegung und Entwicklung von T-Zellen beeinflussen, umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Antica et al., Blood 84: 111–117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111–122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770–2778, 1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7548–7551, 1991.
  • Ein Protein der vorliegenden Erfindung könnte bei der Regulation der Hämopoese nützlich sein, und demzufolge bei der Behandlung von Defizienzen myeloischer oder lymphoider Zellen. Sogar eine marginale unterstützende biologische Aktivität von Kolonie-bildenden Zellen oder von Faktor-abhängigen Zelllinien deutet auf eine Beteiligung an der Regulation der Hämopoese hin, z.B. eine Unterstützung des Wachstums oder der Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen, wodurch ein Nutzen angezeigt wird, beispielsweise bei der Behandlung von verschiedenen Anämien oder zur Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie zur Stimulation der Produktion von erythroiden Vorläuferzellen und/oder erythroiden Zellen; zur Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von myeloischen Zellen wie etwa Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (d.h. traditionelle CSF Aktivität), was beispielsweise in Verbindung mit Chemotherapie nützlich ist um eine daraus resultierende Myelosuppression zu verhindern; zur Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von Megakaryozyten und demzufolge von Plättchen, wodurch eine Prävention oder Behandlung von verschiedenen Plättchenstörungen wie etwa Thrombozytopenie ermöglicht wird, und allgemein zur Verwendung anstatt oder als Ergänzung zu Plättchen-Transfusionen; und/oder zur Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von hämopoetischen Stammzellen, die fähig sind zu allen den vorstehend genannten hämopoetischen Zellen zu reifen und daher eine therapeutische Anwendung in verschiedenen Stammzellstörungen haben (wie etwa diejenigen, welche üblicherweise mit Transplantationen behandelt werden, umfassend ohne Einschränkung aplastische Anämie und krampfartige nächtliche Hämoglobinurie) sowie bei der Repopulation des Stammzellkompartments nach Bestrahlung/Chemotherapie, entweder in vivo oder ex vivo (d.h. in Verbindung mit Knochenmarkstransplantation) als normale Zellen oder genetisch manipulierte Zellen für eine Gentherapie.
  • Die Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann unter Anderem durch die nachfolgenden Methoden gemessen werden:
    Geeignete Assays für die Proliferation und Differenzierung von verschiedenen hämopoetischen Linien sind vorstehend zitiert.
    Assays für die Proliferation und Differenzierung embryonischer Stammzellen (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die hämopoetische Differentiationshämopoese beeinflussen) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Johansson et al., Cellular Biology 15: 141–151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473–486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903–2915, 1993.
    Assays für das Überleben und die Differenzierung von Stammzellen (welche unter Anderem Proteine identifizieren werden, die Lympho-Hämopoese regulieren) umfassen ohne Einschränkung diejenigen, welche beschrieben sind in: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M. G., in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 265–268, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5907–5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming celle with high proliferative potential, McNiece, I. K., und Briddell, R. A., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 23–39, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353–359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R. E., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 1–21, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Long Term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M., und Allen, T., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 163–179, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J., in Culture of Hematopoietic cells, Herausgeber R. I. Freshney et al., Vol., Seiten 139–162, Wiley-Liss Inc., New York, NY, 1994.
  • CTLA-8 Proteine sind nützlich bei der Behandlung von verschiedenen Immundefizienzen und Immunstörungen (umfassend SCID), z.B. durch Regulieren (nach oben oder unten) des Wachstums, der Proliferation und/oder der Aktivität von T- und/oder B-Lymphozyten sowie der zytolytischen Aktivität von NK-Zellen. Diese Immundefizienzen können durch virale (z.B. HIV) sowie bakterielle Infektionen verursacht sein, oder aus Autoimmunstörungen resultieren. In genaueren Worten könnten Infektionserkrankungen, hervorgerufen durch Viren, Bakterien, Pilze oder eine andere Infektion, durch die Verwendung von CTLA-8 Proteinen behandelbar sein, umfassend Infektionen durch HIV, Hepatitis, Influenza, CMV, Herpes, Mycobakterien, Leishmania, Malaria, und verschiedene Pilzinfektionen (wie etwa Candida). Die CTLA-8 Proteine können in dieser Hinsicht natürlich auch nützlich sein, wenn allgemein ein Boost für das Immunsystem angezeigt ist, d.h. bei der Behandlung von Krebs, oder als ein Adjuvans für Impfstoffe. Autoimmunerkrankungen, die unter Verwendung von Faktoren der vorliegenden Erfindung behandelt werden könnten, umfassen beispielsweise multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, Autoimmun-Lungenentzündung, Guillan-Barre-Syndrom, Autoimmun-Thyreoiditis, Insulin-abhängigen Diabetes mellitus, und Autoimmun-Augenentzündung. Es wird auch erwartet, dass die CTLA-8 Proteine bei der Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen geeignet sind.
  • Es wird auch erwartet, dass CTLA-8 Proteine chemotaktische Aktivität aufweisen. Wie hierin verwendet hat ein Protein oder Peptid "chemotaktische Aktivität", wenn es direkt oder indirekt die gerichtete Orientierung oder Bewegung von Zellen, umfassend myeloische und lymphoide Zellen, stimulieren kann. Bevorzugt weist das Protein oder Peptid die Fähigkeit auf, eine gerichtete Bewegung von Zellen (insbesondere von T-Zellen) direkt zu stimulieren. Ob ein besonderes Protein oder Peptid chemotaktische Aktivität für Zellen aufweist, kann leicht bestimmt werden, indem ein derartiges Protein oder Peptid in einem bekannten Assay für Zellchemotaxis eingesetzt wird.
  • CTLA-8 Proteine inhibieren auch das Wachstum und die Proliferation von vaskulären Endothelzellen. Als ein Ergebnis sind humane CTLA-8 Proteine wirksam, die Angiogenese (d.h. Bildung von Gefäßen) zu inhibieren. Diese Aktivität wird auch bei der Behandlung von Tumoren und anderen Zuständen, an denen Angiogenese beteiligt ist, nützlich sein. Eine Inhibition der Angiogenese durch humane CTLA-8 Proteine wird auch dazu führen, dass der Zustand, zu dem eine normale Angiogenese beitragen würde, inhibiert oder verhindert wird.
  • Isolierte CTLA-8 Proteine, aus Zellen gereinigt oder rekombinant produziert, können als eine pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, wenn mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger kombiniert. Eine derartige Zusammensetzung kann, zusätzlich zu CTLA-8 Protein und Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel und andere in der Technik gut bekannte Materialien enthalten. Der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" bedeutet ein nicht-toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des bzw. der Wirkstoffe nicht beeinträchtigt. Die charakteristischen Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Cytokine, Lymphokine oder andere hämopoetische Faktoren enthalten, wie etwa M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, γ-IFN, Stammzellenfaktor und Erythropoietin. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann thrombolytische oder anti-Thrombose-Faktoren enthalten, wie etwa Plasminogen-Aktivator und Faktor VIII. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch andere entzündungshemmende Faktoren enthalten. Derartige zusätzliche Faktoren und/oder Mittel können in die pharmazeutische Zusammensetzung aufgenommen werden um mit dem CTLA-8 Protein eine synergistische Wirkung zu erzeugen oder um Nebenwirkungen, die durch das CTLA-8 Protein hervorgerufen werden, zu minimieren. Umgekehrt kann CTLA-8 Protein in Formulierungen des besonderen Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktors, oder entzündungshemmenden Mittels aufgenommen werden um Nebenwirkungen des Cytokins, Lymphokins, anderen hämopoetischen Faktors, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktors, oder entzündungshemmenden Mittels zu minimieren.
  • Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form eines Liposoms vorliegen, in dem CTLA-8 Protein zusätzlich zu anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägern mit amphipathischen Mitteln, wie etwa Lipiden, kombiniert ist, welche in wässriger Lösung in aggregierter Form als Micellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristalle, oder lamellare Schichten vorliegen. Geeignete Lipide zur Formulierung von Liposomen umfassen ohne Einschränkung Monoglyzeride, Diglyzeride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren, und dergleichen. Die Herstellung derartiger liposomaler Formulierungen gehört zum üblichen Fachwissen, wie beispielsweise in US Patent Nr. 4,235,871, US Patent Nr. 4,501,728, US Patent Nr. 4,837,028 und US Patent Nr. 4,737,323 offenbart, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge jedes Wirkstoffs der pharmazeutischen Zusammensetzung oder Methode, welche ausreichend ist um einen bedeutungsvollen Nutzen für einen Patienten zu zeigen, z.B. eine Verbesserung von Symptomen von derartigen Zuständen, eine Heilung davon, oder erhöhte Heilungsrate. Bei Anwendung auf einen individuellen Wirkstoff bei alleiniger Verabreichung bezieht sich der Begriff auf diesen Wirkstoff alleine. Bei Anwendung auf eine Kombination bezieht sich der Begriff auf die kombinierten Mengen an Wirkstoffen, welche zu der therapeutischen Wirkung führen, unabhängig davon, ob in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht.
  • Bei der praktischen Durchführung des Behandlungsverfahrens oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird einem Säuger eine therapeutisch wirksame Menge an CTLA-8 Protein verabreicht. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann CTLA-8 Protein entweder alleine oder in Kombination mit anderen Therapien, wie etwa Behandlung unter Verwendung von Cytokinen, Lymphokinen oder anderen hämopoetischen Faktoren, verabreicht werden. Bei Verabreichung zusammen mit einem oder mehreren Cytokinen, Lymphokinen, anderen hämopoetischen Faktoren oder Impfstoffkomponenten (wie etwa Antigenen oder anderen Adjuvantien) kann CTLA-8 Protein entweder gleichzeitig mit dem bzw. den Cytokinen, Lymphokinen, anderen hämopoetischen Faktoren, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktoren verabreicht werden, oder zeitlich versetzt. Bei zeitlich versetzter Verabreichung wird der behandelnde Arzt über die geeignete Reihenfolge der Verabreichung von CTLA-8 Protein in Kombination mit dem bzw. den Cytokinen, Lymphokinen, anderen hämopoetischen Faktoren, thrombolytischen oder anti-Thrombose-Faktoren entscheiden.
  • Eine Verabreichung von CTLA-8 Protein, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung oder zur praktischen Ausführung des Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann auf eine Vielzahl von herkömmlichen Wegen erfolgen, wie etwa orale Einnahme, Inhalation, oder kutane, subkutane oder intravenöse Injektion. Intravenöse Verabreichung an den Patienten ist bevorzugt.
  • Bei oraler Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an CTLA-8 Protein wird das CTLA-8 Protein in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixirs vorliegen. Bei Verabreichung in Form einer Tablette kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen festen Träger wie etwa eine Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95% CTLA-8 Protein, und bevorzugt von etwa 25 bis 90% CTLA-8 Protein. Bei Verabreichung in flüssiger Form kann ein flüssiger Träger wie etwa Wasser, Petroleum; Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie etwa Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl, oder synthetische Öle zugegeben werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische Salzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung, oder Glykole wie etwa Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol enthalten. Bei Verabreichung in flüssiger Form enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% an CTLA-8 Protein, und bevorzugt von etwa 1 bis 50% CTLA-8 Protein.
  • Bei intravenöser, kutaner oder subkutaner Injektion einer therapeutisch wirksamen Menge an CTLA-8 Protein wird das CTLA-8 Protein in Form einer Pyrogen-freien parenteral akzeptablen wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung derartiger parenteral akzeptabler Proteinlösungen, im Hinblick auf deren pH-Wert, Isotonizität, Stabilität und dergleichen, ist dem Fachwissen zuzurechnen. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung für intravenöse, kutane oder subkutane Injektion sollte zusätzlich zu CTLA-8 Protein ein isotonisches Vehikel wie etwa Natriumchlorid-Injektionslösung, Ringer-Injektionslösung, Dextrose-Injektionslösung Dextrose und Natriumchlorid-Injektionslösung, milchsaure Ringer-Injektionslösung, oder ein anderes, in der Technik bekanntes Vehikel enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere dem Fachmann bekannte Additive enthalten.
  • Die Menge an CTLA-8 Protein in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird von der Art und der Schwere des zu behandelnden Zustands abhängen, und von der Art früherer Behandlungen, die der Patient durchgemacht hat. Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die Menge an CTLA-8 Protein entscheiden, mit welcher ein individueller Patient jeweils behandelt wird. Anfangs wird der behandelnde Arzt niedrige Dosierungen an CTLA-8 Protein verabreichen und die Reaktion des Patienten beobachten. Es können größere Dosierungen an CTLA-8 Protein verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erhalten wird, und an diesem Punkt wird die Dosierung im Allgemeinen nicht weiter erhöht. Es wird erachtet, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, etwa 0.1 μg bis etwa 100 mg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht enthalten sollten, bevorzugt etwa 0.1 μg bis etwa 10 mg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht, stärker bevorzugt etwa 0.1 μg bis etwa 100 μg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht, am meisten bevorzugt etwa 0.1 μg bis etwa 10 μg CTLA-8 Protein pro kg Körpergewicht.
  • Die Dauer einer intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird in Abhängigkeit von der Schwere der zu behandelnden Erkrankung und des Zustands und der potentiellen Überempfindlichkeitsreaktion jedes individuellen Patienten variieren. Es wird erachtet, dass die Dauer jeder Anwendung des CTLA-8 Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegen wird. Letztendlich wird der behandelnde Arzt über die geeignete Dauer einer intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung entscheiden.
  • Erfindungsgemäßes CTLA-8 Protein kann auch für eine Immunisierung von Tieren verwendet werden, um polyklonale und monoklonale Antikörper zu erhalten, die spezifisch mit dem CTLA-8 Protein reagieren und eine Bindung von CTLA-8 an dessen Rezeptor inhibieren können. Derartige Antikörper sind auch zur Durchführung von diagnostischen Assays auf CTLA-8 gemäß bekannten Methoden nützlich. Derartige Antikörper können erhalten werden durch die Verwendung des vollständigen CTLA-8 Proteins als ein Immunogen, oder durch die Verwendung von Fragmenten von humanem CTLA-8 Protein. Die Peptid-Immunogene können an ihrem Carboxy-Terminus zusätzlich einen Cysteinrest enthalten, und sie werden an ein Hapten wie etwa Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH) konjugiert. Zusätzliche Peptid-Immunogene können erzeugt werden, indem man Tyrosinreste durch sulfatierte Tyrosinreste ersetzt. Methoden zur Synthese derartiger Peptide sind in der Technik bekannt, beispielsweise in R. P. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963); J. L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
  • Neutralisierende oder nicht-neutralisierende Antikörper (bevorzugt monoklonale Antikörper), die an humanes CTLA-8 Protein binden, können ebenfalls nützliche Therapeutika für bestimmte Tumore und auch bei der Behandlung von vorstehend genannten Zuständen sein. Diese neutralisierenden Antikörper können die Bindung von Ligand an das humane CTLA-8 Protein blockieren oder sie könnten die Clearance von Protein aus dem Patienten fördern.
  • Aufgrund ihrer Homologie zu humanem CTLA-8 werden auch CTLA-8 Proteine aus Ratte, Herpes CTLA-8 Proteine und IL-17 Proteine (das "humane CTLA-8" von Golstein et al., a.a.O.) CTLA-8 Aktivität wie vorstehend beschrieben aufweisen. Als ein Ergebnis davon können Ratte- und Herpes CTLA-8 Proteine und IL-17 Proteine sowie aktive Fragmente und Varianten davon bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Behandlungsverfahren, wie für das humane CTLA-8 beschrieben, verwendet werden. Ratte- und Herpes CTLA-8 Proteine und aktive Fragmente und Varianten davon können wie vorstehend beschrieben hergestellt werden unter Verwendung der Polynukleotide (oder von Fragmenten oder Varianten davon), die in SEQ ID NO: 3 bzw. SEQ ID NO: 5 beschrieben sind. Ratte- und Herpes CTLA-8 können auch wie in Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150, 5445–5456, beschrieben, hergestellt werden. CTLA-8 Proteine anderer Spezies können ebenfalls wie hierin beschrieben verwendet werden. cDNA, die für CTLA-8 aus Ratte und Herpes CTLA-8 kodieren, wurden am 6. Juli 1995 bei der American Type Tissue Collection hinterlegt, und ihnen wurden die Zugangsnummern ATCC 69867 bzw. ATCC 69866 zugeordnet. IL-17 Proteine können ebenfalls hergestellt werden wie in Golstein et al., a.a.O., beschrieben.
  • Aufgrund ihrer Homologie zu IL-17 kann es sein, dass die humanen CTLA-8 (B18) Proteine der vorliegenden Erfindung auch manche Aktivitäten mit IL-17 gemeinsam haben.
  • Für eine Behandlung oder Therapie kann ein beliebiges der hierin diskutierten oder offenbarten Proteine durch in vivo Expression des Proteins in einem Säuger verabreicht werden. In solchen Fällen wird ein für das gewünschte Protein kodierendes Polynukleotid gemäß bekannten Verfahren dem Lebewesen in einer Weise verabreicht, die eine Expression ermöglicht, umfassend ohne Einschränkung die hierin offenbarten Adenovirus-Verfahren.
  • Beispiel 1
  • Isolierung von humaner CTLA-8 cDNA
  • Ein Partialklon für humanes CTLA-8 wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, die aus RNA, isoliert von stimulierten mononuklearen Zellen aus humanem peripheren Blut, hergestellt worden war. Dieser Partialklon wurde als "B18" identifiziert. B18 wird hierin manchmal verwendet um das humane CTLA-8 der vorliegenden Erfindung zu bezeichnen. Homologievergleiche ergaben, dass dieser Partialklon zu den CTLA-8 Genen von Herpes und Ratte verwandt ist. Die DNA-Sequenz dieses Partialklons wurde verwendet um den Volllänge-Klon zu isolieren.
  • Um eine Volllänge-cDNA für B18 zu isolieren wurde eine direktionale Volllänge-cDNA-Bibliothek mittels Standardmethoden im COS-Expressionsvektor pMV2 hergestellt. Die cDNA-Bibliothek wurde mittels Elektroporation in E. coli transformiert. Der Großteil der ursprünglich transformierten cDNA-Bibliothek wurde bei –80°C in Glyzerin eingefroren. Ein Aliquot wurde austitriert um die Konzentration an transformierten E. coli zu bestimmen. Die E. coli wurden aufgetaut, auf 76.000/0,1 ml in Ampicillin-haltigem Medium verdünnt, und 0,1 ml wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in einer 8 × 8 Anordnung verteilt. Die Mikrotiterplatte wurde über Nacht bei 37°C aufbewahrt um die E. coli wachsen zu lassen.
  • Um DNA für eine PCR herzustellen wurden 20 μl Aliquots der Kultur aus jeder Vertiefung entnommen und separat für jede Reihe und Spalte von acht Vertiefungen gepoolt, wobei 16 Pools von jeweils 160 μl erhalten wurden. Die E. coli wurden pelletiert, in 160 μl Standardlysepuffer, der 10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100 enthielt, erneut aufgenommen und durch 10-minütiges Erwärmen auf 95°C lysiert.
  • Um diejenigen Vertiefungen zu identifizieren, die mit B18 transformierte E. coli enthielten, wurde zunächst eine PCR mit den DNA-Präparationen, welche den acht Spalten entsprachen, durchgeführt. Die PCR bestand aus zwei Reaktionen nacheinander mit "nested" Oligonukleotiden unter Verwendung von Standardbedingungen. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide waren von der Sequenz des B18-Partialklons abgeleitet. Sie waren:
    B185: CACAGGCATACACAGGAAGATACATTCA (SEQ ID NO: 7)
    B183: TCTTGCTGGATGGGAACGGAATTCA (SEQ ID NO: 8)
    B18N: ATACATTCACAGAAGAGCTTCCTGCACA (SEQ ID NO: 9)
  • Die PCR-Bedingungen waren 2,5 mM MgCl2 und 95°C × 2 min für einen Zyklus, 95°C × 1 min plus 68°C × 1 min für 30 Zyklen, und 68°C × 10 min für einen Zyklus. Jede Reaktion hatte 20 μl. Die erste Reaktion enthielt die Oligonukleotide B185 und B183 und 1 μl der DNA-Präparationen. Die zweite Reaktion enthielt die Oligonukleotide B183 und B18N und 1 μl der ersten Reaktion.
  • DNA-Präparationen, die möglicherweise einen Volllänge-B18-cDNA-Klon enthielten, wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese eines Aliquots der zweiten PCR-Reaktion identifiziert. Es wurde angenommen, dass eine DNA-Bande mit der korrekten Mobilität von einer B18-cDNA abgeleitet wäre. Danach wurde die gleiche Abfolge von PCR-Reaktionen und Gelanalyse mit den DNA-Präparationen durchgeführt, welche den acht Reihen entsprachen. Die Schnittstelle einer Reihe und einer Spalte identifizierte die Vertiefung A2 als potentiell B18-enthaltend, was eine Einengung auf die 76.000 ursprünglich in dieser Vertiefung angeimpften E. coli ergab.
  • Um diejenigen individuellen E. coli, welche den mutmaßlichen Vollänge-B18-cDNA-Klon enthielten weiter zu reinigen, wurde die Konzentration an E. coli in der Vertiefung A2 durch Austitrieren und Plattieren von Verdünnungen der Vertiefung bestimmt. Danach wurden 7600 E. coli in die Vertiefungen einer zweiten Mikrotiterplatte in einer 8 × 8 Anordnung angeimpft. Die E. coli wurden über Nacht wachsen gelassen, Vertiefungen wurden gepoolt, und DNA wurde präpariert wie vorstehend beschrieben. Um zu identifizieren, welche von diesen Vertiefungen E. coli enthielten, die mit B18 transformiert waren, wurden aufeinander folgende PCR-Reaktionen durchgeführt, im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben. Agarose-Gelelektrophorese identifizierte die Vertiefung B2 als potentiell eine B18-cDNA-enthaltend.
  • Diejenigen E. coli, welche diese cDNA enthielten, wurden weiter gereinigt durch Animpfen von Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 253 E. coli pro Vertiefung, und weiterem Vorgehen wie für die Reinigung der E. coli in der Vertiefung A2. Es wurde bestimmt, dass die Vertiefung C3 einen mutmaßlichen Volllänge-B18-cDNA-Klon enthielt. Das exakte E. coli wurde identifiziert durch Plattieren des Inhalts der Vertiefung auf Bakterienkulturmedium und danach Screenen der E. coli Kolonien nach anerkannten Protokollen. Die Sonde für diese Hybridisierungen war ein PCR-Fragment, welches erzeugt worden war mittels Durchführung einer PCR-Reaktion mit dem B18-Klon unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonukleotide (SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9) als Primer. Sobald eine Einzelkolonie identifiziert war, wurde DNA gemäß Standardverfahren präpariert und sequenziert. Ein Vergleich dieser Sequenz mit der Sequenz des ursprünglichen Partialklons bestätigte die Identität, und dass die isolierte cDNA Volllänge hatte.
  • Der Volllänge-Klon wurde am 6. Juli 1995 bei der American Type Tissue Collection hinterlegt, und ihm wurde die Zugangsnummer ATCC 69868 zugeordnet.
  • Beispiel 2
  • Expression von humanem CTLA-8
  • Der Volllänge-B18-Klon für humanes CTLA-8 wurde in COS-Zellen transfiziert, die danach mit 35S-Methionin markiert wurden. Ein Aliquot konditioniertes Medium von der transfizierten Zellkultur wurde eingeengt, denaturiert und einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Autoradiogramme dieser Gele sind in 2 wiedergegeben. Die durch den Pfeil angezeigte Bande zeigt eine Expression von humanem CTLA-8.
  • Beispiel 3
  • Inhibition von Angiogenese durch humanes CTLA-8
  • Die Fähigkeit von humanem CTLA-8, die Angiogenese zu inhibieren, wurde in einem angiostatischen Aktivitätsassay (Endothelzellen-Proliferationsassay) untersucht. Der Assay wurde in einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Primäre humane Nabelzellen (HUVECs) wurden in einer Konzentration von 2 × 103 Zellen pro Vertiefung in EGM-Medium (Clonetics)/20% FCS angeimpft und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden danach in M199-Medium (GIBCO BRL), enthaltend 10% Aktivkohle-behandeltes Serum (M199-CS) während 48 Stunden bei 37°C ausgehungert. Konditioniertes, B-18 (humanes CTLA-8) enthaltendes Medium wurde von transfizierten COS-Zellen oder stabil exprimierenden CHO-Zellen erhalten, und 1:10, 1:50, 1:250 und 1:1250 Verdünnungen wurden in M199-CS-Medium, enthaltend 100 ng/ml FGF, hergestellt. Die B18-Verdünnungen wurden zu den ausgehungerten Zellen zugegeben und es wurde 72 h bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden danach 6 Stunden mit [3H]-Thymidin radiomarkiert. Radiomarkierte Zellen wurden mit PBS gewaschen und für eine Flüssigscintillationsauszählung trypsiniert. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Kaleidograph-Software graphisch ausgewertet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. In der Figur ist "Med" die Negativkontrolle, "B18" und "B18-1" waren konditioniertes Medium aus zwei unabhängigen Transfektionen von COS-Zellen mit DNA, die für humanes CTLA-8 (B18) kodiert. IFN-γ wurde als eine Positivkontrolle für angiostatische Aktivität (d.h. Inhibition der Angiogenese) verwendet. Diese Daten zeigen, dass humanes CTLA-8 (B18) die Angiogenese inhibiert.
  • Beispiel 4
  • Hämopoetische Aktivität von humanem CTLA-8
  • Die hämopoetische Aktivität von in vivo exprimiertem humanem CTLA-8 (B18) wurde durch Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus-Vektors untersucht.
  • Die B18-cDNA im Expressionsplasmid Adori 2-12 B18 wurde durch den unmittelbaren frühen Promoter und Enhancer von Cytomegalovirus (CMV) angetrieben.
  • Der Vektor Adori 2-12 war durch Hinzufügen eines SV40 Ursprungs und Enhancers zu einem bekannten Adenovirus-Vektor erzeugt worden (Barr et al., Gene Therapy 1: 51 (1994); Davidson et al., Nature Genetics 3: 219 (1993)). Das für den SV40 Ursprung und Enhancer kodierende HindIII/BamHI-Fragment war von dem Säugerexpressionsvektor pMT2 isoliert worden, mit Klenow glatt gemacht worden und in die NatI-Stelle (mit Klenow glatt gemacht) des Expressionsvektors Ad5 kloniert worden.
  • Der Vektor wurde erhalten durch Verdauen von pNOT-B18-cDNA mit SalI, Auffüllen des 5'-Überhangs mit Klenow um ein glattes Ende zu erzeugen, und Verdau mit EcoRI um die B18-cDNA zu isolieren. Das glattgemachte EcoRI-B18-Fragment wurde in die Restriktionsstellen EcoRV-EcoRI des Adenovirus-Vektors Adori 2-12 insertiert. Die CMV-B18-Expressionskassette war stromabwärts vom SV40 Ursprung und Enhancer lokalisiert, und 0–1 Karteneinheiten am linken Ende des Adenovirus Typ 5 (Ad5). Der SV40 Spleißdonor und -akzeptor waren zwischen dem CMV-Promoter und der B18-cDNA lokalisiert. Nach dem Insert folgte eine SV40 Poly-A-Stelle, 9–16 Karteneinheiten von Ad5 und vom pUC-Ursprung.
  • Ein rekombinanter Adenovirus wurde mittels homologer Rekombination in 293-Zellen erzeugt. AscI-linearisierter Adori 2-12 B18 und ClaI-verdauter AdCMVlacZ wurden unter Verwendung von Lipofectamin in die 293-Zellen eingebracht. Rekombinanter Adenovirus wurde isoliert und in 293-Zellen amplifiziert. Das Virus wurde von infizierten 293-Zellen durch 3 Gefrier-Auftau-Zyklen freigesetzt. Das Virus wurde durch zwei Cäsiumchlorid-Gradientenzentrifugationen und Dialyse bei 4°C gegen PBS weiter gereinigt. Nach Dialyse des Virus wurde Glyzerin bis zu einer Konzentration von 10% zugegeben, und das Virus wurde bis zur Verwendung bei –70°C aufbewahrt. Das Virus wurde charkterisiert durch Expression des Transgens, Plaque-bildende Einheiten mit 293-Zellen, Partikel/ml und Southern-Analyse des Virus.
  • Eine Einzeldosis von 5 × 1010 Partikeln rekombinantes, für B18 kodierendes Adenovirus wurde in die Schwanzvene von männlichen C57/bl6-Mäusen mit einem Alter von 7–8 Wochen injiziert. Kontrollmäuse empfingen ein für B-Galactosidase kodierendes Adenovirus. An den Tagen 7 und 14 wurden 4 Mäuse jeder Versuchsgruppe geopfert. Blut wurde gesammelt, und eine automatisierte hämatologische Analyse wurde unter Verwendung eines Baker 9000 durchgeführt. Mit Blutabstrichen wurden differentielle Auszählungen durchgeführt. Gewebe wurde geerntet, in Formalin fixiert und für die Histopathologie mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt. Im ersten Satz Experimente wurden Serum und Gewebe 1 und 14 Tage nach der Injektion analysiert. In den Auszählungen von peripheren Plättchen wurde ein leichter Anstieg festgestellt. Die Tiere, die B18 erhalten hatten, zeigten eine geringe Vergrößerung der Milz. Makroskopische Analyse der Milz zeigte eine Zunahme der extramedullären Hämopoese der Milz an Tag 7 im Vergleich zur Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigten eine mit B18 assoziierte hämopoetische Wachstumsaktivität.
  • In einem zweiten Satz Experimente wurden 5 × 1010 Partikel rekombinantes, für B18 kodierendes Adenovirus in die Schwanzvene von männlichen C57/bl6-Mäusen mit einem Alter von 17–18 Wochen injiziert. Kontrollmäuse empfingen ein für B-Galactosidase kodierendes Adenovirus. An den Tagen 2, 5, 7, 10, 14 und 21 wurden über die retro-orbitalen Höhlen Blutproben entnommen. Die hämatologischen Analysen wurden unter Verwendung einer automatisierten Zellauszählvorrichtung Baker 9000 mit für Maus spezifischen Einstellungen durchgeführt. Die Analysen umfassten Auszählungen von WBC, RBC, HCT und PLT. Blutabstriche wurden hergestellt und mit Wright-Giemsa für WBC-Differentiale, auf Basis einer Zellauszählung von 100 angefertigt. Retikulozyten und retikuläre Plättchen wurden unter Verwendung von Durchflusscytometrie quantifiziert. Vier Mäuse jeder Gruppe wurden an den Tagen 7, 14 und 21 geopfert. Zusätzlich zu Analyse von peripherem Blut wurde mittels Herzpunktion Serum gesammelt, für eine Quantifizierung von systemischem IL-6 unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Endogen). Milz und Leber wurden für Histopathologie entnommen, hämopoetische Vorläufer aus Milz und Knochenmark wurden quantifiziert, und Knochenmarkabstriche wurden präpariert und für Zellauszählungen mit Wright-Giemsa angefärbt.
  • Die Verabreichung des für B18 kodierenden Adenovirus führte zu einem beachtlichen Anstieg an peripheren Blut-Neutrophilen und WBC (4). Maximale Anstiege von Neutrophilen wurden an Tag 5 und Tag 7 beobachtet. Die Kontrollmäuse zeigten an Tag 5 und Tag 7 wenig Unterschiede. An Tag 21 waren Neutrophile aus peripherem Blut in den Kontrollmäusen und in Mäusen, die B18 empfingen, ähnlich. Sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der B18-Gruppe wurde auch ein Anstieg von weißen Blutzellen beobachtet. Die Mäuse, die B18 empfangen hatten, hatten zwischen Tag 2 und Tag 7 einen größeren Anstieg an WBC. An Tag 21 wurde in der B-Gal-Gruppe ein deutlicherer Anstieg beobachtet. Es wurden keine Veränderungen in anderen Zellchemien beobachtet (Tabelle I).
  • Der Zellaufbau des Knochenmarks wurde aus gepoolten Oberschenkelknochen in jeder Gruppe berechnet (Tabelle III). In keiner Gruppe wurden signifikante Unterschiede festgestellt. Bei hämopoetischen Vorläufern aus Knochenmark von den Tagen 7, 14 und 21 wurden keine signifikanten Veränderungen festgestellt. Die CFU-GM, BFU-E und CFU-MEG in den B18-Mäusen waren ähnlich zu denen der B-Gal-Kontrolle (Tabelle II).
  • Die Verabreichung des für B18 kodierenden Adenovirus führte zu an Tag 7 zu einem Anstieg an CFU-GM (myeloischen) und BFU-E (erythroiden) Vorläufern in der Milz, im Vergleich zu Tieren, die das B-Gal-Virus empfangen hatten. Der Anstieg an Vorläufern in den B18-Mäusen war 11-fach für CFU-GM und 52-fach für BFU-E (Tabelle II). Für die B18-Mäuse gab es einen 2-fachen Anstieg von CFU-MEG an Tag 7. An Tag 21 wurden zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede an CFU-MEG oder BFE-U aus Milz festgestellt (Tabelle II). Bei Mäusen, die den für B18 kodierenden Adenovirus empfangen hatten, wurde eine 3-fache Abnahme an CFU-GM festgestellt. In der B18-Gruppe wurde an Tag 7 eine leichte Vergrößerung der Milz festgestellt. Dies ist konsistent mit einer Zunahme des Zellaufbaus in der Milz. An Tag 14 und Tag 21 waren die Gewichte der Milz ähnlich zu denen der Kontrollgruppe (Tabelle III). Makroskopische Analyse der Milz zeigte eine Zunahme der extramedullären Hämopoese der Milz in den B18-Mäusen an Tag 7 im Vergleich zur Kontrolle.
  • Die Verhältnisse myeloisch:erythroid in Knochenmark (Tabelle IV) legen eine granulozytische Hyperplasie mit einer möglichen erythroiden Hyperplasie in Mäusen, die den B18-Adenovirus empfangen hatten, an Tag 7 nahe. An Tag 21 war das Verhältnis in der B-Gal-Gruppe höher. In den IL-6 Serumkonzentrationen wurden keine Veränderungen festgestellt.
  • Diese Ergebnisse zeigen eine hämopoetische Aktivität, die mit der Verabreichung von für B18 (humanes CTLA-8) kodierendem Adenovirus assoziiert ist. In Tieren, die den B18-Adenovirus empfangen hatten, wurden an Tag 7 Anstiege an Neutrophilen und weißen Blutzellen beobachtet. Die Daten zeigten, dass B18 im Vergleich zu den Kontrolltieren an Tag 7 zu einer Zunahme an CFU-GM und BFU-E aus Milz führte. Die extramedulläre Hämopoese der Milz an Tag 7 legt nahe, dass B18 eine hämopoetische Wachstumsaktivität hat. Diese Daten legen nahe, dass B18 frühe hämopoetische Vorläufer mobilisieren könnte.
  • Tabelle I: Periphere Hämatologie für die Tage 2, 5, 7, 10, 14 und 21
    Figure 00350001
  • Tabelle II: Hämopoetische Vorläufer aus Knochenmark und Milz
    Figure 00360001
  • Hämopoetische Vorläufer wurden aus gepoolten Milz- und Knochenmarksproben von vier Tieren in jeder Gruppe bestimmt. Für die Quantifizierung von CFU-GM und BFU-E wurden entweder 1 × 104 Knochenmarkszellen oder 1 × 105 Milzzellen zu alpha-Methylcellulose-Komplettmedium (0,9% Methylcellulose in alpha-Medium, 30% fötales Rinderserum, 1% Rinderserumalbumin, 10-4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 2% konditioniertes Maus-Milzzell-Medium und 3 U/ml Erythropoietin) zugegeben und in einem Endvolumen von 1,0 ml in 35 mm Gewebekulturschalen aliquotiert. Die Kulturen wurden 7 Tage bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Mikroskopische Kolonien waren als Cluster von 50 oder mehr Zellen definiert. Für die Quantifizierung von CFU-MEG wurden entweder 1 × 105 Knochenmarkszellen oder 1 × 106 Milzzellen zu alpha-Methylcellulose-Komplettmedium zugegeben und inkubiert, wie vorstehend beschrieben. Megakaryozyten-Kolonien waren definiert als eine Gruppe von 3 oder mehr Zellen.
    • * Vorläufer aus Knochenmark sind angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichung der Anzahl von Kolonien pro 105 Zellen.
    • ** Vorläufer aus Milz sind angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichung der Anzahl von Kolonien pro 106 Zellen.
  • Tabelle III: Milzgewichte und Zellaufbau von Oberschenkelknochen
    Figure 00380001
  • Milzgewichte wurden zum Zeitpunkt der Opferung bestimmt und sind angegeben als der Mittelwert ± Standardabweichung von vier Tieren.
  • Tabelle IV: Verhältnisse myeloisch:erythroid in Knochenmark
    Figure 00380002
  • Alle Einträge stellen die Anzahl von myeloischen Zellen pro 1 erythroide Zelle dar. Normale Verhältnisse in der Maus liegen bei annähernd 1:1 bis 2:1.
  • Beispiel 5
  • Zusätzliche Experimente bezüglich der hämopoetischen Aktivität von humanem CTLA-8
  • B18 (humanes CTLA-8) wurde auf seine Fähigkeit getestet, die Produktion von Faktoren mit hämopoetischer Aktivität in einem Faktor-abhängigen Zell-Proliferationsassay unter Verwendung der humanen erythroleukämischen Zelllinie TF1 (Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140: 323 (1989)) zu induzieren. Die Zellen wurden anfangs in der Gegenwart von rhGMCSF (100 U/ml) angezogen. Die Zellen wurden drei Tage vor dem Einrichten des Assays gefüttert. Die Assaybedingungen waren wie folgt:
    Zellen/Vertiefung 5000/200 μl
    Inkubationszeitraum 3 Tage
    Pulsdauer 4 Stunden
    Menge an tritiiertem Thymidin 0,5 μCi-Vertiefung
    Auszählzeitraum 1 Minute
    Replica 2
  • B18 alleine, konditioniertes Medium (CM) aus B18-induzierten HS-5-Zellen wurden getestet. Puffer alleine, CM aus mit Puffer induzierten HS-5-Zellen und CM aus nicht-induzierten HS-5-Zellen wurden als Kontrollen getestet. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. B18 (humanes CTLA-8) zeigte eine Fähigkeit, die Produktion von Faktoren zu induzieren, welche eine Proliferation von TF-1 induzierten. Diese Aktivität wurde durch eine Zugabe von anti-GMCSF-Antikörpern im Wesentlichen eliminiert. Diese Daten zeigen, dass das humane CTLA-8 (B18) fähig ist, eine Hämopoese zu induzieren. Ohne sich an eine Theorie zu binden scheint es insbesondere, dass humanes CTLA-8 (B18) eine Produktion von GM-CSF und/oder IL-3 induziert.
  • Beispiel 6
  • Fähigkeit von humanem CTLA-8, eine Produktion von IL-6 und IL-8 zu induzieren
  • MRC5-Zellen wurden in der Gegenwart von humanem CTLA-8 (B18) inkubiert, und die Produktion von IL-6 und IL-8 wurde gemessen. Herpes CTLA-8 (IL-17) wurde als eine positive Kontrolle verwendet. Das humane CTLA-8 (B18) der Anmelder zeigte eine austitrierbare Produktion von sowohl IL-6 als auch IL-8 (siehe die 6 und 7).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001

Claims (17)

  1. Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544, (b) eine Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der in (a) definierten Nukleotidsequenz infolge von Degeneriertheit des genetischen Codes abweicht, wobei die Sequenz für humanes CTLA-8 Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 kodiert.
  2. Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz für ein Protein mit CTLA-8 Aktivität kodiert, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität, und wobei die Nukleotidsequenz operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, bevorzugt in einem zur in vivo Expression in einem Säuger geeigneten Vektor enthalten ist.
  3. Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 55 bis Nukleotid 544, bevorzugt umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 86 bis Nukleotid 544, stärker bevorzugt umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 139 bis Nukleotid 544.
  4. Wirtszelle, die mit dem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert ist.
  5. Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
  6. Isoliertes humanes CTLA-8 Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, (b) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 11 bis 163, (c) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 29 bis 163, (d) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäure 31 bis 163, und (e) Fragmenten von (a), (b), (c) oder (d) mit CTLA-8 Aktivität, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität.
  7. Protein nach Anspruch 6, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, bevorzugt umfassend die Sequenz von Aminosäure 11 bis 163 von SEQ ID NO: 2, stärker bevorzugt umfassend die Sequenz von Aminosäure 29 bis 163 von SEQ ID NO: 2, am meisten bevorzugt umfassend die Sequenz von Aminosäure 31 bis 163 von SEQ ID NO: 2.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein humanes CTLA-8 Protein nach Anspruch 6 oder 7 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  9. Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper, der spezifisch mit einem humanem CTLA-8 Protein nach Anspruch 6 oder 7 reagiert.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper und/oder ein neutralisierender Antikörper ist.
  11. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Inhibition von Angiogenese, Inhibition von Wachstum oder Proliferation von vaskulären Endothelzellen, Inhibition von Tumorwachstum, Inhibition von Angiogenese-abhängigem Gewebewachstum, Proliferation von myeloischen Zellen oder Vorläufern, Proliferation von erythroiden Zellen oder Vorläufern, Proliferation von lymphoiden Zellen oder Vorläufern, Induktion einer Produktion von IFNγ, Induktion einer Produktion von IL-3 oder Induktion einer Produktion von GM-CSF.
  12. Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine allelische humane Variante der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 146 bis Nukleotid 544, wobei die Nukleotidsequenz für ein Protein mit CTLA-8 Aktivität kodiert, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität.
  13. Polynukleotid nach Anspruch 12, wobei die Nukleotidsequenz für ein Protein mit CTLA-8 Aktivität kodiert, welche definiert ist durch Induktion einer Expression oder Sezernierung von γ-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 oder GM-CSF, oder durch seine chemoattraktive oder chemotaktische Aktivität, und wobei die Nukleotidsequenz operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, bevorzugt in einem zur in vivo Expression in einem Säuger geeigneten Vektor enthalten ist.
  14. Polynukleotid nach Anspruch 12 oder 13, umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 55 bis Nukleotid 544, bevorzugt umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 86 bis Nukleotid 544, stärker bevorzugt umfassend die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 139 bis Nukleotid 544.
  15. Nicht-humane Wirtszelle, die mit dem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 12 bis 14 transformiert ist.
  16. Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
  17. Verfahren zur Herstellung eines humanen CTLA-8 Proteins, wobei das Verfahren umfasst: (a) Anziehen einer Kultur der Wirtszelle nach Anspruch 4, 5, 15 oder 16 in einem geeigneten Kulturmedium, und (b) Reinigen des humanen CTLA-8 Proteins aus der Kultur.
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