ES2253879T3 - Mu-1, miembro de la familia del receptor de citoquina. - Google Patents
Mu-1, miembro de la familia del receptor de citoquina.Info
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Abstract
Se describen polinucleótidos codificantes de la cadena de la superfamilia de receptores de hematopoyetina MU-1. Se describen también proteínas MU-1 y procedimientos para su producción.
Description
MU-1, miembro de la familia del
receptor de citoquina.
La presente invención se refiere a nuevos
miembros de la familia de proteínas del receptor de citoquina de
mamíferos (incluyendo sin limitación las proteínas del receptor
humano y murino), a los fragmentos de las mismas y a polinucleótidos
recombinantes y a las células útiles para la expresión de dichas
proteínas.
Se ha identificado una variedad de moléculas
reguladoras, conocidas como hematopoyetinas, que están implicadas en
el desarrollo y en la proliferación de varias poblaciones de células
hematopoyéticas o sanguíneas. La mayoría de las hematopoyetinas
presentan determinadas actividades biológicas interactuando con un
receptor en la superficie de las células diana. Los receptores de
citoquina se componen normalmente de una, dos o tres cadenas. Muchos
receptores de citoquina y algunas citoquinas, tales como
IL-12 p40, son miembros de la superfamilia de
proteínas del receptor de hematopoyetina. La identificación de
nuevos miembros de la superfamilia del receptor de hematopoyetina
puede ser útil en la regulación de la hematopoyesis, en la
regulación de respuestas inmunitarias y en la identificación de
otros miembros de la superfamilia de la hematopoyetina, incluyendo
las citoquinas y los receptores. La entrada de la base de datos
EMBL, HSAC2303 (26-jun-1997; número
de registro AC002303) se refiere a una secuencia de ADN genómico
procedente de un clon de BAC que comprende el ADN del cromosoma 16
humano.
Sería deseable identificar y determinar el ADN y
la secuencia de proteínas para los miembros de la superfamilia de
receptor de hematopoyetina desconocidas hasta ahora.
Según la presente invención, se dan a conocer
polinucleótidos que codifican la cadena de la superfamilia del
receptor de hematopoyetina MU-1, incluyendo sin
limitación los de procedencia murina y humana.
En determinadas formas de realización, la
invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que está
constituido por:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 238 hasta el nucleótido 1852;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 1852;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 945 o desde el nucleótido 238 hasta el nucleótido 945;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que oscila entre la secuencia de la secuencia de nucleótidos especificada en cualquiera de (a) a (d) como resultado de la degeneración del código genético; y
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una especie homóloga de la secuencia de SEC. ID nº: 2, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene la actividad biológica de la proteína MU-1 representada por SEC. ID nº: 2 en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o de timocitos.
La secuencia de nucleótidos puede estar ligada
funcionalmente a una secuencia de control de expresión.
La invención proporciona también polinucleótidos
aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido o una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada de entre el grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 538;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 236;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 1 hasta el 236; y
- (e)
- fragmentos de (a) a (d) que tienen la actividad biológica del péptido o de la proteína según (a) a (d) en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o timocitos.
Se proporcionan también células huésped,
preferentemente células de mamífero, transformadas con
polinucleótidos.
En otras formas de realización, la invención
proporciona un procedimiento para la producción de una proteína
MU-1. El procedimiento comprende:
- (a)
- cultivar un cultivo de células huésped de la presente invención en un medio de cultivo adecuado; y
- (b)
- purificar la proteína MU-1 humana procedente del cultivo.
Se proporcionan también proteínas producidas
según estos métodos.
La presente invención también proporciona una
proteína MU-1 aislada que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada de entre el grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 538;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 236;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 1 hasta el 236;
- (e)
- fragmentos de (a) a (d) que tienen la actividad biológica de la de la proteína MU-1 según (a) a (d) en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o timocitos; y
- (f)
- una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse en condiciones muy seguras de 0,1 \times SSC a 65ºC con la secuencia de nucleótidos especificada en cualquiera de las reivindicaciones 1(a)-(c) o con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 945.
En otras formas de realización preferidas, la
secuencia de aminoácidos especificada forma parte de una proteína de
fusión (con una secuencia de aminoácidos adicional no derivada de
MU-1). Las proteínas de fusión preferidas comprenden
un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de Fc.
También se proporcionan composiciones
farmacéuticas que comprenden una proteína de la presente invención y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención proporciona además
composiciones que comprenden un anticuerpo que reacciona
específicamente con una proteína de la presente invención.
Los inventores de la presente solicitud han
identificado y proporcionado por primera vez polinucleótidos que
codifican la cadena de la superfamilia del receptor de
hematopoyetina MU-1 (en lo sucesivo
"MU-1" o "proteína MU-1"),
incluyendo sin limitación los polinucleótidos que codifican la
MU-1 humana.
Se utilizó una zona de 70 aminoácidos del
receptor de IL5 humano(LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSM
CREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFVIVIMATICFILLIL, SEC. ID nº: 3) para explorar la base datos EST de GenBank que utiliza el algoritmo TBLASTN. Se identificó la secuencia dentro del clon AC002303 de BAC genómico procedente del cromosoma 16p12 humano con homología a esta zona, lo que sugiere que este segmento podría codificar un gen de un nuevo receptor de hematopoyetina. El examen de los marcos de lectura abiertos dentro de 1000 bp de nucleótido 40.886 pusieron de manifiesto un marco de lectura de 270 bp que cuando se utilizó en una exploración de BLASTP de GenPept identificó exclusivamente miembros de la familia del receptor de citoquina. Un codón de terminación presente al final de este marco de lectura se interpretó como indicación de transición sobre un límite exón/intrón.
CREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFVIVIMATICFILLIL, SEC. ID nº: 3) para explorar la base datos EST de GenBank que utiliza el algoritmo TBLASTN. Se identificó la secuencia dentro del clon AC002303 de BAC genómico procedente del cromosoma 16p12 humano con homología a esta zona, lo que sugiere que este segmento podría codificar un gen de un nuevo receptor de hematopoyetina. El examen de los marcos de lectura abiertos dentro de 1000 bp de nucleótido 40.886 pusieron de manifiesto un marco de lectura de 270 bp que cuando se utilizó en una exploración de BLASTP de GenPept identificó exclusivamente miembros de la familia del receptor de citoquina. Un codón de terminación presente al final de este marco de lectura se interpretó como indicación de transición sobre un límite exón/intrón.
Se determinó a continuación si el ARN estaba
transcrito en un gen contenido en este clon BAC del cromosoma 16p12.
Se sintetizaron cebadores de PCR basándose en el segmento mayor de
ORF que contenía la secuencia de péptidos conservada dentro de la
familia del receptor de citoquina. Los cebadores
GAGTCCGAGGAGAA
AGCTGATCTCA (5p) (SEC. ID nº: 4) y GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEC. ID nº: 5) se utilizaron en las PCR para cribar los bancos de fagos de varios tejidos humanos (Clontech). Los productos de PCR del tamaño de 164 bp esperado que se hibridaron específicamente con un oligonucleótido marcado con 32-P de la secuencia
ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEC. ID nº: 6) se observaron en un fago de pulmón, riñón, placenta y corazón. Utilizando el oligonucleótido ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEC. ID nº: 7) se identificó, se purificó y se secuenció un clon de ADNc completo NN14-1b (MU-1). La secuencia del ADN y la secuencia de los aminoácidos previstos se presentan en la SEC. ID nº: 1 y SEC. ID nº: 2, respectivamente. El marco de lectura abierto codifica un nuevo miembro de la familia del receptor de hematopoyetina. Presenta una secuencia principal, pares de cisteína conservados, PP y WSXWS (SEC. ID nº: 8) motivos característicos de la familia así como un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico extenso. La alineación FASTA ulterior de esta secuencia con GenPept presentó la mayor homología con IL-2Rb humana. La secuencia de aminoácidos prevista de la cadena del receptor incluye una supuesta secuencia señal de los aminoácidos 1 a 21. Se cree que la MU-1 humana madura tiene la secuencia de aminoácidos 24 a 538 de SEC. ID nº: 2. El dominio transmembrana se encuentra en los aminoácidos 237 a
254.
AGCTGATCTCA (5p) (SEC. ID nº: 4) y GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEC. ID nº: 5) se utilizaron en las PCR para cribar los bancos de fagos de varios tejidos humanos (Clontech). Los productos de PCR del tamaño de 164 bp esperado que se hibridaron específicamente con un oligonucleótido marcado con 32-P de la secuencia
ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEC. ID nº: 6) se observaron en un fago de pulmón, riñón, placenta y corazón. Utilizando el oligonucleótido ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEC. ID nº: 7) se identificó, se purificó y se secuenció un clon de ADNc completo NN14-1b (MU-1). La secuencia del ADN y la secuencia de los aminoácidos previstos se presentan en la SEC. ID nº: 1 y SEC. ID nº: 2, respectivamente. El marco de lectura abierto codifica un nuevo miembro de la familia del receptor de hematopoyetina. Presenta una secuencia principal, pares de cisteína conservados, PP y WSXWS (SEC. ID nº: 8) motivos característicos de la familia así como un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico extenso. La alineación FASTA ulterior de esta secuencia con GenPept presentó la mayor homología con IL-2Rb humana. La secuencia de aminoácidos prevista de la cadena del receptor incluye una supuesta secuencia señal de los aminoácidos 1 a 21. Se cree que la MU-1 humana madura tiene la secuencia de aminoácidos 24 a 538 de SEC. ID nº: 2. El dominio transmembrana se encuentra en los aminoácidos 237 a
254.
El ADNc de MU-1 se depositó en la
American Type Culture Collection el 10 de marzo de 1998, con número
de registro ATCC ____.
Algunas formas de proteínas MU-1
menores de la longitud completa están comprendidas dentro de la
presente invención y se mencionan en la presente memoria
conjuntamente las formas completa y madura tales como
"MU-1" o "proteínas MU-1".
Pueden producirse proteínas MU-1 menores de la
longitud completa expresando un fragmento correspondiente del
polinucleótido que codifica la proteína MU-1
completa (SEC. ID nº: 4 o SEC. ID nº: 6). Estos fragmentos de
polinucleótido correspondientes forman también parte de la presente
invención. Los polinucleótidos modificados descritos anteriormente
pueden prepararse por técnicas de biología molecular normalizadas,
que comprenden la construcción de mutantes apropiados con la
delección deseada, métodos de mutagénesis dirigida al sitio o
mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores
de oligonucleótido apropiados.
Para los objetivos de la presente invención, una
proteína presenta "una actividad biológica de la cadena de la
superfamilia del receptor de hematopoyetina de
MU-1" si posee una o más de las actividades
biológicas de la proteína MU-1 madura
correspondiente.
MU-1 o los fragmentos activos de
la misma (proteínas MU-1) pueden fusionarse a
moléculas transportadoras tales como las inmunoglobulinas. Por
ejemplo, las formas solubles de la MU-1 pueden
fusionarse mediante secuencias "enlazadoras" al fragmento Fc de
una inmunoglobulina. Pueden utilizarse asimismo otras proteínas de
fusiones, tales como aquellas con GST, Lex-A o
MBP.
La invención también comprende variantes alelas
de la secuencia de nucleótidos como las publicadas en la SEC. ID nº:
1, es decir, formas alternativas naturales del polinucleótido
aislado de la SEC. ID nº: 1 que también codifican las proteínas
MU-1, preferentemente aquellas proteínas con
actividad biológica de MU-1. También están incluidos
en la invención los polinucleótidos aislados que se hibridan con la
secuencia de nucleótidos publicada en la SEC. ID nº: 1 en
condiciones muy severas (por ejemplo, 0,1 \times SSC a 65ºC). Los
polinucleótidos aislados que codifican las proteínas
MU-1 pero que se diferencian de la secuencia de
nucleótidos publicada en la SEC. ID nº: 1 en virtud de la
degeneración del código genético están también comprendidos en la
presente invención. Las variaciones en la secuencia de nucleótidos
publicadas en la SEC. ID nº: 1 que se producen por mutaciones
puntuales o por modificaciones inducidas están también incluidas en
la invención.
La presente invención también proporciona
polinucleótidos que codifican homólogos de la MU-1
humana de otras especies animales, particularmente de otras especies
de mamíferos. Pueden identificarse y aislarse especies homólogas
preparando sondas u operadores de las secuencias murinas o humanas
dadas a conocer en la presente memoria y cribando un banco de una
especie apropiada, tales como por ejemplo los bancos construidos a
partir de las PBMC, timo o testículos de las especies
relevantes.
Los polinucleótidos aislados de la invención
pueden estar funcionalmente ligados a una secuencia de control de
expresión tales como los vectores de expresión pMT2 o pED dados a
conocer en Kaufman et al., Nucleic Acid Res. 19,
4485-4490 (1991), a fin de producir la proteína
MU-1 por ingeniería genética. En la técnica se
conocen muchas secuencias de control de expresión adecuadas. También
se conocen los métodos generales de expresión de proteínas
recombinantes y están ejemplificados en R. Kaufman, Methods in
Enzymology 185, 537-566 (1990). Tal como
se define en la presente memoria "ligado funcionalmente"
significa enzimática o químicamente ligado para formar un enlace
covalente entre el polinucleótido aislado de la invención y la
secuencia de control de expresión, de tal modo que la proteína
MU-1 esté expresada por una célula huésped que ha
sido transformada (transfectada) con el polinucleótido ligado y la
secuencia de control de expresión.
Numerosos tipos de células pueden actuar como
células huésped adecuadas para la expresión de la proteína
MU-1. Puede utilizarse cualquier tipo de célula
capaz de expresar la proteína MU-1 operativa. Las
células huésped de mamífero adecuadas comprenden, por ejemplo,
células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO),
células 293 de riñón humano, células A431 epidérmicas humanas,
células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1,
otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides
normales, cepas celulares procedentes de cultivos in vitro de
tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de
ratón, células BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3,
32D, FDCP-1, PC12, M1x o C2C12.
La proteína MU-1 puede también
producirse uniendo funcionalmente el polinucleótido aislado de la
invención a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de
expresión de insecto y empleando un sistema de expresión de insecto.
Los materiales y métodos para los sistemas de expresión
bacilovirus/célula de insecto están disponibles en el mercado en
forma de kit en, p. ej., Invitrogen, San Diego, California, U.S.A.
(kit MaxBac®) y dichos métodos son bien conocidos en la técnica,
como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural
Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Las formas solubles
de la proteína MU-1 pueden también producirse en
células de insecto utilizando polinucleótidos aislados apropiados
como se describió anteriormente.
Como alternativa, la proteína
MU-1 puede producirse en eucariotas inferiores tales
como levaduras o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de
levadura adecuadas comprenden cepas de Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, Candida o cualquier
cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas
bacterianas adecuadas comprenden Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana
capaz de expresar proteínas heterólogas.
La expresión en bacterias puede producir la
formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína
recombinante. Por este motivo, el replegamiento de la proteína
recombinante puede ser necesario para producir material activo o más
activo. En la técnica se conocen varios métodos de obtención de
proteínas heterólogas plegadas correctamente a partir de cuerpos de
inclusión bacteriana. Estos métodos generalmente implican
solubilizar la proteína de los cuerpos de inclusión, a continuación
desnaturalizar la proteína completamente utilizando un agente
caótropo. Cuando están presentes restos de cisteína en la secuencia
de aminoácidos primaria de la proteína, es necesario con frecuencia
realizar el replegamiento en un medio que permita la formación
correcta de los enlaces disulfuro (sistema redox). Los métodos
generales de replegamiento se dan a conocer en Kohno, Meth.
Enzym., 185:187-195 (1990). El documento EP
0433225 y la solicitud pendiente de trámite USSN 08/163.877
describen otros métodos apropia-
dos.
dos.
La proteína MU-1 de la invención
puede también expresarse como producto de animales transgénicos, p.
ej., como componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u ovejas
transgénicas que están caracterizadas por células somáticas o
germinales que contienen una secuencia de polinucleótidos que
codifica la proteína MU-1.
La proteína MU-1 de la invención
puede prepararse cultivando un cultivo de células huésped
transformado en condiciones de cultivo necesarias para expresar la
proteína deseada. La proteína expresada resultante puede purificarse
a continuación a partir del medio de cultivo o de los extractos
celulares. Las formas solubles de la proteína MU-1
de la invención pueden purificarse a partir del medio acondicionado.
Las formas ligadas a la membrana de la proteína MU-1
de la invención pueden purificarse preparando una fracción de la
membrana total procedente de la expresión celular y extrayendo las
membranas con un detergente no iónico tal como Triton
X-100.
La proteína MU-1 puede
purificarse utilizando los métodos conocidos por los expertos en la
materia. Por ejemplo, la proteína MU-1 de la
invención puede concentrase utilizando un filtro de concentración de
proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de
concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de
purificación tal como un medio de filtración en gel. Como
alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por
ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo
(DEAE) o polietilenimina (PEI) pendientes. Las matrices pueden ser
de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados
normalmente en la purificación de proteínas. Como alternativa, puede
emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores
catiónicos adecuados comprenden varias matrices insolubles que
comprenden grupos de sulfopropilo o de carboximetilo. Son
preferibles los grupos sulfopropilo (p. ej., columnas de
S-Sepharose®). La purificación de la proteína
MU-1 del sobrenadante del cultivo puede también
comprender una o más etapas en columna sobre resinas de afinidad
tales como concanavalina A-agarosa,
heparina-toyopearl® o Cibacrom blue 3GA Sepharose®;
o mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando resinas
tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico; o por
cromatografía de inmunoafinidad. Por último, pueden emplearse una o
más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase
inversa (RP-HPLC) empleando medio
RP-HPLC hidrófobo, p. ej., gel de sílice con metilo
pendiente u otros grupos alifáticos para purificar más la proteína
MU-1. Pueden también utilizarse columnas de afinidad
que incluyen anticuerpos contra la proteína MU-1 en
la purificación según métodos conocidos. Pueden también emplearse
alguna o todas las etapas de purificación anteriores en varias
combinaciones o con otros métodos conocidos, para proporcionar una
proteína recombinante aislada sustancialmente purificada.
Preferentemente, la proteína MU-1 aislada se
purifica para que esté sustancialmente exenta de otras proteínas
de
mamífero.
mamífero.
Las proteínas MU-1 de la
invención también pueden utilizarse para cribar agentes que pueden
unirse a MU-1. Los análisis de enlace que utilizan
una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, son bien conocidos
en la técnica y pueden emplearse para esta finalidad utilizando la
proteína MU-1 de la invención. Pueden utilizarse
ensayos de cribado a base de células purificadas o a base de
proteínas (exentos de células) para identificar dichos agentes. Por
ejemplo, la proteína MU-1 puede inmovilizarse en
forma purificada en un portador y pueden determinarse los ligandos
de fijación o potenciales a la proteína MU-1
purificada.
Las proteínas MU-1, purificadas
en las células o producidas por ingeniería genética, pueden
utilizarse como composición farmacéutica cuando se combinan con un
portador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición puede
contener, además de MU-1 o de inhibidor y portador,
varios diluyentes, cargas, sales, tampones, estabilizantes,
solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. La
expresión "farmacéuticamente aceptable" significa un material
no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad
biológica del o de los ingrediente(s) activo(s). Las
características del portador dependerán de la vía de
administración.
La composición farmacéutica de la invención puede
contener también citoquinas, linfocinas u otros factores
hematopoyéticos tales como M-CSF,
GM-CSF, IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-14, IL-15,
G-CSF, factor de células madre y eritropoyetina. La
composición farmacéutica puede también incluir anticuerpos
anti-citoquina. La composición farmacéutica puede
contener factores trombolíticos o antitrombóticos tales como el
activador plasminógeno y el Factor VIII. La composición farmacéutica
puede contener además otros agentes antiinflamatorios. Dichos
factores y/o agentes adicionales pueden estar incluidos en la
composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la
proteína MU-1 aislada o para minimizar los efectos
secundarios producidos por la proteína MU-1 aislada.
A la inversa, la proteína MU-1 aislada puede
incluirse en formulaciones de la citoquina, linfocina, otro factor
hematopoyético, trombolítico o antitrombótico o agente
antiinflamatorio concreto para minimizar los efectos secundarios de
la citoquina, linfocina, otro factor hematopoyético, trombolítico o
antitrombótico o agente antiinflamatorio.
La composición farmacéutica de la invención puede
estar en forma de liposoma en el cual se combina la proteína
MU-1 aislada, además de otros portadores
farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como
lípidos que existen en formas acumuladas como micelas, monocapas
insolubles, cristales líquidos o capas laminares que están en
solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación
liposómica comprenden, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos,
sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y
similares. La preparación de dichas formulaciones liposómicas está
dentro del alcance del experto en la materia, tal como se da a
conocer, por ejemplo, en la patente U.S. nº 4.235.871; patente U.S.
nº 4.501.728; patente U.S. nº 4.837.028; y patente U.S. nº
4.737.323.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la
cantidad total de cada componente activo de la composición
farmacéutica o del método que es suficiente para presentar una
utilidad significativa en el paciente, p. ej. mejoría de síntomas,
cicatrización, o aumento de la velocidad de cicatrización de dichas
enfermedades. Cuando se aplica a un individuo el ingrediente activo,
administrado solo, la expresión se refiere al ingrediente solo.
Cuando se aplica a una combinación, la expresión se refiere a las
cantidades combinadas de ingredientes activos que producen el efecto
terapéutico, si se administra en combinación, en serie o
simultánea-
mente.
mente.
En la puesta en práctica del método de
tratamiento o en la utilización de la presente invención, se
administra una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína
MU-1 aislada a un mamífero. La proteína
MU-1 aislada puede administrarse según el método de
la invención ya sea sola o en combinación con otras terapias tales
como los tratamientos que emplean citoquinas, linfocinas u otros
factores hematopoyéticos. Cuando se administra conjuntamente con una
o más citoquinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos, la
proteína MU-1 puede administrarse ya sea
simultáneamente con la(s) citoquina(s),
linfocina(s), otro(s) factor(es)
hematopoyético(s), trombolítico(s) o factores
antitrombolíticos o sucesivamente. Si se administra sucesivamente,
el médico adjunto decidirá la secuencia de administración apropiada
de la proteína MU-1 en combinación con
citoquina(s), linfocina(s), otro(s)
factor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o
antitrombolíticos.
La administración de la proteína
MU-1 utilizada en la composición farmacéutica o para
poner en práctica el método de la presente invención puede
realizarse por una variedad de vías convencionales, tales como por
ingestión oral, inhalación o cutánea, subcutánea o por inyección
intravenosa. Es preferible la administración intravenosa al
paciente.
Cuando se administra por vía oral una cantidad
terapéuticamente eficaz de proteína MU-1, la
proteína MU-1 estará en forma de comprimido,
cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de
comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede
contener además un excipiente sólido tal como gelatina o un
adyuvante. El comprimido, cápsula y polvo contiene aproximadamente
del 5 al 95% de proteína MU-1 y preferentemente
desde aproximadamente 25 al 90% de proteína MU-1.
Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un excipiente
líquido tal como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal
tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o
aceite de sésamo o aceites sintéticos. La forma líquida de la
composición farmacéutica puede contener además solución salina
fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido, o glicoles tales
como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se
administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene
aproximadamente del 0,5 al 90% en peso de proteína
MU-1 y preferentemente desde aproximadamente 1 al
50% de proteína
MU-1.
MU-1.
Cuando se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de proteína MU-1 por
inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína
MU-1 estará en forma de solución acuosa
parenteralmente aceptable, exenta de pirógenos. La preparación de
dichas soluciones de proteína parenteralmente aceptables, que tienen
posibilidades con respecto al pH, isotonicidad, estabilidad y
similares, está comprendida en la experiencia en la materia. Una
composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea contiene, además de la proteína
MU-1 un vehículo isotónico tales como cloruro de
sodio inyectable, solución inyectable de Ringer, dextrosa
inyectable, dextrosa y cloruro de sodio inyectables, solución
inyectable de Ringer lacteada u otro vehículo conocido en la
técnica. La composición farmacéutica de la presente invención puede
contener además estabilizantes, conservantes, tampones,
antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la
materia.
La cantidad de proteína MU-1 en
la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la
naturaleza y gravedad de la enfermedad en tratamiento y de la
naturaleza de los tratamientos anteriores que ha recibido el
paciente. Por último, el médico adjunto decidirá la cantidad de
proteína MU-1 con la que tratar a cada paciente.
Inicialmente, el médico adjunto administrará bajas dosis de proteína
MU-1 y observará la respuesta del paciente. Pueden
administrarse dosis mayores de proteína MU-1 hasta
que se obtenga el efecto terapéutico óptimo en el paciente y este
punto de dosificación generalmente no se incrementa más. Se
contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas
para poner en práctica el método de la presente invención deberían
contener aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 100 \mug de
proteína MU-1 por kilo de peso corporal.
La duración de la terapia intravenosa que utiliza
la composición farmacéutica de la presente invención oscilará,
dependiendo de la gravedad de la enfermedad en tratamiento y del
estado y respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente. Se
contempla que la duración de cada aplicación de proteína
MU-1 estará comprendida en el intervalo entre 12 y
24 horas de administración intravenosa continua. Por último, el
médico adjunto decidirá la duración apropiada de la terapia
intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente
invención.
Es de esperar que el polinucleótido y las
proteínas de la presente invención presenten una o más utilizaciones
o actividades biológicas (incluyendo las asociadas a los ensayos
citados en la presente memoria) identificadas a continuación. Las
utilizaciones o actividades descritas para las proteínas de la
presente invención pueden proporcionarse mediante la administración
o utilización de dichas proteínas o mediante la administración o
utilización de los polinucleótidos que codifican dichas proteínas
(tales como, por ejemplo, en las terapias génicas o vectores
adecuados para la introducción de ADN).
Una proteína de la presente invención puede
presentar actividad de citoquina, de proliferación celular (ya sea
provocando o inhibiendo) o de diferenciación celular (ya sea
provocando o inhibiendo) o puede provocar la producción de otras
citoquinas en determinadas poblaciones celulares. Muchos factores
proteicos descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las
citoquinas conocidas, han presentado actividad en uno o más ensayos
de proliferación celular dependientes de uno o más factores y por
consiguiente los ensayos sirven como confirmación conveniente de la
actividad de las citoquinas. La actividad de una proteína de la
presente invención se demuestra mediante uno cualquiera de los
numerosos ensayos de proliferación celular dependientes del factor
de rutina para las líneas celulares que incluyen, sin limitación,
32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RB5,
DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e y CMK.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, por los siguientes métodos:
Los ensayos destinados a la proliferación de
linfocitos T o de timocitos comprenden sin limitación los descritos
en: Current Protocols en Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M.
Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene
Publishing Associates y Wiley-Interscience (Capítulo
3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Takai et al., J. Immunol.
137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al.,
J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli
et al., Cellular Immunology
133:327-341, 1991; Bertagnolli et al., J.
Immunol. 149:3778-3783, 1992; Bowman et
al., J. Immunol. 152:1756-1761, 1994.
Los ensayos destinados a la producción de
citoquinas y/o a la proliferación de células de bazo, células de
ganglios linfáticos o a los timocitos comprenden, sin limitación,
los descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. y
Shevach, E.M. en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a.
Coligan eds. Vol. 1 págs. 3.12.1-3.12.14, John Wiley
and Sons, Toronto. 1994; y Measurement of mouse and human Interferon
\gamma, Schreiber, R.D. en Current Protocols in Immunology.
J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 págs. 6.8.1-6.8.8, John
Wiley and Sons, Toronto. 1994.
Los ensayos destinados a la proliferación y
diferenciación de células hematopoyéticas y linfopoyéticas
comprenden, sin limitación, los descritos en: Measurement of Human
and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis,
L.S. y Lipsky, P.E. en Current Protocols in Immunology.
J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.3.1-6.3.12,
John Wiley and Sons, Toronto. 1991; deVries et al., J.
Exp. Med. 173:1205-1211, 1991; Moreau et
al., Nature 336:690-692, 1988;
Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:2931-2938, 1983; Measurement of mouse and human
interleukin 6-Nordan, R. en Current Protocols in
Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 págs.
6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto. 1991;
Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
83:1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin
11-Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. y
Turner, K.J. en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a.
Coligan eds. Vol. 1 págs. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto, 1991;
Measurement of mouse and human Interleukin
9-Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. y
Turner, K.J. en Current Protocols in Immunology. J.E.e.a.
Coligan eds. Vol 1 págs. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto,
1991.
Los ensayos destinados a las respuestas del clon
de linfocito T a los antígenos (que identificarán, entre otros, a
proteínas que afectan las interacciones de
APC-linfocitos T así como a los efectos directos de
los linfocitos T por medición de la proliferación y de la producción
de citoquina) comprenden, sin limitación, los descritos en: Current
Protocols en Immunology, editado por J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek,
D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing
Associates y Wiley-Interscience (capítulo 3, In
Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; capítulo 6,
Cytokines and their cellular receptors; capítulo 7, Immunologic
studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 77:6091-6095, 1980; Weinberger et
al., Eur. J. Immun. 11:405-411, 1981;
Takai et al., J. Immunol.
137:3494-3500, 1986; Takai et al., J.
Immunol. 140:508-512, 1988.
Una proteína de la presente invención también
puede presentar estimulación inmunitaria o actividad supresora
inmunitaria, incluyendo sin limitación las actividades para las que
se describen los ensayos en la presente memoria. Una proteína puede
ser útil en el tratamiento de varias insuficiencias y trastornos
inmunitarios (incluyendo la inmunoinsuficiencia combinada grave
(SCID)), p. ej., en la regulación (por aumento o disminución) del
crecimiento y en la proliferación de los linfocitos T y/o B, así
como efectuando la actividad citolítica de las células NK y de otras
poblaciones celulares. Estas insuficiencias inmunitarias pueden ser
genéticas o pueden estar causadas por infecciones víricas (p. ej.,
VIH) así como bacterianas o micóticas o pueden proceder de
trastornos autoinmunitarios. Más particularmente, las causas de
enfermedades infecciosas por infección vírica, bacteriana, micótica
u otras pueden tratarse utilizando una proteína de la presente
invención, que comprende las infecciones por VIH, virus de
hepatitis, herpesvirus, micobacterias, Leishmania spp.,
paludismo spp. y varias infecciones micóticas tal como la
candidiasis. Desde luego, a este respecto, puede ser también útil
una proteína de la presente invención en la que generalmente pueda
ser deseable un refuerzo para el sistema inmunitario, es decir, en
el tratamiento del
cáncer.
cáncer.
Los trastornos autoinmunitarios que pueden
tratarse utilizando una proteína de la presente invención
comprenden, por ejemplo, la enfermedad del tejido conectivo,
esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, artritis
reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de
Guillain-Barre, tiroiditis autoinmunitaria, diabetes
mellitus dependiente de insulina, miastemia grave, enfermedad
injerto contra huésped y enfermedad ocular inflamatoria
autoinmunitaria. Dicha proteína de la presente invención puede
también ser útil en el tratamiento de reacciones y afecciones
alérgicas, tales como el asma (particularmente el asma alérgico) u
otros problemas respiratorios. Otras afecciones, en las que se desea
la supresión inmunitaria (incluyendo, por ejemplo, el trasplante de
órganos), pueden también tratarse utilizando una proteína de la
presente invención.
El ADN de MU-1 también
cartografía el locus cromosómico para la enfermedad de Crohn. Como
resultado, pueden utilizarse las proteínas de la presente invención
para tratar la enfermedad de Crohn y otras enfermedades
inflamatorias del intestino.
Utilizando las proteínas de la invención también
puede ser posible regular las respuestas inmunitarias, de numerosas
maneras. La regulación por disminución puede ser en forma de
inhibición o bloqueo de una respuesta inmunitaria ya en evolución o
puede implicar la prevención de la producción de una respuesta
inmunitaria. Las funciones de los linfocitos T activados pueden
inhibirse suprimiendo la respuesta de los linfocitos T o provocando
la tolerancia específica en los linfocitos T o ambas. La
inmunosupresión de las respuestas de los linfocitos T es
generalmente un proceso activo, no específico del antígeno que
requiere la exposición continua de los linfocitos T al agente
supresor. La tolerancia, que implica la inducción no sensible o la
energía en los linfocitos T, es distinguible de la inmunosupresión
que generalmente es específica del antígeno y persiste después que
ha cesado la exposición al agente tolerante. Funcionalmente, puede
demostrarse la tolerancia por la falta de respuesta de los
linfocitos T en la reexposición al antígeno específico en ausencia
del agente tolerante.
La regulación por disminución en la prevención de
una o más funciones del antígeno (incluyendo sin limitación las
funciones de antígeno del linfocito B (tal como, por ejemplo, B7)),
p. ej., impidiendo la síntesis de linfocina en grandes
concentraciones por los linfocitos T activados, será útil en
situaciones de trasplante de tejido, piel y órganos y en la
enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Por ejemplo, el bloqueo
de la función de los linfocitos T debe producir una reducción de la
destrucción del tejido en el trasplante de tejido. Típicamente, en
los trasplantes de tejido, el rechazo del trasplante se inicia
mediante su reconocimiento como extraño por los linfocitos T,
seguido de una reacción inmunitaria que destruye el trasplante. La
administración de una molécula que inhibe o bloquea la interacción
de un antígeno de linfocito B7 con su(s) ligando(s)
natural(es) en las células inmunitarias (tal como una forma
monómera soluble de un péptido con actividad B7-2
solo o junto con una forma monómera de un péptido con actividad de
otro antígeno de linfocitos B (p. ej. B7-1,
B7-3) o anticuerpo de bloqueo), antes del trasplante
puede conducir a la fijación de la molécula al o a los
ligando(s) natural(es) en las células inmunitarias sin
transmitir la correspondiente señal coestimulante. El bloqueo de la
función del antígeno del linfocito B en este material impide la
síntesis de citoquina por las células inmunitarias, tales como los
linfocitos T, y por este motivo actúa como inmunosupresor. Además,
la falta de coestimulación puede también ser suficiente para
energizar los linfocitos T provocando de este modo tolerancia en un
paciente. La producción de tolerancia de larga duración por los
reactivos de bloqueo del antígeno del linfocito B puede evitar la
necesidad de la administración repetida de estos reactivos de
bloqueo. Para conseguir inmunosupresión o tolerancia suficiente en
un paciente, puede ser necesario bloquear la función de una
combinación de antígenos del linfocito B.
La eficacia de determinados reactivos de bloqueo
para impedir el rechazo del trasplante de órganos o la GVHD puede
evaluarse utilizando modelos animales que pronostican la eficacia en
el hombre. Ejemplos de sistemas apropiados que pueden utilizarse
comprenden los trasplantes alogeneicos cardíacos en ratas y los
trasplantes xenogeneicos de células del islote pancreático, los
cuales se han utilizado para examinar los efectos inmunosupresores
de las proteínas de fusión CTLA4Ig in vivo tal como se
describe en Lenschow et al., Science
257:789-792 (1992) y Turka et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105 (1992).
Además, pueden utilizarse modelos murinos de GVHD (véase Paul ed.,
Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs.
846-847) para determinar el efecto de bloqueo de la
función de antígeno de linfocito B in vivo en el desarrollo
de esta enfermedad.
La función de bloqueo del antígeno puede también
ser terapéuticamente útil para el tratamiento de enfermedades
autoinmunitarias. Muchos trastornos autoinmunitarios son el
resultado de la activación inapropiada de los linfocitos T que son
reactivos frente al propio tejido y que estimulan la producción de
citoquinas y autoanticuerpos involucrados en la patología de las
enfermedades. La prevención de la activación de los linfocitos T
autorreactivos puede reducir o eliminar los síntomas de la
enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la
coestimulación de los linfocitos T obstruyendo las interacciones
receptor:ligando de los antígenos del linfocito B puede utilizarse
para inhibir la activación de los linfocitos T y para impedir la
producción de autoanticuerpos o citoquinas derivadas de linfocitos T
que pueden estar implicadas en el proceso patológico. Además, los
reactivos de bloqueo pueden producir tolerancia específica al
antígeno de los linfocitos T autorreactivos que podrían conducir a
un alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de los
reactivos de bloqueo para la prevención o alivio de los trastornos
autoinmunitarios puede determinarse utilizando numerosos modelos
animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunitarias
humanas. Los ejemplos incluyen la encefalitis autoinmunitaria
experimental murina, el lupus eritematoso sistémico en ratones
MRL/lpr /lpr o en ratones híbridos NZB, la artritis del
colágeno autoinmunitaria murina, la diabetes mellitus en ratones NOD
y ratas BB y la miastemia grave (véase Paul ed., Fundamental
Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs.
840-856).
La regulación del aumento de una función del
antígeno (preferentemente una función de antígeno del linfocito B)
como medio de regulación por aumento de respuestas inmunitarias,
también puede ser útil en terapia. La regulación por aumento de las
respuestas inmunitarias puede resultar una forma de aumentar una
respuesta inmunitaria existente o producir una respuesta inmunitaria
inicial. Por ejemplo, el aumento de una respuesta inmunitaria
estimulando la función del antígeno del linfocito B puede ser útil
en los casos de infección vírica. Además, las enfermedades víricas
diseminadas tales como la gripe, el catarro común y la encefalitis
podrían aliviarse mediante la administración de formas estimulantes
de antígenos de linfocito B de forma generalizada.
Como alternativa, las respuestas inmunitarias
antivíricas pueden potenciarse en un paciente infectado eliminando
los linfocitos T del paciente, coestimulando los linfocitos T in
vitro con APC pulsados con antígeno vírico ya sea expresando un
péptido de la presente invención o junto con una fórmula estimulante
y un péptido soluble de la presente invención y reintroduciendo los
linfocitos T activados in vitro en el paciente. Otro método
de potenciar las respuestas inmunitarias antivíricas consistiría en
aislar las células infectadas de un paciente, transfectarlas con un
ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención
tal como se describe en la presente memoria de modo que las células
expresen toda o una parte de la proteína en su superficie y
reintroducir las células transfectadas en el paciente. Las células
infectadas serían ahora capaces de liberar una señal coestimulante,
y por esta razón activar, a los linfocitos T in vivo.
En otra aplicación, la regulación por aumento o
la potenciación de la función del antígeno (preferentemente la
función de antígeno del linfocito B) puede ser útil para la
producción de inmunidad tumoral. Las células tumorales (p. ej.,
sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma)
transfectadas con un ácido nucleico que codifica por lo menos un
péptido de la presente invención pueden administrarse a un paciente
para superar la tolerancia específica al tumor en el paciente. Si se
desea, puede transfectarse la célula tumoral para expresar una
combinación de péptidos. Por ejemplo, las células tumorales
extraídas de un paciente pueden transfectarse ex vivo con un
vector de expresión que dirige la expresión de un péptido que
presenta actividad de tipo B7-2 solo o junto con un
péptido que presenta actividad de tipo B7-1 y/o
actividad de tipo B7-3. Las células tumorales
transfectadas se devuelven a paciente para producir la expresión del
péptido en la superficie de la célula transfectada. Como
alternativa, pueden utilizarse técnicas de terapia génica para
dirigir una célula tumoral para la transfección in vivo.
La presencia del péptido de la presente invención
que tiene la actividad de un o unos antígenos de linfocitos B en la
superficie de la célula tumoral proporciona la señal de
coestimulación necesaria a los linfocitos T para provocar una
respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T contra las células
tumorales transfectadas. Además, las células tumorales que carecen
de moléculas MHC de clase I o MHC de clase II o que no pueden volver
a expresar suficientes cantidades de moléculas MHC de clase I o MHC
de clase II, pueden transfectarse con el ácido nucleico que codifica
toda o una parte (p. ej., de un fragmento truncado del dominio
citoplasmático) de una proteína de la cadena \alpha de MHC de
clase I y la proteína \beta_{2} microglobulina o una proteína de
la cadena \alpha de MHC de clase II y una proteína de la cadena
\beta de MHC de clase II para expresar de este modo las proteínas
MHC de clase I o MHC de clase II en la superficie celular. La
expresión de MHC apropiada de clase I o clase II junto con un
péptido que posee actividad de un antígeno de linfocito B (p. ej.,
B7-1, B7-2 y B7-3)
produce una respuesta inmunitaria mediada por el linfocito T contra
la célula tumoral transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica
un montaje de cadena complementaria que bloquea la expresión de una
proteína asociada a MHC de clase II, tal como la cadena invariable,
puede también transfectarse conjuntamente con un ADN que codifica un
péptido que posee la actividad de un antígeno de linfocito B para
favorecer la presentación de antígenos asociados al tumor y producir
inmunidad tumoral específica. Por lo tanto, la producción de una
respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T en un paciente humano
puede ser suficiente para superar la tolerancia específica tumoral
en el paciente.
La actividad de una proteína de la invención
puede, entre otros medios, medirse mediante los métodos
siguientes:
Los análisis adecuados de citotoxicidad de
timocitos o esplenocitos, incluyen sin limitación, los descritos en:
Current Protocols in Immunology, ed. por J.E. Coligan, A.M.
Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene
Publishing Associates y Wiley-Interscience (capítulo
3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19; capítulo 7, Immunologic studies in
Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.
Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et
al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985;
Takai et al., J. Immunol.
137:3494-3500, 1986; Takai et al., J.
Immunol. 140:508-512, 1988; Herrmann et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.
Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et
al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985;
Takai et al., J. Immunol.
137:3494-350, 1986; Bowmanet et al., J.
Virology 61:1992-1998; Takai et al.,
J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli
et al., Cellular Immunology
133:327-341, 1991; Brown et al., J.
Immunol. 153:3079-3092, 1994.
Los análisis para las respuestas a la
inmunoglobulina dependiente de linfocitos T y el intercambio de
isótopos (que identificarán, entre otros, proteínas que modulan las
respuestas del anticuerpo dependiente del linfocito T y que afectan
los perfiles Th1/Th2) comprenden, sin limitación, los descritos en:
Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990;
y Assays for B cell function: In vitro antibody production,
Mond., J.J. y Brunswick, M. en Current Protocols in
Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol. 1 págs.
3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto,
1994.
Los análisis por reacción de linfocitos mezclados
(MLR) (que identificarán, entre otros, las proteínas que generan
principalmente respuestas a Th 1 y CTL), comprenden, sin limitación,
los descritos en: Current Protocols in Immunology, ed. por J.E.
Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober,
Pub. Greene Publishing Associates y
Wiley-Interscience (capítulo 3, In Vitro
assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19;
capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al.,
J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et
al., J. Immunol. 140:508-512, 1988;
Bertagnolli et al., J. Immunol.
149:3778-3783, 1992.
Los análisis dependientes de las células
dendríticas (que identificarán, entre otros, las proteínas
expresadas por las células dendríticas que activan linfocitos T
naturales activos) comprenden, sin limitación, los descritos en:
Guery et al., J. Immunol. 134:536-544,
1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine
173:549-559; 1991; Macatonia et al.,
Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995;
Porgador et al., Journal of Experimental Medicine
182:255-260, 1995; Nair et al., Journal of
Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et
al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia
et al., Journal of Experimental Medicine
169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al.,
Journal of Clinical Investigation 94:797-807,
1994; e Inaba et al., Journal of Experimental Medicine
172:631-640, 1990.
Los análisis de supervivencia/apoptosis de
linfocitos (que identificarán, entre otros, las proteínas que
impiden la apoptosis después de la producción del superantígeno y
las proteínas que regulan la homeostasis de linfocitos) comprenden,
sin limitación, los descritos en: Darzynkiewicz et al.,
Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et
al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca
et al., Cancer Research 53:1945-1951,
1993; Itoh et al., Cell 66:233-243,
1991; Zacharchuk, Journal of Immunology
145:4037-4045, 1990; Zamai et al.,
Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et
al., International Journal of Oncology
1:639-648, 1992.
Los análisis de proteínas que influyen en las
etapas iniciales de cometido y desarrollo de linfocitos T
comprenden, sin limitación, los descritos en: Antica et al.,
Blood 84:111-117, 1994; Fine et al.,
Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy
et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:7548-7551, 1991.
Una proteína de la presente invención puede ser
útil en la regulación de la hematopoyesis y, por consiguiente, en el
tratamiento de las insuficiencias celulares mieloides y linfoides.
Incluso la actividad biológica marginal en ayuda de las células
formadoras de colonias o de las líneas celulares dependientes del
factor indica la implicación en la regulación de la hematopoyesis,
p. ej. en ayuda del crecimiento y proliferación de las células madre
eritroides solas o en combinación con otras citoquinas, indicando de
este modo utilidad, por ejemplo, en el tratamiento de varias anemias
o para su utilización juntamente con la irradiación/quimioterapia
para estimular la producción de precursores eritroides y/o células
eritroides; en ayuda del crecimiento y proliferación de células
mieloides tales como los granulocitos y monocitos/macrófagos (es
decir, la actividad tradicional de CSF) útiles, por ejemplo, junto
con la quimioterapia para prevenir o tratar la mielosupresión
consiguiente; en ayuda del crecimiento y proliferación de
megacariocitos y por consiguiente de plaquetas permitiendo de este
modo la prevención o tratamiento de varios trastornos de las
plaquetas tales como la trombocitopenia y generalmente para su
utilización en lugar de transfusiones de plaquetas o complementario
a éstas; y/o en ayuda del crecimiento y proliferación de las células
madre hematopoyéticas que son capaces de madurar alguna y todas las
células hematopoyéticas mencionadas anteriormente y por lo tanto
encuentran utilidad terapéutica en varios trastornos de células
madre (tales como los tratados normalmente con trasplante,
incluyendo, sin limitación, anemia aplásica y hemoglobinuria
nocturna paroxísmica), así como en la repoblación del compartimento
de las células madre tras la irradiación/quimioterapia, ya sean
in vivo o ex vivo (es decir, juntamente con el
trasplante de médula ósea o con el trasplante de células madre
periféricas (homólogos o heterólogos)) como células normales o
manipuladas genéticamente para la terapia génica.
La actividad de una proteína de la invención
puede, entre otros medios, medirse por los métodos siguientes:
Los análisis adecuados para la proliferación y
diferenciación de varias líneas hematopoyéticas se citaron
anteriormente.
Los análisis de diferenciación de células madre
embrionarias (que identificarán, entre otras, proteínas que influyen
en la hematopoyesis por diferenciación embrionaria) comprenden, sin
limitación, los descritas en: Johansson et al., Cellular
Biology 15:141-151, 1995; Keller et al.,
Molecular and Cellular Biology 13:473-486,
1993; McClanahan et al., Blood
81:2903-2915, 1993.
Los análisis para la supervivencia y
diferenciación de las células madre (que identificarán, entre otras,
las proteínas que regulan la linfo-hematopoyesis)
comprenden, sin limitación, las descritas en: Methylcellulose colony
forming
assays, Freshney, M.G. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol. págs. 265-268, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potencial, McNiece, L.K. y Briddell, R.A. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol págs. 23-39, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., vol págs. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol págs. 163-1779, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol. págs 139-162, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994.
assays, Freshney, M.G. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol. págs. 265-268, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potencial, McNiece, L.K. y Briddell, R.A. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol págs. 23-39, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., vol págs. 1-21, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. y Allen, T. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol págs. 163-1779, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. En Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney et al., eds. Vol. págs 139-162, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY. 1994.
Los polinucleótidos proporcionados por la
presente invención pueden ser utilizados por la comunidad científica
para varias finalidades. Los polinucleótidos pueden utilizarse para
expresar proteínas recombinantes para análisis, caracterización o
utilización terapéutica. Como marcadores para tejidos en los que la
proteína correspondiente se expresa preferentemente (ya sea de
manera constitutiva o en una etapa determinada de diferenciación o
desarrollo del tejido o en estados patológicos); como marcadores de
peso molecular en geles de Southern; como marcadores o etiquetas de
cromosomas (cuando se marquen) para identificar cromosomas o para
cartografiar posiciones génicas relacionadas; para comparar con las
secuencias de ADN endógeno en los pacientes para identificar
trastornos genéticos potenciales; como sondas para hibridar y
descubrir de este modo nuevas secuencias de ADN relacionadas; como
fuente de información para deducir cebadores de PCR destinados a la
toma de huellas genética; como sonda para "sustraer" secuencias
conocidas en el proceso de descubrir otros polinucleótidos nuevos;
para seleccionar y preparar oligómeros destinados al acoplamiento a
un "chip génico" u otro soporte, incluyendo el examen de
modelos de expresión; para construir anticuerpos
anti-proteína utilizando técnicas de inmunización de
ADN; y como antígeno para construir anticuerpos
anti-ADN o provocar otra respuesta inmunitaria.
Cuando el polinucleótido codifica una proteína que se une o que se
une potencialmente a otra proteína (tal como, por ejemplo, en una
interacción receptor-ligando), el polinucleótido
también puede utilizarse en ensayos de trampa de interacción (tal
como, por ejemplo, el descrito en Gyuris et al., Cell
75:791-803 (1993))para identificar polinucleótidos
que codifican la otra proteína con la que tiene lugar la unión o
para identificar inhibidores de la interacción con la unión.
Las proteínas proporcionadas por la presente
invención pueden utilizarse asimismo en un análisis para determinar
la actividad biológica, incluyendo en un panel de proteínas
múltiples para cribado de alto rendimiento; para construir
anticuerpos o para producir otra respuesta inmunitaria; como
reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en análisis diseñados para
determinar cuantitativamente las concentraciones de la proteína (o
su receptor) en los fluidos biológicos; como marcadores para tejidos
en los que se expresa principalmente la proteína correspondiente (ya
sea constitutivamente o en una etapa determinada de la
diferenciación o desarrollo del tejido o en un estado patológico);
y, desde luego, para aislar receptores o ligandos correlativos.
Cuando la proteína se une o puede unirse a otra proteína (tal como,
por ejemplo, en una interacción receptor-ligando),
la proteína puede utilizarse para identificar otra proteína con la
que se produce la unión o para identificar los inhibidores de la
interacción de la unión. Las proteínas implicadas en estas
interacciones de enlace pueden también utilizarse para identificar
péptidos o pequeñas moléculas de inhibidores o agonistas de la
interacción de enlace.
Alguno o todos estos servicios de la
investigación pueden desarrollarse en calidad de reactivo o en
formato de kit para su comercialización como productos para
investigación.
Los métodos para realizar las utilizaciones
relacionadas anteriormente son bien conocidos por los expertos en la
materia. Las referencias que describen dichos métodos incluyen sin
limitación "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch y T.
Maniatis eds., 1989, y "Methods in Enzymology: Guide to Molecular
Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. y A.R. Kimmel
eds., 1987.
Los polinucleótidos y proteínas de la presente
invención pueden también utilizarse como fuentes o complementos
nutritivos. Dichas utilizaciones incluyen sin limitación la
utilización como complemento de proteínas o aminoácidos, la
utilización como fuente de carbono, la utilización como fuente de
nitrógeno y la utilización como fuente de carbohidratos. En tales
casos la proteína o polinucleótido de la invención puede añadirse al
alimento de un organismo determinado o puede administrarse como una
preparación sólida o líquida por separado, tal como en forma de
polvo, píldoras, soluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de
microorganismos, la proteína o polinucleótido de la invención puede
añadirse en o sobre el medio en el que se cultiva el
microorganismo.
Las proteínas MU-1 de la
invención pueden utilizarse también para inmunizar animales para
obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen
específicamente con la proteína MU-1 y que puedan
inhibir la unión de los ligandos al receptor. Dichos anticuerpos
pueden obtenerse utilizando la MU-1 completa como
inmunógeno o utilizando fragmentos de MU-1. Pueden
utilizarse también fragmentos más pequeños de la
MU-1 para inmunizar animales. Los inmunógenos
peptídicos pueden contener además un resto de cisteína en el
terminal carboxilo y se conjugan con un hapteno tal como la
hemocianina de la lapa californiana (KLH). Pueden generarse
inmunógenos peptídicos adicionales sustituyendo los restos de
tirosina por restos de tirosina sulfatados. Los métodos de síntesis
de dichos péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como en
R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85,
2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky, et al.,
FEBS Lett. 211, 10 (1987).
Los anticuerpos neutralizantes o no
neutralizantes (preferentemente los anticuerpos monoclonales) que se
unen a la proteína MU-1 pueden ser también productos
terapéuticos útiles para determinados tumores y también en el
tratamiento de las enfermedades descritas anteriormente. Estos
anticuerpos monoclonales neutralizantes pueden ser capaces de
bloquear la unión del ligando a la cadena del receptor de
MU-1.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Genetics Institute, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE MU-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Genetics Institute, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 87 Cambridge Park Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOD/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release 1.0, Versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- CONSULTOR/APODERADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Brown, Scott A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.724
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: GI5320-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 617-498-8224
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 617-876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.665 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 538 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "oligonucleótico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTCCGAGG AGAAAGCTGA TCTCA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "oligonucleótico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAAGATGAC CGGGTCACTC CATT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "oligonucleótico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGAGCTA TGAGCTGCAG GTGCGGGCA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc. = "oligonucleótico"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGAGCTA TGAGCTGCAG GTGCGGGCA
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE FILAMENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ser Xaa Trp Ser}
Claims (24)
1. Polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo constituido
por:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1;
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 238 hasta el nucleótido 1852;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 1852;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 945 o desde el nucleótido 238 hasta el nucleótido 945;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que oscila entre la secuencia de la secuencia de nucleótidos especificada en cualquiera de (a) a (d) como resultado de la degeneración del código genético; y
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una especie homóloga de la secuencia de SEC. ID nº: 2, en la que dicha secuencia de nucleótidos codifica una proteína que tiene la actividad biológica de la proteína MU-1 representada por SEC. ID nº: 2 en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o de timocitos.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en
el que la secuencia de nucleótidos puede estar ligada funcionalmente
a una secuencia de control de expresión.
3. Célula huésped transformada con el
polinucleótido según la reivindicación 2.
4. Célula huésped según la reivindicación 3, en
la que dicha célula es una célula de mamífero.
5. Procedimiento para la producción de una
proteína MU-1, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un cultivo de la célula huésped de la reivindicación 3 en un medio de cultivo adecuado; y
- (b)
- purificar la proteína MU-1 procedente del cultivo.
6. Proteína MU-1 aislada que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el
grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 538;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 236;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 1 hasta el 236;
- (e)
- fragmentos de (a) a (d) que tienen la actividad biológica de la proteína MU-1 según (a) a (d) en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o de timocitos; y
- (f)
- una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse en condiciones muy severas de 0,1 \times SSC a 65ºC con la secuencia de nucleótidos especificada en cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a (c) o con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID nº: 1 desde el nucleótido 301 hasta el nucleótido 945.
7. Composición farmacéutica que comprende una
proteína según la reivindicación 6 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
8. Anticuerpo, que reacciona específicamente con
una proteína según la reivindicación 6.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante.
10. Anticuerpo según las reivindicaciones 8 ó 9,
en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
11. Composición que comprende un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
12. Polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el
grupo constituido por:
- (a)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2;
- (b)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 538;
- (c)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 22 hasta el 236;
- (d)
- la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 2 desde el aminoácido 1 hasta el 236; y
- (e)
- fragmentos de (a) a (d) que tienen la actividad biológica del péptido o de la proteína según (a) a (d) en un análisis de la producción de interferón \gamma de ratón o humano y/o de la proliferación de células del bazo, células de los ganglios linfáticos o de timocitos.
13. Proteína según la reivindicación 6, en la que
dicha secuencia de aminoácidos forma parte de una proteína de
fusión.
14. Proteína según la reivindicación 13, en la
que dicha secuencia de aminoácidos está fusionada a un fragmento
Fc.
15. Proteína según la reivindicación 14, en la
que dicha secuencia de aminoácidos está fusionada a dicho fragmento
Fc mediante secuencias enlazadoras.
16. Proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 13 a 15, o anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10 para su utilización en terapia.
17. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
16 para la utilización especificada en la presente memoria, en la
que dicha proteína o anticuerpo está destinada al tratamiento de un
trastorno autoinmunitario, de una reacción o afección alérgica o del
rechazo del trasplante de tejido, piel u órgano o de la enfermedad
injerto contra huésped (GVHD).
18. Utilización de la proteína según cualquiera
de las reivindicaciones 6 ó 13 a 15, o del anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para la preparación de una
composición farmacéutica destinada al tratamiento de un trastorno
autoinmunitario, de una reacción o afección alérgica o del rechazo
del trasplante de tejido, piel u órgano o de la enfermedad injerto
contra huésped (GVHD).
19. Anticuerpo según las reivindicaciones 16 ó
17, para la utilización especificada en la presente memoria, o para
la utilización del anticuerpo según la reivindicación 18, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal neutralizante capaz de
bloquear el enlace del ligando a la cadena del receptor de
MU-1 representada por la SEC. ID. nº: 2.
20. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
17 ó 19 para la utilización especificada en la presente memoria, o
para la utilización de la proteína o del anticuerpo según la
reivindicación 18 ó 19, en la que dicho trastorno autoinmunitario es
uno seleccionado de entre el grupo constituido por enfermedad del
tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico,
artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome
de Guillain-Barré, tiroiditis autoinmunitaria,
diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia grave,
enfermedad injerto contra huésped, enfermedad ocular inflamatoria
autoinmunitaria y enfermedad inflamatoria del intestino,
particularmente la enfermedad de Crohn.
21. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
20, para la utilización especificada en la presente memoria, o para
la utilización de la proteína o del anticuerpo según la
reivindicación 20, en la que dicho trastorno autoinmunitario es la
artritis reumatoide.
22. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
20, para la utilización especificada en la presente memoria, o para
la utilización de la proteína o del anticuerpo según la
reivindicación 20, en la que dicho trastorno autoinmunitario es el
lupus eritematoso sistémico.
23. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
20, para la utilización especificada en la presente memoria, o para
la utilización de la proteína o del anticuerpo según la
reivindicación 20, en la que dicho trastorno autoinmunitario es la
enfermedad inflamatoria del intestino, particularmente la enfermedad
de Crohn.
24. Proteína o anticuerpo según la reivindicación
17 ó 19, para la utilización especificada en la presente memoria, o
para la utilización de la proteína o del anticuerpo según la
reivindicación 18 ó 19, en la que dicha reacción o afección alérgica
es el asma u otro problema respiratorio.
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