ES2242966T3 - Ctla-8humana y usos de proteinas relacionadas con ctla-8. - Google Patents

Ctla-8humana y usos de proteinas relacionadas con ctla-8.

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ES2242966T3
ES2242966T3 ES96927237T ES96927237T ES2242966T3 ES 2242966 T3 ES2242966 T3 ES 2242966T3 ES 96927237 T ES96927237 T ES 96927237T ES 96927237 T ES96927237 T ES 96927237T ES 2242966 T3 ES2242966 T3 ES 2242966T3
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Debra Pittman
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Abstract

SE PRESENTAN POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN EL CTLA-8 HUMANO Y LAS PROTEINAS RELACIONADAS. SE PRESENTAN TAMBIEN LAS PROTEINAS HUMANAS CTLA-8 Y LOS METODOS PARA SU PRODUCCION. SE PRESENTAN TAMBIEN LOS METODOS DE TRATAMIENTO BASADOS EN LAS PROTEINAS HUMANAS CTLA-8 Y LAS PROTEINAS CTLA-8 DEL RATON Y LAS PROTEINAS CTLA-8 DEL VIRUS DEL HERPES.

Description

CTLA-8 humana y usos de proteínas relacionadas con CTLA-8.
Esta solicitud es continuación en parte de la solicitud US 08/504.032 (no expedida) y continuación en parte del documento US 5.707.829.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas CTLA-8 humanas, a ácidos nucleicos que codifican tales proteínas, y a su uso para preparar composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades, como se menciona en la reivindicación 11ª.
Fundamento de la invención
Las citocinas son proteínas segregadas que actúan sobre células hematopoyéticas diana específicas provocando un evento de diferenciación, o sobre otras células diana induciendo una respuesta fisiológica concreta, tal como la secreción de proteínas características de la inflamación. Las citocinas, también conocidas indistintamente como linfocinas, hematopoyetinas, interleucinas, factores estimuladores de colonias, y de formas similares, pueden ser agentes terapéuticos importantes, especialmente para enfermedades o situaciones en las que se reduce una población específica de células. Por ejemplo, la eritropoyetina, G-CSF y GM-CSF se han hecho todas ellas importantes para el tratamiento de la anemia y la leucopenia, respectivamente. Otras citocinas, tales como interleucina-3, interleucina-6, interleucina-11 e interleucina-12, se muestran prometedoras en el tratamiento de enfermedades como la trombocitopenia y en la modulación de la respuesta inmunitaria.
Por estas razones, se ha dedicado un considerable esfuerzo investigador a la búsqueda de nuevas citocinas y a la clonación de los DNAs que las codifican. En el pasado, se identificaron nuevas citocinas ensayando una célula particular tal como una célula de la médula ósea, en cuanto a una respuesta medible, tal como la proliferación. La busca de nuevas citocinas se ha visto así limitada por los ensayos disponibles, y, si una nueva citocina tiene una actividad que no es posible medir mediante un ensayo conocido, la citocina sigue siendo indetectable. En un planteamiento más reciente, se han detectado cDNAs que codifican citocinas, usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cebadores de oligonucleótidos que tienen homología con motivos compartidos de citocinas conocidas o sus receptores. El planteamiento de la PCR está también limitado por la necesidad del conocimiento de citocinas previamente clonadas en la misma familia de proteínas. También se han clonado citocinas usando hibridación sustractiva para construir y cribar genotecas de cDNA, o potencialmente pueden clonarse usando PCR seguida por electroforesis en gel para detectar genes expresados diferencialmente. Los métodos de hibridación sustractiva se basan en la suposición de que los mRNAs de la citocina son aquellos que se expresan diferencialmente, y estos métodos no requieren ningún conocimiento previo de la secuencia de interés. Sin embargo, muchas citocinas pueden ser codificadas por mRNAs que no se expresan diferencialmente, y así son detectables usando estos méto-
dos.
Sería deseable desarrollar nuevos métodos para identificar nuevas citocinas y otros factores segregados, y para aislar los polinucleótidos que los codifican.
Sumario de la invención
Al desarrollar la presente invención se emplearon métodos que identifican selectivamente polinucleótidos que codifican proteínas segregadas. Se aisló uno de tales nucleótidos que codifica "CTLA-8 humana". De acuerdo con la presente invención, se describen polinucleótidos que codifican CTLA-8 humana y fragmentos activos de la misma. A lo largo de la presente memoria descriptiva, se usa "CTLA-8" para referirse tanto a las proteínas como a los polinucleótidos que codifican a esas proteínas, y para referirse a proteínas y polinucleótidos de todas las especies de mamíferos.
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en:
(a)
la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 146 al nucleótido 544;
(b)
una secuencia de nucleótidos que varía a partir de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) como resultado de la degeneración del código genético, en la que dicha secuencia codifica la proteína CTLA-8 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2.
La invención proporciona también un polinucleótido aislado que comprende una variante alélica de la secuencia de nucleótidos que comprende la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 146 hasta el nucleótido 544, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína CTLA-8 que tiene actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o de la secreción de gamma-IFN, IL-3, IL-8 o GM-CSF o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
Preferentemente, el polinucleótido de la invención codifica una proteína que tiene actividad de CTLA-8. En otras realizaciones, el polinucleótido está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. En otras realizaciones preferidas, el polinucleótido está contenido en un vector adecuado para la expresión in vivo en un mamífero. Los polinucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 55 al nucleótido 544, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No: 1 desde el nucleótido 139 hasta el nucleótido 544, o la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 86 hasta el nucleótido 544, son particularmente preferidos.
También se proporcionan células hospedadoras transformadas con los polinucleótidos de la invención, incluyendo células de mamíferos.
También se proporcionan procedimientos para producir una proteína CTLA-8 humana, comprendiendo dicho procedimiento:
(a)
desarrollar un cultivo de la células hospedadora de la invención en un medio de cultivo adecuado; y
(b)
purificar la proteína CTLA-8 humana a partir del cultivo.
También se proporciona la proteína CTLA-8 humana aislada, que comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo consistente en:
(a)
la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2;
(b)
la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 11 al 163;
(c)
la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 29 al 163;
(d)
la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº:2 desde el aminoácido 31 al 163; y
(e)
fragmentos de (a), (b), (c) o (d) que tienen actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o de la secreción de \gamma-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 o GM-CSF, o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
Las proteínas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que comprenden la secuencia desde el aminoácido 29 al 163, desde al aminoácido 31 al 163 o desde el aminoácido 11 al 163 de las SEC ID Nº: 2, son particularmente preferidas. Preferentemente, la proteína tiene actividad de CTLA-8. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína CTLA-8 humana de la invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
También se describen composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína CTLA-8 humana de la invención.
La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende una proteína CTLA-8 humana según la invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
La CTLA-8 de rata y fragmentos activos (es decir, que tienen actividad de CTLA-8) de la misma, pueden también usarse en tales métodos de tratamiento. Preferentemente la proteína de rata se administra como una composición que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente y una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo que consiste en:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4;
(b)
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4 desde el aminoácido 18 al 150; y
(c)
fragmentos de (a) o (b) que tienen actividad de CTLA-8.
El herpesvirus Saimiri ORF-13, denominado en el presente texto "CTLA-8 de herpes", y fragmentos activos (es decir, que tienen actividad de CTLA-8) del mismo, pueden también usarse en tales métodos de tratamiento. Preferentemente, la proteína CTLA-8 de herpes es administrada como una composición que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente y una proteína que comprende un secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo consistente en:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6;
(b)
la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6 desde el aminoácido 19 al 151; y
(c)
fragmentos de (a) o (b) que tienen actividad de CTLA-8.
La invención proporciona también un método para tratar un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un vehículo aceptable farmacéuticamente e IL-17 o un fragmento activo de la misma. La invención proporciona también el uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición según la invención, que comprende una proteína CTLA-8 humana, para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis, la inhibición del crecimiento o de la proliferación de las células endoteliales vasculares, la inhibición del crecimiento de tumores, la inhibición del desarrollo de tejidos dependiente de la angiogénesis, la proliferación de células mieloides o progenitoras, proliferación de células eritroides o progenitoras, proliferación de células linfoides o progenitoras, la inducción de la producción de IFN\gamma, la inducción de la producción de IL-3 y la inducción de la producción del GM-CSF.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es una comparación de regiones homólogas de las secuencias de aminoácidos de la CTLA-8 humana (indicada como "B 18_F1"), CTLA-8 de rata (indicada como "Musctla8") y CTLA-8 de herpes (indicada como "Hsvie_2").
La Fig. 2 representa autorradiografías que demuestran la expresión de CTLA-8 humana en células de COS.
La Fig. 3 presenta datos relacionados con la capacidad de la CTLA-8 humana para inhibir la angiogénesis.
Las Fig. 4 y 5 presentan datos relacionados con la capacidad de la CTLA-8 humana para producir o inducir la actividad hematopoyética.
Las Fig. 6 y 7 presentan datos que demuestran la capacidad de la CTLA-8 humana para inducir la producción de IL-6 e IL-8.
Descripción detallada y realizaciones preferidas
Los inventores de la presente solicitud han identificado y proporcionado un polinucleótido que codifica una proteína CTLA-8 humana. La SEC ID Nº: 1 proporciona la secuencia de nucleótidos de un cDNA que codifica la proteína CTLA-8 humana. La SEC ID Nº: 2 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína CTLA-8 humana. Alternativamente, la metionina de iniciación puede estar en el aminoácido 11 de la SEC ID Nº: 2. Sobre la base de la secuenciación amino terminal, se cree que la secuencia de la proteína madura comienza en el aminoácido 31 de la SEC ID Nº: 2 (codificada por la secuencia que comienza con el nucleótido 146 de la SEC ID Nº: 1).
La región desde el aminoácido 29 hasta el aminoácido 163 de la CTLA-8 humana (SEC ID Nº: 2) muestra una acusada homología con porciones de la CTLA-8 de rata (aminoácidos 18 a 150 de la SEC ID Nº: 4) y de herpes virus Saimiri ORF 13 ("CTLA-8 de herpes") (aminoácidos 19 a 151 de la SEC ID Nº: 5). Una secuencia de cDNA que codifica la CTLA-8 de rata está listada en la SEC ID Nº: 3 y su correspondiente secuencia de aminoácidos se expone en la SEC ID Nº: 4. Una secuencia de cDNA que codifica la CTLA-8 de herpes está listada en la SEC ID Nº: 5 y su correspondiente secuencia de aminoácidos se expone en la SEC ID Nº: 6. La homología entre la CTLA-8 de rata y la CTLA-8 de herpes fue publicada por Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150, 5445-5456.
Los solicitantes habían identificado previamente de forma incorrecta las secuencias de rata de la SEC ID Nº: 3 y la SEC ID Nº: 4 como válidas para la CTLA-8 murina. La CTLA-8 humana de los solicitantes (B 18) también muestra homología con la secuencia de la CTLA-8 murina verdadera.
Golstein et al. (documento WO 95/18826; Fossiez et al., Microbial Evasion and Subversion of Immunity 544:3222 (Resumen)) han publicado también una especie que ellos identificaron inicialmente como "CTLA-8 humana". Sin embargo, el examen de la secuencia de la especie de Golstein et al. y de la secuencia de CTLA-8 humana (B18) de la presente invención revela fácilmente que son dos proteínas diferentes, aunque son homólogas entre sí y con la CTLA-8 de rata y la CTLA-8 de herpes identificadas aquí. La especie de Golstein et al. ha sido ahora rebautizada como interleucina-17 (IL-17). A causa de la homología entre la CTLA-8 humana (B18) de los solicitantes y la IL-17, es de esperar que estas proteínas compartan algunas actividades.
También se ha determinado de forma preliminar que la CTLA-8 humana (B18) forma homodímeros cuando se expresa. Como resultado de ellos, las proteínas CTLA-8 humanas pueden poseer actividad bien sea en la forma monómera o bien en la dímera. Las proteínas CTLA-8 humanas pueden también producirse como heterodímeros con proteínas CTLA-8 de rata y de herpes y con IL-17 humana. También es de esperar que estos heterodímeros tengan las actividades de las proteínas de las que están formados.
Las formas de proteína CTLA-8 humana de longitud inferior a la completa están comprendidas dentro de la presente invención y pueden producirse expresando el correspondiente fragmento del polinucleótido que codifica la proteína CTLA-8 humana (SEC ID Nº: 1). Estos fragmentos de polinucleótido correspondientes son también parte de la presente invención. Polinucleótidos modificados como se describen antes pueden prepararse mediante técnicas estándar de biología molecular, incluyendo métodos de mutagénesis dirigida al sitio que son conocidos en la técnica, o mediante una reacción en cadena de polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.
Para los propósitos de la presente invención, una proteína tiene "actividad de CTLA-8": (1) si muestra actividad biológica en un ensayo de proliferación celular dependiente de factor (preferentemente un ensayo en el que es activa la correspondiente especie de CTLA-8 de longitud completa) (incluyendo, pero sin limitarse a ellos, los ensayos descritos más adelante), o bien (2) si induce la expresión o la secreción de \gamma-IFN, o bien (3) si muestra actividad quimiotáctica en un ensayo de quimiotaxis (preferentemente en un ensayo en el que es activa la correspondiente especie de CTLA-8 de longitud completa) o (4) si induce la expresión o la secreción de IL-3 o GM-
CSF.
La proteína CTLA-8 humana, o fragmentos de la misma que tienen actividad de CTLA-8, pueden fusionarse con moléculas portadoras tales como inmunoglobulinas. Por ejemplo, la proteína CTLA-8 humana puede fusionarse por medio de secuencias "espaciadoras" con la porción Fc de una inmunoglobulina.
La invención comprende también variaciones alélicas de la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEC ID Nº: 1, esto es, formas alternativas de origen natural del polinucleótido aislado de la SEC ID Nº: 1 que también codifica CTLA-8 humana o proteínas CTLA-8 que tienen actividad de CTLA-8. También se incluyen en la invención polinucleótidos aislados que se hibridan con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEC ID Nº: 1 bajo condiciones muy estrictas (0,2 x SSC a 65ºC), estrictas (4 x SSC a 65ºC o formamida al 50% y 4 x SSC a 42ºC), o relajadas (4 x SSC a 50ºC o formamida al 30-40% y 4 x SSC a 42ºC). Los polinucleótidos aislados que codifican la proteína CTLA-8 humana pero que difieren de la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 1 en virtud de la degeneración del código genético, están también comprendidas por la presente invención. También están incluidas en la presente invención variaciones de la secuencia de nucleótidos que se expone en la SEQ ID Nº: 1 que son producidas por mutaciones puntuales o por modificaciones inducidas que potencian la actividad de CTLA-8, la vida mitad o el nivel de producción.
Los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden estar unidos operativamente a una secuencia de control de la expresión tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991), con el fin de producir la proteína CTLA-8 de forma recombinante. Se conocen en la técnica muchas secuencias de control de la expresión adecuadas. También se conocen métodos generales para expresar proteínas recombinantes, y se ejemplifican en Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990). Como se define en el presente texto, "unido operativamente" significa ligado enzimáticamente o químicamente para formar un enlace covalente entre el polinucleótido aislado de la invención y la secuencia de control de la expresión, de tal manera que la proteína CTLA-8 sea expresada por una célula hospedadora que ha sido transformada (transfectada) con el polinucleótido ligado/secuencia de control de la expresión.
Varios tipos de células pueden actuar como células hospedadoras adecuadas para la expresión de la proteína CTLA-8 humana. Puede usarse cualquier tipo de célula capaz de expresar la proteína CTLA-8 humana funcional. Las células de mamífero hospedadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de hamster chino (CHO), células 293 de riñón humano, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1, otras líneas de células de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12 o C2C12.
La proteína CTLA-8 humana puede también producirse uniendo operativamente el polinucleótido aislado de la invención a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto son disponibles comercialmente en forma de estuche o kit de, p. ej., Invitrogen, San Diego, California, EE.UU. (el kit MaxBac®) y tales métodos son bien conocidos en la técnica, como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº. 1555 (1987), incorporado al presente texto como referencia. También pueden producirse formas solubles de la proteína CTLA-8 humana en células de insectos usando polinucleótidos aislados apropiados, como se describió antes.
Alternativamente, la proteína CTLA-8 humana puede ser producida en eucariotas inferiores tales como levaduras, o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de levaduras adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas.
La proteína CTLA-8 humana de la presente invención puede también expresarse como producto de animales transgénicos, p. ej. como componente de la leche de vacas, cabras cerdas u ovejas transgénicas, que se caracterizan por células somáticas o germinales que contienen una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína CTLA-8 humana.
La proteína CTLA-8 humana de la presente invención puede prepararse desarrollando un cultivo de células hospedadoras transformadas, bajo las condiciones de cultivo necesarias para que expresen la proteína deseada. La proteína expresada resultante puede entonces ser purificada del medio de cultivo o de los extractos celulares. Las formas solubles de la proteína CTLA-8 humana de la presente invención pueden se purificadas desde medios acondicionados. Las formas, unidas a la membrana, de la proteína CTLA-8 humana de la presente invención pueden ser purificadas preparando una fracción de membrana total a partir de la célula expresante y extrayendo las membranas con un detergente no iónico tal como Triton X-100.
La proteína CTLA-8 humana puede purificarse usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la proteína CTLA-8 humana de la presente invención puede concentrarse usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo una matriz o sustrato que tenga grupos dimetilaminoetilo colgantes (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados normalmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo (p. ej. columnas de S-Sepharose®). La purificación de la proteína CTLA-8 humana del sobrenadante del cultivo puede incluir también una o más etapas en columna sobre resinas de afinidad, tales como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl®, o Cibacrom blue-3GA Sepharose®; o por cromatografía de interacción hidrofóbica usando resinas tales como fenil éter, butil éter o propil éter, o por cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) empleando medios de RP-HPLC hidrófobos, p. ej. gel de sílice que tienen grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes, para purificar más la proteína CTLA- 8 humana. Algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en varias combinaciones o con otros métodos conocidos, pueden también emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente purificada.
Preferentemente, la proteína CTLA-8 humana se purifica de forma que esté sustancialmente libre de otras proteínas de mamífero.
Se cree que la CTLA-8 humana, los fragmentos activos y variantes de la misma, y proteínas relacionadas con CTLA-8 (tales como, por ejemplo, CTLA-8 de rata y CTLA-8 de herpes) (colectivamente "proteínas CTLA-8") poseen o inducen actividad de citocina. La expresión de CTLA-8 humana se correlacionó con la expresión de \gamma-IFN en células primarias inducidas y puede inducir la expresión de IL-3 y/o GM-CSF, la cual expresión puede a su vez producir efectos asociados con la citocina inducida. Por consiguiente, la CTLA-8 humana y proteínas CTLA-8 relacionadas con CTLA-8, pueden tener un efecto sobre la proliferación o la función de células mieloides, células eritroides, células linfoides y sus progenitores. Las proteínas CTLA-8 humanas pueden también desempeñar un papel en la formación de las plaquetas o sus progenitores.
Una proteína de la presente invención puede mostrar actividad de citocina, proliferación celular (bien sea induciéndola o bien inhibiéndola) o diferenciación celular (bien sea induciéndola o bien inhibiéndola), o puede inducir la producción de otras citocinas en ciertas poblaciones de células. Muchos factores proteicos descubiertos hasta ahora, incluyendo todas las citocinas conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de proliferación celular dependiente de factor, y por ello los ensayos sirven como confirmación práctica de la actividad de citocina. La actividad de una proteína de la presente invención se pone de evidencia por uno cualquiera entre una serie de ensayos rutinarios de proliferación celular dependiente de factor para líneas de células que incluyen, sin limitación, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF_{3}, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y
CMK.
La actividad de una proteína de la presente invención puede medirse, entre otros medios, por los métodos siguientes.
Los ensayos de proliferación de células T o timocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed. by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494:3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.
Los ensayos para producción de citocina y/o proliferación de células esplénicas, células de ganglios linfáticos o timocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. y Shevach, E. M. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 3.12 -3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; y Measurement of mouse and human Interferon \gamma, Schreiber, R. D. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Los ensayos para la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davie, L. S. y Lipsky, P. E. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; deVries et al., J. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin 6 - Nordan, R en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11 - Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse and human Interleukin 9 -
Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
Los ensayos de las respuestas de clones de células T frente a antígenos (que identificarán, entre otras, a las proteínas que afectan a las interacciones entre las APC y las células T, así como efectos directos de las células T midiendo la proliferación y la producción de citocina) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed. por J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; capítulo 6, Cytokines and their cellular receptors; capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095; 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981; Takai et al., J. Immun. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immun. 140: 508-512, 1988.
Una proteína de la presente invención puede mostrar también actividad de estimulación inmunitaria o de supresión inmunitaria, incluyendo, sin limitarse a ellas, las actividades para las que se han descrito ensayos en el presente texto. Una proteína puede ser útil en el tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunitarios (incluyendo la inmunodeficiencia combinada grave (SCID: Severe Combined ImmunoDeficiency)), p. ej. en la regulación (por incremento o por disminución) del crecimiento y proliferación de linfocitos T y/o B, así como llevando a efecto la actividad citolítica de las células NK y otras poblaciones celulares. Estas deficiencias inmunitarias pueden ser genéticas o causadas por infecciones víricas (p. ej. el VIH), así como bacterianas o fúngicas, o pueden ser el resultado de trastornos autoinmunitarios. Más específicamente, las enfermedades infecciosas causadas por infecciones víricas, bacterianas, fúngicas u otras pueden tratarse usando una proteína de la presente invención, incluyendo las infecciones por VIH, virus de la hepatitis, virus herpes, micobacterias, leshmania, malaria y diversas infecciones fúngicas tales como candida. Desde luego, en relación con esto, una proteína de la presente invención puede ser también útil en los casos en los que esté indicado un refuerzo para el sistema inmunitario, p. ej. en el tratamiento del cáncer.
Los trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse usando una proteína de la presente invención incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de la insulina, miastenia grave, enfermedad de rechazo del injerto contra el hospedador y enfermedad ocular autoinflamatoria. Tal proteína de la presente invención puede ser también útil en el tratamiento de reacciones y enfermedades alérgicas, tales como asma y otros problemas respiratorios. Otras enfermedades en las que se desea la supresión inmunitaria (incluyendo, por ejemplo, asma y enfermedades respiratorias relacionadas con el asma) pueden ser tratables usando una proteína de la presente invención.
Una proteína de la presente invención puede también suprimir la inflamación crónica o aguda, tal como, por ejemplo, la asociada con la infección (tal como en el choque séptico o el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome)), enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, o resultante de la superproducción de citocinas tales como TNF o IL-1 (tal como el efecto demostrado por IL-11).
La actividad de una proteína de la presente invención puede medirse, entre otros medios, por los métodos siguientes:
Los ensayos adecuados para la citotoxicidad de timocitos o esplenocitos incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Curent Protocols in Immunology, Ed. by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bowmanet et al., J. Virology 61: 1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140: 508:512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994.
Los ensayos para respuestas de inmunoglobulina dependientes de las células T y cambio de isotipos (que identificarán, entre otras, las proteínas que modulan las respuestas de los anticuerpos dependientes de las células T y que afectan a los perfiles de Th1/Th2) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; y Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. y Brunswick, M. en Current Protocols in Immunology, J. E. e. a. Coligan eds. Vol. 1 p. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
Los ensayos de la reacción de linfocitos mixtos (MLR: Mixed Lymphocite Reaction) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan predominantemente respuestas de Th1 y CTL) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Current Protocols in Immunology, J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494: 3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
Los ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T originales) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Guery et al., J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961-965; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631-640, 1990.
Los ensayos para supervivencia/apoptosis de linfocitos (que identificarán, entre otras, proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción de superantígeno y proteínas que regulan la homeostasis de los linfocitos), incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1: 639-648, 1992.
Los ensayos para proteínas que influyen sobre las etapas iniciales de diferenciación y desarrollo de células T incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Antica et al., Blood 84: 11-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7548-7551, 1991.
Una proteína de la presente invención puede ser útil en la regulación de la hematopoyesis y, en consecuencia, en el tratamiento de las deficiencias de células mieloides o linfoides. Incluso la actividad biológica marginal en apoyo de las células formadoras de colonias o de líneas de células dependientes de factor, indica la intervención en la regulación de la hematopoyesis, p. ej. en el apoyo del crecimiento y la proliferación de células progenitoras de eritroides, sola o en combinación con otras citocinas, lo que indica una utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de diversas anemias o para su uso junto con radiación/quimioterapia para estimular la producción de células precursoras de eritroides y/o eritroides; en el apoyo del crecimiento y la proliferación de células mieloides tales como granulocitos y monocitos/macrófagos (es decir, actividad de CSF tradicional) útil, por ejemplo, junto con la quimioterapia para prevenir o tratar la consiguiente mielo-supresión; en el apoyo del crecimiento y proliferación de megacariocitos y en consecuencia de plaquetas, permitiéndose así la prevención o el tratamiento de varios trastornos plaquetarios tales como la trombocitopenia, y generalmente para el uso en vez de transfusiones de plaquetas, o complementario a las mismas; y/o en el apoyo del crecimiento y proliferación de células troncales hematopoyéticas que son capaces de madurar para dar cualquiera o todas las células hematopoyéticas antes mencionadas, y que por tanto encuentran utilidad terapéutica en varios trastornos de las células troncales (tales como los tratados habitualmente con trasplante, incluyendo, sin limitarse a ellos, anemia aplásica y hemoglobinuria nocturna paroxística), así como en la repoblación del compartimiento de células troncales después de una radiación/quimioterapia, bien sea in vivo o ex vivo (es decir, junto con un trasplante de médula ósea) como células normales o manipuladas genéticamente para terapia génica.
La actividad de una proteína de la invención puede medirse, entre otros medios, por los métodos siguientes.
Los ensayos adecuados para la proliferación y diferenciación de varias líneas hematopoyéticas se citaron anteriormente.
Los ensayos para la diferenciación de células troncales embrionarias (que identificarán, entre otras, las proteínas que influyen sobre la hematopoyesis de la diferenciación embrionaria) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Johansson et al., Cellular Biology 15: 141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular Biology 13: 473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915, 1993.
Los ensayos para la superviviencia y diferenciación de células troncales (que identificarán, entre otras, proteínas que regulan la linfo-hematopoyesis) incluyen, sin limitarse a ellos, los descritos en: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M. G. en Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., ed. Vol. p. 265-268, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potencial, McNiece, I. K. y Briddell, R. A. en Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., ed. Vol. p. 23-39, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay; Ploemacher, R. E. en Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., ed. Vol. p. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. en Culture of Hematopoietic Cells, R. I. Freshney et al., ed. Vol. p. 163-179, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H. J. en Culture of Hematopoietic Cells, R. L. Freshney et al., ed. Vol. p. 139-162, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994.
Las proteínas CTLA-8 son útiles en el tratamiento de varias deficiencias y trastornos inmunitarios (incluyendo SCID), p. ej. en la regulación (por incremento o por disminución) del crecimiento, la proliferación y/o la actividad de los linfocitos T y/o B, así como la actividad citolítica de las células NK. Estas deficiencias inmunitarias pueden estar causadas por infecciones víricas (p. ej. VIH) así como bacterianas, y pueden ser resultado de trastornos autoinmunitarios. Mas específicamente, las enfermedades infecciosas causadas por una infección vírica, bacteriana, fúngica o de otro tipo, pueden ser tratables usando proteínas CTLA-8, incluyendo infecciones por VIH, hepatitis, gripe, CMV, herpes, micobacterias, leishmaniasis, malaria y varias infecciones fúngicas (tales como candida). Desde luego, en relación con esto, las proteínas CTLA-8 pueden ser también útiles en los casos en los que generalmente estaría indicado un refuerzo para el sistema inmunitario, p. ej. en el tratamiento del cáncer o como coadyuvante para vacunas. Los trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse usando factores de la presente invención incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria, diabetes mellitus dependiente de la insulina y enfermedad ocular autoinflamatoria. Es también de esperar que las proteínas CTLA-8 sean útiles en el tratamiento de reacciones y enfermedades alérgicas.
También es de esperar que las proteínas CTLA-8 tengan actividad quimiotáctica. Una proteína o un péptido tienen "actividad quimiotáctica", como se usa en el presente texto, si pueden estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento dirigido de las células, incluyendo las células mieloides y linfoides. Preferentemente, la proteína o el péptido tienen la capacidad de estimular directamente el movimiento dirigido de las células (en particular las células T). Puede determinarse fácilmente si una proteína o un péptido concretos tienen actividad quimiotáctica para las células, empleando tal proteína o péptido en cualquier ensayo conocido para quimiotaxis de células.
Las proteínas CTLA-8 inhiben también el crecimiento y la proliferación de células endoteliales vasculares. Como resultado, las proteínas CTLA-8 humanas son efectivas para inhibir la angiogénesis (es decir, la formación vascular). Esta actividad será también útil en el tratamiento de tumores y otras enfermedades en las que interviene la angiogénesis. La inhibición de la angiogénesis por las proteínas CTLA-8 humanas tendrá también por resultado la inhibición o la prevención de la enfermedad a la que contribuiría la angiogénesis normal.
Las proteínas CTLA-8 aisladas, purificadas a partir de células u obtenidas por vía recombinante, pueden ser usadas como composición farmacéutica cuando se combinan con un vehículo aceptable farmacéuticamente. Tal composición puede contener, además de la proteína CTLA-8 y el vehículo, diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. La expresión "aceptable farmacéuticamente" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia ni con la actividad biológica del ingrediente o de los ingredientes activos. Las características del vehículo dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener también citocinas, linfocinas y otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, \gamma-IFN, factor de células troncales, y eritropoyetina. La composición farmacéutica puede contener factores trombolíticos o antitrombóticos tales como activador del plasminógeno y factor VIII. La composición farmacéutica puede contener además otros agentes anti-inflamatorios. Tales factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la proteína CTLA-8, o para minimizar los efectos secundarios provocados por la proteína CTLA-8. En cambio, la proteína CTLA-8 puede incluirse en formulaciones de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio en particular, para minimizar los efectos secundarios de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o anti-trombótico, o agente anti-inflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en el que la proteína CTLA-8 está combinada, además de con otros vehículos aceptables farmacéuticamente, con agentes anfipáticos tales como lípidos que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas laminares que en solución acuosa. Los lípidos adecuados para formulación liposómica incluyen, sin limitarse a ellos, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposómicas está en el nivel de un experto en la técnica, como se describe, por ejemplo en la patente de EE.UU. nº 4.235.871, la patente de EE.UU. nº 4.501.728, la patente de EE.UU. nº 4.837.028 y la patente de EE.UU. nº 4.737.323, todas las cuales se incorporan al presente texto como referencia.
Como se usa en el presente texto, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método, que es suficiente para mostrar un significativo beneficio para el paciente, p. ej. la mejora de los síntomas, la curación o el aumento de la velocidad de curación de su enfermedad. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, la expresión se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que tienen por resultado el efecto terapéutico, sea administrado en combinación, en serie o al mismo tiempo.
En la puesta en práctica del método de tratamiento o uso de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína CTLA-8 a un mamífero. La proteína CTLA-8 puede ser administrada de acuerdo con el método de la invención, bien sea solo o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos. Cuando se administra conjuntamente con una o más citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos o componentes de vacunas (tales como antígenos u otros coadyuvantes), la proteína CTLA-8 puede ser administrada simultáneamente con las citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos, o bien puede hacerse secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico responsable decidirá la secuencia apropiada para la administración de la proteína CTLA-8 en combinación con citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, o factores trombolíticos o antitrombóticos.
La administración de la proteína CTLA-8 usada en la composición farmacéutica o para la puesta en práctica del método de la presente invención, puede llevarse a cabo de alguna entre una diversidad de formas convencionales, tal como la ingestión oral, inhalación o inyección cutánea, subcutánea o intravenosa. Se prefiere la administración intravenosa al paciente.
Cuando se administra oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína CTLA-8, la proteína CTLA-8 estará en forma de comprimido, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como gelatina o un coadyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contienen de aproximadamente 5 a 95% de proteína CTLA-8, y preferentemente de aproximadamente 25 a 90% de proteína CTLA- 8. Cuando se administra de forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, solución de dextrosa o de otro disacárido, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene de aproximadamente 0,5 a 90% en peso de proteína CTLA-8, y preferentemente de aproximadamente 1 a 50% de proteína CTLA-8.
Cuando se administra una cantidad terapéutica efectiva de proteína CTLA-8 mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína CTLA-8 estará en forma de solución acuosa libre de pirógenos, aceptable parenteralmente. La preparación de tales soluciones de proteína aceptables parenteralmente, teniendo en cuenta en forma debida el pH, la isotonicidad, la estabilidad y aspectos similares, está dentro de la experiencia en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de proteína CTLA-8, un vehículo isotónico tal como una solución de cloruro sódico para inyección, solución de Ringer para inyección, solución de dextrosa para inyección, solución de dextrosa y cloruro sódico para inyección, solución de Ringer con lactato para inyección (solución de lactato sódico compuesta), u otros vehículos conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención puede contener también estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica.
La cantidad de proteína CTLA-8 en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se esté tratando, y de la naturaleza de los tratamientos previos a los que se haya sometido al paciente. Finalmente, el médico decidirá la cantidad de proteína CTLA-8 con la que ha de tratar a cada paciente en concreto. Inicialmente, el médico administrará dosis bajas de proteína CTLA-8 y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores de proteína CTLA-8 hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y generalmente en ese punto ya no se sigue aumentando la dosificación. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas para poner en práctica el método de la presente invención deben contener de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 mg de proteína CTLA-8 por kg de peso corporal, preferentemente aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 10 mg de proteína CTLA-8 por kg de peso corporal, más preferentemente aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 \mug de proteína CTLA-8 por kg de peso corporal, y lo más preferentemente aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 10 \mug de proteína CTLA-8 por kg de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención variará dependiendo de la gravedad de la enfermedad objeto de tratamiento, y del estado y la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente en concreto. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína CTLA-8 estará en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continuada. Finalmente el médico decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención.
La proteína CTLA-8 de la presente invención puede usarse también para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína CTLA-8 y que puedan inhibir la unión de CTLA-8 con su receptor. Tales anticuerpos son también útiles para realizar ensayos diagnósticos de CTLA-8 de acuerdo con métodos conocidos. Tales anticuerpos pueden obtenerse usando la proteína CTLA-8 entera como inmunógeno, o usando fragmentos de proteína CTLA-8 humana. Los inmunógenos peptídicos pueden contener adicionalmente un resto de cisteína en el término carboxilo, y están conjugados con un hapteno tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin). Pueden generarse otros inmunógenos peptídicos adicionales reemplazando los restos de tirosina con restos de tirosina sulfatada, Los métodos para sintetizar tales péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, en R. P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos (preferentemente anticuerpos monoclonales) neutralizantes o no neutralizantes que se unen a la proteína CTLA-8 humana pueden ser también agentes terapéuticos útiles para ciertos tumores, y también en el tratamiento de enfermedades descritas anteriormente. Estos anticuerpos monoclonales neutralizantes son capaces de bloquear la unión del ligando a la proteína CTLA-8 humana, o pueden favorecer el aclaramiento de la proteína del paciente.
A causa de su homología con la CTLA-8 humana, las proteínas CTLA-8 de rata, las proteínas CTLA-8 de herpes y las proteínas IL-17 (la "CTLA-8 humana" de Golstein et al, supra) poseerán también actividad de CTLA-8 como se describió anteriormente. Como resultado de ello, las proteínas CTLA-8 de rata y de herpes y las proteínas IL-17, así como fragmentos activos y variantes de las mismas, pueden ser usadas en la preparación de composiciones farmacéuticas y en métodos de tratamiento como se han descrito para la CTLA-8 humana. Las proteínas CTLA-8 de rata y de herpes, y fragmentos activos y variantes de las mismas, pueden prepararse como se describió antes usando los polinucleótidos (o fragbentos o variantes de los mismos) descritos en la SEC ID Nº: 3 y en la SEC ID Nº: 5, respectivamente. También puede producirse CTLA-8 de rata y de herpes como se describe en Rouvier et al., J. Immunol. 1993, 150, 5445-5456. También pueden usarse proteínas CTLA-8 de otras especies, como se describe en el presente texto. cDNAs que codifican CTLA-8 de rata y CTLA-8 de herpes fueron depositados en la American Type Culture Collection el 6 de julio de 1995, asignándoseles los números de entrada ATCC 69867 y ATCC 69866, respectivamente. También pueden producirse proteínas IL-17 como se describe en Goldstein et al., supra.
A causa de su homología con IL-17, las proteínas CTLA-8 humanas (B18) de la presente invención pueden también compartir algunas actividades con IL-17.
Para los propósitos de tratamiento o terapia, cualquiera de las proteínas que se discuten o se describen en el presente texto puede ser administrada por expresión in vivo de la proteína en un mamífero. En tales casos, se administra al sujeto un polinucleótido que codifica la proteína deseada de manera que permita la expresión de acuerdo con métodos conocidos, incluyendo, sin limitarse a ellos, los métodos con adenovirus descritos en el presente texto.
Ejemplo 1 Aislamiento del cDNA de la CTLA-8 humana
Un clon parcial para CTLA-8 humana fue aislado de una genoteca de cDNA hecha a partir de RNA aislado de células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas. Este parcial fue identificado como "B18". B18 se usa a veces en el presente texto para referirse a la CTLA-8 humana de la presente invención. Las búsquedas de homología identificaron este clon parcial como relacionado con los genes de CTLA-8 de herpes y de rata. La secuencia de DNA de este clon parcial se usó para aislar el clon de longitud completa.
Para aislar un cDNA de longitud completa para B18, se preparó una genoteca de cDNA de longitud completa direccional por métodos estándar en el vector pMV2 de expresión de COS. La genoteca de cDNA fue transformada en E. coli por electroporación. El grueso de la genoteca de cDNA transformada original se congeló en glicerol a -80ºC. Se obtuvo el título de una parte alícuota para medir la concentración de E. coli transformado. Los E. coli se descongelaron, se diluyeron a 76.000/0,1 ml en medio que contiene ampicilina, y se distribuyó 0,1 ml en los pocillos de una placa de microtítulo en una matriz de 8 x 8. La placa de microtítulo se puso a 37ºC durante la noche para desarrollar el E. coli.
Para preparar el DNA para PCR, se retiraron partes alícuotas de 20 \mul de cultivo de cada pocillo y se agruparon por separado para cada fila y columna de ocho pocillos, dando 16 agrupaciones de 160 \mul cada una. Los E. coli fueron sedimentados, resuspendidos en 160 \mul de tampón para lisis estándar consistente en Tris HCl 10 mM pH 8,1, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, y se lisaron calentando a 95ºC durante 10 minutos.
Para identificar los pocillos que contenían E. coli transformado con B18, se llevó a cabo la PCR primero sobre los preparados de DNA correspondientes a las ocho columnas. La PCR consistió en dos reacciones secuenciales con oligonucleótidos anidados, usando condiciones estándar. Los oligonucleótidos usados para la reacción de PCR se derivaron de la secuencia del clon de B18 parcial. Eran:
B185: CACAGGCATACACAGGAAGATACATTCA (SEQ ID Nº: 7)
B183: TCTTGCTGGATGGGAACGGAATTCA (SEQ ID Nº: 8)
B18N: ATACATTCACAGAAGAGCTTCCTGCACA (SEQ ID Nº: 9)
Las condiciones para la PCR fueron MgCl_{2} 2,5 mM y 95ºC x 2 min para un ciclo, 95ºC x 1 min más 68ºC x 1 min para 30 ciclos, y 68ºC x 10 para un ciclo. Cada reacción era en 20 \mul. La primera reacción contenía los oligonucleótidos B185 y B183 y 1 \mul de los preparados de DNA. La segunda reacción contenía los oligonucleótidos B183 y B18N y 1 \mul de la primera reacción.
Los preparados de DNA que contenían potencialmente un clon de cDNA de B18 de longitud completa fueron identificados mediante electroforesis en gel de agarosa en una parte alícuota de la segunda reacción PCR. Se supuso que una banda de DNA de movilidad correcta se derivaba de un cDNA de B18. A continuación se hizo la misma secuencia de reacciones PCR y análisis en gel en los preparados de DNA correspondientes a las ocho filas. La intersección de una fila y una columna identificó el pocillo A2 como contenedor potencial de B18 reduciéndole a los 76.000 E. coli originalmente sembrados en ese pocillo.
Para purificar más el E. coli individual que contiene el clon de cDNA de B18 de longitud completa putativo, se midió la concentración de E. coli en el pocillo A2 obteniendo el título y cultivando en placa diluciones del pocillo. Después se sembraron 7600 E. coli en los pocillos de una segunda placa de microtítulo en una matriz de 8 x 8. Los E. coli se desarrollaron durante la noche; los pocillos fueron agrupados y el DNA se preparó como se describió anteriormente. Para identificar cuál de estos pocillos contenía E. coli transformado con B18, se llevaron a cabo reacciones secuenciales de PCR, esencialmente como se describió antes. La electroforesis en gel de agarosa identificó el pocillo B2 como potencial contenedor de un cDNA de B18.
El E. coli que contiene este cDNA se purificó más sembrando pocillos de una placa de microtítulo con 253 E. coli por pocillo y procediendo como para la purificación del E. coli en el pocillo A2. El pocillo C3 fue identificado como contenedor de un clon de cDNA de B18 de longitud completa putativo. El E. coli exacto se identificó poniendo en placa el contenido del pocillo sobre medio de cultivo bacteriano y cribando después las colonias de E. coli siguiendo protocolos establecidos. La sonda para estas hibridaciones fue un fragmento de PCR generado haciendo una reacción PCR en el clon de B18 usando como cebadores los oligonucleótidos descritos anteriormente (SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9). Cuando se identificó una colonia individual, se preparó el DNA y se secuenció por métodos estándar. La comparación de esta secuencia con la secuencia del clon parcial original confirmó la identidad y que el cDNA aislado era de longitud completa.
El clon de longitud completa fue depositado en la American Type Culture Collection el 6 de julio de 1995 y se le asignó el número de entrada ATCC 69868.
Ejemplo 2 Expresión de CTLA-8 humana
El clon de B18 de longitud completa para la CTLA-8 humana fue transfectado en células COS, que después se marcaron con ^{35}S-metionina. Una parte alícuota de medio acondicionado procedente del cultivo de células transfectadas se redujo, se desnaturalizó y se sometió a electroforesis en geles de poliacrilamida. Las autorradiografías de esos geles se reproducen en la Fig. 2. La banda indicada por la flecha demuestra la expresión de CTLA-8 humana.
Ejemplo 3 Inhibición de la angiogénesis por la CTLA-8 humana
La capacidad de la CTLA-8 humana para inhibir la angiogénesis fue examinada en un ensayo de actividad angiostática (ensayo de proliferación de células endoteliales). El ensayo se hizo en una placa de 96 pocillos. Células umbilicales humanas primarias (HUVECs) fueron sembradas a razón de 2 x 10^{3} células por pocillo en medio EGM (Clonetics)/20% FCS e incubadas a 37ºC durante 24 horas. Las células fueron después sometidas a privación en medio M199 (GIBCO BRL) que contiene suero tratado con 10% de carbón (M199-CS) durante 48 h a 37ºC. Se obtuvo medio acondicionado que contiene B18 (CTLA-8 humana) a partir de células COS transfectadas o células de CHO que se expresan establemente, y se prepararon diluciones 1:10, 1:50, 1:250 y 1:1250 en medio M199-CS que contiene 100 ng/ml de FGF. Las diluciones de B18 se añadieron a las células sometidas a privación y se incubaron durante 72 h a 37ºC. La células se radiomarcaron después mediante [^{3}H]-timidina durante 6 h. Las células radiomarcadas se lavaron con PBS y se tripsinizaron para conteo de centelleo de líquidos. Los resultados se representaron usando el programa Kaleidograph. Los resultados se muestran en la Fig. 3. En la figura, "Med" es el control simulado, "B18" y "B18-1" eran medio acondicionado de dos transfecciones independientes de COS con DNA que codifica CTLA-8 humana (B18). Se usó IFN-\gamma como control positivo de actividad angiostática (es decir, inhibición de la angiogénesis). Estos datos demuestran que la CTLA-8 humana (B18) inhibe la angiogénesis.
Ejemplo 4 Actividad hematopoyética de la CTLA-8 humana
La actividad hematopoyética de la CTLA-8 humana (B18) expresada in vivo fue examinada mediante la construcción de un vector de adenovirus recombinante.
El cDNA de B18 en el plásmido de expresión Adori 2-12 B18 fue impulsado por el promotor temprano inmediato y potenciador de citomegalovirus (CMV).
El vector Adori 2-12 fue creado mediante la adición de un origen y potenciador de SV40 a un vector de adenovirus conocido (Barr et al., Gene Therapy 1:51 (1994); Davidson et al., Nature Genetics 3:219 (1993)). El fragmento HindIII/BamHI que codifica el origen y potenciador de SV40 fue aislado del vector de expresión de mamífero pMT2, se hicieron los extremos romos con Klenow y fue clonado en el sitio NatI (hecho romo con Klenow) del vector de expresión Ad5.
El vector fue derivado digiriendo de cDNA de pNOT-B18 con SalI, rellenando el saliente 5' con Klenow para generar un extremo romo y digiriendo con EcoRI para aislar el cDNA de B18. El fragmento de B18 de EcoRI hecho romo fue insertado en los sitos de restricción EcoRV-EcoRI del vector de adenovirus Adori 2-12. La casete de expresión de CMV-B18 fue localizada secuencia abajo del origen y potenciador de SV40, y 0-1 unidades de mapa del extremo de la izquierda del adenovirus tipo 5(Ad5). El donador y aceptor de ayuste de SV40 fueron localizados entre el promotor de CMV y el cDNA de B18. Después del inserto estaba el sitio de poli A de SV40, 9-16 unidades de mapa de Ad5 y el origen de puc 19.
Se generó un adenovirus recombinante por recombinación homóloga en células 293. Adori 2-12 B18 linealizado con AscI y AdCMVlacZ digerido con ClaI fueron introducidos en células 293 usando lipofectamina. El virus de adenovirus recombinante fue aislado y amplificado en células 293. El virus se liberó de las células 293 infectadas mediante tres ciclos de congelación y descongelación. El virus se siguió purificando mediante dos gradientes de centrifugación con cloruro de cesio y se dializó frente a PBS a 4ºC. Después de la diálisis del virus, se añadió glicerol a una concentración de 10% y el virus se almacenó a -70ºC hasta su uso. El virus fue caracterizado mediante la expresión del transgén, unidades formadoras de placas en células 293, partículas/ml y análisis Southern del virus.
Una dosis individual de 5 x 10^{10} partículas de adenovirus recombinante que codifica B18 fue inyectada en la vena de la cola de ratones C57/b16 macho, de 7 a 8 semanas de edad. Los ratones testigo recibieron un adenovirus que codifica B-galactosidasa. Cuatro ratones de cada grupo experimental fueron sacrificados el día 7 y el día 14. Se recogió la sangre y se llevó a cabo un análisis hematológico automático usando un instrumento Baker 9000. Se realizaron recuentos diferenciales en frotis sanguíneos. El tejido fue recogido, fijado en formalina y teñido con hematoxilina y eosina para histopatología. En el primer conjunto de experimentos, el suero y los tejidos se analizaron a los 7 y a los 14 días después de la inyección. Se observó un ligero aumento en el recuento de las plaquetas periféricas. Los animales que recibieron B18 mostraron un ligero aumento en el tamaño del bazo. El análisis macroscópico del bazo indicó un aumento de la hematopoyesis extramedular esplénica el día 7, en comparación con el testigo. Estos resultados indicaron una actividad de crecimiento hematopoyético asociada con B18.
En un segundo conjunto de experimentos, 5 x 10^{10} partículas de adenovirus recombinante que codifica B18 fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones C57/b16 machos, de 17 a 18 años de edad. Los ratones testigo recibieron un adenovirus que codifica B-galactosidasa. Se tomaron muestras de sangre a través del seno retro-orbital los días 2, 5, 7, 10, 14 y 21. Los análisis hematológicos se realizaron en el contador de células automático Baker 9000 con ajustes murinos específicos. Los análisis incluían WBC (leucocitos), RBC (glóbulos rojos), HCT (hematocrito) y PLT Plaquetas). Se prepararon frotis o extensiones de sangre y se tiñeron con Wright-Geimsa para diferenciales de WBC basados en un recuento de 100 células. Los reticulocitos y las plaquetas reticuladas se cuantificaron usando citometría de flujo. Cuatro ratones de cada grupo fueron sacrificados los días 7, 14 y 21. Además del análisis de sangre periférica, se recogió el suero por punción cardíaca para cuantificación de II-6 sistémico usando un kit comercial (Endogen). El bazo y el hígado se recogieron para histopatología, se cuantificaron los progenitores hematopoyéticos de bazo y médula ósea y se prepararon frotis de médula ósea y se tiñeron con Wright-Geimsa para recuentos de células.
La administración de adenovirus que codifica B18 tuvo por resultado un acusado aumento de neutrófilos y WBC de la sangre periférica (Fig. 4). Los máximos aumentos en los neutrófilos se observaron el día 5 y el día 7. Los ratones testigo mostraron pequeñas diferencias los días 5 y 7. Los neutrófilos de la sangre periférica eran similares en los ratones testigo y en los ratones que recibieron B18 el día 21. En ambos grupos de B18 y testigo se observó también un aumento de los leucocitos. Los ratones que recibieron B18 tenían un mayor aumento de WBC entre el día 2 y el día 7. El día 21 se observó un aumento más pronunciado en el grupo de B-gal. No se observaron otros cambios en los datos de la química celular (Tabla I).
La celularidad de la médula ósea fue calculada a partir de los fémures reunidos de cada grupo (Tabla III). No se observaron diferencias significativas en ninguno de los grupos. No se observaron cambios significativos en los progenitores hematopoyéticos de la médula ósea de los días 7, 14 y 21. Los CFU-GM, BFU-E y CFU-MEG en los ratones B18 fueron similares a los del testigo B-gal (Tabla II).
La administración del adenovirus que codifica B18 tuvo por resultado un aumento en los progenitores de CFU-GM (mieloide) y BFU-E (eritroide) en el bazo en comparación con los animales que recibieron el virus B-gal el día 7. El aumento de progenitores en los ratones B18 fue 11 veces en los CFU-GM y 52 veces en los BFU-E (Tabla II). Hubo un aumento de 2 veces en CFU-MEG el día 7 para los ratones B18. El día 21 no se observaron diferencias significativas en CFU-MEG esplénico o BFU-E entre los grupos (Tabla II). Se observó un aumento de 3 veces en CFU-GM en los ratones que recibieron adenovirus que codifica B18. Se observó un ligero aumento en el tamaño del bazo el día 7 en el grupo de B18. Esto es consistente con un aumento de la celularidad esplénica. Para el día 14 y el día 21 los pesos del bazo fueron similares a los del grupo testigo (Tabla III). El análisis macroscópico del bazo indicó un aumento en la hematopoyesis extramedular esplénica de los ratones B18 el día 7 en comparación con el testigo.
Las relaciones mieloide:eritroide de la médula ósea (Tabla IV) sugieren una hiperplasia granulocítica con una posible hipoplasia eritroide en ratones que recibieron adenovirus B18 el día 7. El día 21 la relación en el grupo de B-gal era más alta. No se observaron cambios en los niveles en suero de IL6.
Estos resultados indican una actividad hematopoyética asociada con la administración de un adenovirus que codifica B18 (CTLA-8 humana). Se observaron aumentos en los neutrófilos y leucocitos en el día 7 en animales que recibieron adenovirus B18. Los datos indicaron que B18 tuvo por resultado un aumento en CFU-GM y BFU-E esplénicos 7 días después de la administración en comparación con los animales testigo. La hematopoyesis extramedular esplénica en el día 7 apoya que B18 muestra una actividad de crecimiento hematopoyético. Estos datos sugieren que B18 puede movilizar precursores hematopoyéticos tempranos.
1
2
3
TABLA II
4
Los precursores hematopoyéticos se determinaron a partir de muestras de bazo y médula ósea agrupadas, procedentes de cuatro animales de cada grupo. Para la cuantificación de CFU-GM y BFU-E, se añadieron 1 x 10^{4} células de médula ósea o bien 1 X 10^{5} células esplénicas a medio completo alfa metilcelulosa (0,9% de metil celulosa en medio alfa, 30% de suero bovino fetal, 1% de albúmina de suero bovino, 2-mercapto-etanol 10^{-4}M, L-glutamina 2 mM, 2% de medio acondicionado para células esplénicas murinas, y 3 U/mL de eritropoyetina) y se dividió en partes alícuotas en placas para cultivo de tejidos de 35 mm, en un volumen final de 1,0 mL. Los cultivos se incubaron durante 7 días a 37ºC y 5% de CO_{2}. Se definieron colonias microscópicas como racimos de 50 o más células. Para la cuantificación de CFU-MEG, se añadieron 1 x 10^{5} células de médula ósea o bien 1 X 10^{6} células esplénicas a medio completo alfa metilcelulosa como se describió anteriormente, y se incubó como se describió anteriormente. Se definieron colonias de megacariocitos como un grupo de 3 o más células.
^{*} Los progenitores de la médula ósea se representan como la media \pm la desviación estándar del número de colonias por 10^{5} células.
^{**} Los progenitores esplénicos se representan como la media \pm la desviación estándar del número de colonias por 10^{6} células.
TABLA III Pesos del bazo y celularidad del fémur
5
Los pesos del bazo se determinaron en el momento del sacrificio; se representan como las medias \pm la desviación estándar (sd) para cuatro animales.
TABLA IV
6
Todas las entradas representan el número de células mieloides por 1 célula eritroide. Las relaciones para ratones normales son aproximadamente de 1:1 a 2:1.
Ejemplo 5 Experimentos adicionales en relación con la actividad hematopoyética de la CTLA-8 humana
Se ensayó B18 (CTLA-8 humana) en cuanto a la capacidad para inducir la producción de factores que tienen actividad hematopoyética en un ensayo de proliferación de células dependiente de factor, usando la línea de células eritroleucémicas humanas, TF-1 (Kitamura et al., J. Cell Physiol. 140: 323 (1989)). Las células fueron desarrolladas inicialmente en presencia de rhGMCSF (100 U/ml). Las células se alimentaron tres días antes de establecerse el ensayo. Las condiciones de ensayo fueron las siguientes:
células/pocillo 5000/200 \mul
tiempo de incubación 3 días
tiempo de pulsación 4 horas
cantidad de timidina tritiada 0,5 \muCi/pocillo
tiempo de conteo 1 minuto
replicados 2
Se ensayó B18 solo, medio acondicionado (CM) de células HS-5 inducidas con B18. Se ensayó tampón solo, CM de células HS-5 inducidas con tampón y CM de células HS-5 no inducidas como testigos. Los resultados se muestran en la Fig. 5. La B18 (CTLA-8 humana) demostró capacidad para inducir la producción de factores que inducían la proliferación de TF-1. Esta actividad se eliminaba sustancialmente mediante la adición de anticuerpos anti-GMCSF. Estos datos demuestran que la CTLA-8 humana (B18) puede inducir hematopoyesis. En particular, y sin que ello suponga vincularse a ninguna teoría, parece que la CTLA-8 humana (B18) induce la producción de GM-CSF y/o IL-3.
Ejemplo 6 Capacidad de la CTLA-8 humana para inducir la producción de IL-6 e Il-8.
Se incubaron células MRC5 en presencia de CTLA-8 humana (B18) y se midió la producción de IL-6 e IL-8. Se usó CTLA-8 de herpes (BL-17) como control positivo. La CTLA-8 humana (B18) de los solicitantes demostró una producción valorable tanto de IL-6 como de IL-8 (véanse las fig. 6 y 7).
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE: Jacobs, Kenneth
\hskip3.95cm
Kelleher, Kerry 
\hskip3.95cm
Carlin, McKeough 
\hskip3.95cm
Goldman, Samuel 
\hskip3.95cm
Pittman, Debra 
\hskip3.95cm
Mi, Sha 
\hskip3.95cm
Neben, Steven 
\hskip3.95cm
Giannotti, JoAnn 
\hskip3.95cm
Golden'Fleet, Margaret 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TITULO DE LA INVENCIÓN: CTLA-8 humana y usos de proteínas relacionadas con CTLA-8.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Genetics Institute, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 87 Cambridge Park Drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Massachussets
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Relase nº 1.0, ver. 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACION
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACION:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Brown, Scott A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NUMERO DE REGISTRO: 32.724
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: GI5262
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELEFONO: (617) 498-8224
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (617) 876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 813 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 56..544
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 163 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 461 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 6..455
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 150 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 459 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..453
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACAGGCATA CACAGGAAGA TACATTCA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTTCGTGGA TGGGAACGGA ATTCA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATACATTCAC AGAAGAGCTT CCTGCACA 
\hfill
28

Claims (17)

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en:
(a) la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 146 al nucleótido 544;
(b) una secuencia de nucleótidos que varía a partir de la secuencia de nucleótidos especificada en (a) como resultado de la degeneración del código genético,
en la que dicha secuencia codifica la proteína CTLA-8 humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 2.
2. El polinucleótido según la reivindicación 1ª, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o secreción de \gamma-IFN, IL-3, IL-6, IL-8, o GM-CSF, o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica, y en el que dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión, preferentemente contenida en un vector adecuado para la expresión in vivo en un mamífero.
3. El polinucleótido según las reivindicaciones 1ª o 2ª, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 55 al nucleótido 544, preferentemente que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 86 al nucleótido 544, más preferentemente que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 139 al nucleótido 544.
4. Una célula hospedadora transformada con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª.
5. La célula hospedadora según la reivindicación 4ª, en la que dicha célula es una célula de mamífero.
6. Una proteína CTLA-8 humana que comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre el grupo consistente en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;
(b) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 desde el aminoácido 11 al 163;
(c) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 desde el aminoácido 29 al 163;
(d) la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 desde el aminoácido 31 al 163;
(e) fragmentos de (a), (b), (c) o (d) que tienen actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o la secreción de \gamma-IFN, IL-3, IL-6, IL-8 o GM-CSF, o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
7. La proteína según la reivindicación 6ª que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2, que comprende preferentemente la secuencia desde el aminoácido 11 al 163 de la SEC ID Nº: 2, que comprende más preferentemente la secuencia desde el aminoácido 29 al 163 de la SEC ID Nº: 2, que comprende lo más preferentemente la secuencia desde el aminoácido 31 al 163 de la SEC ID Nº: 2.
8. Una composición farmacéutica que comprende una proteína CTLA-8 humana según las reivindicaciones 6ª o 7ª y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
9. Una composición que comprende un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína CTLA-8 humana según las reivindicaciones 6ª o 7ª.
10. La composición según la reivindicación 9ª, en la que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, o un anticuerpo monoclonal, y/o un anticuerpo neutralizante.
11. El uso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición según la reivindicación 8ª, para la preparación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis, la inhibición del crecimiento o de la proliferación de las células endoteliales vasculares, la inhibición del crecimiento de tumores, la inhibición del desarrollo de tejidos dependiente de la angiogénesis, la proliferación de células o progenitores mieloides, la proliferación de células o progenitores eritroides, la proliferación de células o progenitores linfoides, la inducción de la producción de IFN\gamma, la inducción de la producción de IL-3 o la inducción de la producción de GM-CSF.
12. Un polinucleótido aislado que comprende una variante humana alélica de la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1 desde el nucleótido 146 hasta el nucleótido 544, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o secreción de \gamma-TFN, IL-3, IL-6, IL-8 o GM-CSF o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica.
13. El polinucleótido según la reivindicación 12ª, en el que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene actividad de CTLA-8, que está especificada por la inducción de la expresión o secreción de \gamma-TFN, IL-3, IL-6, IL-8 o GM-CSF o por su actividad quimioatrayente o quimiotáctica y en el que dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión, preferentemente contenida en un vector adecuado para la expresión in vivo en un mamífero.
14. El polinucleótido según las reivindicaciones 12ª o 13ª, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, desde el nucleótido 55 hasta el nucleótido 544, que comprende preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, desde el nucleótido 86 hasta el nucleótido 544, que comprende más preferentemente la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 1, desde el nucleótido 139 hasta el nucleótido 544.
15. Una célula hospedadora no humana transformada con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 12ª a 14ª.
16. La célula hospedadora según la reivindicación 15ª, en la que dicha célula es una célula de mamífero.
17. Un procedimiento para producir una proteína CTLA-8 humana, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) desarrollar un cultivo de la célula hospedadora según las reivindicaciones 4ª, 5ª, 15ª o 16ª en un medio de cultivo adecuado, y
(b) purificar la proteína CTLA-8 humana del cultivo.
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Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6274711B1 (en) 1993-06-14 2001-08-14 Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Purified mammalian CTLA-8 antigens and related reagents
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US7053190B2 (en) 1997-03-07 2006-05-30 Human Genome Sciences, Inc. Secreted protein HRGDF73
WO1999066041A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-23 Human Genome Sciences, Inc. 94 human secreted proteins
WO1999043693A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Human Genome Sciences, Inc. 36 human secreted proteins
CA2284131A1 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Human Genome Sciences, Inc. 70 human secreted proteins
WO1998039448A2 (en) * 1997-03-07 1998-09-11 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6420526B1 (en) 1997-03-07 2002-07-16 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6878687B1 (en) 1997-03-07 2005-04-12 Human Genome Sciences, Inc. Protein HMAAD57
EP1352962A1 (en) * 1997-03-07 2003-10-15 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
WO1998054963A2 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 Human Genome Sciences, Inc. 207 human secreted proteins
CA2284550A1 (en) 1997-03-21 1998-10-01 Human Genome Sciences, Inc. 87 human secreted proteins
WO1999060127A2 (en) 1998-05-15 1999-11-25 Genentech, Inc. Il-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
AU6891098A (en) * 1997-04-10 1998-10-30 Genetics Institute Inc. Secreted expressed sequence tags (sests)
JP2001518793A (ja) * 1997-04-10 2001-10-16 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド 分泌発現配列タグ（ｓＥＳＴｓ）
AU6956698A (en) * 1997-04-10 1998-10-30 Genetics Institute Inc. Secreted expressed sequence tags (sests)
EP1428833A3 (en) * 1997-06-06 2004-07-07 Human Genome Sciences, Inc. 207 human secreted proteins
US6548633B1 (en) 1998-12-22 2003-04-15 Genset, S.A. Complementary DNA's encoding proteins with signal peptides
US6562578B1 (en) 1999-01-11 2003-05-13 Schering Corporation IL-17-like cytokine binding compounds and antibodies
US7060479B2 (en) 1999-12-08 2006-06-13 Serono Genetics Institute, S.A. Full-length human cDNAs encoding potentially secreted proteins
US7223727B2 (en) 1998-04-09 2007-05-29 Serono Genetics Institute S.A. GSSP4 polynucleotides and polypeptides and uses thereof
US6251583B1 (en) 1998-04-27 2001-06-26 Schering Corporation Peptide substrates for HCV NS3 protease assays
US7771719B1 (en) 2000-01-11 2010-08-10 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions, kits, and therapeutic uses of antagonist antibodies to IL-17E
US20030003545A1 (en) * 1998-05-29 2003-01-02 Reinhard Ebner Interleukins-21 and 22
US7091315B1 (en) 1998-07-15 2006-08-15 Human Genome Sciences, Inc. Protein HDPBQ71
CA2333917A1 (en) * 1998-07-15 2000-01-27 Human Genome Sciences, Inc. 71 human secreted proteins
EP1897948A1 (en) * 1998-09-17 2008-03-12 ZymoGenetics, Inc. Mammalian transforming growth factor beta 9
IL143600A0 (en) * 1999-01-11 2002-04-21 Schering Corp Interleukin-17 related mammalian cytokines, polynucleotides encoding them and their uses
CA2296792A1 (en) * 1999-02-26 2000-08-26 Genset S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
EP1053751A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compositions and methods for treating cell proliferation disorders
CA2387959A1 (en) * 1999-11-12 2001-05-17 Human Genome Sciences, Inc. 21 human secreted proteins
CA2382165A1 (en) 1999-12-08 2001-06-14 Genset S.A. Full-length human cdnas encoding potentially secreted proteins
EP1259253A2 (en) * 2000-02-29 2002-11-27 ZymoGenetics, Inc. Methods for promoting production of myelin by schwann cells
US7718397B2 (en) 2000-03-21 2010-05-18 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding receptor for IL-17 homologous polypeptides and uses thereof
DK1274450T3 (da) * 2000-04-18 2009-04-06 Schering Corp Medicinsk anvendelse af agonister og antagonister af IL-174
US20030096969A1 (en) 2000-06-02 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CN1329090A (zh) * 2000-06-21 2002-01-02 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人自身免疫疾病相关蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸
MXPA03003407A (es) 2000-10-18 2004-05-04 Immunex Corp Metodos para el tratamiento de artritis reumatoide usando antagonistas il-17.
JP2005522986A (ja) * 2001-10-19 2005-08-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 炎症性腸疾患の診断と治療のための組成物と方法
CA2504144A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis of immune related diseases using pro7
MXPA06000347A (es) * 2003-07-08 2006-03-28 Genentech Inc Polipeptidos heterologos il-17 a/f y usos terapeuticos de los mismos.
EP1687026B1 (en) 2003-11-21 2008-05-14 UCB Pharma, S.A. Method for the treatment of multiple sclerosis by inhibiting il-17 activity
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
US7790163B2 (en) 2006-03-10 2010-09-07 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
EP2377887A1 (en) 2006-03-10 2011-10-19 Zymogenetics Inc Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
EP2150564A2 (en) 2007-04-27 2010-02-10 ZymoGenetics, Inc. Antagonists to il-17a, il-17f, and il-23p19 and methods of use
US20090317400A1 (en) 2008-05-05 2009-12-24 Krzysztof Masternak Anti-IL 17A/IL-17F Cross-Reactive Antibodies and Methods of Use Thereof
MX2011011729A (es) 2009-05-05 2012-04-10 Novimmune Sa Anticuerpo anti il-17f y metodos de uso de los mismos.
EP2432493A1 (en) * 2009-05-20 2012-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of il-17 polypeptides for use in the prevention or treatment of atherosclerosis
HUE046670T2 (hu) 2010-01-15 2020-03-30 Kirin Amgen Inc Anti IL-17RA ellenanyag kiszerelés és terápiás rendek pikkelysömör kezelésére
LT2663577T (lt) 2011-01-14 2017-07-25 Ucb Biopharma Sprl Antikūnas, surišantis il-17a ir il-17f
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6562333B1 (en) * 1993-06-14 2003-05-13 Schering Corporation Purified mammalian CTLA-8 antigens and related reagents
ATE279517T1 (de) * 1995-03-23 2004-10-15 Immunex Corp Il-17 receptor
US5707829A (en) * 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby

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