ES2242966T3 - Ctla-8humana y usos de proteinas relacionadas con ctla-8. - Google Patents
Ctla-8humana y usos de proteinas relacionadas con ctla-8.Info
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Abstract
SE PRESENTAN POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN EL CTLA-8 HUMANO Y LAS PROTEINAS RELACIONADAS. SE PRESENTAN TAMBIEN LAS PROTEINAS HUMANAS CTLA-8 Y LOS METODOS PARA SU PRODUCCION. SE PRESENTAN TAMBIEN LOS METODOS DE TRATAMIENTO BASADOS EN LAS PROTEINAS HUMANAS CTLA-8 Y LAS PROTEINAS CTLA-8 DEL RATON Y LAS PROTEINAS CTLA-8 DEL VIRUS DEL HERPES.
Description
CTLA-8 humana y usos de proteínas
relacionadas con CTLA-8.
Esta solicitud es continuación en parte de la
solicitud US 08/504.032 (no expedida) y continuación en parte del
documento US 5.707.829.
La presente invención se refiere a proteínas
CTLA-8 humanas, a ácidos nucleicos que codifican
tales proteínas, y a su uso para preparar composiciones
farmacéuticas para tratar enfermedades, como se menciona en la
reivindicación 11ª.
Las citocinas son proteínas segregadas que actúan
sobre células hematopoyéticas diana específicas provocando un evento
de diferenciación, o sobre otras células diana induciendo una
respuesta fisiológica concreta, tal como la secreción de proteínas
características de la inflamación. Las citocinas, también conocidas
indistintamente como linfocinas, hematopoyetinas, interleucinas,
factores estimuladores de colonias, y de formas similares, pueden
ser agentes terapéuticos importantes, especialmente para
enfermedades o situaciones en las que se reduce una población
específica de células. Por ejemplo, la eritropoyetina,
G-CSF y GM-CSF se han hecho todas
ellas importantes para el tratamiento de la anemia y la leucopenia,
respectivamente. Otras citocinas, tales como
interleucina-3, interleucina-6,
interleucina-11 e interleucina-12,
se muestran prometedoras en el tratamiento de enfermedades como la
trombocitopenia y en la modulación de la respuesta inmunitaria.
Por estas razones, se ha dedicado un considerable
esfuerzo investigador a la búsqueda de nuevas citocinas y a la
clonación de los DNAs que las codifican. En el pasado, se
identificaron nuevas citocinas ensayando una célula particular tal
como una célula de la médula ósea, en cuanto a una respuesta
medible, tal como la proliferación. La busca de nuevas citocinas se
ha visto así limitada por los ensayos disponibles, y, si una nueva
citocina tiene una actividad que no es posible medir mediante un
ensayo conocido, la citocina sigue siendo indetectable. En un
planteamiento más reciente, se han detectado cDNAs que codifican
citocinas, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
cebadores de oligonucleótidos que tienen homología con motivos
compartidos de citocinas conocidas o sus receptores. El
planteamiento de la PCR está también limitado por la necesidad del
conocimiento de citocinas previamente clonadas en la misma familia
de proteínas. También se han clonado citocinas usando hibridación
sustractiva para construir y cribar genotecas de cDNA, o
potencialmente pueden clonarse usando PCR seguida por
electroforesis en gel para detectar genes expresados
diferencialmente. Los métodos de hibridación sustractiva se basan
en la suposición de que los mRNAs de la citocina son aquellos que
se expresan diferencialmente, y estos métodos no requieren ningún
conocimiento previo de la secuencia de interés. Sin embargo, muchas
citocinas pueden ser codificadas por mRNAs que no se expresan
diferencialmente, y así son detectables usando estos méto-
dos.
dos.
Sería deseable desarrollar nuevos métodos para
identificar nuevas citocinas y otros factores segregados, y para
aislar los polinucleótidos que los codifican.
Al desarrollar la presente invención se emplearon
métodos que identifican selectivamente polinucleótidos que codifican
proteínas segregadas. Se aisló uno de tales nucleótidos que
codifica "CTLA-8 humana". De acuerdo con la
presente invención, se describen polinucleótidos que codifican
CTLA-8 humana y fragmentos activos de la misma. A lo
largo de la presente memoria descriptiva, se usa
"CTLA-8" para referirse tanto a las proteínas
como a los polinucleótidos que codifican a esas proteínas, y para
referirse a proteínas y polinucleótidos de todas las especies de
mamíferos.
En ciertas realizaciones, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia
de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 146 al nucleótido 544;
- (b)
- una secuencia de nucleótidos que varía a partir de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) como resultado de la degeneración del código genético, en la que dicha secuencia codifica la proteína CTLA-8 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2.
La invención proporciona también un
polinucleótido aislado que comprende una variante alélica de la
secuencia de nucleótidos que comprende la SEC ID Nº: 1 desde el
nucleótido 146 hasta el nucleótido 544, en la que dicha secuencia de
nucleótidos codifica una proteína CTLA-8 que tiene
actividad de CTLA-8, que está especificada por la
inducción de la expresión o de la secreción de
gamma-IFN, IL-3,
IL-8 o GM-CSF o por su actividad
quimioatrayente o quimiotáctica.
Preferentemente, el polinucleótido de la
invención codifica una proteína que tiene actividad de
CTLA-8. En otras realizaciones, el polinucleótido
está unido operativamente a una secuencia de control de la
expresión. En otras realizaciones preferidas, el polinucleótido
está contenido en un vector adecuado para la expresión in
vivo en un mamífero. Los polinucleótidos que comprenden la
secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 55
al nucleótido 544, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No: 1
desde el nucleótido 139 hasta el nucleótido 544, o la secuencia de
nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 86 hasta el
nucleótido 544, son particularmente preferidos.
También se proporcionan células hospedadoras
transformadas con los polinucleótidos de la invención, incluyendo
células de mamíferos.
También se proporcionan procedimientos para
producir una proteína CTLA-8 humana, comprendiendo
dicho procedimiento:
- (a)
- desarrollar un cultivo de la células hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado; y
- (b)
- purificar la proteína CTLA-8 humana a partir del cultivo.
También se proporciona la proteína
CTLA-8 humana aislada, que comprende una secuencia
de aminoácidos elegida entre el grupo consistente en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 11 al 163;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 29 al 163;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 31 al 163; y
- (e)
- fragmentos de (a), (b), (c) o (d) que tienen actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o de la secreción de \gamma-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 o GM-CSF, o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
Las proteínas que comprenden la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que comprenden la secuencia desde
el aminoácido 29 al 163, desde al aminoácido 31 al 163 o desde el
aminoácido 11 al 163 de las SEC ID Nº: 2, son particularmente
preferidas. Preferentemente, la proteína tiene actividad de
CTLA-8. También se proporcionan composiciones
farmacéuticas que comprenden una proteína CTLA-8
humana de la invención y un vehículo aceptable
farmacéuticamente.
También se describen composiciones que comprenden
un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína
CTLA-8 humana de la invención.
La invención proporciona también una composición
farmacéutica que comprende una proteína CTLA-8
humana según la invención y un vehículo aceptable
farmacéuticamente.
La CTLA-8 de rata y fragmentos
activos (es decir, que tienen actividad de CTLA-8)
de la misma, pueden también usarse en tales métodos de tratamiento.
Preferentemente la proteína de rata se administra como una
composición que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente y
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos elegida
entre el grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 desde el aminoácido 18 al 150; y
- (c)
- fragmentos de (a) o (b) que tienen actividad de CTLA-8.
El herpesvirus Saimiri
ORF-13, denominado en el presente texto
"CTLA-8 de herpes", y fragmentos activos (es
decir, que tienen actividad de CTLA-8) del mismo,
pueden también usarse en tales métodos de tratamiento.
Preferentemente, la proteína CTLA-8 de herpes es
administrada como una composición que comprende un vehículo
aceptable farmacéuticamente y una proteína que comprende un
secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo consistente en:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 desde el aminoácido 19 al 151; y
- (c)
- fragmentos de (a) o (b) que tienen actividad de CTLA-8.
La invención proporciona también un método para
tratar un mamífero, que comprende administrar una cantidad
terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un
vehículo aceptable farmacéuticamente e IL-17 o un
fragmento activo de la misma. La invención proporciona también el
uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición
según la invención, que comprende una proteína
CTLA-8 humana, para la preparación de un medicamento
para la inhibición de la angiogénesis, la inhibición del
crecimiento o de la proliferación de las células endoteliales
vasculares, la inhibición del crecimiento de tumores, la inhibición
del desarrollo de tejidos dependiente de la angiogénesis, la
proliferación de células mieloides o progenitoras, proliferación de
células eritroides o progenitoras, proliferación de células
linfoides o progenitoras, la inducción de la producción de
IFN\gamma, la inducción de la producción de IL-3 y
la inducción de la producción del GM-CSF.
La Fig. 1 es una comparación de regiones
homólogas de las secuencias de aminoácidos de la
CTLA-8 humana (indicada como "B 18_F1"),
CTLA-8 de rata (indicada como "Musctla8") y
CTLA-8 de herpes (indicada como "Hsvie_2").
La Fig. 2 representa autorradiografías que
demuestran la expresión de CTLA-8 humana en células
de COS.
La Fig. 3 presenta datos relacionados con la
capacidad de la CTLA-8 humana para inhibir la
angiogénesis.
Las Fig. 4 y 5 presentan datos relacionados con
la capacidad de la CTLA-8 humana para producir o
inducir la actividad hematopoyética.
Las Fig. 6 y 7 presentan datos que demuestran la
capacidad de la CTLA-8 humana para inducir la
producción de IL-6 e IL-8.
Los inventores de la presente solicitud han
identificado y proporcionado un polinucleótido que codifica una
proteína CTLA-8 humana. La SEC ID Nº: 1 proporciona
la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica la proteína
CTLA-8 humana. La SEC ID Nº: 2 proporciona la
secuencia de aminoácidos de la proteína CTLA-8
humana. Alternativamente, la metionina de iniciación puede estar en
el aminoácido 11 de la SEC ID Nº: 2. Sobre la base de la
secuenciación amino terminal, se cree que la secuencia de la
proteína madura comienza en el aminoácido 31 de la SEC ID Nº: 2
(codificada por la secuencia que comienza con el nucleótido 146 de
la SEC ID Nº: 1).
La región desde el aminoácido 29 hasta el
aminoácido 163 de la CTLA-8 humana (SEC ID Nº: 2)
muestra una acusada homología con porciones de la
CTLA-8 de rata (aminoácidos 18 a 150 de la SEC ID
Nº: 4) y de herpes virus Saimiri ORF 13
("CTLA-8 de herpes") (aminoácidos 19 a 151 de
la SEC ID Nº: 5). Una secuencia de cDNA que codifica la
CTLA-8 de rata está listada en la SEC ID Nº: 3 y su
correspondiente secuencia de aminoácidos se expone en la SEC ID Nº:
4. Una secuencia de cDNA que codifica la CTLA-8 de
herpes está listada en la SEC ID Nº: 5 y su correspondiente
secuencia de aminoácidos se expone en la SEC ID Nº: 6. La homología
entre la CTLA-8 de rata y la CTLA-8
de herpes fue publicada por Rouvier et al., J. Immunol. 1993,
150, 5445-5456.
Los solicitantes habían identificado previamente
de forma incorrecta las secuencias de rata de la SEC ID Nº: 3 y la
SEC ID Nº: 4 como válidas para la CTLA-8 murina. La
CTLA-8 humana de los solicitantes (B 18) también
muestra homología con la secuencia de la CTLA-8
murina verdadera.
Golstein et al. (documento WO 95/18826;
Fossiez et al., Microbial Evasion and Subversion of Immunity
544:3222 (Resumen)) han publicado también una especie que ellos
identificaron inicialmente como "CTLA-8
humana". Sin embargo, el examen de la secuencia de la especie de
Golstein et al. y de la secuencia de CTLA-8
humana (B18) de la presente invención revela fácilmente que son dos
proteínas diferentes, aunque son homólogas entre sí y con la
CTLA-8 de rata y la CTLA-8 de herpes
identificadas aquí. La especie de Golstein et al. ha sido
ahora rebautizada como interleucina-17
(IL-17). A causa de la homología entre la
CTLA-8 humana (B18) de los solicitantes y la
IL-17, es de esperar que estas proteínas compartan
algunas actividades.
También se ha determinado de forma preliminar que
la CTLA-8 humana (B18) forma homodímeros cuando se
expresa. Como resultado de ellos, las proteínas
CTLA-8 humanas pueden poseer actividad bien sea en
la forma monómera o bien en la dímera. Las proteínas
CTLA-8 humanas pueden también producirse como
heterodímeros con proteínas CTLA-8 de rata y de
herpes y con IL-17 humana. También es de esperar que
estos heterodímeros tengan las actividades de las proteínas de las
que están formados.
Las formas de proteína CTLA-8
humana de longitud inferior a la completa están comprendidas dentro
de la presente invención y pueden producirse expresando el
correspondiente fragmento del polinucleótido que codifica la
proteína CTLA-8 humana (SEC ID Nº: 1). Estos
fragmentos de polinucleótido correspondientes son también parte de
la presente invención. Polinucleótidos modificados como se describen
antes pueden prepararse mediante técnicas estándar de biología
molecular, incluyendo métodos de mutagénesis dirigida al sitio que
son conocidos en la técnica, o mediante una reacción en cadena de
polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.
Para los propósitos de la presente invención, una
proteína tiene "actividad de CTLA-8": (1) si
muestra actividad biológica en un ensayo de proliferación celular
dependiente de factor (preferentemente un ensayo en el que es activa
la correspondiente especie de CTLA-8 de longitud
completa) (incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los ensayos
descritos más adelante), o bien (2) si induce la expresión o la
secreción de \gamma-IFN, o bien (3) si muestra
actividad quimiotáctica en un ensayo de quimiotaxis
(preferentemente en un ensayo en el que es activa la correspondiente
especie de CTLA-8 de longitud completa) o (4) si
induce la expresión o la secreción de IL-3 o
GM-
CSF.
CSF.
La proteína CTLA-8 humana, o
fragmentos de la misma que tienen actividad de
CTLA-8, pueden fusionarse con moléculas portadoras
tales como inmunoglobulinas. Por ejemplo, la proteína
CTLA-8 humana puede fusionarse por medio de
secuencias "espaciadoras" con la porción Fc de una
inmunoglobulina.
La invención comprende también variaciones
alélicas de la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEC ID
Nº: 1, esto es, formas alternativas de origen natural del
polinucleótido aislado de la SEC ID Nº: 1 que también codifica
CTLA-8 humana o proteínas CTLA-8 que
tienen actividad de CTLA-8. También se incluyen en
la invención polinucleótidos aislados que se hibridan con la
secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 bajo
condiciones muy estrictas (0,2 x SSC a 65ºC), estrictas (4 x SSC a
65ºC o formamida al 50% y 4 x SSC a 42ºC), o relajadas (4 x SSC a
50ºC o formamida al 30-40% y 4 x SSC a 42ºC). Los
polinucleótidos aislados que codifican la proteína
CTLA-8 humana pero que difieren de la secuencia de
nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 1 en virtud de la degeneración
del código genético, están también comprendidas por la presente
invención. También están incluidas en la presente invención
variaciones de la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEQ
ID Nº: 1 que son producidas por mutaciones puntuales o por
modificaciones inducidas que potencian la actividad de
CTLA-8, la vida mitad o el nivel de producción.
Los polinucleótidos aislados de la presente
invención pueden estar unidos operativamente a una secuencia de
control de la expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o
pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res.
19, 4485-4490 (1991), con el fin de producir
la proteína CTLA-8 de forma recombinante. Se
conocen en la técnica muchas secuencias de control de la expresión
adecuadas. También se conocen métodos generales para expresar
proteínas recombinantes, y se ejemplifican en Kaufman, Methods in
Enzymology 185, 537-566 (1990). Como se
define en el presente texto, "unido operativamente" significa
ligado enzimáticamente o químicamente para formar un enlace
covalente entre el polinucleótido aislado de la invención y la
secuencia de control de la expresión, de tal manera que la proteína
CTLA-8 sea expresada por una célula hospedadora que
ha sido transformada (transfectada) con el polinucleótido
ligado/secuencia de control de la expresión.
Varios tipos de células pueden actuar como
células hospedadoras adecuadas para la expresión de la proteína
CTLA-8 humana. Puede usarse cualquier tipo de célula
capaz de expresar la proteína CTLA-8 humana
funcional. Las células de mamífero hospedadoras adecuadas incluyen,
por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de hamster
chino (CHO), células 293 de riñón humano, células A431 epidérmicas
humanas, células Colo205 humanas, células 3T3, células
CV-1, otras líneas de células de primate
transformadas, células diploides normales, cepas de células
derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes
primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK,
HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D,
FDCP-1, PC12 o C2C12.
La proteína CTLA-8 humana puede
también producirse uniendo operativamente el polinucleótido aislado
de la invención a secuencias de control adecuadas en uno o más
vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de
expresión de insecto. Los materiales y métodos para sistemas de
expresión de baculovirus/células de insecto son disponibles
comercialmente en forma de estuche o kit de, p. ej.,
Invitrogen, San Diego, California, EE.UU. (el kit MaxBac®) y
tales métodos son bien conocidos en la técnica, como se describe en
Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº.
1555 (1987), incorporado al presente texto como referencia. También
pueden producirse formas solubles de la proteína
CTLA-8 humana en células de insectos usando
polinucleótidos aislados apropiados, como se describió antes.
Alternativamente, la proteína
CTLA-8 humana puede ser producida en eucariotas
inferiores tales como levaduras, o en procariotas tales como
bacterias. Las cepas de levaduras adecuadas incluyen
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de
levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas
bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacteriana
capaz de expresar proteínas heterólogas.
La proteína CTLA-8 humana de la
presente invención puede también expresarse como producto de
animales transgénicos, p. ej. como componente de la leche de vacas,
cabras cerdas u ovejas transgénicas, que se caracterizan por células
somáticas o germinales que contienen una secuencia de
polinucleótidos que codifica la proteína CTLA-8
humana.
La proteína CTLA-8 humana de la
presente invención puede prepararse desarrollando un cultivo de
células hospedadoras transformadas, bajo las condiciones de cultivo
necesarias para que expresen la proteína deseada. La proteína
expresada resultante puede entonces ser purificada del medio de
cultivo o de los extractos celulares. Las formas solubles de la
proteína CTLA-8 humana de la presente invención
pueden se purificadas desde medios acondicionados. Las formas,
unidas a la membrana, de la proteína CTLA-8 humana
de la presente invención pueden ser purificadas preparando una
fracción de membrana total a partir de la célula expresante y
extrayendo las membranas con un detergente no iónico tal como
Triton X-100.
La proteína CTLA-8 humana puede
purificarse usando métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, la proteína CTLA-8 humana de la
presente invención puede concentrarse usando un filtro de
concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo
una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después
de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una
matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel.
Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio
aniónico, por ejemplo una matriz o sustrato que tenga grupos
dimetilaminoetilo colgantes (DEAE). Las matrices pueden ser
acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
normalmente en la purificación de proteínas. Alternativamente,
puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los
intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices
insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se
prefieren los grupos sulfopropilo (p. ej. columnas de
S-Sepharose®). La purificación de la proteína
CTLA-8 humana del sobrenadante del cultivo puede
incluir también una o más etapas en columna sobre resinas de
afinidad, tales como concanavalina A-agarosa,
heparina-toyopearl®, o Cibacrom
blue-3GA Sepharose®; o por cromatografía de
interacción hidrofóbica usando resinas tales como fenil éter, butil
éter o propil éter, o por cromatografía de inmunoafinidad.
Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía de
líquidos de alto rendimiento en fase inversa
(RP-HPLC) empleando medios de
RP-HPLC hidrófobos, p. ej. gel de sílice que tienen
grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar
más la proteína CTLA- 8 humana. Algunas o todas las etapas de
purificación precedentes, en varias combinaciones o con otros
métodos conocidos, pueden también emplearse para proporcionar una
proteína recombinante aislada sustancialmente purificada.
Preferentemente, la proteína
CTLA-8 humana se purifica de forma que esté
sustancialmente libre de otras proteínas de mamífero.
Se cree que la CTLA-8 humana, los
fragmentos activos y variantes de la misma, y proteínas relacionadas
con CTLA-8 (tales como, por ejemplo,
CTLA-8 de rata y CTLA-8 de herpes)
(colectivamente "proteínas CTLA-8") poseen o
inducen actividad de citocina. La expresión de
CTLA-8 humana se correlacionó con la expresión de
\gamma-IFN en células primarias inducidas y puede
inducir la expresión de IL-3 y/o
GM-CSF, la cual expresión puede a su vez producir
efectos asociados con la citocina inducida. Por consiguiente, la
CTLA-8 humana y proteínas CTLA-8
relacionadas con CTLA-8, pueden tener un efecto
sobre la proliferación o la función de células mieloides, células
eritroides, células linfoides y sus progenitores. Las proteínas
CTLA-8 humanas pueden también desempeñar un papel
en la formación de las plaquetas o sus progenitores.
Una proteína de la presente invención puede
mostrar actividad de citocina, proliferación celular (bien sea
induciéndola o bien inhibiéndola) o diferenciación celular (bien
sea induciéndola o bien inhibiéndola), o puede inducir la producción
de otras citocinas en ciertas poblaciones de células. Muchos
factores proteicos descubiertos hasta ahora, incluyendo todas las
citocinas conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de
proliferación celular dependiente de factor, y por ello los ensayos
sirven como confirmación práctica de la actividad de citocina. La
actividad de una proteína de la presente invención se pone de
evidencia por uno cualquiera entre una serie de ensayos rutinarios
de proliferación celular dependiente de factor para líneas de
células que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10, B9,
B9/11, BaF_{3}, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165,
HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y
CMK.
CMK.
La actividad de una proteína de la presente
invención puede medirse, entre otros medios, por los métodos
siguientes.
Los ensayos de proliferación de células T o
timocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en:
Current Protocols in Immunology, Ed. by J. E. Coligan, A. M.
Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience
(capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in
Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494:3500, 1986;
Bertagnolli et al., J. Immunol. 145:
1706-1712, 1990; Bertagnolli et al.,
Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli
et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992;
Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761,
1994.
Los ensayos para producción de citocina y/o
proliferación de células esplénicas, células de ganglios linfáticos
o timocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en:
Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. y Shevach, E. M. en
Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds.
Vol. 1 p. 3.12 -3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; y
Measurement of mouse and human Interferon \gamma, Schreiber, R.
D. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan
eds. Vol. 1 p. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons,
Toronto, 1994.
Los ensayos para la proliferación y
diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen,
sin limitarse a ellos, los descritos en: Measurement of Human and
Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davie, L. S. y
Lipsky, P. E. en Current Protocols in Immunology, J. E. e.
a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.3.1-6.3.12, John Wiley
and Sons, Toronto, 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173:
1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336:
690-692, 1988; Greenberger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931-2938, 1983;
Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R en
Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds.
Vol. 1 p. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons,
Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin
11 - Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. en
Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds.
Vol. 1 p. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of
mouse and human Interleukin 9 -
Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
Los ensayos de las respuestas de clones de
células T frente a antígenos (que identificarán, entre otras, a las
proteínas que afectan a las interacciones entre las APC y las
células T, así como efectos directos de las células T midiendo la
proliferación y la producción de citocina) incluyen, sin limitarse
a ellos, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed. por
J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W.
Strober Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience
(capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function;
capítulo 6, Cytokines and their cellular receptors; capítulo 7,
Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095; 1980;
Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11:
405-411, 1981; Takai et al., J. Immun. 137:
3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immun. 140:
508-512, 1988.
Una proteína de la presente invención puede
mostrar también actividad de estimulación inmunitaria o de supresión
inmunitaria, incluyendo, sin limitarse a ellas, las actividades
para las que se han descrito ensayos en el presente texto. Una
proteína puede ser útil en el tratamiento de diversas deficiencias y
trastornos inmunitarios (incluyendo la inmunodeficiencia combinada
grave (SCID: Severe Combined
ImmunoDeficiency)), p. ej. en la regulación (por
incremento o por disminución) del crecimiento y proliferación de
linfocitos T y/o B, así como llevando a efecto la actividad
citolítica de las células NK y otras poblaciones celulares. Estas
deficiencias inmunitarias pueden ser genéticas o causadas por
infecciones víricas (p. ej. el VIH), así como bacterianas o
fúngicas, o pueden ser el resultado de trastornos autoinmunitarios.
Más específicamente, las enfermedades infecciosas causadas por
infecciones víricas, bacterianas, fúngicas u otras pueden tratarse
usando una proteína de la presente invención, incluyendo las
infecciones por VIH, virus de la hepatitis, virus herpes,
micobacterias, leshmania, malaria y diversas infecciones fúngicas
tales como candida. Desde luego, en relación con esto, una proteína
de la presente invención puede ser también útil en los casos en los
que esté indicado un refuerzo para el sistema inmunitario, p. ej.
en el tratamiento del cáncer.
Los trastornos autoinmunitarios que pueden
tratarse usando una proteína de la presente invención incluyen, por
ejemplo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis
reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de
Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria, diabetes
mellitus dependiente de la insulina, miastenia grave, enfermedad de
rechazo del injerto contra el hospedador y enfermedad ocular
autoinflamatoria. Tal proteína de la presente invención puede ser
también útil en el tratamiento de reacciones y enfermedades
alérgicas, tales como asma y otros problemas respiratorios. Otras
enfermedades en las que se desea la supresión inmunitaria
(incluyendo, por ejemplo, asma y enfermedades respiratorias
relacionadas con el asma) pueden ser tratables usando una proteína
de la presente invención.
Una proteína de la presente invención puede
también suprimir la inflamación crónica o aguda, tal como, por
ejemplo, la asociada con la infección (tal como en el choque
séptico o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS:
Systemic Inflammatory Response
Syndrome)), enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de
Crohn, o resultante de la superproducción de citocinas tales como
TNF o IL-1 (tal como el efecto demostrado por
IL-11).
La actividad de una proteína de la presente
invención puede medirse, entre otros medios, por los métodos
siguientes:
Los ensayos adecuados para la citotoxicidad de
timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los
descritos en: Curent Protocols in Immunology, Ed. by J. E. Coligan,
A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub.
Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience
(capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in
Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:
2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.
Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al.,
J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et
al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai
et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988;
Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:
2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.
Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al.,
J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et
al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bowmanet
et al., J. Virology 61: 1992-1998; Takai
et al., J. Immunol. 140: 508:512, 1988; Bertagnolli et
al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991;
Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092,
1994.
Los ensayos para respuestas de inmunoglobulina
dependientes de las células T y cambio de isotipos (que
identificarán, entre otras, las proteínas que modulan las
respuestas de los anticuerpos dependientes de las células T y que
afectan a los perfiles de Th1/Th2) incluyen, sin limitarse a ellos,
los descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:
3028-3033, 1990; y Assays for B cell function: In
vitro antibody production, Mond, J. J. y Brunswick, M. en
Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds.
Vol. 1 p. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons,
Toronto, 1994.
Los ensayos de la reacción de linfocitos mixtos
(MLR: Mixed Lymphocite Reaction) (que identificarán, entre otras,
proteínas que generan predominantemente respuestas de Th1 y CTL)
incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Current
Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H.
Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience (capítulo 3,
In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in
Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494: 3500,
1986; Takai et al., J. Immunol. 140:
508-512, 1988; Bertagnolli et al., J.
Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
Los ensayos dependientes de células dendríticas
(que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células
dendríticas que activan células T originales) incluyen, sin
limitarse a ellos, los descritos en: Guery et al., J.
Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al.,
Journal of Experimental Medicine 173: 549-559, 1991;
Macatonia et al., Journal of Immunology 154:
5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of
Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair
et al., Journal of Virology 67: 4062-4069,
1993; Huang et al., Science 264: 961-965;
Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:
1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of
Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; e Inaba
et al., Journal of Experimental Medicine 172:
631-640, 1990.
Los ensayos para supervivencia/apoptosis de
linfocitos (que identificarán, entre otras, proteínas que previenen
la apoptosis después de la inducción de superantígeno y proteínas
que regulan la homeostasis de los linfocitos), incluyen, sin
limitarse a ellos, los descritos en: Darzynkiewicz et al.,
Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et
al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et
al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh
et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk,
Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai
et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca
et al., International Journal of Oncology 1:
639-648, 1992.
Los ensayos para proteínas que influyen sobre las
etapas iniciales de diferenciación y desarrollo de células T
incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Antica et
al., Blood 84: 11-117, 1994; Fine et al.,
Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et
al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7548-7551,
1991.
Una proteína de la presente invención puede ser
útil en la regulación de la hematopoyesis y, en consecuencia, en el
tratamiento de las deficiencias de células mieloides o linfoides.
Incluso la actividad biológica marginal en apoyo de las células
formadoras de colonias o de líneas de células dependientes de
factor, indica la intervención en la regulación de la
hematopoyesis, p. ej. en el apoyo del crecimiento y la
proliferación de células progenitoras de eritroides, sola o en
combinación con otras citocinas, lo que indica una utilidad, por
ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para su uso junto
con radiación/quimioterapia para estimular la producción de células
precursoras de eritroides y/o eritroides; en el apoyo del
crecimiento y la proliferación de células mieloides tales como
granulocitos y monocitos/macrófagos (es decir, actividad de CSF
tradicional) útil, por ejemplo, junto con la quimioterapia para
prevenir o tratar la consiguiente mielo-supresión;
en el apoyo del crecimiento y proliferación de megacariocitos y en
consecuencia de plaquetas, permitiéndose así la prevención o el
tratamiento de varios trastornos plaquetarios tales como la
trombocitopenia, y generalmente para el uso en vez de transfusiones
de plaquetas, o complementario a las mismas; y/o en el apoyo del
crecimiento y proliferación de células troncales hematopoyéticas
que son capaces de madurar para dar cualquiera o todas las células
hematopoyéticas antes mencionadas, y que por tanto encuentran
utilidad terapéutica en varios trastornos de las células troncales
(tales como los tratados habitualmente con trasplante, incluyendo,
sin limitarse a ellos, anemia aplásica y hemoglobinuria nocturna
paroxística), así como en la repoblación del compartimiento de
células troncales después de una radiación/quimioterapia, bien sea
in vivo o ex vivo (es decir, junto con un trasplante
de médula ósea) como células normales o manipuladas genéticamente
para terapia génica.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, por los métodos siguientes.
Los ensayos adecuados para la proliferación y
diferenciación de varias líneas hematopoyéticas se citaron
anteriormente.
Los ensayos para la diferenciación de células
troncales embrionarias (que identificarán, entre otras, las
proteínas que influyen sobre la hematopoyesis de la diferenciación
embrionaria) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en:
Johansson et al., Cellular Biology 15:
141-151, 1995; Keller et al., Molecular and
Cellular Biology 13: 473-486, 1993; McClanahan et
al., Blood 81: 2903-2915, 1993.
Los ensayos para la superviviencia y
diferenciación de células troncales (que identificarán, entre otras,
proteínas que regulan la linfo-hematopoyesis)
incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Methylcellulose
colony forming assays, Freshney, M. G. en Culture of
Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., ed. Vol. p.
265-268, Wiley-Liss, Inc., Nueva
York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89: 5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony
forming cells with high proliferative potencial, McNiece, I. K. y
Briddell, R. A. en Culture of Hematopoietic Cells, R. I.
Freshney et al., ed. Vol. p. 23-39,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Neben et
al., Experimental Hematology 22: 353-359, 1994;
Cobblestone area forming cell assay; Ploemacher, R. E. en
Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al.,
ed. Vol. p. 1-21, Wiley-Liss, Inc.,
Nueva York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence
of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. en
Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et
al., ed. Vol. p. 163-179,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term
culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. en Culture of
Hematopoietic Cells, R. L. Freshney et al., ed. Vol. p.
139-162, Wiley-Liss, Inc., Nueva
York, NY. 1994.
Las proteínas CTLA-8 son útiles
en el tratamiento de varias deficiencias y trastornos inmunitarios
(incluyendo SCID), p. ej. en la regulación (por incremento o por
disminución) del crecimiento, la proliferación y/o la actividad de
los linfocitos T y/o B, así como la actividad citolítica de las
células NK. Estas deficiencias inmunitarias pueden estar causadas
por infecciones víricas (p. ej. VIH) así como bacterianas, y pueden
ser resultado de trastornos autoinmunitarios. Mas específicamente,
las enfermedades infecciosas causadas por una infección vírica,
bacteriana, fúngica o de otro tipo, pueden ser tratables usando
proteínas CTLA-8, incluyendo infecciones por VIH,
hepatitis, gripe, CMV, herpes, micobacterias, leishmaniasis, malaria
y varias infecciones fúngicas (tales como candida). Desde luego, en
relación con esto, las proteínas CTLA-8 pueden ser
también útiles en los casos en los que generalmente estaría
indicado un refuerzo para el sistema inmunitario, p. ej. en el
tratamiento del cáncer o como coadyuvante para vacunas. Los
trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse usando factores de
la presente invención incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple,
lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación
pulmonar autoinmunitaria, síndrome de
Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria,
diabetes mellitus dependiente de la insulina y enfermedad ocular
autoinflamatoria. Es también de esperar que las proteínas
CTLA-8 sean útiles en el tratamiento de reacciones y
enfermedades alérgicas.
También es de esperar que las proteínas
CTLA-8 tengan actividad quimiotáctica. Una proteína
o un péptido tienen "actividad quimiotáctica", como se usa en
el presente texto, si pueden estimular, directa o indirectamente,
la orientación o movimiento dirigido de las células, incluyendo las
células mieloides y linfoides. Preferentemente, la proteína o el
péptido tienen la capacidad de estimular directamente el movimiento
dirigido de las células (en particular las células T). Puede
determinarse fácilmente si una proteína o un péptido concretos
tienen actividad quimiotáctica para las células, empleando tal
proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxis de
células.
Las proteínas CTLA-8 inhiben
también el crecimiento y la proliferación de células endoteliales
vasculares. Como resultado, las proteínas CTLA-8
humanas son efectivas para inhibir la angiogénesis (es decir, la
formación vascular). Esta actividad será también útil en el
tratamiento de tumores y otras enfermedades en las que interviene la
angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis por las proteínas
CTLA-8 humanas tendrá también por resultado la
inhibición o la prevención de la enfermedad a la que contribuiría
la angiogénesis normal.
Las proteínas CTLA-8 aisladas,
purificadas a partir de células u obtenidas por vía recombinante,
pueden ser usadas como composición farmacéutica cuando se combinan
con un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal composición puede
contener, además de la proteína CTLA-8 y el
vehículo, diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes,
solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. La
expresión "aceptable farmacéuticamente" significa un material
no tóxico que no interfiere con la eficacia ni con la actividad
biológica del ingrediente o de los ingredientes activos. Las
características del vehículo dependerán de la vía de administración.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener
también citocinas, linfocinas y otros factores hematopoyéticos tales
como M-CSF, GM-CSF,
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
IL-15, G-CSF,
\gamma-IFN, factor de células troncales, y
eritropoyetina. La composición farmacéutica puede contener factores
trombolíticos o antitrombóticos tales como activador del
plasminógeno y factor VIII. La composición farmacéutica puede
contener además otros agentes anti-inflamatorios.
Tales factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la
composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la
proteína CTLA-8, o para minimizar los efectos
secundarios provocados por la proteína CTLA-8. En
cambio, la proteína CTLA-8 puede incluirse en
formulaciones de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético,
factor trombolítico o anti-trombótico, o agente
anti-inflamatorio en particular, para minimizar los
efectos secundarios de la citocina, linfocina, otro factor
hematopoyético, factor trombolítico o
anti-trombótico, o agente
anti-inflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención puede
estar en forma de un liposoma en el que la proteína
CTLA-8 está combinada, además de con otros vehículos
aceptables farmacéuticamente, con agentes anfipáticos tales como
lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas
insolubles, cristales líquidos o capas laminares que en solución
acuosa. Los lípidos adecuados para formulación liposómica incluyen,
sin limitarse a ellos, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos,
lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares.
La preparación de tales formulaciones liposómicas está en el nivel
de un experto en la técnica, como se describe, por ejemplo en la
patente de EE.UU. nº 4.235.871, la patente de EE.UU. nº 4.501.728,
la patente de EE.UU. nº 4.837.028 y la patente de EE.UU. nº
4.737.323, todas las cuales se incorporan al presente texto como
referencia.
Como se usa en el presente texto, la expresión
"cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad
total de cada componente activo de la composición farmacéutica o
método, que es suficiente para mostrar un significativo beneficio
para el paciente, p. ej. la mejora de los síntomas, la curación o
el aumento de la velocidad de curación de su enfermedad. Cuando se
aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, la
expresión se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una
combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los
ingredientes activos que tienen por resultado el efecto
terapéutico, sea administrado en combinación, en serie o al mismo
tiempo.
En la puesta en práctica del método de
tratamiento o uso de la presente invención, se administra una
cantidad terapéuticamente efectiva de proteína
CTLA-8 a un mamífero. La proteína
CTLA-8 puede ser administrada de acuerdo con el
método de la invención, bien sea solo o en combinación con otras
terapias tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u
otros factores hematopoyéticos. Cuando se administra conjuntamente
con una o más citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos
o componentes de vacunas (tales como antígenos u otros
coadyuvantes), la proteína CTLA-8 puede ser
administrada simultáneamente con las citocinas, linfocinas, otros
factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos,
o bien puede hacerse secuencialmente. Si se administra
secuencialmente, el médico responsable decidirá la secuencia
apropiada para la administración de la proteína
CTLA-8 en combinación con citocinas, linfocinas,
otros factores hematopoyéticos, o factores trombolíticos o
antitrombóticos.
La administración de la proteína
CTLA-8 usada en la composición farmacéutica o para
la puesta en práctica del método de la presente invención, puede
llevarse a cabo de alguna entre una diversidad de formas
convencionales, tal como la ingestión oral, inhalación o inyección
cutánea, subcutánea o intravenosa. Se prefiere la administración
intravenosa al paciente.
Cuando se administra oralmente una cantidad
terapéuticamente efectiva de proteína CTLA-8, la
proteína CTLA-8 estará en forma de comprimido,
cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de
comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede
contener adicionalmente un vehículo sólido tal como gelatina o un
coadyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen de
aproximadamente 5 a 95% de proteína CTLA-8, y
preferentemente de aproximadamente 25 a 90% de proteína CTLA- 8.
Cuando se administra de forma líquida, puede añadirse un vehículo
líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal
tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o
aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la
composición farmacéutica puede contener además solución salina
fisiológica, solución de dextrosa o de otro disacárido, o glicoles
tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando
se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene
de aproximadamente 0,5 a 90% en peso de proteína
CTLA-8, y preferentemente de aproximadamente 1 a
50% de proteína CTLA-8.
Cuando se administra una cantidad terapéutica
efectiva de proteína CTLA-8 mediante inyección
intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína
CTLA-8 estará en forma de solución acuosa libre de
pirógenos, aceptable parenteralmente. La preparación de tales
soluciones de proteína aceptables parenteralmente, teniendo en
cuenta en forma debida el pH, la isotonicidad, la estabilidad y
aspectos similares, está dentro de la experiencia en la técnica.
Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea debe contener, además de proteína
CTLA-8, un vehículo isotónico tal como una solución
de cloruro sódico para inyección, solución de Ringer para inyección,
solución de dextrosa para inyección, solución de dextrosa y cloruro
sódico para inyección, solución de Ringer con lactato para
inyección (solución de lactato sódico compuesta), u otros vehículos
conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la presente
invención puede contener también estabilizantes, conservantes,
tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos
en la técnica.
La cantidad de proteína CTLA-8 en
la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la
naturaleza y gravedad de la enfermedad que se esté tratando, y de
la naturaleza de los tratamientos previos a los que se haya sometido
al paciente. Finalmente, el médico decidirá la cantidad de proteína
CTLA-8 con la que ha de tratar a cada paciente en
concreto. Inicialmente, el médico administrará dosis bajas de
proteína CTLA-8 y observará la respuesta del
paciente. Pueden administrarse dosis mayores de proteína
CTLA-8 hasta que se obtiene el efecto terapéutico
óptimo para el paciente, y generalmente en ese punto ya no se sigue
aumentando la dosificación. Se contempla que las diversas
composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el método
de la presente invención deben contener de aproximadamente 0,1
\mug a aproximadamente 100 mg de proteína CTLA-8
por kg de peso corporal, preferentemente aproximadamente 0,1 \mug
a aproximadamente 10 mg de proteína CTLA-8 por kg de
peso corporal, más preferentemente aproximadamente 0,1 \mug a
aproximadamente 100 \mug de proteína CTLA-8 por
kg de peso corporal, y lo más preferentemente aproximadamente 0,1
\mug a aproximadamente 10 \mug de proteína
CTLA-8 por kg de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa usando la
composición farmacéutica de la presente invención variará
dependiendo de la gravedad de la enfermedad objeto de tratamiento, y
del estado y la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente
en concreto. Se contempla que la duración de cada aplicación de la
proteína CTLA-8 estará en el intervalo de 12 a 24
horas de administración intravenosa continuada. Finalmente el
médico decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa
usando la composición farmacéutica de la presente invención.
La proteína CTLA-8 de la presente
invención puede usarse también para inmunizar animales para obtener
anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen
específicamente con la proteína CTLA-8 y que puedan
inhibir la unión de CTLA-8 con su receptor. Tales
anticuerpos son también útiles para realizar ensayos diagnósticos
de CTLA-8 de acuerdo con métodos conocidos. Tales
anticuerpos pueden obtenerse usando la proteína
CTLA-8 entera como inmunógeno, o usando fragmentos
de proteína CTLA-8 humana. Los inmunógenos
peptídicos pueden contener adicionalmente un resto de cisteína en
el término carboxilo, y están conjugados con un hapteno tal como la
hemocianina de la lapa californiana (KLH: Keyhole Limpet
Hemocyanin). Pueden generarse otros inmunógenos peptídicos
adicionales reemplazando los restos de tirosina con restos de
tirosina sulfatada, Los métodos para sintetizar tales péptidos son
conocidos en la técnica, por ejemplo, en R. P. Merrifield, J. Amer.
Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J. L.
Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos (preferentemente anticuerpos
monoclonales) neutralizantes o no neutralizantes que se unen a la
proteína CTLA-8 humana pueden ser también agentes
terapéuticos útiles para ciertos tumores, y también en el
tratamiento de enfermedades descritas anteriormente. Estos
anticuerpos monoclonales neutralizantes son capaces de bloquear la
unión del ligando a la proteína CTLA-8 humana, o
pueden favorecer el aclaramiento de la proteína del paciente.
A causa de su homología con la
CTLA-8 humana, las proteínas CTLA-8
de rata, las proteínas CTLA-8 de herpes y las
proteínas IL-17 (la "CTLA-8
humana" de Golstein et al, supra) poseerán también
actividad de CTLA-8 como se describió anteriormente.
Como resultado de ello, las proteínas CTLA-8 de
rata y de herpes y las proteínas IL-17, así como
fragmentos activos y variantes de las mismas, pueden ser usadas en
la preparación de composiciones farmacéuticas y en métodos de
tratamiento como se han descrito para la CTLA-8
humana. Las proteínas CTLA-8 de rata y de herpes, y
fragmentos activos y variantes de las mismas, pueden prepararse como
se describió antes usando los polinucleótidos (o fragbentos o
variantes de los mismos) descritos en la SEC ID Nº: 3 y en la SEC
ID Nº: 5, respectivamente. También puede producirse
CTLA-8 de rata y de herpes como se describe en
Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150,
5445-5456. También pueden usarse proteínas
CTLA-8 de otras especies, como se describe en el
presente texto. cDNAs que codifican CTLA-8 de rata
y CTLA-8 de herpes fueron depositados en la
American Type Culture Collection el 6 de julio de 1995,
asignándoseles los números de entrada ATCC 69867 y ATCC 69866,
respectivamente. También pueden producirse proteínas
IL-17 como se describe en Goldstein et al.,
supra.
A causa de su homología con
IL-17, las proteínas CTLA-8 humanas
(B18) de la presente invención pueden también compartir algunas
actividades con IL-17.
Para los propósitos de tratamiento o terapia,
cualquiera de las proteínas que se discuten o se describen en el
presente texto puede ser administrada por expresión in vivo
de la proteína en un mamífero. En tales casos, se administra al
sujeto un polinucleótido que codifica la proteína deseada de manera
que permita la expresión de acuerdo con métodos conocidos,
incluyendo, sin limitarse a ellos, los métodos con adenovirus
descritos en el presente texto.
Un clon parcial para CTLA-8
humana fue aislado de una genoteca de cDNA hecha a partir de RNA
aislado de células mononucleares de sangre periférica humana
estimuladas. Este parcial fue identificado como "B18". B18 se
usa a veces en el presente texto para referirse a la
CTLA-8 humana de la presente invención. Las
búsquedas de homología identificaron este clon parcial como
relacionado con los genes de CTLA-8 de herpes y de
rata. La secuencia de DNA de este clon parcial se usó para aislar el
clon de longitud completa.
Para aislar un cDNA de longitud completa para
B18, se preparó una genoteca de cDNA de longitud completa
direccional por métodos estándar en el vector pMV2 de expresión de
COS. La genoteca de cDNA fue transformada en E. coli por
electroporación. El grueso de la genoteca de cDNA transformada
original se congeló en glicerol a -80ºC. Se obtuvo el título de una
parte alícuota para medir la concentración de E. coli
transformado. Los E. coli se descongelaron, se diluyeron a
76.000/0,1 ml en medio que contiene ampicilina, y se distribuyó 0,1
ml en los pocillos de una placa de microtítulo en una matriz de 8 x
8. La placa de microtítulo se puso a 37ºC durante la noche para
desarrollar el E. coli.
Para preparar el DNA para PCR, se retiraron
partes alícuotas de 20 \mul de cultivo de cada pocillo y se
agruparon por separado para cada fila y columna de ocho pocillos,
dando 16 agrupaciones de 160 \mul cada una. Los E. coli
fueron sedimentados, resuspendidos en 160 \mul de tampón para
lisis estándar consistente en Tris HCl 10 mM pH 8,1, EDTA 1 mM,
0,01% de Triton X-100, y se lisaron calentando a
95ºC durante 10 minutos.
Para identificar los pocillos que contenían E.
coli transformado con B18, se llevó a cabo la PCR primero sobre
los preparados de DNA correspondientes a las ocho columnas. La PCR
consistió en dos reacciones secuenciales con oligonucleótidos
anidados, usando condiciones estándar. Los oligonucleótidos usados
para la reacción de PCR se derivaron de la secuencia del clon de
B18 parcial. Eran:
B185: CACAGGCATACACAGGAAGATACATTCA (SEQ ID Nº:
7)
B183: TCTTGCTGGATGGGAACGGAATTCA (SEQ ID Nº:
8)
B18N: ATACATTCACAGAAGAGCTTCCTGCACA (SEQ ID Nº:
9)
Las condiciones para la PCR fueron MgCl_{2} 2,5
mM y 95ºC x 2 min para un ciclo, 95ºC x 1 min más 68ºC x 1 min para
30 ciclos, y 68ºC x 10 para un ciclo. Cada reacción era en 20
\mul. La primera reacción contenía los oligonucleótidos B185 y
B183 y 1 \mul de los preparados de DNA. La segunda reacción
contenía los oligonucleótidos B183 y B18N y 1 \mul de la primera
reacción.
Los preparados de DNA que contenían
potencialmente un clon de cDNA de B18 de longitud completa fueron
identificados mediante electroforesis en gel de agarosa en una
parte alícuota de la segunda reacción PCR. Se supuso que una banda
de DNA de movilidad correcta se derivaba de un cDNA de B18. A
continuación se hizo la misma secuencia de reacciones PCR y
análisis en gel en los preparados de DNA correspondientes a las
ocho filas. La intersección de una fila y una columna identificó el
pocillo A2 como contenedor potencial de B18 reduciéndole a los
76.000 E. coli originalmente sembrados en ese pocillo.
Para purificar más el E. coli individual
que contiene el clon de cDNA de B18 de longitud completa putativo,
se midió la concentración de E. coli en el pocillo A2
obteniendo el título y cultivando en placa diluciones del pocillo.
Después se sembraron 7600 E. coli en los pocillos de una
segunda placa de microtítulo en una matriz de 8 x 8. Los E.
coli se desarrollaron durante la noche; los pocillos fueron
agrupados y el DNA se preparó como se describió anteriormente. Para
identificar cuál de estos pocillos contenía E. coli
transformado con B18, se llevaron a cabo reacciones secuenciales de
PCR, esencialmente como se describió antes. La electroforesis en gel
de agarosa identificó el pocillo B2 como potencial contenedor de un
cDNA de B18.
El E. coli que contiene este cDNA se
purificó más sembrando pocillos de una placa de microtítulo con 253
E. coli por pocillo y procediendo como para la purificación
del E. coli en el pocillo A2. El pocillo C3 fue identificado
como contenedor de un clon de cDNA de B18 de longitud completa
putativo. El E. coli exacto se identificó poniendo en placa
el contenido del pocillo sobre medio de cultivo bacteriano y
cribando después las colonias de E. coli siguiendo
protocolos establecidos. La sonda para estas hibridaciones fue un
fragmento de PCR generado haciendo una reacción PCR en el clon de
B18 usando como cebadores los oligonucleótidos descritos
anteriormente (SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9). Cuando se
identificó una colonia individual, se preparó el DNA y se secuenció
por métodos estándar. La comparación de esta secuencia con la
secuencia del clon parcial original confirmó la identidad y que el
cDNA aislado era de longitud completa.
El clon de longitud completa fue depositado en la
American Type Culture Collection el 6 de julio de 1995 y se le
asignó el número de entrada ATCC 69868.
El clon de B18 de longitud completa para la
CTLA-8 humana fue transfectado en células COS, que
después se marcaron con ^{35}S-metionina. Una
parte alícuota de medio acondicionado procedente del cultivo de
células transfectadas se redujo, se desnaturalizó y se sometió a
electroforesis en geles de poliacrilamida. Las autorradiografías de
esos geles se reproducen en la Fig. 2. La banda indicada por la
flecha demuestra la expresión de CTLA-8 humana.
La capacidad de la CTLA-8 humana
para inhibir la angiogénesis fue examinada en un ensayo de actividad
angiostática (ensayo de proliferación de células endoteliales). El
ensayo se hizo en una placa de 96 pocillos. Células umbilicales
humanas primarias (HUVECs) fueron sembradas a razón de 2 x 10^{3}
células por pocillo en medio EGM (Clonetics)/20% FCS e incubadas a
37ºC durante 24 horas. Las células fueron después sometidas a
privación en medio M199 (GIBCO BRL) que contiene suero tratado con
10% de carbón (M199-CS) durante 48 h a 37ºC. Se
obtuvo medio acondicionado que contiene B18 (CTLA-8
humana) a partir de células COS transfectadas o células de CHO que
se expresan establemente, y se prepararon diluciones 1:10, 1:50,
1:250 y 1:1250 en medio M199-CS que contiene 100
ng/ml de FGF. Las diluciones de B18 se añadieron a las células
sometidas a privación y se incubaron durante 72 h a 37ºC. La células
se radiomarcaron después mediante [^{3}H]-timidina
durante 6 h. Las células radiomarcadas se lavaron con PBS y se
tripsinizaron para conteo de centelleo de líquidos. Los resultados
se representaron usando el programa Kaleidograph. Los resultados se
muestran en la Fig. 3. En la figura, "Med" es el control
simulado, "B18" y "B18-1" eran medio
acondicionado de dos transfecciones independientes de COS con DNA
que codifica CTLA-8 humana (B18). Se usó
IFN-\gamma como control positivo de actividad
angiostática (es decir, inhibición de la angiogénesis). Estos datos
demuestran que la CTLA-8 humana (B18) inhibe la
angiogénesis.
La actividad hematopoyética de la
CTLA-8 humana (B18) expresada in vivo fue
examinada mediante la construcción de un vector de adenovirus
recombinante.
El cDNA de B18 en el plásmido de expresión Adori
2-12 B18 fue impulsado por el promotor temprano
inmediato y potenciador de citomegalovirus (CMV).
El vector Adori 2-12 fue creado
mediante la adición de un origen y potenciador de SV40 a un vector
de adenovirus conocido (Barr et al., Gene Therapy 1:51
(1994); Davidson et al., Nature Genetics 3:219 (1993)). El
fragmento HindIII/BamHI que codifica el origen y potenciador de
SV40 fue aislado del vector de expresión de mamífero pMT2, se
hicieron los extremos romos con Klenow y fue clonado en el sitio
NatI (hecho romo con Klenow) del vector de expresión Ad5.
El vector fue derivado digiriendo de cDNA de
pNOT-B18 con SalI, rellenando el saliente 5'
con Klenow para generar un extremo romo y digiriendo con
EcoRI para aislar el cDNA de B18. El fragmento de B18 de
EcoRI hecho romo fue insertado en los sitos de restricción
EcoRV-EcoRI del vector de adenovirus Adori
2-12. La casete de expresión de
CMV-B18 fue localizada secuencia abajo del origen y
potenciador de SV40, y 0-1 unidades de mapa del
extremo de la izquierda del adenovirus tipo 5(Ad5). El
donador y aceptor de ayuste de SV40 fueron localizados entre el
promotor de CMV y el cDNA de B18. Después del inserto estaba el
sitio de poli A de SV40, 9-16 unidades de mapa de
Ad5 y el origen de puc 19.
Se generó un adenovirus recombinante por
recombinación homóloga en células 293. Adori 2-12
B18 linealizado con AscI y AdCMVlacZ digerido con ClaI
fueron introducidos en células 293 usando lipofectamina. El virus
de adenovirus recombinante fue aislado y amplificado en células
293. El virus se liberó de las células 293 infectadas mediante tres
ciclos de congelación y descongelación. El virus se siguió
purificando mediante dos gradientes de centrifugación con cloruro
de cesio y se dializó frente a PBS a 4ºC. Después de la diálisis
del virus, se añadió glicerol a una concentración de 10% y el virus
se almacenó a -70ºC hasta su uso. El virus fue caracterizado
mediante la expresión del transgén, unidades formadoras de placas
en células 293, partículas/ml y análisis Southern del virus.
Una dosis individual de 5 x 10^{10} partículas
de adenovirus recombinante que codifica B18 fue inyectada en la
vena de la cola de ratones C57/b16 macho, de 7 a 8 semanas de edad.
Los ratones testigo recibieron un adenovirus que codifica
B-galactosidasa. Cuatro ratones de cada grupo
experimental fueron sacrificados el día 7 y el día 14. Se recogió
la sangre y se llevó a cabo un análisis hematológico automático
usando un instrumento Baker 9000. Se realizaron recuentos
diferenciales en frotis sanguíneos. El tejido fue recogido, fijado
en formalina y teñido con hematoxilina y eosina para histopatología.
En el primer conjunto de experimentos, el suero y los tejidos se
analizaron a los 7 y a los 14 días después de la inyección. Se
observó un ligero aumento en el recuento de las plaquetas
periféricas. Los animales que recibieron B18 mostraron un ligero
aumento en el tamaño del bazo. El análisis macroscópico del bazo
indicó un aumento de la hematopoyesis extramedular esplénica el día
7, en comparación con el testigo. Estos resultados indicaron una
actividad de crecimiento hematopoyético asociada con B18.
En un segundo conjunto de experimentos, 5 x
10^{10} partículas de adenovirus recombinante que codifica B18
fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones C57/b16 machos,
de 17 a 18 años de edad. Los ratones testigo recibieron un
adenovirus que codifica B-galactosidasa. Se tomaron
muestras de sangre a través del seno retro-orbital
los días 2, 5, 7, 10, 14 y 21. Los análisis hematológicos se
realizaron en el contador de células automático Baker 9000 con
ajustes murinos específicos. Los análisis incluían WBC (leucocitos),
RBC (glóbulos rojos), HCT (hematocrito) y PLT Plaquetas). Se
prepararon frotis o extensiones de sangre y se tiñeron con
Wright-Geimsa para diferenciales de WBC basados en
un recuento de 100 células. Los reticulocitos y las plaquetas
reticuladas se cuantificaron usando citometría de flujo. Cuatro
ratones de cada grupo fueron sacrificados los días 7, 14 y 21.
Además del análisis de sangre periférica, se recogió el suero por
punción cardíaca para cuantificación de II-6
sistémico usando un kit comercial (Endogen). El bazo y el
hígado se recogieron para histopatología, se cuantificaron los
progenitores hematopoyéticos de bazo y médula ósea y se prepararon
frotis de médula ósea y se tiñeron con
Wright-Geimsa para recuentos de células.
La administración de adenovirus que codifica B18
tuvo por resultado un acusado aumento de neutrófilos y WBC de la
sangre periférica (Fig. 4). Los máximos aumentos en los neutrófilos
se observaron el día 5 y el día 7. Los ratones testigo mostraron
pequeñas diferencias los días 5 y 7. Los neutrófilos de la sangre
periférica eran similares en los ratones testigo y en los ratones
que recibieron B18 el día 21. En ambos grupos de B18 y testigo se
observó también un aumento de los leucocitos. Los ratones que
recibieron B18 tenían un mayor aumento de WBC entre el día 2 y el
día 7. El día 21 se observó un aumento más pronunciado en el grupo
de B-gal. No se observaron otros cambios en los
datos de la química celular (Tabla I).
La celularidad de la médula ósea fue calculada a
partir de los fémures reunidos de cada grupo (Tabla III). No se
observaron diferencias significativas en ninguno de los grupos. No
se observaron cambios significativos en los progenitores
hematopoyéticos de la médula ósea de los días 7, 14 y 21. Los
CFU-GM, BFU-E y
CFU-MEG en los ratones B18 fueron similares a los
del testigo B-gal (Tabla II).
La administración del adenovirus que codifica B18
tuvo por resultado un aumento en los progenitores de
CFU-GM (mieloide) y BFU-E
(eritroide) en el bazo en comparación con los animales que
recibieron el virus B-gal el día 7. El aumento de
progenitores en los ratones B18 fue 11 veces en los
CFU-GM y 52 veces en los BFU-E
(Tabla II). Hubo un aumento de 2 veces en CFU-MEG
el día 7 para los ratones B18. El día 21 no se observaron
diferencias significativas en CFU-MEG esplénico o
BFU-E entre los grupos (Tabla II). Se observó un
aumento de 3 veces en CFU-GM en los ratones que
recibieron adenovirus que codifica B18. Se observó un ligero
aumento en el tamaño del bazo el día 7 en el grupo de B18. Esto es
consistente con un aumento de la celularidad esplénica. Para el día
14 y el día 21 los pesos del bazo fueron similares a los del grupo
testigo (Tabla III). El análisis macroscópico del bazo indicó un
aumento en la hematopoyesis extramedular esplénica de los ratones
B18 el día 7 en comparación con el testigo.
Las relaciones mieloide:eritroide de la médula
ósea (Tabla IV) sugieren una hiperplasia granulocítica con una
posible hipoplasia eritroide en ratones que recibieron adenovirus
B18 el día 7. El día 21 la relación en el grupo de
B-gal era más alta. No se observaron cambios en los
niveles en suero de IL6.
Estos resultados indican una actividad
hematopoyética asociada con la administración de un adenovirus que
codifica B18 (CTLA-8 humana). Se observaron aumentos
en los neutrófilos y leucocitos en el día 7 en animales que
recibieron adenovirus B18. Los datos indicaron que B18 tuvo por
resultado un aumento en CFU-GM y
BFU-E esplénicos 7 días después de la administración
en comparación con los animales testigo. La hematopoyesis
extramedular esplénica en el día 7 apoya que B18 muestra una
actividad de crecimiento hematopoyético. Estos datos sugieren que
B18 puede movilizar precursores hematopoyéticos tempranos.
Los precursores hematopoyéticos se determinaron a
partir de muestras de bazo y médula ósea agrupadas, procedentes de
cuatro animales de cada grupo. Para la cuantificación de
CFU-GM y BFU-E, se añadieron 1 x
10^{4} células de médula ósea o bien 1 X 10^{5} células
esplénicas a medio completo alfa metilcelulosa (0,9% de metil
celulosa en medio alfa, 30% de suero bovino fetal, 1% de albúmina
de suero bovino, 2-mercapto-etanol
10^{-4}M, L-glutamina 2 mM, 2% de medio
acondicionado para células esplénicas murinas, y 3 U/mL de
eritropoyetina) y se dividió en partes alícuotas en placas para
cultivo de tejidos de 35 mm, en un volumen final de 1,0 mL. Los
cultivos se incubaron durante 7 días a 37ºC y 5% de CO_{2}. Se
definieron colonias microscópicas como racimos de 50 o más células.
Para la cuantificación de CFU-MEG, se añadieron 1 x
10^{5} células de médula ósea o bien 1 X 10^{6} células
esplénicas a medio completo alfa metilcelulosa como se describió
anteriormente, y se incubó como se describió anteriormente. Se
definieron colonias de megacariocitos como un grupo de 3 o más
células.
^{*} Los progenitores de la médula ósea se
representan como la media \pm la desviación estándar del número
de colonias por 10^{5} células.
^{**} Los progenitores esplénicos se
representan como la media \pm la desviación estándar del número
de colonias por 10^{6} células.
Los pesos del bazo se determinaron en el momento
del sacrificio; se representan como las medias \pm la desviación
estándar (sd) para cuatro animales.
Todas las entradas representan el número de
células mieloides por 1 célula eritroide. Las relaciones para
ratones normales son aproximadamente de 1:1 a 2:1.
Se ensayó B18 (CTLA-8 humana) en
cuanto a la capacidad para inducir la producción de factores que
tienen actividad hematopoyética en un ensayo de proliferación de
células dependiente de factor, usando la línea de células
eritroleucémicas humanas, TF-1 (Kitamura et
al., J. Cell Physiol. 140: 323 (1989)). Las células fueron
desarrolladas inicialmente en presencia de rhGMCSF (100 U/ml). Las
células se alimentaron tres días antes de establecerse el ensayo.
Las condiciones de ensayo fueron las siguientes:
células/pocillo | 5000/200 \mul |
tiempo de incubación | 3 días |
tiempo de pulsación | 4 horas |
cantidad de timidina tritiada | 0,5 \muCi/pocillo |
tiempo de conteo | 1 minuto |
replicados | 2 |
Se ensayó B18 solo, medio acondicionado (CM) de
células HS-5 inducidas con B18. Se ensayó tampón
solo, CM de células HS-5 inducidas con tampón y CM
de células HS-5 no inducidas como testigos. Los
resultados se muestran en la Fig. 5. La B18 (CTLA-8
humana) demostró capacidad para inducir la producción de factores
que inducían la proliferación de TF-1. Esta
actividad se eliminaba sustancialmente mediante la adición de
anticuerpos anti-GMCSF. Estos datos demuestran que
la CTLA-8 humana (B18) puede inducir hematopoyesis.
En particular, y sin que ello suponga vincularse a ninguna teoría,
parece que la CTLA-8 humana (B18) induce la
producción de GM-CSF y/o IL-3.
Se incubaron células MRC5 en presencia de
CTLA-8 humana (B18) y se midió la producción de
IL-6 e IL-8. Se usó
CTLA-8 de herpes (BL-17) como
control positivo. La CTLA-8 humana (B18) de los
solicitantes demostró una producción valorable tanto de
IL-6 como de IL-8 (véanse las fig. 6
y 7).
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Jacobs, Kenneth
\hskip3.95cmKelleher, Kerry
\hskip3.95cmCarlin, McKeough
\hskip3.95cmGoldman, Samuel
\hskip3.95cmPittman, Debra
\hskip3.95cmMi, Sha
\hskip3.95cmNeben, Steven
\hskip3.95cmGiannotti, JoAnn
\hskip3.95cmGolden'Fleet, Margaret
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: CTLA-8 humana y usos de proteínas relacionadas con CTLA-8.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genetics Institute, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 87 Cambridge Park Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachussets
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Relase nº 1.0, ver. 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brown, Scott A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 32.724
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: GI5262
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: (617) 498-8224
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (617) 876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 813 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 56..544
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 163 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 461 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6..455
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 459 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1..453
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAGGCATA CACAGGAAGA TACATTCA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTTCGTGGA TGGGAACGGA ATTCA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATACATTCAC AGAAGAGCTT CCTGCACA
\hfill28
Claims (17)
1. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en:
(a) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº:
1 desde el nucleótido 146 al nucleótido 544;
(b) una secuencia de nucleótidos que varía a
partir de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) como
resultado de la degeneración del código genético,
en la que dicha secuencia codifica la proteína
CTLA-8 humana que tiene la secuencia de aminoácidos
de SEC ID Nº 2.
2. El polinucleótido según la reivindicación 1ª,
en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que
tiene actividad de CTLA-8, que está especificada
por la inducción de la expresión o secreción de
\gamma-IFN, IL-3,
IL-6, IL-8, o
GM-CSF, o por su actividad quimioatrayente o
quimiotáctica, y en el que dicha secuencia de nucleótidos está unida
operativamente a una secuencia de control de la expresión,
preferentemente contenida en un vector adecuado para la expresión
in vivo en un mamífero.
3. El polinucleótido según las reivindicaciones
1ª o 2ª, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1
desde el nucleótido 55 al nucleótido 544, preferentemente que
comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el
nucleótido 86 al nucleótido 544, más preferentemente que comprende
la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 139
al nucleótido 544.
4. Una célula hospedadora transformada con el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª.
5. La célula hospedadora según la reivindicación
4ª, en la que dicha célula es una célula de mamífero.
6. Una proteína CTLA-8 humana que
comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo
consistente en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:
2;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2
desde el aminoácido 11 al 163;
(c) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2
desde el aminoácido 29 al 163;
(d) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2
desde el aminoácido 31 al 163;
(e) fragmentos de (a), (b), (c) o (d) que tienen
actividad de CTLA-8, que está especificada por la
inducción de la expresión o la secreción de
\gamma-IFN, IL-3,
IL-6, IL-8 o GM-CSF,
o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
7. La proteína según la reivindicación 6ª que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que comprende
preferentemente la secuencia desde el aminoácido 11 al 163 de la SEC
ID Nº: 2, que comprende más preferentemente la secuencia desde el
aminoácido 29 al 163 de la SEC ID Nº: 2, que comprende lo más
preferentemente la secuencia desde el aminoácido 31 al 163 de la SEC
ID Nº: 2.
8. Una composición farmacéutica que comprende una
proteína CTLA-8 humana según las reivindicaciones 6ª
o 7ª y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
9. Una composición que comprende un anticuerpo
que reacciona específicamente con una proteína
CTLA-8 humana según las reivindicaciones 6ª o
7ª.
10. La composición según la reivindicación 9ª, en
la que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo
monoclonal, y/o un anticuerpo neutralizante.
11. El uso de una cantidad terapéuticamente
efectiva de una composición según la reivindicación 8ª, para la
preparación de un medicamento para la inhibición de la
angiogénesis, la inhibición del crecimiento o de la proliferación de
las células endoteliales vasculares, la inhibición del crecimiento
de tumores, la inhibición del desarrollo de tejidos dependiente de
la angiogénesis, la proliferación de células o progenitores
mieloides, la proliferación de células o progenitores eritroides,
la proliferación de células o progenitores linfoides, la inducción
de la producción de IFN\gamma, la inducción de la producción de
IL-3 o la inducción de la producción de
GM-CSF.
12. Un polinucleótido aislado que comprende una
variante humana alélica de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº:
1 desde el nucleótido 146 hasta el nucleótido 544, en la que dicha
secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene actividad
de CTLA-8, que está especificada por la inducción de
la expresión o secreción de \gamma-TFN,
IL-3, IL-6, IL-8 o
GM-CSF o por su actividad quimioatrayente o
quimiotáctica.
13. El polinucleótido según la reivindicación
12ª, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína
que tiene actividad de CTLA-8, que está
especificada por la inducción de la expresión o secreción de
\gamma-TFN, IL-3,
IL-6, IL-8 o GM-CSF
o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica y en el que dicha
secuencia de nucleótidos está unida operativamente a una secuencia
de control de la expresión, preferentemente contenida en un vector
adecuado para la expresión in vivo en un mamífero.
14. El polinucleótido según las reivindicaciones
12ª o 13ª, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº:
1, desde el nucleótido 55 hasta el nucleótido 544, que comprende
preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, desde
el nucleótido 86 hasta el nucleótido 544, que comprende más
preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, desde
el nucleótido 139 hasta el nucleótido 544.
15. Una célula hospedadora no humana transformada
con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 12ª a
14ª.
16. La célula hospedadora según la reivindicación
15ª, en la que dicha célula es una célula de mamífero.
17. Un procedimiento para producir una proteína
CTLA-8 humana, comprendiendo dicho
procedimiento:
(a) desarrollar un cultivo de la célula
hospedadora según las reivindicaciones 4ª, 5ª, 15ª o 16ª en un medio
de cultivo adecuado, y
(b) purificar la proteína CTLA-8
humana del cultivo.
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