JP4319686B2 - ヒト・ctla−8およびctla−8−関連蛋白質の用途 - Google Patents
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Description
これらの理由から、新しいサイトカインの調査およびそれらをコードするDNAのクローニングについて、重要な研究努力がなされている。過去において、新しいサイトカインは、骨髄細胞のような個々の細胞の、増殖のような測定可能な応答を分析することにより同定されていた。したがって、新しいサイトカインの調査は、利用できる分析法によって制限され、新しいサイトカインが、公知の分析法で測定できない活性を有する場合、そのサイトカインは検出できないままである。より新しいアプローチは、複製連鎖反応(PCR)および公知のサイトカインまたはそれら受容体の共有特色に相同性を有するオリゴヌクレオチド・プライマーを使用して、サイトカインをコードするcDNAを検出している。PCRアプローチも、同じ蛋白質ファミリーで予めクローンされたサイトカインの知識を必要とするために制限される。サイトカインはまた、差し引きハイブリダイゼーションを使用し、cDNAライブラリーの構築およびスクリーニングをしてクローンされており、あるいは、PCR、ついでゲル電気泳動を用いて、区別して発現する遺伝子を検出することによってクローンできる可能性がある。消去式ハイブリダイゼーションは、サイトカインmRNAが区別して発現するmRNAであるとの仮定に基づいており、該方法は、興味ある配列の先行知識を何ら必要としない。しかし、多くのサイトカインは、区別して発現しないmRNAによってコードされうるもので、それ故、この方法を使用して検出することはできない。
(a)配列番号1のヌクレオチド146〜ヌクレオチド544の塩基配列、
(b)(a)の塩基配列にハイブリダイズできる塩基配列、
(c)遺伝子コードの縮重による(a)の塩基配列の変形した塩基配列、および
(d)(a)の塩基配列の対立遺伝子変異体
からなる群から選ばれる塩基配列からなる単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、CTLA−8活性を有する蛋白質をコードする。他の具体例において、ポリヌクレオチドは、発現制御配列と作動可能の連結している。他の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物においてin vivo発現に適したベクター中に含有される。ポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド55〜ヌクレオチド544の塩基配列、配列番号1のヌクレオチド139〜ヌクレオチド544の塩基配列または配列番号1のヌクレオチド86〜ヌクレオチド544の塩基配列からなるものが特に好ましい。
本発明は、哺乳動物細胞を含め、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞も提供する。
ヒトCTLA−8の製造方法も提供するもので、該方法は、
(a)本発明の宿主細胞の培養物を適当な培地中で増殖させ、
(b)該培養物からヒトCTLA−8蛋白質を精製することからなる。
単離されたヒトCTLA−8蛋白質も提供するもので、それは、
(a)配列番号2のアミノ酸配列、
(b)配列番号2のアミノ酸11〜163のアミノ酸配列、
(c)配列番号2のアミノ酸29〜163のアミノ酸配列、
(d)配列番号2のアミノ酸31〜163のアミノ酸配列、および
(e)CTLA−8活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のフラグメント
からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる。
本発明のヒトCTLA−8と特異的に反応する抗体からなる組成物も開示する。
ヒトCTLA−8蛋白質からなる医薬組成物の治療有効量を投与することからなる哺乳動物対象の治療方法も提供する。
ラットCTLA−8およびその活性(すなわち、CTLA−8活性)フラグメントもこの方法で使用できる。好ましくは、該ラット蛋白質は、医薬上許容される担体と、
(a)配列番号4のアミノ酸配列、
(b)配列番号4のアミノ酸18〜150のアミノ酸配列、および
(c)CTLA−8活性を有する(a)または(b)のフラグメント
からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる蛋白質とからなる組成物として投与される。
ここでは「ヘルペスCTLA−8」と称するヘルペスウイルスサイミリ
ORF13およびその活性(すなわち、CTLA−8活性)フラグメントも、本発明の方法に使用できる。好ましくは、ヘルペスCTLA−8蛋白質は、医薬上許容される担体と、
(a)配列番号6のアミノ酸配列、
(b)配列番号6のアミノ酸19〜151のアミノ酸配列、および
(c)CTLA−8活性を有する(a)または(b)のフラグメント
からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなる蛋白質とからなる組成物として投与される。
本発明はまた、医薬上許容される担体と、IL−17またはその活性フラグメントからなる組成物の治療有効量を投与することからなる哺乳動物対象の治療方法も提供する。
本発明の治療方法において、好ましくは、対象は、血管形成の抑制、血管内皮細胞の増殖抑制、腫瘍増殖の抑制、血管形成依存組織増殖、骨髄細胞または前駆細胞の増殖、赤血球系細胞または前駆細胞の増殖、リンパ性細胞または前駆細胞の増殖の抑制、IFNγ産生の誘発、IL−3産生の誘発およびGM−CSF産生の誘発を生じさせるために治療される。
ヒト・CTLA−8(配列番号:2)のアミノ酸29からアミノ酸163までの領域は、ラット・CTLA−8(配列番号:4のアミノ酸18から150)およびヘルペスウイルスサイミリ(Saimiri)のORF13(「ヘルペス・CTLA−8」という)(配列番号:5のアミノ酸19から151まで)に対して著しい相同性を示す。ラット・CTLA−8をコードしているcDNA配列を配列番号:3に示し、その対応アミノ酸配列を配列番号:4に示す。ヘルペス・CTLA−8をコードしているcDNA配列を配列番号:5に示し、その対応アミノ酸配列を配列番号:6に示す。ラット・CTLA−8とヘルペスCTLA−8のとの間の相同性は、Rouvier et al., J.Immunol.1993,150,5445-5456により報告されている。
出願人らは、すでに、不正確ではあるが、ネズミ・CTLA−8にあてはまるものとして配列番号:3および配列番号:4のラット・配列を同定した。出願人らのヒト・CTLA−8(B18)は真のネズミ・CTLA−8配列に対しても相同性を示す。
Golsteinら(WO95/18826;Fossiez et al.,Microbial Evasion and Subversion of Immunity 544:3222(Abstract))もまた、最初に「ヒト・CTLA−8」と同定された種を報告している。しかしながら、Golsteinらの種の配列および本発明ヒト・CTLA−8(B18)の配列を試験することにより、それらが2つの異なる蛋白ではあるが、互いに相同的であり、本明細書記載のラット・CTLA−8およびヘルペス・CTLA−8に対して相同性があることが容易に明らかとなる。Golsteinらの種はインターロイキン−17(IL−17)と改名された。出願人らのヒト・CTLA−8(B18)およびIL−17の間に相同性により、これらの蛋白は特定の活性を共有していると考えられる。
全長に満たないヒト・CTLA−8蛋白も本発明に包含され、ヒト・CTLA−8蛋白(配列番号:1)をコードしているポリヌクレオチドの対応フラグメントを発現することにより製造することができる。これらの対応ポリヌクレオチドフラグメントも本発明の一部である。当該分野において知られている部位特異的突然変異法を包含する標準的な分子生物学的方法により、あるいは適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、上記修飾ポリヌクレオチドを製造してもよい。
本発明の目的からすると、(1)因子−依存的細胞増殖アッセイにおいて活性を示す(好ましくは、全長のCTLA−8に対応する種の全長が活性を有するアッセイ)、あるいは(2)γ−IFNの発現または分泌を誘導する、あるいは(3)化学誘引性または化学走性アッセイにおいて化学誘引性または化学走性を示す(好ましくは、全長のCTLA−8に対応する種の全長が活性を有するアッセイ)、あるいはIL−3またはGM−CSFの発現または分泌を誘導する場合に、活性蛋白は「CTLA−8」活性を有する。
CTLA−8活性を有するヒト・CTLA−8蛋白またはそのフラグメントを免疫グロブリンのごときキャリア分子と融合させてもよい。例えば、ヒト・CTLA−8蛋白を、「リンカー」配列を介して、免疫グロブリンのFc部分に融合させてもよい。
また本発明は、配列番号:1記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、すなわち、CTLA−8活性を有するヒト・CTLA−8またはCTLA−8蛋白をやはりコードしている天然に発生する配列番号:1の単離ポリペプチドの別形態をも包含する。また、非常に厳密な条件(0.2xSSC 65℃)、厳密な条件(例えば、4xSSC 65℃あるいは50%ホルムアミドおよび4xSSC 42℃)、または厳密性を減じた条件(4xSSC 50℃あるいは30−40%ホルムアミドおよび4xSSC 42℃)で配列番号:1に示すヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする単離ポリヌクレオチドも本発明に包含される。遺伝コードの縮重によってヒト・CTLA−8蛋白をコードしているが配列番号:1に示すヌクレオチド配列とは異なる単離ポリヌクレオチドも本発明に包含される。点突然変異により、またはCTLA−8活性、半減期もしくは産生レベルを増加させるために誘導された修飾により生じる配列番号:1に示すヌクレオチド配列中の変化も本発明に包含される。
多くのタイプの細胞が、ヒト・CTLA−8蛋白発現のための適当な細胞として作用しうる。機能的なヒト・CTLA−8蛋白を発現しうるいずれの細胞を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞は、例えば、サル・COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、ヒト・腎293細胞、ヒト・上皮A431細胞、ヒト・結腸205細胞、3T3細胞、CV−1細胞、他の形質転換された霊長類の細胞系、正常2倍体細胞、インビトロ1次組織培養から得られる細胞株、1次移植物、HeLa細胞、マウス・L細胞、BHK、HL−60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP−1、PC12またはC2C12細胞を包含する。
本発明単離ポリヌクレオチドを1種またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることにより、ヒト・CTLA−8蛋白を製造してもよい。バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、例えば、Invitrogen,San Diego,California,USAから市販されており(MaxBacRキット)、かかる方法はSummers and Smith,Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)(参照により本明細書に記載されているものとみなす)に記載されているようなものであり、当該分野においてよく知られている。上記のごとく適当な単離ポリヌクレオチドを用いてヒト・CTLA−8の可溶性形態を昆虫細胞において製造してもよい。
別法として、酵母のごとき下等真核生物または細菌のごとき原核生物においてヒト・CTLA−8蛋白を製造してもよい。適当な酵母株はSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株、Candida、または異種蛋白発現可能な酵母株を包含する。適当な細菌株は、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、または異種蛋白発現可能な細菌株を包含する。トランスジェニック動物の産生物として、例えば、ヒト・CTLA−8蛋白をコードしているポリヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニックなウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジの乳成分として本発明ヒト・CTLA−8蛋白を発現させてもよい。
所望蛋白発現に必要な培養条件下で形質転換宿主細胞培養を増殖させることにより本発明ヒト・CTLA−8蛋白を製造してもよい。次いで、得られた発現蛋白を培地または細胞抽出物から精製してもよい。本発明ヒト・CTLA−8の可溶性形態をならし培地から精製することができる。発現細胞から全膜フラクションを調製し、Triton X-100のごとき非イオン性界面活性剤で膜を抽出することにより、膜結合形態の本発明ヒト・CTLA−8蛋白を精製することができる。
Pellicon限外濾過ユニット)を用いて本発明ヒト・CTLA−8蛋白を濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物をゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに適用することができる。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、懸垂ジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックスまたは基材を用ることもできる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に広く用いられる他のタイプのものであってよい。別法として、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルフプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを包含する。スルフプロピル基が好ましい(例えば、S-Sepharoseカラム)。培養上清からのヒト・CTLA−8蛋白の精製に、コンカナバリンA−アガロース、ヘパリン−toyopearlまたはCibacrom blue 3GA Sepharoseのごときアフィニティー樹脂による1種またはそれ以上のカラム工程を用いてもよく、あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性クロマトグラフィーにより、あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製してもよい。最終的に、疎水性RP−HPLC媒体、例えば、懸垂メチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる1種またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程を用いてヒト・CTLA−8をさらに精製することができる。上記精製工程のいくつかまたは全部を、種々の組み合わせまたは他の知られた方法との組み合わせにおいて使用して実質的に精製された単離組み換え蛋白を得ることもできる。
好ましくは、ヒト・CTLA−8蛋白を、他の哺乳動物蛋白を実質的に含まないように精製する。
本発明蛋白は、サイトカイン活性、細胞増殖活性(誘導または阻害のいずれか)または細胞分化活性(誘導または阻害のいずれか)を示すかもしれず、あるいは特定の細胞集団においては他のサイトカインの産生を誘導するかもしれない。現在に至るまで見いだされた多くの蛋白性因子(既知サイトカインを包含)は、1種またはそれ以上の因子に依存した細胞増殖アッセイにおいて活性を示し、それゆえ、アッセイはサイトカイン活性の便利な確認方法として役立つ。細胞系(32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preM+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF−1、Mo7eおよびCMKを包含するが、これらに限らない)に関する多くの通常の因子依存性細胞増殖アッセイのいずれかにより本発明蛋白の活性を確認する。
T細胞または胸腺リンパ球増殖のアッセイは、Current Protocols in Immunology, Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.,Marguelis,E.M.Shevach,W.Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3,In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7,Immunogenic studies in Humans); Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986; Bertagnolli et al.,J.Immunol.145:1706-1712,1990; Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991; Bertagnolli, et al.,J.Immunol.149:3778-3783,1992; Bowman et al.,J.Immunol.152:1756-1761,1994に記載のものを包含するが、これらに限らない。
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺リンパ球のサイトカイン産生および/または増殖についてのアッセイは、Polyclonal T cell stimulation,Kruisbeek,A.M.and Shevach,E.M.In Current Protocols in Immunology, J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.3.12.1-3.12.14,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1994;およびMeasurement of mouse and human Interferon γ,Schreiber,R.D.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.6.8.1-6.8.8,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1994に記載されたものを包含するが、これらに限らない。
造血細胞および造リンパ細胞の増殖および分化についてのアッセイは、
Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and 4,Bottomly,K.,Davis,L.S.and Lipsky,P.E.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.6.3.1-6.3.12,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1991; deVries et al.,J.Exp.Med,173:1205-1211,1991; Moreau et al.,Nature 336:690-692,1988; Greenberg et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2931-2938; Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan,R.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.6.6.1-6.6.5,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1991; Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:1857-1861,1986; Measurement of human interleukin 11-Bennett,F.,Giannoti,J.,Clark,S.C. and Turner,K.J.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.6.15.1,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1991; Measurement of mouse and human interleukin 9-Ciarletta,A,mGiannotti,J.,Clark,S.C.and Turner K.J.In Current Protocols in Immunology,J.E.Coligan eds. Vol 1 pp.6.13.1,Joghn Wiley and Sons,Toronto,1991に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
抗原に対するT細胞応答のアッセイ(特に、増殖およびサイトカイン産生を測定することにより、APC−T細胞相互作用に影響し、T細胞の効果を発揮させる蛋白を同定するアッセイ)は、Current Protocols in Immunology,Ed. by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach,W Strober, Pub.Geene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function;Chapter 6,Cytokines and their cellular receptors;Chapter 7,Immunologic studies in Humans); Weiberger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:6901-6905,1980; Weinberger et al.,Eur.J.Immun.11:405-411,1981;Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986; Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,1988に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guillain-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明のかかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状(例えば、喘息および関連呼吸器系の症状を包含)を本発明蛋白を用いて治療してもよい。 また本発明蛋白は、慢性または急性の炎症、例えば、感染に関連した炎症(敗血性ショックまたは全身性炎症応答症候群(SIRS))、炎症性腸疾患、クローン病、またはTNFもしくはIL−1のごときサイトカインの過剰産生から生じる疾病(IL−11により示される効果のごときもの)を抑制することもできる。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法により測定してもよい。
胸腺細胞または脾臓細胞の細胞毒性に適したアッセイは、Current Protocols in Immunology,Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.,Marguelis,E.M.Shevach,W.Strober,Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3,In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;Chapter 7,Immunogenic studies in Humans); Herrmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981; Herrmann et al.,J.Immunol.,128:1968-1974,1982; Handa et al.,J.Immunol.135:1564-1572,1985; Takai et al.,J.Immunol.137:2494-3500,1986; Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,1988; Herrmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2488-2492,1981; Herrmann et al.,J.Immunol.128:1968-1974,1982; Handa et al.,J.Immunol.135:1564-1572,1985; Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500,1986; Bowman et al.,J.Virology 61:1992-1998; Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,1988; Bertagnolli et al.,Cellular Immunology 133:327-341,1991; Brown et al.,J.Immunol.153:3079-3092,1994に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(特に、主としてTh1およひCTL応答を発生させる蛋白を同定する)は、Current Protocols in Immunology, Ed by J.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.,Marguelis,E.M.Shevach,W.Strober, Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3,In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;Chapter 7, Immunogenic studies in Humans); Takai et al.,J.Immunol.137:3494-3500, 1986; Takai et al.,J.Immunol.140:508-512,1988; Ertagnolli et al.,J. Immunol.149:3778-3783,1992に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
樹枝状細胞依存的アッセイ(特に、無処理のT細胞を活性化する樹枝状細胞により発現される蛋白を同定する)は、Guery et al.J.Immunol.134:536-544,1995; Inaba et al.Journal of Experimental Medicine 173:549-559,1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079,1995; Porgador et al.,Journal of Experimental Medicine 182:255-260,1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069,1993; Huang et al.,Science 264:961-965,1994; Macatonia et al.,Journal of Experimental Medicine 169:1225-1264,1989; Bhadwaj et al.,Journal of Clinical Investigation 94:797-807,1994;およびInaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640,1990に記載さいれたアッセイを包含するが、これらに限らない。
リンパ球生存/アポトーシスのアッセイ(特に、超抗体誘導後のアポトーシスを防止する蛋白、ならびにリンパ球のホメオスタシスを調節する蛋白を同定する)は、Darzynkiewicz et al.,Cytometry 13:795-808,1992; Gorczyca et al.,Leukimia 7:659-670,1993; Gorczyca et al.,Cancer Research 53:1945-1951,1993; Itoh et al.,Cell 66:233-243,1991; Zacharchuk,Journal of Immunology 145:4037-4045,1990; Zamai et al.,Cytometry 14:891-897,1993; Gorczyca et al.,International Journal of Oncology 1:639-648,1992に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
初期段階のT細胞のコミットメント(commitment)および発達のアッセイは、Antica et al.,Blood 84:111-117,1994; Fine et al.,Cellular Immunology 155:111-122,1994; Galy et al.,Blood 85:2770-2778,1995; Toki et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7548-7551,1991に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
本発明蛋白の活性を、特に、下記方法測定してもよい。
種々の造血細胞系の増殖および分化に適したアッセイはすでに引用されている。
胚の幹細胞の分化のアッセイ(特に、胚の分化造血に影響する蛋白を同定する)は、Johansson et al.Cellular Biology 15:141-151,1995; Keller et al.,Molecular and Cellular Biology 13:473-486,1993; McClanahan et al.,Blood81:2903-2915,1993に記載のアッセイを包含するが、これらに限らない。
幹細胞生存および分化のアッセイ(特に、リンパ−造血を調節する蛋白を同定する)は、: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. and Briddell, R.A. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 1-21, Wiley-Liss, Inc.., New York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. and Allen, T. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Long term culture initating cell assay, Sutherland, H.J. In Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. eds. Vol pp. 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994.に記載されたアッセイを包含するが、これらに限らない。
本発明蛋白を用いて治療してもよい自己免疫疾患は、例えば、多発性硬化症、全身性の深在性エリトマーデス、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、Guillain-Barre症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主移植片疾患および自己免疫性の炎症性の目の疾患を包含する。本発明のかかる蛋白を、喘息または他の呼吸器系の疾患のごときアレルギー性反応および症状の治療に用いてもよい。免疫抑制が望まれる他の症状(例えば、喘息および関連呼吸器系の症状を包含)を本発明蛋白を用いて治療してもよい。
また、CTLA−8蛋白は化学走性活性を有すると考えられる。本明細書において「化学走性」を有する蛋白またはペプチドとは、直接または間接的に刺激できる場合に、骨髄細胞およびリンパ球を包含する細胞の方向づけまたは運動を刺激するものである。好ましくは、蛋白またはペプチドは、細胞(好ましくはT細胞)の方向づけられた運動を直接刺激する能力を有する。特定の蛋白またはペプチドが細胞に対する化学走性活性を有するかどうかは、細胞の化学走性についての既知アッセイにおいてかかる蛋白またはペプチドを用いることにより容易に調べることができる。
また、CTLA−8蛋白は血管内皮細胞の増殖を阻害する。その結果、ヒト・CTLA−8蛋白は、血管新生(血管形成)の阻害に効果的である。この活性は、腫瘍および血管新生が関与している他の症状の治療においても有用である。また、ヒト・CTLA−8による血管新生は、正常な血管新生が関与している状態を抑制または防止するであろう。
本発明医薬組成物は、他の医薬上許容される担体のほかに、CTLA−8蛋白が、水溶液中においてミセル、不溶性単層、液体結晶またはラメラ層のような凝集体として存在する脂質のごとき両親媒性物質と混合されているリポソームの形態であってもよい。リポソーム形成に適する脂質は、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチジド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが、これらに限らない。かかるリポソーム処方の製造は当業者のレベルの範囲内であり、例えば、米国特許第4235871、4501728、4837028、および4737323号(参照により本明細書に記載されているものとみなす)に記載されたようなものである。
本明細書の用語「治療上有効量」とは、有意な患者の利益、例えば、かかる症状の徴候の改善、治癒、治癒速度の増大を示すに十分な医薬組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分について用いる場合、該用語は当該成分のみをいう。有効成分の組み合わせに用いる場合、逐次あるいは同時に投与された場合に治療効果を生じる有効成分量の総量をいう。
本発明医薬組成物中または本発明の実施に用いるためのCTLA−8蛋白の投与を種々の慣用的方法、例えば、経口的摂食、吸入、または皮内、皮下、または静脈注射で行うことができる。患者への静脈注射が好ましい。
治療上有効量のCTLA−8蛋白を経口投与する場合、CTLA−8蛋白は錠剤、カプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発明医薬組成物はゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントをさらに含有していてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約5ないし95%のCTLA−8蛋白、好ましくは約25ないし90%のCTLA−8蛋白を含有する。液体形態で投与する場合、水、ペトロレウム、動物または植物起源の油脂、例えばピーナッツ油、鉱油、大豆油、またはゴマ油、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組成物は、生理的セイライン溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、またはグリコール類(例えばエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール)をさらに含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は、約0.5ないし90重量%のCTLA−8蛋白、好ましくは約1ないし50%のCTLA−8蛋白を含有する。 治療上有効量のCTLA−8蛋白を静脈、皮内または皮下注射により投与する場合、CTLA−8蛋白はパイロジェン不含で、非経口的に許容される水溶液の形態であろう。適切なpH、等張性、安定性を有するかかる非経口的に許容される蛋白溶液の調製は、当業者の範囲内である。静脈、皮内、または皮下注射用の好ましい医薬組成物は、CTLA−8蛋白のほかに、注射用塩化ナトリウム、リンゲル溶液、注射用デキストロース、注射用デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、注射用乳酸含有リンゲル溶液、または当該分野で知られている他の担体を含有すべきである。本発明医薬組成物は、安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含んでいてもよい。
本発明組成物を用いる静脈投与による治療の期間は、治療すべき疾病の重さならびに各患者の状態および応答により変化させられるであろう。
CTLA−8蛋白の各適用期間は、連続静脈投与の場合12ないし24時間の範囲であると考えられる。最終的には、担当医師が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与による治療の期間を決定するであろう。
ヒト・CTLA−8蛋白に結合する中和または非中和抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)は、ある種の腫瘍の治療および上記症状の治療にも有用である。これらの中和モノクローナル抗体はヒト・CTLA−8蛋白へのリガンド結合をブロックする能力があり、あるいは患者からの蛋白の消去を促進しうる。
IL−17に対する相同性のため、本発明CTLA−8(B18)蛋白はIL−17のいくつかの活性を有する可能性がある。
処置または治療目的には、本明細書で議論または開示した蛋白を、哺乳動物対象におけるインビトロ発現により投与してもよい。かかる場合、本明細書開示のアデノウイルス法を包含する既知方法(アデノウイルス法に限らない)に従って所望蛋白をコードしているポリヌクレオチドを対象に投与する。
ヒトCTLA-8に対する部分クローンは、刺激したヒト末梢血液単球から単離したRNAから作製したcDNAライブラリーから単離した。この部分クローンは、「B18」と同定された。本明細書中にて時々用いるB18とは、本発明のヒトCTLA-8をいう。相同 性の探索によって、この部分クローンがヘルペスおよびラットのCTLA-8遺伝子に関連することが明らかとなった。この部分クローンのDNA配列を用いて、完全長クローンを単離した。
B18に対する完全長cDNA、一方向性の完全長cDNAライブラリーを単離するには、COS発現ベクターpMV2における標準的な方法を用いた。エレクトロポレーションによって、該cDNAライブラリーをイー・コリ(E.coli)に形質転換した。オリジナルの形質転換cDNAライブラリー塊は、グリセリン中、-80℃にて凍結させた。アリコットを力価測定して、形質転換イー・コリ濃度を測定した。イー・コリを解凍し、アンピシリン(ampicillin)を含有する培地中で76,000/0.1mlに希釈し、その0.1mlを8×8配列でマイクロタイターディッシュのウェルに撒いた。そのマイクロタイターディッシュを37℃に一晩置いて、イー・コリを増殖させた。
PCR用のDNAを調製するために、各ウェルからの培養物の20μlアリコットを吸引し、8ウェルの各列および各行に別々に保存して、各160μlの16保存物を得た。該イー・コリをペレット化し、10mM トリス-HCl、pH8、1mM EDTA、0.01%TtitonX-100よりなる標準的な溶解緩衝液160μlに再懸濁し、95℃に10分間加熱することによって溶解した。
B185:CACAGGCATACACAGGAAGATACATTCA(配列番号:7)
B183:TCTTGCTGGATGGGAACGGAATTCA(配列番号:8)
B18N:ATACATTCACAGAAGAGCTTCCTGCACA(配列番号:9)
PCR条件は、2.5mM MgCl2、ならびに、95℃×2分間を1サイクル、95℃×1分間+68℃×1分間を30サイクル、および68℃×10分間を1サイクルであった。各反応容量は20μlであった。最初の反応物には、オリゴヌクレオチドB185およびB183、ならびにDNA調製物1μlが含まれていた。2番目の反応物には、オリゴヌクレオチドB183およびB18N、ならびに最初の反応物1μlが含まれていた。
完全長B18のcDNAクローンを含む可能性のあるDNA調製物は、2番目のPCR反応物アリコットのアガロースゲル電気泳動によって同定した。正確な移動度を示すDNAバンドを、B18 cDNA由来のものであるとみなした。
ついで、同一の一連のPCR反応およびゲル分析を、8列に想到するDNA調製物に対して行った。列および行の交差によって、B18を潜在的に含むとしてウェルA2が同定され、これは、そのウェルに元々撒いたイー・コリを76000まで狭めた。
ウェル当たり253のイー・コリをマイクロタイタープレートのウェルに撒き、ウェルA2におけるイー・コリの精製と同様に進めることによって、このcDNAを含有するイー・コリをさらに精製した。推定される完全長B18 cDNAクローンを含有するとして、ウェルC3が同定された。正確なイー・コリは、ウェル内容物を細菌培養培地に平板し、ついで確立されたプロトコールに従ってイー・コリコロニーをスクリーニングすることによって同定した。これらのハイブリダイゼーション用のプローブは、前記のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、B18クローンのPCR反応を行うことによって生成したPCRフラグメントであった(配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9)。単一のコロニーを同定したら、標準的な方法によってDNAを調製し、配列決定した。この配列と元の部分クローンの配列とを比較することによって、同一であること、および単離したcDNAが完全長であることを確認した。
完全長クローンは、1995年7月6日にAmerican Type Culture Collectionに寄託し、受託番号ATCC 69868と登録された。
ヒトCTLA-8の完全長B18クローンをCOS細胞にトランスフェクトし、ついでこれを35S-メチオニンで標識した。トランスフェクト細胞培養物からの条件培地のアリコットを還元し、変性させ、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に付した。これらのゲルのオートラジオグラフを図2に再現する。矢印で示したバンドが、ヒトCTLA-8の発現を示している。
血管形成を阻害するヒトCTLA-8の能力は、アニギオスタティック(angio-static)活性アッセイ(内皮細胞増殖アッセイ)で検定した。該アッセイは、96ウェルプレートで行った。初代ヒト臍帯細胞(HUVEC)を撒いて、EGM培地(Clonetics社製)/20%FCS中のウェル当たり2×103細胞とし、37℃にて24時間インキュベートした。ついで、該細胞を、10%チャコール処理血清(M199-CS)を含有するM199培地(GIBCO BRL社製)中、37℃にて48時間、飢餓状態(starve)とした。B18(ヒトCTLA-8)を含有する条件培地は、トランスフェクトしたCOS細胞または安定して発現するCHO細胞から得、1:10、1:50、1:250および1:1250希釈物を、100ng/mlのFGFを含有するM199-CS培地中で調製した。B18の希釈物を飢餓状態の細胞に添加し、37℃にて72時間インキュベートした。ついで、その細胞を[3H]-チミジンで6時間放射性同位元素標識した。その放射性同位元素標識細胞をPBSで洗浄し、液体シンチレーションカウント用にトリプシン処理した。結果は、Kaleidograph softwareを用いてプロットした。その結果を図3に示す。図中、「Med」とは偽対照であり、「B18」および「B18-1」とはヒトCTLA-8(B18)をコードするDNAを有するCOSの2つの独立したトランスフェクト体からの条件培地であった。IFNγを陽性対照アンギオスタティック(すなわち、血管形成阻害)活性として用いた。これらのデータは、ヒトCTLA-8(B18)が血管形成を阻害することを示している。
イン・ビボ(in vivo)で発現させたヒトCTLA-8(B18)の造血活性は、組換えアデノウイルスベクターの構築物によって検定した。
発現プラスミドAdori 2-12 B18中のB18 cDNAは、サイトメガロウイルス(CMV)即時型プロモーターおよびエンハンサーによって作動させた。
Adori 2-12ベクターは、SV40複製起点およびエンハンサーを公知のアデノウイルスベクター(Barrら、Gene Therapy 1:51(1994);Davidsonら、Nature Genetics 3:219(1993))に付加することによって生成し た。SV40複製起点およびエンハンサーをコードしているHindIII/BamHIフラグメントをpMT2哺乳動物発現ベクターから単離し、Klenowを 用いて平滑化し、Ad5発現ベクターの(Klenowで平滑化した)NatIサイトにクローン化した。
pNOT-B18 cDNAをSalIで消化し、Klenowで5'突出末端を埋めて平滑末端を生成させ、EcoRIで消化することによってベクターを誘導化して、B18 cDNAを単離した。該平滑化-EcoRI B18フラグメントをアデノウイルスベクターAdori 2-12の制限部位EcoRV-EcoRIに挿入した。CMV-B18発現カセットは、SV40複製起点およびエンハンサーから下流であって、5型アデノウイルス(Ad5)の左手末端の0-1地図単位に位置していた。SV40スプライシングのドナーおよびアクセプターは、CMVプロモーターとB18 cDNAとの間に位置していた。インサートの後には、SV40ポリAサイト、9-16地図単位のAd5、およびpUC19複製起点が存在していた。
B18をコードする組換えアデノウイルスの5×1010粒子の単一用量を、7-8週齢のC57/bl6雄マウスの尾部静脈に注射した。対照マウスには、B-ガラクトシダーゼを コードするアデノウイルスを投与した。各実験群からのマウス4匹を7および14日目に殺した。採血し、Baker 9000を用いて自動血液分析を行った。種々のカウントを血液スメア(blood smear)で行った。組織病理学用に、組織を採取し、ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン(hematoxylin)およびエオシン(eosin)で染色した。最初のセットの実験においては、注射7および14日後に血清および組織を分析した。末梢血小板計数のわずかな上昇が認められた。B18を投与した動物は、脾臓サイズのわずかな増大を示した。脾臓の肉眼分析によって、対照と比較しての、7日目の脾臓髄質外造血(splenic extramedullary hematopoiesis)の上昇が示された。これらの結果は、B18に関連した造血促進(hematopoietic growth)活 性を示していた。
B18をコードするアデノウイルスを投与すると、末梢血液好中球およびWBCにおける顕著な上昇を生じた(図4)。好中球の最大の上昇は、5日目および7日目に認められた。対照マウスは、5日目および7日目にほとんど相違を示さなかった。末梢血液好中球は、対照マウス、および21日目にB18を投与したマウスにおいて同様であった。B18および対照群の両方において、白血球における上昇も認められた。B18を投与した マウスは、2日目と7日目との間にWBCにおけるより大きな上昇を有していた。21日目 までに、より顕著な上昇がB-gal群において認められた。細胞化学における他の変化は認められなかった(表I)。
骨髄細胞充実性(cellularity)は、各群における保存大腿骨から算出した(表III)。顕著な相違はいずれの群においても認められなかった。7、14および21日目からの骨髄造血前駆細胞においては、顕著な変化は認められなかった。B18マウスにおけるGFU-GM、BFU-EおよびCFU-MEGは、B-gal対照と同様であった(表II)。
骨髄:赤血球比(表IV)は、7日目にアデノウイルスB18を投与したマウスにおける、可能性のある赤血球減形成を有する顆粒球減形成を示唆している。21日目まで、B-gal群における該比はより高かった。IL6血清レベルにおいて変化は全く認められなかった。
これらの結果は、B18(ヒトCTLA-8)をコードするアデノウイルスの投与に関連する造血活性を示している。B18アデノウイルスを投与した動物においては、7日目に好中球および白血球の上昇が認められた。このデータは、対照動物と比較して、B18が投与7日後に脾臓CFU-GMおよびBFU-E7の上昇を起こしたことを示した。7日目の脾臓髄質外造血は、B18が造血促進活性を示すことを支持している。これらのデータは、B18が初期造血前駆細胞を可動化(moblize)し得ることを示唆している。
*骨髄先駆体は、105細胞あたりのコロニー数の平均±標準偏差で示されている。
**脾臓先駆体は、106細胞あたりのコロニー数の平均±標準偏差で示されている。
B18(ヒトCTLA−8)の造血活性を有する因子の生成を誘発する活性をヒト赤血球細胞ライン、TF−1(Kitamura et al.,J.Cell.Physiol. 140:323(1989))を用いて、因子−依存細胞増殖アッセイで決定した。細胞を、はじめにrhGMCSF(100U/ml)の存在下、培養した。細胞をアッセイの開始に先立ち、3日培養した。アッセイ条件は以下のとおりである。
細胞/ウェル 5000/200μl
培養時間 3日
パルス時間 4時間
トリチウムチミジンの量 0.5μCi/ウェル
計測時間 1分
くり返し 2
B18単一、HS−5誘導B18からのならし培地(conditioned medium、CM)をアッセイした。緩衝液単一、緩衝液で誘導されたHS−5細胞からのCM、非誘導HS−5細胞か らのCMを対照としてアッセイした。結果は図5に示される。B18(ヒトCTLA−8)は、TF−1増殖を誘導する因子の生成を誘発する能力を示した。この活性は、坑GMCSF抗体を加えることで実質的に除かれる。これらのデータは、ヒトCTLA−8(B18)は、造血を誘導することができることを示す。特に、いかなる学説にも縛られることなく、このことは、ヒト・CTLA−8(B18)は、GM−CSFそして/またはIL−3の生成を誘発することを示している。
MRC5細胞をヒトCTLA−8(B18)の存在下培養し、IL−6、IL−8の生成を測定した。ヘルペスCTLA−8(IL−17)を正のコントロールとして用いた。志願者のヒトCTLA−8(B18)は、IL−6とIL−8の両方の測定可能な生成を示した(図6、図7参照)。
ここで引用したすべての特許と文献は、参照により本明細書に記載されているものとみなす。
Claims (26)
- (a)配列番号:1のヌクレオチド146からヌクレオチド544までの塩基配列、および
(b)遺伝子コードの縮重による(a)の塩基配列の変形した塩基配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、上記配列がヒト配列番号:2のアミノ酸配列を有するCTLA−8蛋白をコードするものであるポリヌクレオチド。 - 該ヌクレオチド配列がCTLA−8活性を有する蛋白をコードするものであり、該蛋白がγ−IFN、IL−3、IL−6、IL−8またはGM−CSFの発現または分泌の誘導によって、あるいはその化学誘引性または化学走性活性によって特徴づけられるものであり、該ヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 該ヌクレオチド配列が哺乳動物対象におけるインビボ発現に適したベクター中に含まれている、請求項2記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド55から544までのヌクレオチド配列を含む請求項1ないし3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド86から544までのヌクレオチド配列を含む請求項1ないし3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド139から544までのヌクレオチド配列を含む請求項1ないし3のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1ないし6のいずれか1項記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。
- 該細胞が哺乳動物細胞である請求項7記載の宿主細胞。
- (a)配列番号:2のアミノ酸配列、
(b)配列番号:2のアミノ酸11から163までのアミノ酸配列、
(c)配列番号:2のアミノ酸29から163までのアミノ酸配列、
(d)配列番号:2のアミノ酸31から163までのアミノ酸配列、および
(e)CTLA−8活性を有する(a)、(b)、(c)または(d)のフラグメントであって、γ−IFN、IL−3、IL−6、IL−8またはGM−CSFの発現または分泌の誘導によって、あるいはその化学誘引性または化学走性活性によって特徴づけられるフラグメント
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ヒトCTLA−8蛋白。 - 配列番号:2のアミノ酸配列を含む請求項9記載の蛋白。
- 配列番号:2のアミノ酸11から163までのアミノ酸配列を含む請求項9記載の蛋白。
- 配列番号:2のアミノ酸29から163までのアミノ酸配列を含む請求項9記載の蛋白。
- 配列番号:2のアミノ酸31から163までのアミノ酸配列を含む請求項9記載の蛋白。
- 治療上有効量の請求項9ないし13のいずれか1項記載のヒトCTLA−8蛋白および医薬上許容される担体を含む医薬組成物であって、血管新生の阻害、血管内皮細胞の増殖の阻害、腫瘍の増殖の阻害、血管新生に依存する組織増殖の阻害、骨髄細胞または前駆細胞の増殖、赤血球系細胞または前駆細胞の増殖、リンパ球または前駆細胞の増殖、IFNγ産生の誘導、IL−3産生の誘導またはGM−CSF産生の誘導のための医薬組成物。
- 請求項9ないし13のいずれか1項記載のヒトCTLA−8蛋白に特異的と反応する抗体を含む組成物。
- 該抗体がポリクローナル抗体である請求項15記載の組成物。
- 該抗体がモノクローナル抗体である請求項15記載の組成物。
- 配列番号:1のヌクレオチド146からヌクレオチド544までのヌクレオチド配列のヒト対立遺伝子変異体を含む単離ポリヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列がCTLA−8活性を有する蛋白をコードするものであり、該蛋白がγ−IFN、IL−3、IL−6、IL−8またはGM−CSFの発現または分泌の誘導によって、あるいはその化学誘引性または化学走性活性によって特徴づけられるものである、ポリヌクレオチド。
- 該ヌクレオチド配列がCTLA−8活性を有する蛋白をコードするものであり、該蛋白がγ−IFN、IL−3、IL−6、IL−8またはGM−CSFの発現または分泌の誘導によって、あるいはその化学誘引性または化学走性活性によって特徴づけられるものであり、該ヌクレオチド配列が発現制御配列に作動可能に連結されているものである、請求項18記載のポリヌクレオチド。
- 該ヌクレオチド配列が哺乳動物対象におけるインビボ発現に適したベクター中に含まれている、請求項19記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド55からヌクレオチド544までのヌクレオチド配列を含む請求項18ないし20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド86からヌクレオチド544までのヌクレオチド配列を含む請求項18ないし20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:1のヌクレオチド139からヌクレオチド544までのヌクレオチド配列を含む請求項18ないし20のいずれか1項記載のポリヌクレオチド。
- 請求項18ないし23のいずれか1項記載のポリヌクレオチドで形質転換された非ヒト宿主細胞。
- 該細胞が哺乳動物細胞である請求項24記載の宿主細胞。
- (a)請求項7、8、24または25のいずれか1項記載の宿主細胞を培地にて増殖させ、次いで、
(b)培地からからヒトCTLA−8蛋白を精製する
ことを含む、ヒトCTLA−8の製造方法。
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