JP2003523179A - 哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法 - Google Patents
哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法Info
- Publication number
- JP2003523179A JP2003523179A JP2001538956A JP2001538956A JP2003523179A JP 2003523179 A JP2003523179 A JP 2003523179A JP 2001538956 A JP2001538956 A JP 2001538956A JP 2001538956 A JP2001538956 A JP 2001538956A JP 2003523179 A JP2003523179 A JP 2003523179A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dcrs4
- polypeptide
- sequence
- cells
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 107
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 32
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 title abstract description 87
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 title abstract description 85
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 67
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 165
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 141
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 122
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 120
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 104
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 94
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 91
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 45
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 32
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 5
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 4
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 67
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 23
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 23
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 138
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 82
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 49
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 30
- 241000894007 species Species 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 13
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 11
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 11
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 10
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 7
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 7
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 6
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 5
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 5
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 5
- -1 sequence Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 4
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 4
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- KKTUQAYCCLMNOA-UHFFFAOYSA-N 2,3-diaminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1N KKTUQAYCCLMNOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 102100027367 Cysteine-rich secretory protein 3 Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 101000726258 Homo sapiens Cysteine-rich secretory protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 3
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004551 Interleukin-10 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010017550 Interleukin-10 Receptors Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 101100497639 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CYR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKMMLFOYDTYAGR-UHFFFAOYSA-N 1-phenyl-2-(propan-2-ylamino)pentan-1-one Chemical compound CCCC(NC(C)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 YKMMLFOYDTYAGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical compound CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100325793 Arabidopsis thaliana BCA2 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100455762 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) lysA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100033779 Collagen alpha-4(IV) chain Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 description 1
- 101000988288 Dictyostelium discoideum Protein hssA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100129915 Escherichia coli (strain K12) melB gene Proteins 0.000 description 1
- 241000233756 Fabriciana elisa Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000710870 Homo sapiens Collagen alpha-4(IV) chain Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000845170 Homo sapiens Thymic stromal lymphopoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000004553 Interleukin-11 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017521 Interleukin-11 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710185757 Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102000013967 Monokines Human genes 0.000 description 1
- 108010050619 Monokines Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100004031 Mus musculus Aven gene Proteins 0.000 description 1
- 101100125854 Mus musculus Il18 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000414651 Omosita colon Species 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 description 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 101001062854 Rattus norvegicus Fatty acid-binding protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100289883 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) lys2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000588258 Taenia solium Paramyosin Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100031294 Thymic stromal lymphopoietin Human genes 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 240000001085 Trapa natans Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000005997 bromomethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 1
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000007878 drug screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002458 fetal heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 125000004970 halomethyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000266 injurious effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 201000010260 leiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000005011 phenolic resin Substances 0.000 description 1
- 229920001568 phenolic resin Polymers 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000009919 sequestration Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N thioacetazone Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(\C=N\NC(N)=S)C=C1 SRVJKTDHMYAMHA-WUXMJOGZSA-N 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003245 working effect Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
哺乳動物(例えば、霊長類)のレセプター、精製レセプタータンパク質およびそのフラグメントをコードする核酸。抗体(ポリクローナルおよびモノクローナルの両方)がまた、提供される。診断用途および治療用途の両方のためにこの組成物を使用する方法が、記載される。本発明は、サイトカインレセプターに関連する新規レセプター、例えば、DNAXサイトカインレセプターサブユニット(DCRS)と名付けられた、霊長類のサイトカインレセプター様分子構造、およびそれらの生物学的活性に関する。詳細には、DCRS3(DCRS3.1、およびDCRS3.2と名付けられた2つの実施形態を参照する)ならびにDCRS4(DCRS4.1、DCRS4.2およびDCRS4.3と名付けられた3つの実施形態を参照する)と名付けられたサブユニットの説明を提供する。
Description
【0001】
本出願は、それぞれが本明細書おいて参考として援用される以下の米国特許出
願に対して優先権を主張する:09/443,060(1999年11月18日
出願)、および60/170,320(1999年12月13日出願)。
願に対して優先権を主張する:09/443,060(1999年11月18日
出願)、および60/170,320(1999年12月13日出願)。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、免疫系機能を含む哺乳動物の生理学に作用する組成物および方法に
関連する。詳細には、発生および/または免疫系を調節する方法を提供する。こ
れらの物質の診断用途および治療用途もまた、開示される。
関連する。詳細には、発生および/または免疫系を調節する方法を提供する。こ
れらの物質の診断用途および治療用途もまた、開示される。
【0003】
(発明の背景)
組み換えDNA技術は、一般に、例えば宿主中への導入を介する、連続したプ
ロセシングのためにドナー供給源からベクター中へ組み込む遺伝子情報の技術に
関連し、これにより、移された遺伝情報は、新しい環境中で複製および/または
発現される。通常、遺伝情報は、所望のタンパク質産物をコードするメッセンジ
ャーRNA(mRNA)から誘導される相補的鎖DNA(cDNA)の形態で存
在する。キャリアは、しばしば宿主中での後の複製のためのcDNAを組み込む
能力を持ち、いくつかの場合では、実際にcDNAの発現を制御し、そしてそれ
により、宿主中でコードされる産物の合成を指示する能力を持つプラスミドであ
る。例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻,CSH
Press,NYを参照のこと。
ロセシングのためにドナー供給源からベクター中へ組み込む遺伝子情報の技術に
関連し、これにより、移された遺伝情報は、新しい環境中で複製および/または
発現される。通常、遺伝情報は、所望のタンパク質産物をコードするメッセンジ
ャーRNA(mRNA)から誘導される相補的鎖DNA(cDNA)の形態で存
在する。キャリアは、しばしば宿主中での後の複製のためのcDNAを組み込む
能力を持ち、いくつかの場合では、実際にcDNAの発現を制御し、そしてそれ
により、宿主中でコードされる産物の合成を指示する能力を持つプラスミドであ
る。例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻,CSH
Press,NYを参照のこと。
【0004】
先般来、哺乳動物の免疫応答が、「免疫ネットワーク」と呼ばれる一連の複雑
な細胞の相互作用に基づくことが公知である。近年の報告では、このネットワー
クの内部の作用について新しい洞察を提供している。多くの免疫応答が、事実、
リンパ球、マクロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様相互作用
の周辺を動くことは、依然として明確であるが、現在、免疫学者は、可溶性タン
パク質(リンホカイン、サイトカイン、または、モノカインとして公知)が、こ
れらの細胞の相互作用の制御において重要な役割を果たすという考えを一般的に
有する。従って、注目すべき興味は、細胞調節因子の単離、特徴付け、および作
用機構中にあり、この理解は、多くの医学的異常(例えば、免疫系の障害)の診
断および治療に有意な進歩性をもたらす。
な細胞の相互作用に基づくことが公知である。近年の報告では、このネットワー
クの内部の作用について新しい洞察を提供している。多くの免疫応答が、事実、
リンパ球、マクロファージ、顆粒球、および他の細胞のネットワーク様相互作用
の周辺を動くことは、依然として明確であるが、現在、免疫学者は、可溶性タン
パク質(リンホカイン、サイトカイン、または、モノカインとして公知)が、こ
れらの細胞の相互作用の制御において重要な役割を果たすという考えを一般的に
有する。従って、注目すべき興味は、細胞調節因子の単離、特徴付け、および作
用機構中にあり、この理解は、多くの医学的異常(例えば、免疫系の障害)の診
断および治療に有意な進歩性をもたらす。
【0005】
リンホカインは、種々の方法で細胞の活性を明白に媒介する。例えば、Pau
l(1996編)Fundamental Immunology 第3版,R
aven Press,New York;およびThomson(1994編
)The Cytokine Handbook 第2版,Academic
Press,San Diegoを参照のこと。彼らは、膨大な数の前駆体(複
雑な免疫系を構成する種々の細胞系列を含む)への多能性の造血幹細胞の増殖、
成長、および/または分化を補助することを示している。正確で均衡のとれた細
胞の構成成分間の相互作用は、健常な免疫応答のために必要である。異なる細胞
系列は、リンホカインが他の試薬とともに投与される場合、しばしば異なる様式
で応答する。
l(1996編)Fundamental Immunology 第3版,R
aven Press,New York;およびThomson(1994編
)The Cytokine Handbook 第2版,Academic
Press,San Diegoを参照のこと。彼らは、膨大な数の前駆体(複
雑な免疫系を構成する種々の細胞系列を含む)への多能性の造血幹細胞の増殖、
成長、および/または分化を補助することを示している。正確で均衡のとれた細
胞の構成成分間の相互作用は、健常な免疫応答のために必要である。異なる細胞
系列は、リンホカインが他の試薬とともに投与される場合、しばしば異なる様式
で応答する。
【0006】
免疫応答に対して特に重要な細胞系列は、リンパ球の以下の2つのクラスを含
む:イムノグロブリン(外来物質を除去するために、外来物質を認識し、結合す
る能力を有するタンパク質)を産生および分泌し得るB細胞、およびリンホカイ
ンを分泌し、そして免疫ネットワークを構成するB細胞および種々の他の細胞(
他のT細胞を含む)を誘導または抑制する種々のサブセットのT細胞。これらの
リンパ球は、他の多くの細胞型と相互作用する。
む:イムノグロブリン(外来物質を除去するために、外来物質を認識し、結合す
る能力を有するタンパク質)を産生および分泌し得るB細胞、およびリンホカイ
ンを分泌し、そして免疫ネットワークを構成するB細胞および種々の他の細胞(
他のT細胞を含む)を誘導または抑制する種々のサブセットのT細胞。これらの
リンパ球は、他の多くの細胞型と相互作用する。
【0007】
種々の免疫障害をより良く理解および処置するための研究は、一般にインビト
ロでの免疫系の細胞を維持することができないため、妨げられてきた。免疫学者
は、多くのこれらの細胞を培養することが、T細胞および他の細胞の上清(種々
の増殖因子(多くのリンホカインを含む)を含む上清)の使用を通して達成され
得ることを発見している。
ロでの免疫系の細胞を維持することができないため、妨げられてきた。免疫学者
は、多くのこれらの細胞を培養することが、T細胞および他の細胞の上清(種々
の増殖因子(多くのリンホカインを含む)を含む上清)の使用を通して達成され
得ることを発見している。
【0008】
形態形成の発生を調節する種々の増殖および調節因子が存在する。サイトカイ
ンに対する多くのレセプターは公知である。しばしば、少なくとも2つの重要な
サブユニットが機能的なレセプターに存在する。例えば、GondaおよびD’
Andrea(1997)Blood 89:355−369;Preskyら
(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93:140
02−14007;DrachmanおよびKaushansky(1995)
Curr.Opin.Hematol.2:22−28;Theze(1994
)Eur.Cytokine Netw.5:353−368;およびLemm
onおよびSchlessinger(1994)Trends Bioche
m.Sci.19:459−463を参照のこと。
ンに対する多くのレセプターは公知である。しばしば、少なくとも2つの重要な
サブユニットが機能的なレセプターに存在する。例えば、GondaおよびD’
Andrea(1997)Blood 89:355−369;Preskyら
(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93:140
02−14007;DrachmanおよびKaushansky(1995)
Curr.Opin.Hematol.2:22−28;Theze(1994
)Eur.Cytokine Netw.5:353−368;およびLemm
onおよびSchlessinger(1994)Trends Bioche
m.Sci.19:459−463を参照のこと。
【0009】
前述から、新しいレセプター(リンホカインに対する公知のレセプターに類似
のレセプターを含む)の発見および開発が、新しい治療に寄与するはずであるこ
とが明らかである。詳細には、リンホカイン様の分子に対する新規のレセプター
(他のリンホカインの有益な活性を増強または可能にする分子)の発見および理
解は、非常に有利である。本発明は、サイトカイン様の組成物および関連した化
合物への類似性を示すリガンドに対する新規レセプター、ならびにそれらの使用
の方法を提供する。
のレセプターを含む)の発見および開発が、新しい治療に寄与するはずであるこ
とが明らかである。詳細には、リンホカイン様の分子に対する新規のレセプター
(他のリンホカインの有益な活性を増強または可能にする分子)の発見および理
解は、非常に有利である。本発明は、サイトカイン様の組成物および関連した化
合物への類似性を示すリガンドに対する新規レセプター、ならびにそれらの使用
の方法を提供する。
【0010】
(発明の要旨)
本発明は、サイトカインレセプターに関連する新規レセプター、例えば、DN
AXサイトカインレセプターサブユニット(DCRS)と名付けられた、霊長類
のサイトカインレセプター様分子構造、およびそれらの生物学的活性に関する。
詳細には、DCRS3(DCRS3.1、およびDCRS3.2と名付けられた
2つの実施形態を参照する)ならびにDCRS4(DCRS4.1、DCRS4
.2およびDCRS4.3と名付けられた3つの実施形態を参照する)と名付け
られたサブユニットの説明を提供する。本発明は、このポリペプチド自体をコー
ドする核酸、ならびにこれらの生成および使用のための方法を含む。本発明の核
酸は、特徴付けられ、部分的に、これは本明細書中で包含されるクローニングさ
れた相補鎖DNA(cDNA)配列に対するこれらの相同性による。
AXサイトカインレセプターサブユニット(DCRS)と名付けられた、霊長類
のサイトカインレセプター様分子構造、およびそれらの生物学的活性に関する。
詳細には、DCRS3(DCRS3.1、およびDCRS3.2と名付けられた
2つの実施形態を参照する)ならびにDCRS4(DCRS4.1、DCRS4
.2およびDCRS4.3と名付けられた3つの実施形態を参照する)と名付け
られたサブユニットの説明を提供する。本発明は、このポリペプチド自体をコー
ドする核酸、ならびにこれらの生成および使用のための方法を含む。本発明の核
酸は、特徴付けられ、部分的に、これは本明細書中で包含されるクローニングさ
れた相補鎖DNA(cDNA)配列に対するこれらの相同性による。
【0011】
本発明は、以下より選択される物質の組成物を提供する:実質的に純粋または
組み換え体のDCRS3ポリペプチド(配列番号2または配列番号25のセグメ
ントに対して同一な少なくとも4アミノ酸の少なくとも3つの異なる非重複セグ
メントを含む);実質的に純粋または組み換え体のDCRS3ポリペプチド(配
列番号2または配列番号25のセグメントに対して同一な少なくとも5アミノ酸
の少なくとも2つの異なる非重複セグメントを含む);天然配列のDCRS3(
成熟配列番号2または配列番号25を含む);融合ポリペプチド(DCRS3の
配列を含む);またはDCRS4ポリペプチド(配列番号5、配列番号28、ま
たは配列番号31のセグメントに対して同一な少なくとも4アミノ酸の少なくと
も3つの異なる非重複セグメントを含む);実質的に純粋または組み換え体のD
CRS4ポリペプチド(配列番号5、配列番号28、または配列番号31のセグ
メントに対して同一な少なくとも5アミノ酸の少なくとも2つの異なる非重複セ
グメントを含む);天然配列のDCRS4(成熟配列番号5、配列番号28、ま
たは配列番号31を含む);あるいは融合ポリペプチド(DCRS4の配列を含
む)。特定の実施形態において、本発明は、このような実質的に純粋または単離
された抗原性のDCRS3もしくはDCRS4ポリペプチドを包含し、ここで、
同一性である異なる非重複セグメントは:少なくとも8アミノ酸である1つのセ
グメントを含むか;少なくとも4アミノ酸である1つのセグメントおよび少なく
とも5アミノ酸である第2のセグメントを含む;少なくとも4アミノ酸、5アミ
ノ酸、および6アミノ酸である少なくとも3つのセグメントを含むか、または少
なくとも12アミノ酸である1つのセグメントを含む。他の実施形態としては、
ここで、以下のことが挙げられる:DCRS3ポリペプチド(表1の成熟配列を
含む)が、DCRS3の非グリコシル化形態であるか;霊長類(例えば、ヒト)
由来であるか;配列番号2または配列番号25の少なくとも17アミノ酸を含む
か;配列番号2または配列番号25の少なくとも7アミノ酸である少なくとも4
つの非重複のセグメントを示すか;エキソン境界をまたぐそれぞれの端上の少な
くとも3アミノ酸の配列を含むか;DCRS3の天然の対立遺伝子の改変体であ
るか;少なくとも約30アミノ酸長を有するか;霊長類のDCRS3に対して特
異的である少なくとも2つの非重複エピトープを示すか;グリコシル化されるか
;天然のグリコシル化をともなう少なくとも30kDの分子量を有するか;合成
ポリペプチドであるか;固体基材に接着されるか;別の化学部分に結合されるか
;天然配列より5個以下の置換であるか;または、天然の配列由来の欠失もしく
は挿入改変体であり;あるいは、DCRS4ポリペプチド(表3の成熟配列を含
む)が、DCRS4の非グリコシル化形態であるか;霊長類(例えば、ヒト)由
来であるか;配列番号5の少なくとも17アミノ酸を含むか;配列番号5、配列
番号28、または配列番号31の少なくとも7アミノ酸である少なくとも4つの
非重複のセグメントを示すか;エキソン境界をまたぐそれぞれの端上の少なくと
も3アミノ酸の配列を含むか;DCRS5の天然の対立遺伝子の改変体であるか
;少なくとも約30アミノ酸長を有するか;霊長類のDCRS5に対して特異的
である少なくとも2つの非重複エピトープを示すか;グリコシル化されるか;天
然のグリコシル化をともなう少なくとも30kDの分子量を有するか;合成ポリ
ペプチドであるか;固体基材に接着されるか;別の化学部分に結合されるか;天
然配列より5個以下の置換であるか;または、天然の配列由来の欠失もしくは挿
入改変体である。なお他の実施形態としては、以下を含む組成物が挙げられる:
実質的に純粋なDCRS3および別のサイトカインレセプターファミリーのメン
バー;滅菌DCRS3ポリペプチド;DCRS3ポリペプチドおよびキャリア(
ここで、このキャリアは、水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性
の化合物であり;そして/または経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、も
しくは非経口投与のために処方される);実質的に純粋なDCRS4および別の
サイトカインレセプターファミリーのメンバー;滅菌DCRS4ポリペプチド;
DCRS4ポリペプチドおよびキャリア(ここで、このキャリアは、水、生理食
塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性の化合物であり;そして/または経口
投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、もしくは非経口投与のために処方される
)。融合ポリペプチドの実施形態としては、以下を含む融合タンパク質が挙げら
れる:表1または表3の成熟タンパク質の配列;検出タグまたは精製タグ(FL
AG配列、His6配列、もしくはIgの配列を含む);あるいは別のインター
フェロンレセプタータンパク質の配列。キット実施形態としては、以下を含むキ
ットが挙げられる:このようなポリペプチド、および、このタンパク質もしくは
ポリペプチドを含む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のため
の指示書。
組み換え体のDCRS3ポリペプチド(配列番号2または配列番号25のセグメ
ントに対して同一な少なくとも4アミノ酸の少なくとも3つの異なる非重複セグ
メントを含む);実質的に純粋または組み換え体のDCRS3ポリペプチド(配
列番号2または配列番号25のセグメントに対して同一な少なくとも5アミノ酸
の少なくとも2つの異なる非重複セグメントを含む);天然配列のDCRS3(
成熟配列番号2または配列番号25を含む);融合ポリペプチド(DCRS3の
配列を含む);またはDCRS4ポリペプチド(配列番号5、配列番号28、ま
たは配列番号31のセグメントに対して同一な少なくとも4アミノ酸の少なくと
も3つの異なる非重複セグメントを含む);実質的に純粋または組み換え体のD
CRS4ポリペプチド(配列番号5、配列番号28、または配列番号31のセグ
メントに対して同一な少なくとも5アミノ酸の少なくとも2つの異なる非重複セ
グメントを含む);天然配列のDCRS4(成熟配列番号5、配列番号28、ま
たは配列番号31を含む);あるいは融合ポリペプチド(DCRS4の配列を含
む)。特定の実施形態において、本発明は、このような実質的に純粋または単離
された抗原性のDCRS3もしくはDCRS4ポリペプチドを包含し、ここで、
同一性である異なる非重複セグメントは:少なくとも8アミノ酸である1つのセ
グメントを含むか;少なくとも4アミノ酸である1つのセグメントおよび少なく
とも5アミノ酸である第2のセグメントを含む;少なくとも4アミノ酸、5アミ
ノ酸、および6アミノ酸である少なくとも3つのセグメントを含むか、または少
なくとも12アミノ酸である1つのセグメントを含む。他の実施形態としては、
ここで、以下のことが挙げられる:DCRS3ポリペプチド(表1の成熟配列を
含む)が、DCRS3の非グリコシル化形態であるか;霊長類(例えば、ヒト)
由来であるか;配列番号2または配列番号25の少なくとも17アミノ酸を含む
か;配列番号2または配列番号25の少なくとも7アミノ酸である少なくとも4
つの非重複のセグメントを示すか;エキソン境界をまたぐそれぞれの端上の少な
くとも3アミノ酸の配列を含むか;DCRS3の天然の対立遺伝子の改変体であ
るか;少なくとも約30アミノ酸長を有するか;霊長類のDCRS3に対して特
異的である少なくとも2つの非重複エピトープを示すか;グリコシル化されるか
;天然のグリコシル化をともなう少なくとも30kDの分子量を有するか;合成
ポリペプチドであるか;固体基材に接着されるか;別の化学部分に結合されるか
;天然配列より5個以下の置換であるか;または、天然の配列由来の欠失もしく
は挿入改変体であり;あるいは、DCRS4ポリペプチド(表3の成熟配列を含
む)が、DCRS4の非グリコシル化形態であるか;霊長類(例えば、ヒト)由
来であるか;配列番号5の少なくとも17アミノ酸を含むか;配列番号5、配列
番号28、または配列番号31の少なくとも7アミノ酸である少なくとも4つの
非重複のセグメントを示すか;エキソン境界をまたぐそれぞれの端上の少なくと
も3アミノ酸の配列を含むか;DCRS5の天然の対立遺伝子の改変体であるか
;少なくとも約30アミノ酸長を有するか;霊長類のDCRS5に対して特異的
である少なくとも2つの非重複エピトープを示すか;グリコシル化されるか;天
然のグリコシル化をともなう少なくとも30kDの分子量を有するか;合成ポリ
ペプチドであるか;固体基材に接着されるか;別の化学部分に結合されるか;天
然配列より5個以下の置換であるか;または、天然の配列由来の欠失もしくは挿
入改変体である。なお他の実施形態としては、以下を含む組成物が挙げられる:
実質的に純粋なDCRS3および別のサイトカインレセプターファミリーのメン
バー;滅菌DCRS3ポリペプチド;DCRS3ポリペプチドおよびキャリア(
ここで、このキャリアは、水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性
の化合物であり;そして/または経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、も
しくは非経口投与のために処方される);実質的に純粋なDCRS4および別の
サイトカインレセプターファミリーのメンバー;滅菌DCRS4ポリペプチド;
DCRS4ポリペプチドおよびキャリア(ここで、このキャリアは、水、生理食
塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性の化合物であり;そして/または経口
投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、もしくは非経口投与のために処方される
)。融合ポリペプチドの実施形態としては、以下を含む融合タンパク質が挙げら
れる:表1または表3の成熟タンパク質の配列;検出タグまたは精製タグ(FL
AG配列、His6配列、もしくはIgの配列を含む);あるいは別のインター
フェロンレセプタータンパク質の配列。キット実施形態としては、以下を含むキ
ットが挙げられる:このようなポリペプチド、および、このタンパク質もしくは
ポリペプチドを含む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のため
の指示書。
【0012】
結合化合物の実施形態は、以下を含む:例えば、天然のDCRS3ポリペプチ
ドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を含む結合化合物、ここで、こ
の結合化合物は、容器中に存在するか;DCRS3ポリペプチドは、ヒト由来で
あるか;この結合化合物は、Fv、Fab、もしくはFab2フラグメントであ
るか;この結合化合物は、別の化学部分に結合するか、または抗体は、表1の成
熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか;成熟DCRS3に対して
惹起されるか;精製されたヒトDCRS3に対して惹起されるか;免疫選択され
るか;ポリクローナル抗体であるか;変性したDCRS3に結合するか;少なく
とも30μMの抗原に対するKdを示すか;固体基材(ビーズもしくはプラスチ
ック膜を含む)に接着される;滅菌組成物中に存在するか;または、検出可能に
標識され(放射性標識もしくは蛍光標識を含む);あるいは天然のDCRS4ポ
リペプチドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を含む結合化合物:こ
こで、この結合化合物は、容器中に存在するか;DCRS4ポリペプチドは、ヒ
ト由来である;この結合化合物は、Fv、Fab、もしくはFab2フラグメン
トであるか;この結合化合物は、別の化学部分に結合するか;または抗体は、表
3の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか;成熟DCRS4に
対して惹起されるか;精製されたヒトDCRS4に対して惹起されるか;免疫選
択されるか;ポリクローナル抗体であるか;変性したDCRS4に結合するか;
少なくとも30μMの抗原に対するKdを示すか;固体基材(ビーズもしくはプ
ラスチック膜を含む)に接着されるか;滅菌組成物中に存在するか;または、検
出可能に標識される(放射性標識もしくは蛍光標識を含む)。キットとしては、
以下を含むキットが挙げられる:この結合化合物、および、この結合化合物を含
む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための指示書。
ドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を含む結合化合物、ここで、こ
の結合化合物は、容器中に存在するか;DCRS3ポリペプチドは、ヒト由来で
あるか;この結合化合物は、Fv、Fab、もしくはFab2フラグメントであ
るか;この結合化合物は、別の化学部分に結合するか、または抗体は、表1の成
熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか;成熟DCRS3に対して
惹起されるか;精製されたヒトDCRS3に対して惹起されるか;免疫選択され
るか;ポリクローナル抗体であるか;変性したDCRS3に結合するか;少なく
とも30μMの抗原に対するKdを示すか;固体基材(ビーズもしくはプラスチ
ック膜を含む)に接着される;滅菌組成物中に存在するか;または、検出可能に
標識され(放射性標識もしくは蛍光標識を含む);あるいは天然のDCRS4ポ
リペプチドに特異的に結合する、抗体由来の抗原結合部位を含む結合化合物:こ
こで、この結合化合物は、容器中に存在するか;DCRS4ポリペプチドは、ヒ
ト由来である;この結合化合物は、Fv、Fab、もしくはFab2フラグメン
トであるか;この結合化合物は、別の化学部分に結合するか;または抗体は、表
3の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか;成熟DCRS4に
対して惹起されるか;精製されたヒトDCRS4に対して惹起されるか;免疫選
択されるか;ポリクローナル抗体であるか;変性したDCRS4に結合するか;
少なくとも30μMの抗原に対するKdを示すか;固体基材(ビーズもしくはプ
ラスチック膜を含む)に接着されるか;滅菌組成物中に存在するか;または、検
出可能に標識される(放射性標識もしくは蛍光標識を含む)。キットとしては、
以下を含むキットが挙げられる:この結合化合物、および、この結合化合物を含
む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための指示書。
【0013】
例えば、抗原:抗体複合体を産生するための以下の方法が提供される:適切な
条件下で記載される抗体と霊長類のDCRS3ポリペプチドを接触させ、これに
より、この複合体を形成することを可能にする工程;または、所望の抗体と霊長
類のDCRS4ポリペプチドを接触させ、これにより、この複合体を形成するこ
とを可能にする工程を包含する方法。これは、ここで、以下を含む:この複合体
が他のサイトカインレセプターから精製されることか;この複合体が他の抗体か
ら精製されるか;この接触が、別のサイトカインを含むサンプルとであることか
;この接触がこの抗原の定量的検出を可能にすることか;この接触が抗体を含む
サンプルとであることか;または、この接触が抗体の定量的検出を可能にするこ
と。
条件下で記載される抗体と霊長類のDCRS3ポリペプチドを接触させ、これに
より、この複合体を形成することを可能にする工程;または、所望の抗体と霊長
類のDCRS4ポリペプチドを接触させ、これにより、この複合体を形成するこ
とを可能にする工程を包含する方法。これは、ここで、以下を含む:この複合体
が他のサイトカインレセプターから精製されることか;この複合体が他の抗体か
ら精製されるか;この接触が、別のサイトカインを含むサンプルとであることか
;この接触がこの抗原の定量的検出を可能にすることか;この接触が抗体を含む
サンプルとであることか;または、この接触が抗体の定量的検出を可能にするこ
と。
【0014】
種々の関連する組成物が、提供される。例えば、組成物は以下を含む:記載さ
れるような滅菌結合化合物、または記載される結合化合物およびキャリアであっ
て、ここで、このキャリアは水溶性化合物(水、生理食塩水、および/もしくは
緩衝液を含む)であるか;および/または経口、直腸、鼻腔、局所、もしくは非
経口投与のために処方される。
れるような滅菌結合化合物、または記載される結合化合物およびキャリアであっ
て、ここで、このキャリアは水溶性化合物(水、生理食塩水、および/もしくは
緩衝液を含む)であるか;および/または経口、直腸、鼻腔、局所、もしくは非
経口投与のために処方される。
【0015】
核酸の実施形態としては、以下が挙げられる:例えば、DCRS3ポリペプチ
ドをコードする単離された核酸もしくは組み換え核酸であって、ここで、DCR
S3は、ヒト由来であるか;またはこの核酸は、表1の抗原性ペプチド配列をコ
ードするか;表1の抗原性ペプチド配列を複数コードするか;このセグメントを
コードする天然cDNAに対して少なくとも13ヌクレオチドにわたって同一性
を示すか;発現ベクターであるか;さらに、複製起点を含むか;天然供給源由来
であるか;検出可能な標識を含むか;合成的ヌクレオチド配列を含むか;6kb
未満、好ましくは、3kb未満であるか;霊長類由来であるか;天然の全長コー
ド配列を含むか;DCRS3をコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーショ
ンプローブであるか;またはPCRプライマー、PCR産物、もしくは変異誘発
プライマーであり;あるいは、DCRS4ポリペプチドをコードする単離された
核酸もしくは組み換え核酸であって、ここで、DCRS4は、ヒト由来であるか
;またはこの核酸は、表3の抗原性ペプチド配列をコードするか;表3の抗原性
ペプチド配列を複数コードするか;このセグメントをコードする天然cDNAに
対して少なくとも13ヌクレオチドにわたって同一性を示すか;発現ベクターで
あるか;さらに、複製起点を含むか;天然供給源由来であるか;検出可能な標識
を含むか;合成的ヌクレオチド配列を含むか;6kb未満、好ましくは、3kb
未満であるか;霊長類由来であるか;天然の全長コード配列を含むか;DCRS
4をコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブであるか;また
はPCRプライマー、PCR産物、もしくは変異誘発プライマーである。本発明
の他の実施形態は、記載される組み換え核酸を含む細胞または組織を包含する。
好ましくは、この細胞は、:原核生物細胞;真核生物細胞;細菌細胞;酵母細胞
;昆虫細胞;哺乳動物細胞;マウス細胞;霊長類細胞;またはヒト細胞である。
ドをコードする単離された核酸もしくは組み換え核酸であって、ここで、DCR
S3は、ヒト由来であるか;またはこの核酸は、表1の抗原性ペプチド配列をコ
ードするか;表1の抗原性ペプチド配列を複数コードするか;このセグメントを
コードする天然cDNAに対して少なくとも13ヌクレオチドにわたって同一性
を示すか;発現ベクターであるか;さらに、複製起点を含むか;天然供給源由来
であるか;検出可能な標識を含むか;合成的ヌクレオチド配列を含むか;6kb
未満、好ましくは、3kb未満であるか;霊長類由来であるか;天然の全長コー
ド配列を含むか;DCRS3をコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーショ
ンプローブであるか;またはPCRプライマー、PCR産物、もしくは変異誘発
プライマーであり;あるいは、DCRS4ポリペプチドをコードする単離された
核酸もしくは組み換え核酸であって、ここで、DCRS4は、ヒト由来であるか
;またはこの核酸は、表3の抗原性ペプチド配列をコードするか;表3の抗原性
ペプチド配列を複数コードするか;このセグメントをコードする天然cDNAに
対して少なくとも13ヌクレオチドにわたって同一性を示すか;発現ベクターで
あるか;さらに、複製起点を含むか;天然供給源由来であるか;検出可能な標識
を含むか;合成的ヌクレオチド配列を含むか;6kb未満、好ましくは、3kb
未満であるか;霊長類由来であるか;天然の全長コード配列を含むか;DCRS
4をコードする遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブであるか;また
はPCRプライマー、PCR産物、もしくは変異誘発プライマーである。本発明
の他の実施形態は、記載される組み換え核酸を含む細胞または組織を包含する。
好ましくは、この細胞は、:原核生物細胞;真核生物細胞;細菌細胞;酵母細胞
;昆虫細胞;哺乳動物細胞;マウス細胞;霊長類細胞;またはヒト細胞である。
【0016】
キットの実施形態としては、以下を含むキットが挙げられる:記載される核酸
、およびこの核酸を含む区画;霊長類のDCRS3またはDCRS4ポリペプチ
ドをさらに含む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための指
示書。
、およびこの核酸を含む区画;霊長類のDCRS3またはDCRS4ポリペプチ
ドをさらに含む区画;またはこのキット中の試薬の使用もしくは廃棄のための指
示書。
【0017】
別の核酸の実施形態としては、以下の核酸が挙げられる:30℃で30分間か
つ2M未満の塩での洗浄条件下で、配列番号1、配列番号24、配列番号4,配
列番号27または配列番号30のコード部分に対してハイブリダイズする核酸;
または、霊長類のDCRS3もしくはDCRS4に対して少なくとも約30ヌク
レオチドのストレッチにわたって同一性を提示する核酸。好ましい実施形態とし
ては、ここで、以下が挙げられる:洗浄条件が、45℃および/または500m
Mの塩であるか;洗浄条件が、55℃および/または150mMの塩であるか;
ストレッチが、少なくとも55ヌクレオチドであるか;あるいはストレッチが少
なくとも75ヌクレオチドである。
つ2M未満の塩での洗浄条件下で、配列番号1、配列番号24、配列番号4,配
列番号27または配列番号30のコード部分に対してハイブリダイズする核酸;
または、霊長類のDCRS3もしくはDCRS4に対して少なくとも約30ヌク
レオチドのストレッチにわたって同一性を提示する核酸。好ましい実施形態とし
ては、ここで、以下が挙げられる:洗浄条件が、45℃および/または500m
Mの塩であるか;洗浄条件が、55℃および/または150mMの塩であるか;
ストレッチが、少なくとも55ヌクレオチドであるか;あるいはストレッチが少
なくとも75ヌクレオチドである。
【0018】
他の方法としては、細胞または組織培養細胞の生理機能または発生を調節する
方法(哺乳動物のDCRS3またはDCRS4のアゴニストまたはアンタゴニス
トと細胞を接触させる工程を含む)が挙げられる。好ましくは、この細胞は、D
CRS3またはDCRS4および別のサイトカインレセプターのサブユニットを
コードする核酸を用いて形質転換される。
方法(哺乳動物のDCRS3またはDCRS4のアゴニストまたはアンタゴニス
トと細胞を接触させる工程を含む)が挙げられる。好ましくは、この細胞は、D
CRS3またはDCRS4および別のサイトカインレセプターのサブユニットを
コードする核酸を用いて形質転換される。
【0019】
(好ましい実施形態の詳細な説明)
(概要)
I.一般
II.活性
III.核酸
A.コードしているフラグメント、配列、プローブ
B.変異、キメラ、融合
C.核酸の作製
D.細胞が含有するベクター
IV.タンパク質、ペプチド
A.フラグメント、配列、免疫原、抗原
B.ムテイン
C.アゴニスト/アンタゴニスト、機能的等価物
D.タンパク質の作製
V.核酸、タンパク質の作製
A.合成
B.組換え
C.天然供給源
VI.抗体
A.ポリクローナル
B.モノクローナル
C.フラグメント;Kd
D.抗イディオタイプ抗体
E.ハイブリドーマ細胞株
VII.DCRSを定量するためのキットおよび方法
A.ELISA
B.コードしているmRNAのアッセイ
C.定性的/定量的
D.キット
VIII.治療的組成物および方法
A.組み合わせ組成物
B.単位用量
C.投与
IX.スクリーニング
X.リガンド。
【0020】
(I.一般)
本発明は、アミノ酸配列および哺乳動物(本明細書中では霊長類)のDNA配
列、サイトカインレセプター様サブユニット分子(これは、特定の規定された特
性(構造的および生物学的の両方)を有するDNAXサイトカインレセプターサ
ブユニット3(DCRS3;50R)およびDNAXサイトカインレセプターサ
ブユニット4(DCRS4;cytor)と命名された)を提供する。これらの
分子をコードする種々のcDNAは、霊長類(例えば、ヒト)のcDNA配列ラ
イブラリーから得られた。他の霊長類または他の哺乳動物相当物もまた所望され
る。
列、サイトカインレセプター様サブユニット分子(これは、特定の規定された特
性(構造的および生物学的の両方)を有するDNAXサイトカインレセプターサ
ブユニット3(DCRS3;50R)およびDNAXサイトカインレセプターサ
ブユニット4(DCRS4;cytor)と命名された)を提供する。これらの
分子をコードする種々のcDNAは、霊長類(例えば、ヒト)のcDNA配列ラ
イブラリーから得られた。他の霊長類または他の哺乳動物相当物もまた所望され
る。
【0021】
適用可能ないくつかの標準的な方法は、例えば、Maniatisら(198
2)Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor Press;Sambrookら(198
9)Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,(第二版),1〜3巻、CSH Press,NY;Ausubelら
,Biology,Greene Publishing Associate
s,Brooklyn,NY;またはAusubelら(1987および定期的
な補遺)Current Protocols in Molecular B
iology,Greene/Wiley,New York(これらの各々は
、本明細書中で参考として援用される)に記載されるかまたはこれらにおいて引
用される。
2)Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory,Co
ld Spring Harbor Press;Sambrookら(198
9)Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,(第二版),1〜3巻、CSH Press,NY;Ausubelら
,Biology,Greene Publishing Associate
s,Brooklyn,NY;またはAusubelら(1987および定期的
な補遺)Current Protocols in Molecular B
iology,Greene/Wiley,New York(これらの各々は
、本明細書中で参考として援用される)に記載されるかまたはこれらにおいて引
用される。
【0022】
ヒトDCRS3をコードするセグメントのヌクレオチド(配列番号1)および
対応するアミノ酸配列(配列番号2)が表1に示される;同様に、DCRS3.
2に対して配列番号24および配列番号25として示され;DCRS3.1とD
CRS3.2ポリペプチド配列との比較はまた、表1に示される。共通の遺伝暗
号に基づいた逆翻訳は、表2に示される;コードされる核酸配列の比較はまた、
表2に提供される。この配列は、染色体位置クローンCIT987SK−582
J2 HUAC004525およびCIT987−SKA−670B5 HUA
C002303、16p12、および他のcDNA配列でのゲノム配列に由来す
る。推定シグナル配列が示されるが、これは、細胞型に依存するかもしれないし
、またはいずれかの方向の数個の残基であるかもしれない。膜貫通セグメント(
配列番号2)は、およそleu248−ser264(glu242−his2
68)を走ると推定される。推定されるフィブロネクチンドメインは、およそa
sn128−tyr220を走り;サイトカインレセプターWSボックスは、お
よそtrp224−ser228を走り;保存性ジスルフィドモチーフは、cy
s6−cys26の間であり;第2の保存性ジスルフィド連結は、cys65−
cys89であり;5つのNグリコシル化部位は、Asn残基61、97、12
1、128、および145であり;7つのcAMP PK部位は、lys4;l
ys68;lys184;arg191;arg201;lys202;および
lys292であり;14のCaリン酸化部位は、thr71、ser130、
ser187、ser205、ser237、ser182、ser195、s
er310、ser317、thr323、ser374、ser385、se
r403、およびthr499であり;5つのミリストイル部位は、gly17
4、gly303、gly439、gly449、およびgly466であり;
4つのPKCリン酸化部位は、ser7、ser147、ser180、および
ser264であり;ならびに1つのチロシンキナーゼ部位は、lys163で
ある。
対応するアミノ酸配列(配列番号2)が表1に示される;同様に、DCRS3.
2に対して配列番号24および配列番号25として示され;DCRS3.1とD
CRS3.2ポリペプチド配列との比較はまた、表1に示される。共通の遺伝暗
号に基づいた逆翻訳は、表2に示される;コードされる核酸配列の比較はまた、
表2に提供される。この配列は、染色体位置クローンCIT987SK−582
J2 HUAC004525およびCIT987−SKA−670B5 HUA
C002303、16p12、および他のcDNA配列でのゲノム配列に由来す
る。推定シグナル配列が示されるが、これは、細胞型に依存するかもしれないし
、またはいずれかの方向の数個の残基であるかもしれない。膜貫通セグメント(
配列番号2)は、およそleu248−ser264(glu242−his2
68)を走ると推定される。推定されるフィブロネクチンドメインは、およそa
sn128−tyr220を走り;サイトカインレセプターWSボックスは、お
よそtrp224−ser228を走り;保存性ジスルフィドモチーフは、cy
s6−cys26の間であり;第2の保存性ジスルフィド連結は、cys65−
cys89であり;5つのNグリコシル化部位は、Asn残基61、97、12
1、128、および145であり;7つのcAMP PK部位は、lys4;l
ys68;lys184;arg191;arg201;lys202;および
lys292であり;14のCaリン酸化部位は、thr71、ser130、
ser187、ser205、ser237、ser182、ser195、s
er310、ser317、thr323、ser374、ser385、se
r403、およびthr499であり;5つのミリストイル部位は、gly17
4、gly303、gly439、gly449、およびgly466であり;
4つのPKCリン酸化部位は、ser7、ser147、ser180、および
ser264であり;ならびに1つのチロシンキナーゼ部位は、lys163で
ある。
【0023】
エキソン境界は、およそヌクレオチドg49−c50、g230−g231、
g284−g285、a484−g485、g597−a598、g775−a
776、g875−g876、およびg957−a958の間に存在すると推定
される。この配列は、ゲノム配列に由来しているので、ここで、イントロンは、
スプライシングアウトされておらず、特に重要な組成物は、この境界をまたぐセ
グメントをコードする組成物である(例えば、核酸配列およびアミノ酸配列の両
方)。このセグメントは、以下を含む:例えば、エキソン境界に隣接するいずれ
かの端または両端における8、9、11、13、15、17、20、25、30
、35、50、もしくはそれより多いヌクレオチド、または境界に隣接するいず
れかの端または両端における4、5、6、7、もしくは8アミノ酸を含み得る境
界をまたぐセグメント。いずれかの端における長さは、新規性の目的のために同
じである必要はない(例えば、一方の端における3アミノ酸かつ他方の端におけ
る5アミノ酸)。従って、例えば、境界をまたぐ例えば連続した15ヌクレオチ
ド(このうち少なくとも6ヌクレオチドがどちらかの端由来である)を含む組成
物が提供される。同様に、例えば、エキソン境界の各端からの少なくとも3アミ
ノ酸(この境界をまたぐ少なくとも8アミノ酸は一致している)を含む組成物が
提供される。また、複数のエキソン境界をまたぐ複数のこのようなセグメント(
この異なるセグメントは、同じ長さの制限を持つ必要はない)を含む組成物が提
供される。従って、本発明は、以下を含む核酸を提供する:例えば、エキソン1
/2境界をまたぐ各端における少なくとも5つのヌクレオチド、ならびにエキソ
ン3/4、4/5、5/6、および/または6/7境界のいずれかの端における
少なくとも4ヌクレオチド。天然配列の組成物は、好まれる。
g284−g285、a484−g485、g597−a598、g775−a
776、g875−g876、およびg957−a958の間に存在すると推定
される。この配列は、ゲノム配列に由来しているので、ここで、イントロンは、
スプライシングアウトされておらず、特に重要な組成物は、この境界をまたぐセ
グメントをコードする組成物である(例えば、核酸配列およびアミノ酸配列の両
方)。このセグメントは、以下を含む:例えば、エキソン境界に隣接するいずれ
かの端または両端における8、9、11、13、15、17、20、25、30
、35、50、もしくはそれより多いヌクレオチド、または境界に隣接するいず
れかの端または両端における4、5、6、7、もしくは8アミノ酸を含み得る境
界をまたぐセグメント。いずれかの端における長さは、新規性の目的のために同
じである必要はない(例えば、一方の端における3アミノ酸かつ他方の端におけ
る5アミノ酸)。従って、例えば、境界をまたぐ例えば連続した15ヌクレオチ
ド(このうち少なくとも6ヌクレオチドがどちらかの端由来である)を含む組成
物が提供される。同様に、例えば、エキソン境界の各端からの少なくとも3アミ
ノ酸(この境界をまたぐ少なくとも8アミノ酸は一致している)を含む組成物が
提供される。また、複数のエキソン境界をまたぐ複数のこのようなセグメント(
この異なるセグメントは、同じ長さの制限を持つ必要はない)を含む組成物が提
供される。従って、本発明は、以下を含む核酸を提供する:例えば、エキソン1
/2境界をまたぐ各端における少なくとも5つのヌクレオチド、ならびにエキソ
ン3/4、4/5、5/6、および/または6/7境界のいずれかの端における
少なくとも4ヌクレオチド。天然配列の組成物は、好まれる。
【0024】
ヒトDCRS4をコードするセグメントのヌクレオチド(配列番号4)および
対応するアミノ酸配列(配列番号5)が表3に示される;同様に、DCRS4.
2に対して配列番号27および配列番号28として、DCRS4.3に対して配
列番号30および配列番号31として;DCRS4ポリペプチド配列の比較はま
た、表3に示される。共通の遺伝暗号に基づいた逆翻訳は、表4に示される;コ
ードされる核酸配列の比較はまた、表4に提供される。DCRS4.1の配列は
、染色体位置6q24.1−25.2(IFNγR1鎖のおよそ50kb内にお
ける)でのゲノム配列に由来する。推定DCRS4.1シグナル配列が示される
が、これは、細胞型に依存するかもしれないし、またはいずれかの方向の数個の
残基であるかもしれない。このレセプターのこの実施形態は、膜貫通セグメント
を欠き、これは珍しいが、サイトカインレセプターサブユニットの可溶性形態に
関して前例がある。例えば、IL−12Rα(p40サブユニット)およびEB
I3レセプターサブユニットホモログを参照のこと。このDCRS4.1につい
て、推定サイトカインレセプタードメインは、pro10−arg49であり;
保存性ジスルフィドモチーフは、cys57−cys65の間であり;5つのN
グリコシル化部位は、Asn残基35、131、136、157、および174
であり;4つのcAMP PK部位は、arg30、lys98、lys106
およびlys156であり;8つのCaリン酸化部位は、thr4、thr60
、ser64、thr68、thr71、ser159、ser176、および
ser220に存在する;3つのミリストイル部位は、gly89、gly10
3、およびgly186であり;3つのPKCリン酸化部位は、ser7、se
r97、およびser217であり;1つのアミド化部位は、tyr79であり
;1つのcAMPリン酸化部位は、lys98であり;ならびに2つのCK2リ
ン酸化部位は、ser3およびser159である。エキソン境界は、およそヌ
クレオチドc59−a60;t197−a198、g206−a207、g43
0−c431、およびg601−a602の間に存在すると推定される。他のD
CRS4の実施形態との整列が、提供される。上記のように、エキソン境界をま
たぐ配列を有する組成物が提供される。
対応するアミノ酸配列(配列番号5)が表3に示される;同様に、DCRS4.
2に対して配列番号27および配列番号28として、DCRS4.3に対して配
列番号30および配列番号31として;DCRS4ポリペプチド配列の比較はま
た、表3に示される。共通の遺伝暗号に基づいた逆翻訳は、表4に示される;コ
ードされる核酸配列の比較はまた、表4に提供される。DCRS4.1の配列は
、染色体位置6q24.1−25.2(IFNγR1鎖のおよそ50kb内にお
ける)でのゲノム配列に由来する。推定DCRS4.1シグナル配列が示される
が、これは、細胞型に依存するかもしれないし、またはいずれかの方向の数個の
残基であるかもしれない。このレセプターのこの実施形態は、膜貫通セグメント
を欠き、これは珍しいが、サイトカインレセプターサブユニットの可溶性形態に
関して前例がある。例えば、IL−12Rα(p40サブユニット)およびEB
I3レセプターサブユニットホモログを参照のこと。このDCRS4.1につい
て、推定サイトカインレセプタードメインは、pro10−arg49であり;
保存性ジスルフィドモチーフは、cys57−cys65の間であり;5つのN
グリコシル化部位は、Asn残基35、131、136、157、および174
であり;4つのcAMP PK部位は、arg30、lys98、lys106
およびlys156であり;8つのCaリン酸化部位は、thr4、thr60
、ser64、thr68、thr71、ser159、ser176、および
ser220に存在する;3つのミリストイル部位は、gly89、gly10
3、およびgly186であり;3つのPKCリン酸化部位は、ser7、se
r97、およびser217であり;1つのアミド化部位は、tyr79であり
;1つのcAMPリン酸化部位は、lys98であり;ならびに2つのCK2リ
ン酸化部位は、ser3およびser159である。エキソン境界は、およそヌ
クレオチドc59−a60;t197−a198、g206−a207、g43
0−c431、およびg601−a602の間に存在すると推定される。他のD
CRS4の実施形態との整列が、提供される。上記のように、エキソン境界をま
たぐ配列を有する組成物が提供される。
【0025】
【表1】
【0026】
【表2】
【0027】
【表3】
【0028】
【表4】
【0029】
【表5】
表5は、霊長類(例えば、ヒト)のDCRS3.1(50R)およびDCRS
4.1(cytor)を有するサイトカインレセプターサブユニットの配列の比
較を示す。新規の遺伝子は、両方ともα型レセプターサブユニットのようであり
、従ってβサブユニットを必要としないでリガンドと結合するはずである。構造
的な特徴に基くと、このDCRS3サブユニットに対するリガンドは、IL−2
、IL−4、IL−7、IL−9を含むサイトカイン、ならびにIL−2γ共通
レセプター様サブユニットIL−13、IL−15、およびTSLPリガンドを
通じてシグナル伝達するさらなるサイトカインのファミリーのメンバーのようで
ある。同様に、DCRS4レセプターサブユニットに対するリガンドは、おそら
くIL−10またはIFNファミリーのリガンドであり、そしてこれはIL−6
およびIL−12に類似の、複数サブユニットのサイトカインであり得る。
4.1(cytor)を有するサイトカインレセプターサブユニットの配列の比
較を示す。新規の遺伝子は、両方ともα型レセプターサブユニットのようであり
、従ってβサブユニットを必要としないでリガンドと結合するはずである。構造
的な特徴に基くと、このDCRS3サブユニットに対するリガンドは、IL−2
、IL−4、IL−7、IL−9を含むサイトカイン、ならびにIL−2γ共通
レセプター様サブユニットIL−13、IL−15、およびTSLPリガンドを
通じてシグナル伝達するさらなるサイトカインのファミリーのメンバーのようで
ある。同様に、DCRS4レセプターサブユニットに対するリガンドは、おそら
くIL−10またはIFNファミリーのリガンドであり、そしてこれはIL−6
およびIL−12に類似の、複数サブユニットのサイトカインであり得る。
【0030】
本明細書中で使用される場合、用語DCRS3.1は、表1に示されるアミノ
酸配列を含むタンパク質を示すために使用される(shall);DCRS4お
よび表3についても同様である。多くの場合、それらの実質的なフラグメントは
、機能的または構造的に等価であり、これらとしては、例えば、細胞外ドメイン
および細胞内ドメインが挙げられる。本発明はまた、DCRS3対立遺伝子のタ
ンパク質のバリエーションを含み、これらの配列が、提供される(例えば、ムテ
インまたは可溶性細胞外構築物)。典型的には、このようなアゴニストまたはア
ンタゴニストは、約10%未満の配列の相違を示し、従ってしばしば1と11と
の間(例えば、2、3、5、7など)の置換(fold substituti
on)を有する。このようなアゴニストまたはアンタゴニストはまた、記載され
るタンパク質の対立遺伝子および他の改変体(例えば、天然多型)を含む。典型
的には、このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、恐らくαレセプターサ
ブユニットとの二量体化状態で、高親和性で(例えば、少なくとも約100nM
、通常約30nMより良好に、好ましくは、約10nMより良好に、そしてより
好ましくは、約3nMより良好で)その対応する生物学的リガンドと結合する。
用語「shall」はまた、本明細書中で使用される場合、関連する天然に存在
する形態(例えば、対立遺伝子、多型改変体、および哺乳動物タンパク質の代謝
改変体)をいう。レセプター複合体の好ましい形態は、リガンド−レセプター相
互作用について適切な親和性および選択性で適切なリガンドと結合する。
酸配列を含むタンパク質を示すために使用される(shall);DCRS4お
よび表3についても同様である。多くの場合、それらの実質的なフラグメントは
、機能的または構造的に等価であり、これらとしては、例えば、細胞外ドメイン
および細胞内ドメインが挙げられる。本発明はまた、DCRS3対立遺伝子のタ
ンパク質のバリエーションを含み、これらの配列が、提供される(例えば、ムテ
インまたは可溶性細胞外構築物)。典型的には、このようなアゴニストまたはア
ンタゴニストは、約10%未満の配列の相違を示し、従ってしばしば1と11と
の間(例えば、2、3、5、7など)の置換(fold substituti
on)を有する。このようなアゴニストまたはアンタゴニストはまた、記載され
るタンパク質の対立遺伝子および他の改変体(例えば、天然多型)を含む。典型
的には、このようなアゴニストまたはアンタゴニストは、恐らくαレセプターサ
ブユニットとの二量体化状態で、高親和性で(例えば、少なくとも約100nM
、通常約30nMより良好に、好ましくは、約10nMより良好に、そしてより
好ましくは、約3nMより良好で)その対応する生物学的リガンドと結合する。
用語「shall」はまた、本明細書中で使用される場合、関連する天然に存在
する形態(例えば、対立遺伝子、多型改変体、および哺乳動物タンパク質の代謝
改変体)をいう。レセプター複合体の好ましい形態は、リガンド−レセプター相
互作用について適切な親和性および選択性で適切なリガンドと結合する。
【0031】
本発明はまた、表1または表3中のアミノ酸配列と実質的なアミノ酸配列同一
性を有するタンパク質またはペプチドの組み合わせを含む。この組み合わせには
、比較的わずかな置換(例えば、好ましくは約3〜5未満)しか有さない配列改
変体が挙げられる。
性を有するタンパク質またはペプチドの組み合わせを含む。この組み合わせには
、比較的わずかな置換(例えば、好ましくは約3〜5未満)しか有さない配列改
変体が挙げられる。
【0032】
実質的なポリペプチド「フラグメント」または「セグメント」は、少なくとも
約8アミノ酸、一般的には少なくとも10アミノ酸、より一般的には少なくとも
12アミノ酸(しばしば少なくとも14アミノ酸、より大抵少なくとも16アミ
ノ酸、典型的には少なくとも18アミノ酸、より典型的には少なくとも20アミ
ノ酸、通常少なくとも22アミノ酸、より通常少なくとも24アミノ酸、好まし
くは少なくとも26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、および
特に好ましい実施形態においては、少なくとも約30以上のアミノ酸)のアミノ
酸残基のストレッチである。異なるタンパク質のセグメントの配列は、適切な長
さのストレッチにわたり互いに比較され得る。多くの場合、フラグメントは、イ
ンタクトなサブユニットの機能特性を示し得る。例えば、膜貫通レセプターの細
胞外ドメインは、リガンド結合特色を保持し得、そして可溶性レセプター様複合
体を調製するために使用され得る。
約8アミノ酸、一般的には少なくとも10アミノ酸、より一般的には少なくとも
12アミノ酸(しばしば少なくとも14アミノ酸、より大抵少なくとも16アミ
ノ酸、典型的には少なくとも18アミノ酸、より典型的には少なくとも20アミ
ノ酸、通常少なくとも22アミノ酸、より通常少なくとも24アミノ酸、好まし
くは少なくとも26アミノ酸、より好ましくは少なくとも28アミノ酸、および
特に好ましい実施形態においては、少なくとも約30以上のアミノ酸)のアミノ
酸残基のストレッチである。異なるタンパク質のセグメントの配列は、適切な長
さのストレッチにわたり互いに比較され得る。多くの場合、フラグメントは、イ
ンタクトなサブユニットの機能特性を示し得る。例えば、膜貫通レセプターの細
胞外ドメインは、リガンド結合特色を保持し得、そして可溶性レセプター様複合
体を調製するために使用され得る。
【0033】
アミノ酸配列相同性または配列同一性は、残基の一致を至適化することにより
決定される。いくつかの比較において、必要に応じて、ギャップが導入され得る
。例えば、Needlehamら(1970)J.Mol.Biol.48:4
43−453;Sankoffら(1983)第1節、Time Warps,
String Edits and Macromolecules:The
Theory and Practice of Sequence Comp
arison,Addison−Wesley,Reading,MA;ならび
にIntelliGenetics,Mountain View,CAおよび
University of Wisconsin Genetics Com
puter Group(GCG),Madison,WI製のソフトウェアパ
ッケージ(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと
。保存的置換が一致として考慮する場合に、これは変化する。保存的置換は、代
表的には、以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシ
ン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セ
リン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。
相同性アミノ酸配列は、サイトカン配列における天然対立遺伝子および種間のバ
リエーションを含むことを意図される。代表的な相同性タンパク質またはペプチ
ドは、表1または表3のアミノ酸配列セグメントと、50〜100%相同性(ギ
ャップが導入され得る場合)から60〜100%相同性(保存的置換が導入され
る場合)までを有する。相同性の評価は、少なくとも約70%、一般的には少な
くとも76%、より一般的には少なくとも81%、しばしば少なくとも85%、
よりしばしば少なくとも88%、典型的には少なくとも90%、より典型的には
少なくとも92%、通常少なくとも94%、より通常には少なくとも95%、好
ましくは少なくとも96%、そしてより好ましくは少なくとも97%、そして特
に好ましい実施形態では、少なくとも98%以上である。相同性の程度は、比較
されるセグメントの長さと共に変化する。相同タンパク質またはペプチド(例え
ば、対立遺伝子改変体)は、表1または表3に記載される実施形態と、ほとんど
の生物学的活性を共有する。
決定される。いくつかの比較において、必要に応じて、ギャップが導入され得る
。例えば、Needlehamら(1970)J.Mol.Biol.48:4
43−453;Sankoffら(1983)第1節、Time Warps,
String Edits and Macromolecules:The
Theory and Practice of Sequence Comp
arison,Addison−Wesley,Reading,MA;ならび
にIntelliGenetics,Mountain View,CAおよび
University of Wisconsin Genetics Com
puter Group(GCG),Madison,WI製のソフトウェアパ
ッケージ(これらの各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと
。保存的置換が一致として考慮する場合に、これは変化する。保存的置換は、代
表的には、以下の群内の置換を含む:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシ
ン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セ
リン、スレオニン;リジン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシン。
相同性アミノ酸配列は、サイトカン配列における天然対立遺伝子および種間のバ
リエーションを含むことを意図される。代表的な相同性タンパク質またはペプチ
ドは、表1または表3のアミノ酸配列セグメントと、50〜100%相同性(ギ
ャップが導入され得る場合)から60〜100%相同性(保存的置換が導入され
る場合)までを有する。相同性の評価は、少なくとも約70%、一般的には少な
くとも76%、より一般的には少なくとも81%、しばしば少なくとも85%、
よりしばしば少なくとも88%、典型的には少なくとも90%、より典型的には
少なくとも92%、通常少なくとも94%、より通常には少なくとも95%、好
ましくは少なくとも96%、そしてより好ましくは少なくとも97%、そして特
に好ましい実施形態では、少なくとも98%以上である。相同性の程度は、比較
されるセグメントの長さと共に変化する。相同タンパク質またはペプチド(例え
ば、対立遺伝子改変体)は、表1または表3に記載される実施形態と、ほとんど
の生物学的活性を共有する。
【0034】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的活性」は、限定を伴わずに、サ
イトカイン様リガンドによる、炎症応答、生得免疫、および/または形態形成発
達に対する効果を記載するために使用される。例えば、これらのレセプターは、
ホスファターゼまたはホスホリラーゼ活性を媒介し、この活性は、標準的な手順
により容易に測定される。例えば、Hardieら(1995編)The Pr
otein Kinase FactBook 第I巻および第II巻、Aca
demic Press,San Diego,CA;Hanksら(1991
)Meth.Enzymol.200:38−62;Hunterら(1992
)Cell 70:375−388;Lewin(1990)Cell 61:
743−752;Pinesら(1991)Cold Spring Harb
or Symp.Quant.Biol.56:449−463;およびPar
kerら(1993)Nature 363:736−738を参照のこと。レ
セプターまたはその一部は、一般または特異的な基質を標識するためにホスフェ
ート標識酵素として有用であり得る。サブユニットはまた機能的免疫原であり得
、認識抗体を誘起するかまたは抗体に結合し得る抗原であり得る。
イトカイン様リガンドによる、炎症応答、生得免疫、および/または形態形成発
達に対する効果を記載するために使用される。例えば、これらのレセプターは、
ホスファターゼまたはホスホリラーゼ活性を媒介し、この活性は、標準的な手順
により容易に測定される。例えば、Hardieら(1995編)The Pr
otein Kinase FactBook 第I巻および第II巻、Aca
demic Press,San Diego,CA;Hanksら(1991
)Meth.Enzymol.200:38−62;Hunterら(1992
)Cell 70:375−388;Lewin(1990)Cell 61:
743−752;Pinesら(1991)Cold Spring Harb
or Symp.Quant.Biol.56:449−463;およびPar
kerら(1993)Nature 363:736−738を参照のこと。レ
セプターまたはその一部は、一般または特異的な基質を標識するためにホスフェ
ート標識酵素として有用であり得る。サブユニットはまた機能的免疫原であり得
、認識抗体を誘起するかまたは抗体に結合し得る抗原であり得る。
【0035】
用語リガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびアナログ(例えば、DCR
S3の)は、サイトカインリガンドタンパク質に対する特徴的な細胞応答を調節
する分子、ならびにリガンド−レセプター相互作用(例えば、レセプターが天然
のレセプターまたは抗体である場合)のより標準的な構造的結合競合特色を所有
する分子を含む。細胞応答は、典型的には、レセプターチロシンキナーゼ経路を
介して媒介されるようである。
S3の)は、サイトカインリガンドタンパク質に対する特徴的な細胞応答を調節
する分子、ならびにリガンド−レセプター相互作用(例えば、レセプターが天然
のレセプターまたは抗体である場合)のより標準的な構造的結合競合特色を所有
する分子を含む。細胞応答は、典型的には、レセプターチロシンキナーゼ経路を
介して媒介されるようである。
【0036】
また、リガンドは、上記レセプターまたはそのアナログが結合する天然のリガ
ンドか、または天然のリガンドの機能的アナログである分子のいずれかとして機
能する分子である。機能的アナログは、構造的改変を有するリガンドであり得る
か、または適切なリガンド結合決定因子と相互作用する分子形状を有する全体的
に無関係な分子であり得る。このリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニスト
として機能し得る(例えば、Goodmanら(1990編)Goodman&
Gilman’s:The Pharmacological Bases o
f Therapeutics,Pergamon Press,New Yo
rkを参照のこと)。
ンドか、または天然のリガンドの機能的アナログである分子のいずれかとして機
能する分子である。機能的アナログは、構造的改変を有するリガンドであり得る
か、または適切なリガンド結合決定因子と相互作用する分子形状を有する全体的
に無関係な分子であり得る。このリガンドは、アゴニストまたはアンタゴニスト
として機能し得る(例えば、Goodmanら(1990編)Goodman&
Gilman’s:The Pharmacological Bases o
f Therapeutics,Pergamon Press,New Yo
rkを参照のこと)。
【0037】
合理的な薬物設計はまた、レセプターまたは抗体および他のエフェクターまた
はリガンドの分子形状の構造的研究に基づく。例えば、Herzら(1997)
J.Recept.Signal Transduct.Res.17:671
−776;およびChaikenら(1996)Trends Biotech
nol.14.369−375を参照のこと。エフェクターは、リガンドの結合
に応答して他の機能を媒介する他のタンパク質であるかもしれないし、またレセ
プターと正常に相互作用する他のタンパク質であるかもしれない。特定の他のタ
ンパク質と相互作用する部位を決定するための手段の1つは、物理的構造決定法
(例えば、x線結晶学または2次元NMR技術)である。これらは、アミノ酸残
基が分子の接触領域を形成することに関するガイダンスを提供する。タンパク質
構造決定法の詳細な説明については、例えば、BlundellおよびJohn
son(1976)Protein Crystallography,Aca
demic Press,New York(これは、本明細書中で、参考とし
て本明細書により援用される)を参照のこと。
はリガンドの分子形状の構造的研究に基づく。例えば、Herzら(1997)
J.Recept.Signal Transduct.Res.17:671
−776;およびChaikenら(1996)Trends Biotech
nol.14.369−375を参照のこと。エフェクターは、リガンドの結合
に応答して他の機能を媒介する他のタンパク質であるかもしれないし、またレセ
プターと正常に相互作用する他のタンパク質であるかもしれない。特定の他のタ
ンパク質と相互作用する部位を決定するための手段の1つは、物理的構造決定法
(例えば、x線結晶学または2次元NMR技術)である。これらは、アミノ酸残
基が分子の接触領域を形成することに関するガイダンスを提供する。タンパク質
構造決定法の詳細な説明については、例えば、BlundellおよびJohn
son(1976)Protein Crystallography,Aca
demic Press,New York(これは、本明細書中で、参考とし
て本明細書により援用される)を参照のこと。
【0038】
(II.活性)
サイトカインレセプター様タンパク質は、例えば、細胞増殖の調節またはホス
フェート代謝において多くの異なる生物学的活性を有し、特定の基質(代表的に
はタンパク質)に添加されるかまたはそこから除去される。このようなものは、
サイトカインまたはインターロイキンのシグナル伝達に独特のものとして、一般
に、炎症性の機能の調節、他の先天的免疫応答、または形態学的効果を生じる。
このサブユニットは、このリガンドへの特異的な低い親和性の結合を有する。
フェート代謝において多くの異なる生物学的活性を有し、特定の基質(代表的に
はタンパク質)に添加されるかまたはそこから除去される。このようなものは、
サイトカインまたはインターロイキンのシグナル伝達に独特のものとして、一般
に、炎症性の機能の調節、他の先天的免疫応答、または形態学的効果を生じる。
このサブユニットは、このリガンドへの特異的な低い親和性の結合を有する。
【0039】
このレセプターは、JAK経路を介してシグナル伝達し得る。例えば、Ihl
eら(1997)Stem Cells 15(補遺1):105−111;S
ilvennoinenら(1997)APMIS 105:497−509;
Levy(1997)Cytokine Growth Factor Rev
iew 8:81−90;WinstonおよびHunter(1996)Cu
rrent Biol.6:668−671;Barrett(1996)Ba
illieres Clin.Gastroenterol.10:1−15;
ならびにBriscoeら(1996)Philos.Trans.R.Soc
.Lond.B.Biol.Sci.351:167−171を参照のこと。
eら(1997)Stem Cells 15(補遺1):105−111;S
ilvennoinenら(1997)APMIS 105:497−509;
Levy(1997)Cytokine Growth Factor Rev
iew 8:81−90;WinstonおよびHunter(1996)Cu
rrent Biol.6:668−671;Barrett(1996)Ba
illieres Clin.Gastroenterol.10:1−15;
ならびにBriscoeら(1996)Philos.Trans.R.Soc
.Lond.B.Biol.Sci.351:167−171を参照のこと。
【0040】
サイトカインレセプターサブユニットの生物学的活性は、代表的には特異的な
様式で、しかし時折非特異的な様式で、基質に対するホスフェート部分の付加ま
たは除去に関連する。基質は、同定され得るか、または酵素活性についての条件
が標準的な方法によって(例えば、Hardieら(編、1995)The P
rotein Kinase FactBook IおよびII巻、Acade
mic Press,San Diego,CA;Hanksら(1991)M
eth.Enzymol.200:38−62;Hunterら(1992)C
ell 70:375−388;Lewin(1990)Cell 61:74
3−752;Pinesら(1991)Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.56:449−463;ならびにPark
erら(1993)Nature 363:736−738に記載されるのよう
な)アッセイされ得る。
様式で、しかし時折非特異的な様式で、基質に対するホスフェート部分の付加ま
たは除去に関連する。基質は、同定され得るか、または酵素活性についての条件
が標準的な方法によって(例えば、Hardieら(編、1995)The P
rotein Kinase FactBook IおよびII巻、Acade
mic Press,San Diego,CA;Hanksら(1991)M
eth.Enzymol.200:38−62;Hunterら(1992)C
ell 70:375−388;Lewin(1990)Cell 61:74
3−752;Pinesら(1991)Cold Spring Harbor
Symp.Quant.Biol.56:449−463;ならびにPark
erら(1993)Nature 363:736−738に記載されるのよう
な)アッセイされ得る。
【0041】
このレセプターサブユニットは、他のサブユニット(例えば、βサブユニット
)と組合わせられて機能的複合体(例えばこれは、リガンドを結合するためまた
は抗体を調製するために有用であり得る)を形成し得る。これらは、検出または
定量を含む実質的な診断用途を有する。
)と組合わせられて機能的複合体(例えばこれは、リガンドを結合するためまた
は抗体を調製するために有用であり得る)を形成し得る。これらは、検出または
定量を含む実質的な診断用途を有する。
【0042】
(III.核酸)
本発明は、例えば、これらのタンパク質もしくはそのフラグメントまたは密接
に関連するタンパク質またはそのフラグメントをコードする、単離された核酸ま
たはフラグメントの、例えば、対応するポリぺプチド(好ましくは生物学的に活
性であるポリぺプチド)をコードするための使用を意図する。さらに、本発明は
、例えば、DCRS3またはDCRS4の特徴的配列を有するこのようなタンパ
ク質またはポリぺプチドの組合せをコードする、単離されたまたは組換えのDN
Aを包含する。代表的には、核酸は、適切な条件下で、表1または表3に示され
る核酸配列セグメントとハイブリダイズし得るが、好ましくは例えば表5に記載
される他のレセプターの対応するセグメントとはハイブリダイズし得ない。上記
の生物学的に活性なタンパク質またはポリぺプチドは、全長タンパク質またはフ
ラグメントであり得、そして代表的には、表1または表3に示されるアミノ酸配
列に高度に相同なアミノ酸配列のセグメント(例えば、有意な同一性のストレッ
チを示す)を有する。さらに、本発明は、DCRS3またはDCRS4タンパク
質に等価なフラグメントを有するタンパク質をコードする単離されたまたは組換
えの、核酸またはそのフラグメントの使用を包含する。単離された核酸は、5’
側および3’側においてそれぞれの調節配列(例えば、天然の遺伝子由来のプロ
モーター、エンハンサー、ポリA付加シグナルおよびその他)を有し得る。記載
されるような組合せがまた、提供される。
に関連するタンパク質またはそのフラグメントをコードする、単離された核酸ま
たはフラグメントの、例えば、対応するポリぺプチド(好ましくは生物学的に活
性であるポリぺプチド)をコードするための使用を意図する。さらに、本発明は
、例えば、DCRS3またはDCRS4の特徴的配列を有するこのようなタンパ
ク質またはポリぺプチドの組合せをコードする、単離されたまたは組換えのDN
Aを包含する。代表的には、核酸は、適切な条件下で、表1または表3に示され
る核酸配列セグメントとハイブリダイズし得るが、好ましくは例えば表5に記載
される他のレセプターの対応するセグメントとはハイブリダイズし得ない。上記
の生物学的に活性なタンパク質またはポリぺプチドは、全長タンパク質またはフ
ラグメントであり得、そして代表的には、表1または表3に示されるアミノ酸配
列に高度に相同なアミノ酸配列のセグメント(例えば、有意な同一性のストレッ
チを示す)を有する。さらに、本発明は、DCRS3またはDCRS4タンパク
質に等価なフラグメントを有するタンパク質をコードする単離されたまたは組換
えの、核酸またはそのフラグメントの使用を包含する。単離された核酸は、5’
側および3’側においてそれぞれの調節配列(例えば、天然の遺伝子由来のプロ
モーター、エンハンサー、ポリA付加シグナルおよびその他)を有し得る。記載
されるような組合せがまた、提供される。
【0043】
「単離された」核酸は、例えば、元々の種からのリボソーム、ポリメラーゼ、
および隣接ゲノム配列のような天然の配列にもともと付随する他の成分から分離
された、実質的に純粋な核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー)
である。この用語は、その天然に存在する環境から除去されている核酸配列を包
含し、そして組換えまたはクローン化のDNA単離体を包含し、これらはこれに
関して、天然に存在する組成物、および化学的に合成されたアナログまたは異種
系によって生物学的に合成されたアナログから区別される。実質的に純粋な分子
には、完全に純粋または実質的に純粋のいずれかの分子の単離された形態が含ま
れる。
および隣接ゲノム配列のような天然の配列にもともと付随する他の成分から分離
された、実質的に純粋な核酸(例えば、RNA、DNA、または混合ポリマー)
である。この用語は、その天然に存在する環境から除去されている核酸配列を包
含し、そして組換えまたはクローン化のDNA単離体を包含し、これらはこれに
関して、天然に存在する組成物、および化学的に合成されたアナログまたは異種
系によって生物学的に合成されたアナログから区別される。実質的に純粋な分子
には、完全に純粋または実質的に純粋のいずれかの分子の単離された形態が含ま
れる。
【0044】
単離された核酸は、一般に、分子の均一な組成物であるが、いくつかの実施形
態においては、不均一性(好ましくは少量)を含む。この不均一性は、代表的に
は、所望の生物学的な機能または活性に対して重要でないポリマー末端または部
分で見出される。
態においては、不均一性(好ましくは少量)を含む。この不均一性は、代表的に
は、所望の生物学的な機能または活性に対して重要でないポリマー末端または部
分で見出される。
【0045】
「組換え」核酸は、代表的には、その産生方法またはその構造のいずれかによ
って規定されている。その産生(例えば、プロセスによって生成される産物)の
方法に関して、プロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列におけ
る人為的介入を含む)の使用である。代表的には、この介入には、インビトロ操
作を含むが、特定の状況下では、それはより古典的な動物繁殖技術を含み得る。
あるいは、組換え核酸は、天然には互いに連続しない2つのフラグメントの融合
を含む配列を生成することによって作製される核酸であり得るが、天然の産物(
例えば、その天然の状態に見出されるような天然に存在する変異体)は除外する
ことを意味する。従って、例えば、天然に存在しないベクターで細胞を形質転換
することによって作製される産物が、任意の合成的オリゴヌクレオチドプロセス
を使用して誘導される配列を含む核酸と同様に含まれる。このようなプロセスは
、しばしば、代表的には制限酵素配列認識部位を導入または除去しながら、同一
または保存されたアミノ酸をコードする縮重コドンでコドンを置換するためにな
される。あるいは、このプロセスは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合
して、一般に入手できる天然の形態において見出されない所望の機能の組み合わ
せを含む単一の遺伝子実体(例えば、融合タンパク質をコードする)を生成する
ために行われる。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人為的な操作の標
的であるが、他の部位特異的な標的(例えば、プロモーター、DNA複製部位、
調節配列、制御配列、または他の有用な特徴)は、設計によって組込まれ得る。
類似の概念が、組換え(例えば、融合のポリぺプチド)について意図される。こ
れには、二量体反復が含まれる。詳細には、遺伝暗号の縮重によって、DCRS
3またはDCRS4のフラグメントおよび種々の異なる関連する分子(例えば、
他のサイトカインレセプターファミリーのメンバー)由来の配列の融合物に等価
なポリぺプチドをコードする合成核酸が含まれる。
って規定されている。その産生(例えば、プロセスによって生成される産物)の
方法に関して、プロセスは、組換え核酸技術(例えば、ヌクレオチド配列におけ
る人為的介入を含む)の使用である。代表的には、この介入には、インビトロ操
作を含むが、特定の状況下では、それはより古典的な動物繁殖技術を含み得る。
あるいは、組換え核酸は、天然には互いに連続しない2つのフラグメントの融合
を含む配列を生成することによって作製される核酸であり得るが、天然の産物(
例えば、その天然の状態に見出されるような天然に存在する変異体)は除外する
ことを意味する。従って、例えば、天然に存在しないベクターで細胞を形質転換
することによって作製される産物が、任意の合成的オリゴヌクレオチドプロセス
を使用して誘導される配列を含む核酸と同様に含まれる。このようなプロセスは
、しばしば、代表的には制限酵素配列認識部位を導入または除去しながら、同一
または保存されたアミノ酸をコードする縮重コドンでコドンを置換するためにな
される。あるいは、このプロセスは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合
して、一般に入手できる天然の形態において見出されない所望の機能の組み合わ
せを含む単一の遺伝子実体(例えば、融合タンパク質をコードする)を生成する
ために行われる。制限酵素認識部位は、しばしば、このような人為的な操作の標
的であるが、他の部位特異的な標的(例えば、プロモーター、DNA複製部位、
調節配列、制御配列、または他の有用な特徴)は、設計によって組込まれ得る。
類似の概念が、組換え(例えば、融合のポリぺプチド)について意図される。こ
れには、二量体反復が含まれる。詳細には、遺伝暗号の縮重によって、DCRS
3またはDCRS4のフラグメントおよび種々の異なる関連する分子(例えば、
他のサイトカインレセプターファミリーのメンバー)由来の配列の融合物に等価
なポリぺプチドをコードする合成核酸が含まれる。
【0046】
核酸の状況における「フラグメント」は、少なくとも約17ヌクレオチド、一
般には少なくとも21ヌクレオチド、より一般的には少なくとも25ヌクレオチ
ド、通常少なくとも30ヌクレオチド、より通常には少なくとも35ヌクレオチ
ド、しばしば少なくとも39ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも45ヌクレ
オチド、代表的には少なくとも50ヌクレオチド、より代表的には少なくとも5
5ヌクレオチド、通常少なくとも60ヌクレオチド、より通常には少なくとも6
6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも72ヌクレオチド、より好ましくは少な
くとも79ヌクレオチドの連続するセグメントであり、そして特に好ましい実施
形態において、少なくとも85以上のヌクレオチドである。代表的には、異なる
遺伝子配列のフラグメントは、適切な長さのストレッチ、特に以下に記載するド
メインような規定されたセグメントにわたって互いに比較され得る。
般には少なくとも21ヌクレオチド、より一般的には少なくとも25ヌクレオチ
ド、通常少なくとも30ヌクレオチド、より通常には少なくとも35ヌクレオチ
ド、しばしば少なくとも39ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも45ヌクレ
オチド、代表的には少なくとも50ヌクレオチド、より代表的には少なくとも5
5ヌクレオチド、通常少なくとも60ヌクレオチド、より通常には少なくとも6
6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも72ヌクレオチド、より好ましくは少な
くとも79ヌクレオチドの連続するセグメントであり、そして特に好ましい実施
形態において、少なくとも85以上のヌクレオチドである。代表的には、異なる
遺伝子配列のフラグメントは、適切な長さのストレッチ、特に以下に記載するド
メインような規定されたセグメントにわたって互いに比較され得る。
【0047】
DCRS3またはDCRS4をコードする核酸は、それ自体または密接に関連
するタンパク質をコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA種、ならびに多
型性の、対立遺伝子または他の遺伝的改変体(例えば、異なる個体または関連す
る種由来の)をコードするDNAを同定するために特に有用である。このような
スクリーニングにとって好ましいプローブは、異なる多型性改変体間で保存され
るかまたは特異性を欠失するヌクレオチドを含有するインターロイキンの領域で
あり、そして好ましくは全長またはそれに近い。他の状況では、多型性改変体特
異的配列はより有用である。
するタンパク質をコードする遺伝子、mRNA、およびcDNA種、ならびに多
型性の、対立遺伝子または他の遺伝的改変体(例えば、異なる個体または関連す
る種由来の)をコードするDNAを同定するために特に有用である。このような
スクリーニングにとって好ましいプローブは、異なる多型性改変体間で保存され
るかまたは特異性を欠失するヌクレオチドを含有するインターロイキンの領域で
あり、そして好ましくは全長またはそれに近い。他の状況では、多型性改変体特
異的配列はより有用である。
【0048】
本発明は、本明細書中に示される単離されたDNAに同一または高度に相同な
核酸配列を有する組換え核酸分子およびフラグメントをさらに包含する。特に、
この配列は、しばしば、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメ
ントに作動可能に連結している。これらのさらなるセグメントは、代表的には、
所望の核酸セグメントの発現を補助する。
核酸配列を有する組換え核酸分子およびフラグメントをさらに包含する。特に、
この配列は、しばしば、転写、翻訳、およびDNA複製を制御するDNAセグメ
ントに作動可能に連結している。これらのさらなるセグメントは、代表的には、
所望の核酸セグメントの発現を補助する。
【0049】
相同な、すなわち高度に同一性の核酸配列は、互いに(例えば、DCRS3配
列)比較された場合、有意な類似性を示す。核酸における相同性の標準は、配列
比較によって当該分野で一般に使用される相同性の尺度であるか、またはハイブ
リダイゼーション条件に基づくかのいずれかである。比較ハイブリダイゼーショ
ン条件は、より詳細に以下に記載される。
列)比較された場合、有意な類似性を示す。核酸における相同性の標準は、配列
比較によって当該分野で一般に使用される相同性の尺度であるか、またはハイブ
リダイゼーション条件に基づくかのいずれかである。比較ハイブリダイゼーショ
ン条件は、より詳細に以下に記載される。
【0050】
核酸配列比較の状況における実質的な同一性とは、セグメントまたはその相補
鎖が、比較される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列
された際に、ヌクレオチドの少なくとも約60%、一般的には少なくとも66%
、通常少なくとも71%、しばしば少なくとも76%、よりしばしば少なくとも
80%、通常少なくとも84%、より通常には少なくとも88%、代表的には少
なくとも91%、より代表的には少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約
95%、より好ましくは少なくとも約96%〜98%以上において、そして特定
の実施形態では、ヌクレオチドの約99%以上までの高さにおいて、同一である
ことのいずれかを意味し、例えば、以下に記載されるのセグメントような構造的
ドメインをコードするセグメントを包含する。あるいは、実質的な同一性は、セ
グメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖またはその相補鎖に、代
表的には表1または表3に由来する配列を使用して、ハイブリダイズする場合に
存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約14ヌ
クレオチドのストレッチにわたって少なくとも約55%の相同性、より代表的に
は少なくとも約65%、好ましくは少なくとも約75%、そしてより好ましくは
少なくとも約90%の相同性が存在する場合に生じる。Kanehisa(19
84)Nucl.Acids Res.12:203−213(これは、本明細
書中で参考として援用される)を参照のこと。相同性比較の長さは、記載される
ように、より長いストレッチにわたり得、そして特定の実施形態においては、少
なくとも約17ヌクレオチド、一般的には少なくとも約20ヌクレオチド、通常
(ordinarily)少なくとも約24ヌクレオチド、通常(usuall
y)少なくとも約28ヌクレオチド、代表的には少なくとも約32ヌクレオチド
、より代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50
ヌクレオチドのストレッチにわたり、そしてより好ましくは少なくとも約75〜
100以上のヌクレオチドにわたる。これには、例えば、125、150、17
5、200、225、250、275、300、325、350、375、40
0、425、450、475、500、525、544および他の長さが挙げら
れる。
鎖が、比較される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って最適に整列
された際に、ヌクレオチドの少なくとも約60%、一般的には少なくとも66%
、通常少なくとも71%、しばしば少なくとも76%、よりしばしば少なくとも
80%、通常少なくとも84%、より通常には少なくとも88%、代表的には少
なくとも91%、より代表的には少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約
95%、より好ましくは少なくとも約96%〜98%以上において、そして特定
の実施形態では、ヌクレオチドの約99%以上までの高さにおいて、同一である
ことのいずれかを意味し、例えば、以下に記載されるのセグメントような構造的
ドメインをコードするセグメントを包含する。あるいは、実質的な同一性は、セ
グメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖またはその相補鎖に、代
表的には表1または表3に由来する配列を使用して、ハイブリダイズする場合に
存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約14ヌ
クレオチドのストレッチにわたって少なくとも約55%の相同性、より代表的に
は少なくとも約65%、好ましくは少なくとも約75%、そしてより好ましくは
少なくとも約90%の相同性が存在する場合に生じる。Kanehisa(19
84)Nucl.Acids Res.12:203−213(これは、本明細
書中で参考として援用される)を参照のこと。相同性比較の長さは、記載される
ように、より長いストレッチにわたり得、そして特定の実施形態においては、少
なくとも約17ヌクレオチド、一般的には少なくとも約20ヌクレオチド、通常
(ordinarily)少なくとも約24ヌクレオチド、通常(usuall
y)少なくとも約28ヌクレオチド、代表的には少なくとも約32ヌクレオチド
、より代表的には少なくとも約40ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約50
ヌクレオチドのストレッチにわたり、そしてより好ましくは少なくとも約75〜
100以上のヌクレオチドにわたる。これには、例えば、125、150、17
5、200、225、250、275、300、325、350、375、40
0、425、450、475、500、525、544および他の長さが挙げら
れる。
【0051】
ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションの状況において相同性を
いう場合、ハイブリダイゼーション反応において代表的に制御される塩、温度、
有機溶媒、および他のパラメーターを組み合わせたストリンジェントな条件であ
る。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃を超える温度、より通常に
は約37℃を超える温度、代表的には約45℃を超える温度、より代表的には約
55℃を超える温度、好ましくは約65℃を超える温度、そしてより好ましくは
約70℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、約500m
M未満、通常、約400mM未満、より通常には、約300mM未満、代表的に
は、約200mM未満、好ましくは、約100mM未満、そしてより好ましくは
約80mM未満、さらに約20mM未満までである。しかし、パラメーターの組
み合わせは、任意の単一のパラメーターの尺度よりもさらに重要である。例えば
、WetmurおよびDavidson(1968)J.Mol.Biol.3
1:349−370(これは、本明細書中によって参考として本明細書中に援用
される)を参照のこと。
いう場合、ハイブリダイゼーション反応において代表的に制御される塩、温度、
有機溶媒、および他のパラメーターを組み合わせたストリンジェントな条件であ
る。ストリンジェントな温度条件は、通常、約30℃を超える温度、より通常に
は約37℃を超える温度、代表的には約45℃を超える温度、より代表的には約
55℃を超える温度、好ましくは約65℃を超える温度、そしてより好ましくは
約70℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、約500m
M未満、通常、約400mM未満、より通常には、約300mM未満、代表的に
は、約200mM未満、好ましくは、約100mM未満、そしてより好ましくは
約80mM未満、さらに約20mM未満までである。しかし、パラメーターの組
み合わせは、任意の単一のパラメーターの尺度よりもさらに重要である。例えば
、WetmurおよびDavidson(1968)J.Mol.Biol.3
1:349−370(これは、本明細書中によって参考として本明細書中に援用
される)を参照のこと。
【0052】
単離されたDNAは、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿
入、およびヌクレオチドストレッチの反転によって容易に改変され得る。これら
の改変は、本発明のタンパク質またはその誘導体をコードする新規なDNA配列
を生じる。これらの改変された配列は、変異体タンパク質(ムテイン)を生成す
るために、または改変種の発現を増強するために使用され得る。増強された発現
は、遺伝子増幅、増加された転写、増加された翻訳、および他の機構を含み得る
。このような変異体DCRS様誘導体は、タンパク質またはそのフラグメントの
、予め決定された変異または部位特異的変異を包含し、遺伝暗号縮重を使用する
サイレントな変異を含む。本明細書中で使用される場合「変異体DCRS3」は
、欠失、置換、または挿入のいずれかの手段によって、天然において見出される
ような他のサイトカインレセプター様タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列を有するものを除き、そうでなければ上述に記載されるようなDCRS
3の相同性の定義の中にあるポリぺプチドを含む。特に、「部位特異的変異体D
CRS3」は、表1のタンパク質と実質的な配列相同性を有するタンパク質を含
み、そして代表的に、本明細書中で開示される形態の生物学的活性または効果の
大部分を共有する。DCRS4に関しても同じことがいえる。
入、およびヌクレオチドストレッチの反転によって容易に改変され得る。これら
の改変は、本発明のタンパク質またはその誘導体をコードする新規なDNA配列
を生じる。これらの改変された配列は、変異体タンパク質(ムテイン)を生成す
るために、または改変種の発現を増強するために使用され得る。増強された発現
は、遺伝子増幅、増加された転写、増加された翻訳、および他の機構を含み得る
。このような変異体DCRS様誘導体は、タンパク質またはそのフラグメントの
、予め決定された変異または部位特異的変異を包含し、遺伝暗号縮重を使用する
サイレントな変異を含む。本明細書中で使用される場合「変異体DCRS3」は
、欠失、置換、または挿入のいずれかの手段によって、天然において見出される
ような他のサイトカインレセプター様タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミ
ノ酸配列を有するものを除き、そうでなければ上述に記載されるようなDCRS
3の相同性の定義の中にあるポリぺプチドを含む。特に、「部位特異的変異体D
CRS3」は、表1のタンパク質と実質的な配列相同性を有するタンパク質を含
み、そして代表的に、本明細書中で開示される形態の生物学的活性または効果の
大部分を共有する。DCRS4に関しても同じことがいえる。
【0053】
部位特異的変異部位は予め定められているが、変異体は部位特異的である必要
はない。哺乳動物DCRS3変異誘発は、発現と相まって、遺伝子におけるアミ
ノ酸挿入または欠失の作製によって達成され得る。置換、欠失、挿入、または多
くの組み合わせは、最終構築物で到達するために生成され得る。挿入は、アミノ
末端融合またはカルボキシ末端融合を包含する。ランダム変異誘発は、標的コド
ンで行われ得、そして発現された哺乳動物DCRS3変異体は、次いで所望の活
性についてスクリーニングされ得、構造−活性の関連性のいくつかの局面を提供
する。公知の配列を有するDNAにおいて所定の部位に置換変異を作成する方法
は、例えば、当該分野で周知であるM13プライマー変異誘発による。Samb
rookら(1989)およびAusubelら(1987年および定期補遺)
もまた参照のこと。
はない。哺乳動物DCRS3変異誘発は、発現と相まって、遺伝子におけるアミ
ノ酸挿入または欠失の作製によって達成され得る。置換、欠失、挿入、または多
くの組み合わせは、最終構築物で到達するために生成され得る。挿入は、アミノ
末端融合またはカルボキシ末端融合を包含する。ランダム変異誘発は、標的コド
ンで行われ得、そして発現された哺乳動物DCRS3変異体は、次いで所望の活
性についてスクリーニングされ得、構造−活性の関連性のいくつかの局面を提供
する。公知の配列を有するDNAにおいて所定の部位に置換変異を作成する方法
は、例えば、当該分野で周知であるM13プライマー変異誘発による。Samb
rookら(1989)およびAusubelら(1987年および定期補遺)
もまた参照のこと。
【0054】
DNAの変異は、正常には、リーディングフレームの外のコード配列に配置す
べきではなく、そして好ましくは、ループまたはヘアピンのようなmRNA二次
構造を産生するためにハイブリダイズし得る相補領域を生成しない。
べきではなく、そして好ましくは、ループまたはヘアピンのようなmRNA二次
構造を産生するためにハイブリダイズし得る相補領域を生成しない。
【0055】
BeaucageおよびCarruthers(1981)Tetra.Le
tts.22:1859−1862によって記載されるホスホロアミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を
合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによってか、ま
たはDNAポリメラーゼを使用して適切なプライマー配列で相補鎖を付加するこ
とによってのいずれかでしばしば得られる。
tts.22:1859−1862によって記載されるホスホロアミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を
合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによってか、ま
たはDNAポリメラーゼを使用して適切なプライマー配列で相補鎖を付加するこ
とによってのいずれかでしばしば得られる。
【0056】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術は、しばしば、変異誘発において適用さ
れ得る。あるいは、変異誘発プライマーは、予め決定された部位で規定された変
異を作製するために一般に使用される方法である。例えば、Innisら(編、
1990)PCR Protocols:A Guide to Method
s and Applications、Academic Press、Sa
n Diego、CA;ならびにDieffenbachおよびDveksle
r(1995;編)PCR Primer:A Laboratory Man
ual、Cold Spring Harbor Press、CSH、NYを
参照のこと。
れ得る。あるいは、変異誘発プライマーは、予め決定された部位で規定された変
異を作製するために一般に使用される方法である。例えば、Innisら(編、
1990)PCR Protocols:A Guide to Method
s and Applications、Academic Press、Sa
n Diego、CA;ならびにDieffenbachおよびDveksle
r(1995;編)PCR Primer:A Laboratory Man
ual、Cold Spring Harbor Press、CSH、NYを
参照のこと。
【0057】
本発明の特定の実施形態は、記載されるレセプターまたはリガンド配列を含む
組み合わせ組成物に関する。他の実施形態において、この配列の機能的部分が結
合されて、融合タンパク質をコードし得る。他の形態において、記載される配列
の改変体が置換され得る。
組み合わせ組成物に関する。他の実施形態において、この配列の機能的部分が結
合されて、融合タンパク質をコードし得る。他の形態において、記載される配列
の改変体が置換され得る。
【0058】
(IV.タンパク質、ペプチド)
上記されるように、本発明は、霊長類DCRS3を含み、例えば、その配列は
、表1において開示され、そして上記される。対立遺伝子および他の改変体もま
た意図され、例えば、他の配列(例えば、エピトープタグおよび機能的ドメイン
を含む)と、このような配列の部分とを組合わせる融合タンパク質を含む。
、表1において開示され、そして上記される。対立遺伝子および他の改変体もま
た意図され、例えば、他の配列(例えば、エピトープタグおよび機能的ドメイン
を含む)と、このような配列の部分とを組合わせる融合タンパク質を含む。
【0059】
本発明はまた、組換えタンパク質(例えば、これらの霊長類または齧歯類タン
パク質からのセグメントを使用する異種融合タンパク質)を提供する。異種融合
タンパク質は、天然で同じ様式において通常融合されないタンパク質またはセグ
メントの融合である。従って、別のサイトカインレセプターとDCRS3との融
合産物は、代表的なペプチド結合において融合される配列を有する連続的なタン
パク質分子であり、代表的に単一の翻訳産物として作製され、そして各供給源ペ
プチドに由来する特性(例えば、配列または抗原性)を示す。同様の概念が、異
種核酸配列に適用される。種々の示されたタンパク質の複合体への組み合わせも
また、提供される。
パク質からのセグメントを使用する異種融合タンパク質)を提供する。異種融合
タンパク質は、天然で同じ様式において通常融合されないタンパク質またはセグ
メントの融合である。従って、別のサイトカインレセプターとDCRS3との融
合産物は、代表的なペプチド結合において融合される配列を有する連続的なタン
パク質分子であり、代表的に単一の翻訳産物として作製され、そして各供給源ペ
プチドに由来する特性(例えば、配列または抗原性)を示す。同様の概念が、異
種核酸配列に適用される。種々の示されたタンパク質の複合体への組み合わせも
また、提供される。
【0060】
さらに、新しい構築物は、他の関連タンパク質(例えば、サイトカインレセプ
ターまたはToll様レセプター(特定の改変体を含む))からの類似の機能的
または構造的ドメインを組み合わせることから作製され得る。例えば、リガンド
結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新しい融合ポリペプチドまたは
フラグメント間で、「交換」され得る。例えば、Cunninghamら(19
89)Science 243:1330−1336;およびO’Dowdら(
1988)J.Biol.Chem.263:15985−15992(これら
の各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。従って、特異性
の新しい組み合わせを示す新しいキメラポリペプチドは、レセプター結合特異性
の機能的連結から生じる。例えば、他の関連のレセプター分子からのリガンド結
合ドメインは、付加され得るか、あるいは本発明のタンパク質または関連のタン
パク質の他のドメインと置換され得る。得られるタンパク質は、しばしば、ハイ
ブリッド機能および特性を有する。例えば、融合タンパク質は、特定の非細胞オ
ルガネラへの、融合タンパク質の隔離を提供するように作用し得る、標的化ドメ
インを含み得る。
ターまたはToll様レセプター(特定の改変体を含む))からの類似の機能的
または構造的ドメインを組み合わせることから作製され得る。例えば、リガンド
結合セグメントまたは他のセグメントは、異なる新しい融合ポリペプチドまたは
フラグメント間で、「交換」され得る。例えば、Cunninghamら(19
89)Science 243:1330−1336;およびO’Dowdら(
1988)J.Biol.Chem.263:15985−15992(これら
の各々は、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと。従って、特異性
の新しい組み合わせを示す新しいキメラポリペプチドは、レセプター結合特異性
の機能的連結から生じる。例えば、他の関連のレセプター分子からのリガンド結
合ドメインは、付加され得るか、あるいは本発明のタンパク質または関連のタン
パク質の他のドメインと置換され得る。得られるタンパク質は、しばしば、ハイ
ブリッド機能および特性を有する。例えば、融合タンパク質は、特定の非細胞オ
ルガネラへの、融合タンパク質の隔離を提供するように作用し得る、標的化ドメ
インを含み得る。
【0061】
候補融合パートナーおよび配列は、種々の配列データベース(例えば、Gen
Bank、c/o IntelliGenetics、Mountain Vi
ew、CA;およびBCG、University of Wisconsin
Biotechnology Computing Group、Madis
on、WI(これらは、各々本明細書中に参考として援用される)から選択され
得る。特に、表1および表3に提供されるポリペプチド配列の組み合わせが、特
に好ましい。タンパク質の改変体形態は、記載される組み合わせに置換され得る
。
Bank、c/o IntelliGenetics、Mountain Vi
ew、CA;およびBCG、University of Wisconsin
Biotechnology Computing Group、Madis
on、WI(これらは、各々本明細書中に参考として援用される)から選択され
得る。特に、表1および表3に提供されるポリペプチド配列の組み合わせが、特
に好ましい。タンパク質の改変体形態は、記載される組み合わせに置換され得る
。
【0062】
本発明は特に、サイトカイン様リガンドに結合し、そして/またはシグナル伝
達において影響されるムテインを提供する。サイトカインレセプターファミリー
の他のメンバーと、ヒトDCRS3またはDCRS4との構造アラインメントは
、保存された特徴/残基を示す。表5を参照のこと。サイトカインレセプターフ
ァミリーの他のメンバーとのヒトDCRS3またはDCRS4配列のアラインメ
ントは、種々の構造的および機能的に共有された特徴を示す。Bazanら、(
1996)Nature 379:591;Lodiら、(1994)Scie
nce 263:1762−1766;SayleおよびMilner−Whi
te(1995)TIBS 20:374−376;ならびにGronenbe
rgら(1991)Protein Engineering 4:263−2
69もまた参照のこと。
達において影響されるムテインを提供する。サイトカインレセプターファミリー
の他のメンバーと、ヒトDCRS3またはDCRS4との構造アラインメントは
、保存された特徴/残基を示す。表5を参照のこと。サイトカインレセプターフ
ァミリーの他のメンバーとのヒトDCRS3またはDCRS4配列のアラインメ
ントは、種々の構造的および機能的に共有された特徴を示す。Bazanら、(
1996)Nature 379:591;Lodiら、(1994)Scie
nce 263:1762−1766;SayleおよびMilner−Whi
te(1995)TIBS 20:374−376;ならびにGronenbe
rgら(1991)Protein Engineering 4:263−2
69もまた参照のこと。
【0063】
マウス配列またはヒト配列のいずれかでの置換が特に好ましい。逆に、リガン
ド結合相互作用領域から離れた保存的な置換は、おそらく、大部分のシグナル伝
達活性を保存し;そして細胞内ドメインから離れた保存的な置換は、おそらく、
大部分のリガンド結合性質を保存する。
ド結合相互作用領域から離れた保存的な置換は、おそらく、大部分のシグナル伝
達活性を保存し;そして細胞内ドメインから離れた保存的な置換は、おそらく、
大部分のリガンド結合性質を保存する。
【0064】
霊長類DCRS3の「誘導体」には、アミノ酸配列変異体、グリコシル化改変
体、代謝誘導体、および他の化学部分との共有結合体または凝集結合体が含まれ
る。共有結合的誘導体は、例えば、当該技術分野で周知の手段によって、DCR
S3アミノ酸側鎖またはN末端もしくはC末端で見られる基への機能性の連結に
よって調製され得る。これらの誘導体には、カルボキシル末端の、またはカルボ
キシル側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基
のO−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例え
ば、リジンまたはアルギニン)のN−アシル誘導体が非限定的に含まれ得る。ア
シル基は、C3〜C18の正常アルキルを含むアルキル部分の群から選択され、
それによってアルカノイルアロイル種を形成する。
体、代謝誘導体、および他の化学部分との共有結合体または凝集結合体が含まれ
る。共有結合的誘導体は、例えば、当該技術分野で周知の手段によって、DCR
S3アミノ酸側鎖またはN末端もしくはC末端で見られる基への機能性の連結に
よって調製され得る。これらの誘導体には、カルボキシル末端の、またはカルボ
キシル側鎖を含む残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基
のO−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基(例え
ば、リジンまたはアルギニン)のN−アシル誘導体が非限定的に含まれ得る。ア
シル基は、C3〜C18の正常アルキルを含むアルキル部分の群から選択され、
それによってアルカノイルアロイル種を形成する。
【0065】
特に、グリコシル化変化が含まれ、例えば、その合成およびプロセシング中に
、または更なるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パター
ンを改変することによって作製される。これを達成するために特に好ましい手段
は、このようなプロセシングを通常は提供する細胞に由来するグリコシル化酵素
、例えば、哺乳動物グリコシル化酵素に、ポリペプチドを曝露することによる。
脱グリコシル化酵素もまた意図される。また、他のマイナーな改変を有する同じ
一次アミノ酸配列の型を含み、これには、リン酸化アミノ酸残基(例えば、ホス
ホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン)が含まれる。
、または更なるプロセシング工程において、ポリペプチドのグリコシル化パター
ンを改変することによって作製される。これを達成するために特に好ましい手段
は、このようなプロセシングを通常は提供する細胞に由来するグリコシル化酵素
、例えば、哺乳動物グリコシル化酵素に、ポリペプチドを曝露することによる。
脱グリコシル化酵素もまた意図される。また、他のマイナーな改変を有する同じ
一次アミノ酸配列の型を含み、これには、リン酸化アミノ酸残基(例えば、ホス
ホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニン)が含まれる。
【0066】
誘導体の主要な群は、ポリペプチドの他のタンパク質と、レセプターまたはそ
のフラグメントとの共有結合体である。これらの誘導体は、N−またはC−末端
融合体のような組換え培養物中で、あるいは反応性側基によってタンパク質を架
橋することにおけるそれらの有用性について当該技術分野で公知の薬剤の使用に
よって、合成され得る。架橋剤との好ましい誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭
水化物部分、およびシステイン残基にある。
のフラグメントとの共有結合体である。これらの誘導体は、N−またはC−末端
融合体のような組換え培養物中で、あるいは反応性側基によってタンパク質を架
橋することにおけるそれらの有用性について当該技術分野で公知の薬剤の使用に
よって、合成され得る。架橋剤との好ましい誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭
水化物部分、およびシステイン残基にある。
【0067】
レセプターと他の同種または異種タンパク質との間の融合ポリペプチドもまた
提供される。同種ポリペプチドは、異なるレセプター間の融合物であり得、例え
ば、複数の異なるサイトカインリガンドの結合特異性を示すハイブリッドタンパ
ク質、または基質効果の特異性を広げるかもしくは弱め得るレセプターを生じる
。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が
、構築され得る。代表的な例は、レポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラ
ーゼ)のレセプターのセグメントまたはドメイン(例えば、リガンド結合セグメ
ント)との融合物であり、その結果、所望のリガンドの存在または位置が容易に
決定され得る。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号(これを
本明細書中で参考として援用する)を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーに
は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、細菌性β−ガラクトシ
ダーゼ、trpE、プロテインA、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Godow
skiら(1988)Science 241:812−816を参照のこと。
標識されたタンパク質は、記載されたタンパク質の組み合わせにしばしば置換さ
れる。
提供される。同種ポリペプチドは、異なるレセプター間の融合物であり得、例え
ば、複数の異なるサイトカインリガンドの結合特異性を示すハイブリッドタンパ
ク質、または基質効果の特異性を広げるかもしくは弱め得るレセプターを生じる
。同様に、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す異種融合物が
、構築され得る。代表的な例は、レポーターポリペプチド(例えば、ルシフェラ
ーゼ)のレセプターのセグメントまたはドメイン(例えば、リガンド結合セグメ
ント)との融合物であり、その結果、所望のリガンドの存在または位置が容易に
決定され得る。例えば、Dullら、米国特許第4,859,609号(これを
本明細書中で参考として援用する)を参照のこと。他の遺伝子融合パートナーに
は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、細菌性β−ガラクトシ
ダーゼ、trpE、プロテインA、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコー
ルデヒドロゲナーゼ、および酵母α接合因子が挙げられる。例えば、Godow
skiら(1988)Science 241:812−816を参照のこと。
標識されたタンパク質は、記載されたタンパク質の組み合わせにしばしば置換さ
れる。
【0068】
BeaucageおよびCarruthers(1981)Tetra.Le
tts.22:1859−1862によって記載されたホスホロアミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を
合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによって、また
は適切なプライマー配列を有するDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加す
ることによってのいずれかでしばしば得られる。
tts.22:1859−1862によって記載されたホスホロアミダイト法は
、適切な合成DNAフラグメントを産生する。二本鎖フラグメントは、相補鎖を
合成し、そして適切な条件下で互いの鎖をアニーリングすることによって、また
は適切なプライマー配列を有するDNAポリメラーゼを使用して相補鎖を付加す
ることによってのいずれかでしばしば得られる。
【0069】
このようなポリペプチドはまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、または
他の部分の付加もしくは除去によって化学的に改変されているアミノ酸残基、特
にリン酸基に類似の分子形状を有する残基を有し得る。いくつかの実施形態では
、改変は、有用な標識試薬であり、または精製標的、例えば、アフィニティーリ
ガンドとして役立つ。
他の部分の付加もしくは除去によって化学的に改変されているアミノ酸残基、特
にリン酸基に類似の分子形状を有する残基を有し得る。いくつかの実施形態では
、改変は、有用な標識試薬であり、または精製標的、例えば、アフィニティーリ
ガンドとして役立つ。
【0070】
融合タンパク質は、代表的に、組換え核酸法によってまたは合成ポリぺプチド
法によってのいずれかで作製される。核酸操作および発現についての技術は、例
えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:
A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻、Cold S
pring Harbor Laboratory、およびAusubelら(
編)(1987および定期的な補遺)Current Protocols i
n Molecular Biology、Greene/Wiley、New
York(これらはそれぞれ、本明細書中に参考として援用される)において
、一般に記載される。ポリぺプチドの合成についての技術は、例えば、Merr
ifield(1963)J. Amer. Chem.Soc. 85:21
49−2156;Merrifield(1986)Science 232:
341−347;およびAthertonら(1989)Solid Phas
e Peptide Synthesis: A Practical App
roach、IRL Press、Oxford;(これらのそれぞれは、本明
細書中に参考として援用される)において記載される。より長いポリぺプチドを
作製するための方法について、Dawsonら(1994)Science 2
66:776−779もまた参照のこと。
法によってのいずれかで作製される。核酸操作および発現についての技術は、例
えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:
A Laboratory Manual(第2版)第1〜3巻、Cold S
pring Harbor Laboratory、およびAusubelら(
編)(1987および定期的な補遺)Current Protocols i
n Molecular Biology、Greene/Wiley、New
York(これらはそれぞれ、本明細書中に参考として援用される)において
、一般に記載される。ポリぺプチドの合成についての技術は、例えば、Merr
ifield(1963)J. Amer. Chem.Soc. 85:21
49−2156;Merrifield(1986)Science 232:
341−347;およびAthertonら(1989)Solid Phas
e Peptide Synthesis: A Practical App
roach、IRL Press、Oxford;(これらのそれぞれは、本明
細書中に参考として援用される)において記載される。より長いポリぺプチドを
作製するための方法について、Dawsonら(1994)Science 2
66:776−779もまた参照のこと。
【0071】
本発明はまた、アミノ酸配列またはグリコシル化における改変以外DCRS3
またはDCRS4の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分と
の共有結合的なまたは凝集的な会合を含み得る。これらの誘導体は、一般に、3
つのクラスに分類される:(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合的な
改変、ならびに(3)例えば、細胞膜との、吸着複合体。このような共有結合誘
導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、
またはレセプターまたは他の結合分子(例えば、抗体)のアフィニティー精製の
ためのような精製方法において、有用である。例えば、サイトカインリガンドは
、サイトカインレセプター、抗体、または他の類似の分子のアッセイまたは精製
における使用のために、当該分野において周知である方法により、臭化シアン活
性化Sepharoseのような固体支持体へ共有結合によって固定化され得る
か、または、グルタルアルデヒド架橋を用いるかまたは用いないで、ポリオレフ
ィン表面上に吸着され得る。リガンドはまた、検出可能な基で標識され得、例え
ばクロラミンT手順によって放射性ヨウ素化(radioiodinate)さ
れ得るか、希土類キレートに共有結合され得るか、または診断アッセイにおける
使用のために、別の蛍光部分に結合され得る。
またはDCRS4の誘導体の使用を意図する。このような誘導体は、化学部分と
の共有結合的なまたは凝集的な会合を含み得る。これらの誘導体は、一般に、3
つのクラスに分類される:(1)塩、(2)側鎖および末端残基の共有結合的な
改変、ならびに(3)例えば、細胞膜との、吸着複合体。このような共有結合誘
導体または凝集誘導体は、免疫原として、イムノアッセイにおける試薬として、
またはレセプターまたは他の結合分子(例えば、抗体)のアフィニティー精製の
ためのような精製方法において、有用である。例えば、サイトカインリガンドは
、サイトカインレセプター、抗体、または他の類似の分子のアッセイまたは精製
における使用のために、当該分野において周知である方法により、臭化シアン活
性化Sepharoseのような固体支持体へ共有結合によって固定化され得る
か、または、グルタルアルデヒド架橋を用いるかまたは用いないで、ポリオレフ
ィン表面上に吸着され得る。リガンドはまた、検出可能な基で標識され得、例え
ばクロラミンT手順によって放射性ヨウ素化(radioiodinate)さ
れ得るか、希土類キレートに共有結合され得るか、または診断アッセイにおける
使用のために、別の蛍光部分に結合され得る。
【0072】
本発明の組み合わせ物(combination)(例えば、DCRS3また
はDCRS4を含む)は、記載される組み合わせ物に特異的な(例えば、他のサ
イトカインレセプターファミリーメンバーの間を区別し得る)、抗血清または抗
体の生成のための免疫原として使用され得る。複合体は、タンパク質を含有する
不純な調製物の種々の形態での免疫化によって調製されたモノクローナル抗体ま
たは抗原結合フラグメントをスクリーニングするために使用され得る。特に、用
語「抗体」はまた、天然の抗体の抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fa
b2、Fvなど)を包含する。精製されたDCRS3はまた、上昇したレベルの
発現の存在に応答して産生された抗体、または内因性レセプターに対する抗体産
生を導く免疫障害を検出するための試薬として使用され得る。さらに、DCRS
3フラグメントはまた、すぐ下に記載されるように、本発明の抗体を産生するた
めの免疫原として役立ち得る。例えば、本発明は、表1に示されるアミノ酸配列
、そのフラグメント、または種々の相同的なペプチドに対して結合親和性を有す
るか、またはそれに対して惹起される抗体を意図する。特に、本発明は、ネイテ
ィブなDCRS3の外部タンパク質表面で曝露されることが予測されるか、また
は実際に曝露される、特異的なフラグメントに対し、結合親和性を有するかまた
はそれに対して惹起された抗体を意図する。タンパク質の組み合わせの複合体は
また、有用であり、そしてそれに対する抗体調製物が作製され得る。
はDCRS4を含む)は、記載される組み合わせ物に特異的な(例えば、他のサ
イトカインレセプターファミリーメンバーの間を区別し得る)、抗血清または抗
体の生成のための免疫原として使用され得る。複合体は、タンパク質を含有する
不純な調製物の種々の形態での免疫化によって調製されたモノクローナル抗体ま
たは抗原結合フラグメントをスクリーニングするために使用され得る。特に、用
語「抗体」はまた、天然の抗体の抗原結合フラグメント(例えば、Fab、Fa
b2、Fvなど)を包含する。精製されたDCRS3はまた、上昇したレベルの
発現の存在に応答して産生された抗体、または内因性レセプターに対する抗体産
生を導く免疫障害を検出するための試薬として使用され得る。さらに、DCRS
3フラグメントはまた、すぐ下に記載されるように、本発明の抗体を産生するた
めの免疫原として役立ち得る。例えば、本発明は、表1に示されるアミノ酸配列
、そのフラグメント、または種々の相同的なペプチドに対して結合親和性を有す
るか、またはそれに対して惹起される抗体を意図する。特に、本発明は、ネイテ
ィブなDCRS3の外部タンパク質表面で曝露されることが予測されるか、また
は実際に曝露される、特異的なフラグメントに対し、結合親和性を有するかまた
はそれに対して惹起された抗体を意図する。タンパク質の組み合わせの複合体は
また、有用であり、そしてそれに対する抗体調製物が作製され得る。
【0073】
レセプターリガンドに応答する生理学的応答のブロックは、おそらく競合的阻
害を介する、レセプターに対するリガンドの結合の阻害から生じ得る。従って、
本発明のインビトロアッセイにおいて、抗体、またはこれらの抗体の抗原結合セ
グメント、または固相基体に付着されるフラグメントを、しばしば使用する。こ
れらのアッセイはまた、リガンド結合領域の変異および改変、または他の変異お
よび改変(例えば、シグナル伝達または酵素機能に影響する)のいずれかの効果
の診断的な決定を可能にする。
害を介する、レセプターに対するリガンドの結合の阻害から生じ得る。従って、
本発明のインビトロアッセイにおいて、抗体、またはこれらの抗体の抗原結合セ
グメント、または固相基体に付着されるフラグメントを、しばしば使用する。こ
れらのアッセイはまた、リガンド結合領域の変異および改変、または他の変異お
よび改変(例えば、シグナル伝達または酵素機能に影響する)のいずれかの効果
の診断的な決定を可能にする。
【0074】
本発明はまた、競合的な薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、例えば
、レセプター複合体またはフラグメントに対する中和抗体は、リガンドまたは他
の抗体への結合について、試験化合物と競合する。この様式において、中和抗体
またはフラグメントは、レセプターに対する1つ以上の結合部位を共有するポリ
ぺプチドの存在を検出するために使用され得、そしてそうでなければリガンドを
結合し得る、レセプターにおける結合部位を占有するためにまた使用され得る。
、レセプター複合体またはフラグメントに対する中和抗体は、リガンドまたは他
の抗体への結合について、試験化合物と競合する。この様式において、中和抗体
またはフラグメントは、レセプターに対する1つ以上の結合部位を共有するポリ
ぺプチドの存在を検出するために使用され得、そしてそうでなければリガンドを
結合し得る、レセプターにおける結合部位を占有するためにまた使用され得る。
【0075】
(V.核酸およびタンパク質の作製)
タンパク質またはそのフラグメントをコードするDNAは、化学合成、cDN
Aライブラリーのスクリーニングによって、または広範な種々の細胞株もしくは
組識サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングによって入手
され得る。天然の配列は、標準的な方法、および本明細書中(例えば、表1また
は表3)に提供される配列を使用して、単離され得る。他の種対応物は、ハイブ
リダイゼーション技術によって、または種々のPCR技術によって、配列データ
ベース(例えば、GenBank)における検索と組合わせて、またはこの検索
によって、同定され得る。
Aライブラリーのスクリーニングによって、または広範な種々の細胞株もしくは
組識サンプルから調製されたゲノムライブラリーのスクリーニングによって入手
され得る。天然の配列は、標準的な方法、および本明細書中(例えば、表1また
は表3)に提供される配列を使用して、単離され得る。他の種対応物は、ハイブ
リダイゼーション技術によって、または種々のPCR技術によって、配列データ
ベース(例えば、GenBank)における検索と組合わせて、またはこの検索
によって、同定され得る。
【0076】
このDNAは、完全長のレセプターまたはフラグメントの合成のために、広範
な種々の宿主細胞において発現され得、次いで完全長のレセプターまたはフラグ
メントは、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために
;結合研究のために;改変されたリガンド結合またはキナーゼ/ホスファターゼ
ドメインの構築および発現のために;および構造/機能研究のために、使用され
得る。改変体またはフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトラ
ンスフェクトされる宿主細胞において発現され得る。これらの分子は、組換え宿
主に由来する分子以外のタンパク質または細胞性の夾雑物を実質的に含有しない
ことが可能であり、それゆえ、薬学的に受容可能なキャリアおよび/または希釈
剤と組合わされる場合、薬学的組成物において特に有用である。タンパク質、ま
たはその部分は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。記載されたタ
ンパク質、またはそれらをコードする核酸の組み合わせは、特に興味深い。
な種々の宿主細胞において発現され得、次いで完全長のレセプターまたはフラグ
メントは、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために
;結合研究のために;改変されたリガンド結合またはキナーゼ/ホスファターゼ
ドメインの構築および発現のために;および構造/機能研究のために、使用され
得る。改変体またはフラグメントは、適切な発現ベクターで形質転換またはトラ
ンスフェクトされる宿主細胞において発現され得る。これらの分子は、組換え宿
主に由来する分子以外のタンパク質または細胞性の夾雑物を実質的に含有しない
ことが可能であり、それゆえ、薬学的に受容可能なキャリアおよび/または希釈
剤と組合わされる場合、薬学的組成物において特に有用である。タンパク質、ま
たはその部分は、他のタンパク質との融合物として発現され得る。記載されたタ
ンパク質、またはそれらをコードする核酸の組み合わせは、特に興味深い。
【0077】
発現ベクターは、代表的には、所望のレセプター遺伝子またはそのフラグメン
ト(通常、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子制御エレメントに作
動可能に連結される)を含有する自己複製するDNAまたはRNA構築物である
。これらの制御エレメントは、適切な宿主内の発現に影響し得る。複数の遺伝子
が、協調的に発現され得、そしてポリシストロニックメッセージ上にあり得る。
発現をもたらすために必要な制御エレメントの特定の型は、結果として使用され
る宿主細胞に依存する。一般に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモータ
ー系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的に、転写プ
ロモーター、必要に応じて、転写の開始を制御するオペレーター、mRNAの発
現のレベルを上昇する転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードす
る配列、ならびに転写および翻訳を終結する配列を含み得る。発現ベクターはま
た、通常、ベクターが宿主細胞から独立して複製することを可能する、複製の起
点を含む。
ト(通常、適切な宿主細胞において認識される適切な遺伝子制御エレメントに作
動可能に連結される)を含有する自己複製するDNAまたはRNA構築物である
。これらの制御エレメントは、適切な宿主内の発現に影響し得る。複数の遺伝子
が、協調的に発現され得、そしてポリシストロニックメッセージ上にあり得る。
発現をもたらすために必要な制御エレメントの特定の型は、結果として使用され
る宿主細胞に依存する。一般に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモータ
ー系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得、そして代表的に、転写プ
ロモーター、必要に応じて、転写の開始を制御するオペレーター、mRNAの発
現のレベルを上昇する転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードす
る配列、ならびに転写および翻訳を終結する配列を含み得る。発現ベクターはま
た、通常、ベクターが宿主細胞から独立して複製することを可能する、複製の起
点を含む。
【0078】
本発明のベクターとしては、記載されるようなタンパク質の組み合わせ、また
は生物学的に活性な等価なポリぺプチドをコードするDNAを含むベクターが挙
げられる。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして選択マー
カーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主におい
て、このようなタンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得る、このよ
うな発現ベクターの使用を意図し、ここでベクターは、宿主と適合性であり、お
よび真核生物cDNAはベクターに挿入され、それによってベクターを含む宿主
の増殖は、問題のcDNAを発現する。通常、発現ベクターは、それらの宿主細
胞における安定な複製のために、または細胞あたりの所望の遺伝子の総コピー数
を非常に増加する増幅のために、設計される。発現ベクターが、宿主細胞におい
て複製することが、いつも必要であるわけではなく、例えば、宿主細胞によって
認識される複製起点を含まないベクターを使用して、種々の宿主において、タン
パク質またはそのフラグメントの一過性の発現を生じることが可能である。組換
えによる、宿主DNAへの、タンパク質をコードする部分の組込みを引き起こす
ベクターの使用はまた、可能である。
は生物学的に活性な等価なポリぺプチドをコードするDNAを含むベクターが挙
げられる。DNAは、ウイルスプロモーターの制御下にあり得、そして選択マー
カーをコードし得る。本発明はさらに、原核生物宿主または真核生物宿主におい
て、このようなタンパク質をコードする真核生物cDNAを発現し得る、このよ
うな発現ベクターの使用を意図し、ここでベクターは、宿主と適合性であり、お
よび真核生物cDNAはベクターに挿入され、それによってベクターを含む宿主
の増殖は、問題のcDNAを発現する。通常、発現ベクターは、それらの宿主細
胞における安定な複製のために、または細胞あたりの所望の遺伝子の総コピー数
を非常に増加する増幅のために、設計される。発現ベクターが、宿主細胞におい
て複製することが、いつも必要であるわけではなく、例えば、宿主細胞によって
認識される複製起点を含まないベクターを使用して、種々の宿主において、タン
パク質またはそのフラグメントの一過性の発現を生じることが可能である。組換
えによる、宿主DNAへの、タンパク質をコードする部分の組込みを引き起こす
ベクターの使用はまた、可能である。
【0079】
本明細書中で使用される場合、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリ
オファージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主のゲノムへのDNA
フラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動
可能に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む特殊化さ
れたベクターである。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用される形態であ
るが、等価な機能を提供し、および当該分野において公知であるか、または公知
になる、全ての他の形態は、本明細書における使用に適切である。例えば、Po
uwelsら(1985および補遺)Cloning Vectors:A L
aboratory Manual、Elsevier、N.Y.、およびRo
driquezら(編、1988)Vectors:A Survey of
Molecular Cloning Vectors and Their
Uses、Buttersworth、Boston(これらは本明細書中に参
考として援用される)を参照のこと。
オファージ、組込み可能なDNAフラグメント、および宿主のゲノムへのDNA
フラグメントの組込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、作動
可能に連結された遺伝子の発現をもたらす遺伝子制御エレメントを含む特殊化さ
れたベクターである。プラスミドは、ベクターの最も一般に使用される形態であ
るが、等価な機能を提供し、および当該分野において公知であるか、または公知
になる、全ての他の形態は、本明細書における使用に適切である。例えば、Po
uwelsら(1985および補遺)Cloning Vectors:A L
aboratory Manual、Elsevier、N.Y.、およびRo
driquezら(編、1988)Vectors:A Survey of
Molecular Cloning Vectors and Their
Uses、Buttersworth、Boston(これらは本明細書中に参
考として援用される)を参照のこと。
【0080】
形質転換された細胞は、組換えDNA技術を使用して構築されたベクターで形
質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞であ
る。形質転換された宿主細胞は、通常、所望のタンパク質を発現するが、そのD
NAのクローニング、増幅、および操作の目的のために、本発明のタンパク質を
発現する必要はない。本発明はさらに、栄養培地において、形質転換された細胞
を培養することを意図し、従って、タンパク質が、蓄積することを可能する。タ
ンパク質は、培養物または特定の場合において培養培地のいずれかから、回収さ
れ得る。
質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳動物細胞であ
る。形質転換された宿主細胞は、通常、所望のタンパク質を発現するが、そのD
NAのクローニング、増幅、および操作の目的のために、本発明のタンパク質を
発現する必要はない。本発明はさらに、栄養培地において、形質転換された細胞
を培養することを意図し、従って、タンパク質が、蓄積することを可能する。タ
ンパク質は、培養物または特定の場合において培養培地のいずれかから、回収さ
れ得る。
【0081】
本発明の目的のために、核配列は、それが互いに機能的に関連する場合、作動
可能に連結している。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは
、それがプレタンパク質として発現されるか、またはポリペプチドを細胞膜もし
くはそのポリペプチドの分泌へと指向させるのに関与する場合、そのポリペプチ
ドに作動可能に連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を
制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている;リボソーム結合部位は
、それが翻訳を可能にする位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されて
いる。通常、作動可能な連結とは、連続でかつインリーディングフレームである
ことを意味するが、しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝子エレメン
トは、オペレーター配列に連続して連結していないが、なお結合しており、これ
は次いで発現を制御する。
可能に連結している。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのDNAは
、それがプレタンパク質として発現されるか、またはポリペプチドを細胞膜もし
くはそのポリペプチドの分泌へと指向させるのに関与する場合、そのポリペプチ
ドに作動可能に連結されている。プロモーターは、それがポリペプチドの転写を
制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている;リボソーム結合部位は
、それが翻訳を可能にする位置にある場合、コード配列に作動可能に連結されて
いる。通常、作動可能な連結とは、連続でかつインリーディングフレームである
ことを意味するが、しかし、リプレッサー遺伝子のような特定の遺伝子エレメン
トは、オペレーター配列に連続して連結していないが、なお結合しており、これ
は次いで発現を制御する。
【0082】
適切な宿主細胞は、例えば、原核生物、下等真核生物および高等真核生物を含
む。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物を含む(例えば、E
.coliおよびB.subtilis)。下等真核生物は、酵母(例えば、S
.cerevisiaeおよびPichia)、およびDictyosteli
um属の種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源(例えば、昆虫細胞および
鳥類)および哺乳動物起源(例えば、ヒト、霊長類および齧歯類)の動物細胞か
ら樹立された組織培養細胞株を含む。
む。原核生物は、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物を含む(例えば、E
.coliおよびB.subtilis)。下等真核生物は、酵母(例えば、S
.cerevisiaeおよびPichia)、およびDictyosteli
um属の種を含む。高等真核生物は、非哺乳動物起源(例えば、昆虫細胞および
鳥類)および哺乳動物起源(例えば、ヒト、霊長類および齧歯類)の動物細胞か
ら樹立された組織培養細胞株を含む。
【0083】
原核生物宿主ベクター系は、多数の異なる種について広汎な種々のベクターを
含む。本明細書において使用される場合、E.coliおよびそのベクターは、
他の原核生物において使用される等価なベクターを包含するために遺伝的に使用
される。DNAを増幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその
多くの誘導体である。DNAを増幅するための代表的なベクターは、pBR32
2または多くのその誘導体である。レセプターまたはそのフラグメントを発現す
るために使用され得るベクターとしては、例えば、以下を含有するベクターが挙
げられるが、これらに限定されない:lacプロモーター(pUCシリーズ);
trpプロモーター(pBR322−trp);Ippプロモーター(pINシ
リーズ);λ−pPまたはpRプロモーター(pOTS);またはハイブリッド
プロモーター(例えば、ptac(pDR540))。Brosiusら、(1
988)「Expression Vectors Employing La
mbda−、trp−、lac−、and Ipp−derived Prom
otors」Vectors:A Survey of Molecular
Cloning Vectors and Their Uses(Rodri
guezおよびDenhardt編)、Buttersworth、Bosto
n、第10章、205−236頁(本明細書中で参考として援用される)を参照
のこと。
含む。本明細書において使用される場合、E.coliおよびそのベクターは、
他の原核生物において使用される等価なベクターを包含するために遺伝的に使用
される。DNAを増幅するための代表的なベクターは、pBR322またはその
多くの誘導体である。DNAを増幅するための代表的なベクターは、pBR32
2または多くのその誘導体である。レセプターまたはそのフラグメントを発現す
るために使用され得るベクターとしては、例えば、以下を含有するベクターが挙
げられるが、これらに限定されない:lacプロモーター(pUCシリーズ);
trpプロモーター(pBR322−trp);Ippプロモーター(pINシ
リーズ);λ−pPまたはpRプロモーター(pOTS);またはハイブリッド
プロモーター(例えば、ptac(pDR540))。Brosiusら、(1
988)「Expression Vectors Employing La
mbda−、trp−、lac−、and Ipp−derived Prom
otors」Vectors:A Survey of Molecular
Cloning Vectors and Their Uses(Rodri
guezおよびDenhardt編)、Buttersworth、Bosto
n、第10章、205−236頁(本明細書中で参考として援用される)を参照
のこと。
【0084】
下等真核生物(例えば、酵母およびDictyostelium)は、DCR
S3またはDCRS4配列含有ベクターで形質転換され得る。本発明の目的のた
めに、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母Saccharomyces
cerevisiaeである。これは、一般的に下等真核生物を代表するよう
に使用されるが、多くの他の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは
、代表的に、複製起点(組み込み型でない場合)、選択遺伝子、プロモーター、
レセプターまたはそのフラグメントをコードするDNA、ならびに翻訳終結、ポ
リアデニル化および転写終結のための配列からなる。酵母のための適切な発現ベ
クターは、3−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび種々の他の解糖系酵素遺伝子
プロモーターのような構成的プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ
2プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモータ
ーが挙げられる。適切なベクターとしては、以下の型の誘導体が挙げられる:自
己複製性低コピー数(例えば、YRpシリーズ)、自己複製性高コピー数(例え
ば、YEpシリーズ);組み込み型(例えば、YIpシリーズ)またはミニ染色
体(例えば、YCpシリーズ)。
S3またはDCRS4配列含有ベクターで形質転換され得る。本発明の目的のた
めに、最も一般的な下等真核生物宿主は、パン酵母Saccharomyces
cerevisiaeである。これは、一般的に下等真核生物を代表するよう
に使用されるが、多くの他の株および種もまた利用可能である。酵母ベクターは
、代表的に、複製起点(組み込み型でない場合)、選択遺伝子、プロモーター、
レセプターまたはそのフラグメントをコードするDNA、ならびに翻訳終結、ポ
リアデニル化および転写終結のための配列からなる。酵母のための適切な発現ベ
クターは、3−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび種々の他の解糖系酵素遺伝子
プロモーターのような構成的プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ
2プロモーターまたはメタロチオネインプロモーターのような誘導性プロモータ
ーが挙げられる。適切なベクターとしては、以下の型の誘導体が挙げられる:自
己複製性低コピー数(例えば、YRpシリーズ)、自己複製性高コピー数(例え
ば、YEpシリーズ);組み込み型(例えば、YIpシリーズ)またはミニ染色
体(例えば、YCpシリーズ)。
【0085】
高等真核生物組織培養細胞は、通常には、機能的に活性なインターロイキンま
たはレセプタータンパク質の発現のための好ましい宿主細胞である。原理的に、
多くの高等真核生物組織培養細胞株(例えば、昆虫バキュロウイルス系)が、無
脊椎動物供給源または脊椎動物供給源にかかわらず、実用可能である。しかし、
哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクショ
ンおよび増殖は、慣用的手段となっている。有用な細胞株の例は、HeLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、乳児ラット腎臓(BRK)細
胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル(COS)細胞株が挙げられる。こ
のような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳
開始部位、RNAスプライス部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニ
ル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺
伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス
、SV40、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルス
のような供給源由来のプロモーターを含有する、プラスミド、ウイルス、あるい
はレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA
1;pCD(Okayamaら、(1985)Mol.Cell Biol.5
:1136−1142を参照のこと);pMC1neo PolyA(Thom
asら、(1987)Cell 51:503−512を参照のこと);および
バキュロウイルスベクター(例えば、pAC373またはpAC610)。
たはレセプタータンパク質の発現のための好ましい宿主細胞である。原理的に、
多くの高等真核生物組織培養細胞株(例えば、昆虫バキュロウイルス系)が、無
脊椎動物供給源または脊椎動物供給源にかかわらず、実用可能である。しかし、
哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクショ
ンおよび増殖は、慣用的手段となっている。有用な細胞株の例は、HeLa細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、乳児ラット腎臓(BRK)細
胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株、およびサル(COS)細胞株が挙げられる。こ
のような細胞株のための発現ベクターは、通常、複製起点、プロモーター、翻訳
開始部位、RNAスプライス部位(ゲノムDNAを使用する場合)、ポリアデニ
ル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常、選択遺
伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス
、SV40、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルス
のような供給源由来のプロモーターを含有する、プラスミド、ウイルス、あるい
はレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表的な例は、pCDNA
1;pCD(Okayamaら、(1985)Mol.Cell Biol.5
:1136−1142を参照のこと);pMC1neo PolyA(Thom
asら、(1987)Cell 51:503−512を参照のこと);および
バキュロウイルスベクター(例えば、pAC373またはpAC610)。
【0086】
分泌タンパク質およびいくつかの膜タンパク質について、オープンリーディン
グフレームは、通常、そのN末端でシグナルペプチドに共有結合的に連結されて
いる成熟産物または分泌産物からなるポリペプチドをコードする。このシグナル
ペプチドは、成熟(または、活性)ポリペプチドの分泌前に切断される。切断部
位は、経験則(例えば、von−Heijne(1986)Nucleic A
cids Research 14:4683−4690およびNielsen
ら(1997)Protein Eng.10:1−12)から高度な正確性で
予測され得、そしてシグナルペプチドの正確なアミノ酸組成は、その機能に重要
ではないようである(例えば、Randallら(1989)Science
243:1156−1159;Kaiserら(1987)Science 2
35:312−317)。本発明の成熟タンパク質は、標準的な方法を使用して
容易に決定され得る。
グフレームは、通常、そのN末端でシグナルペプチドに共有結合的に連結されて
いる成熟産物または分泌産物からなるポリペプチドをコードする。このシグナル
ペプチドは、成熟(または、活性)ポリペプチドの分泌前に切断される。切断部
位は、経験則(例えば、von−Heijne(1986)Nucleic A
cids Research 14:4683−4690およびNielsen
ら(1997)Protein Eng.10:1−12)から高度な正確性で
予測され得、そしてシグナルペプチドの正確なアミノ酸組成は、その機能に重要
ではないようである(例えば、Randallら(1989)Science
243:1156−1159;Kaiserら(1987)Science 2
35:312−317)。本発明の成熟タンパク質は、標準的な方法を使用して
容易に決定され得る。
【0087】
特定のグリコシル化パターンまたは規定されたグリコシル化パターンを提供す
る系においてこれらのポリペプチドを発現することが、しばしば所望される。こ
の場合において、通常のパターンは、その発現系によって自然に提供されるパタ
ーンである。しかし、このパターンは、このポリペプチド(例えば、非グリコシ
ル化形態)を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露す
ることによって、改変可能である。例えば、レセプター遺伝子を、哺乳動物また
は他のグリコシル化酵素をコードする1以上の遺伝子と同時形質転換し得る。こ
のアプローチを使用して、特定の哺乳動物グリコシル化パターンが、原核生物ま
たは他の細胞において達成可能である。原核生物細胞における発現は、代表的に
、タンパク質の非グリコシル化形態を導く。
る系においてこれらのポリペプチドを発現することが、しばしば所望される。こ
の場合において、通常のパターンは、その発現系によって自然に提供されるパタ
ーンである。しかし、このパターンは、このポリペプチド(例えば、非グリコシ
ル化形態)を、異種発現系に導入された適切なグリコシル化タンパク質に曝露す
ることによって、改変可能である。例えば、レセプター遺伝子を、哺乳動物また
は他のグリコシル化酵素をコードする1以上の遺伝子と同時形質転換し得る。こ
のアプローチを使用して、特定の哺乳動物グリコシル化パターンが、原核生物ま
たは他の細胞において達成可能である。原核生物細胞における発現は、代表的に
、タンパク質の非グリコシル化形態を導く。
【0088】
DCRS3またはDCRS4の供給源は、上記のような組換えDCRSを発現
する真核生物または原核生物宿主であり得る。この供給源はまた、細胞株であり
得るが、他の哺乳動物細胞株もまた、本発明に意図され、好ましい細胞株は、ヒ
ト種由来である。
する真核生物または原核生物宿主であり得る。この供給源はまた、細胞株であり
得るが、他の哺乳動物細胞株もまた、本発明に意図され、好ましい細胞株は、ヒ
ト種由来である。
【0089】
現在配列が公知であるので、霊長類のDCRS3またはDCRS4、そのフラ
グメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調
製され得る。これらは、以下に記載されるようなプロセスを含む:Stewar
tおよびYoung(1984)Solid Phase Peptide S
ynthesis、Pierce Chemical Co.、Rockfor
d、IL;BodanszkyおよびBodanszky(1984)The
Practice of Peptide Synthesis、Spring
er−Verlag、New York;およびBodanszky(1984
)The Principles of Peptide Synthesis
、Springer−Verlag、New York(これらは全て、本明細
書中に参考として援用される)。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、
酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス(例えば、p−
ニトロフェニルエステル、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシア
ノメチルエステル)、カルボジイミダゾールプロセス、酸化還元プロセス、また
はジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)/付加プロセスが使用され得る
。固相合成および液相合成の両方は、上記のプロセスに適用可能である。類似の
技術が、部分的なDCRS3またはDCRS4配列と共に使用され得る。
グメントまたは誘導体は、ペプチドを合成するための従来のプロセスによって調
製され得る。これらは、以下に記載されるようなプロセスを含む:Stewar
tおよびYoung(1984)Solid Phase Peptide S
ynthesis、Pierce Chemical Co.、Rockfor
d、IL;BodanszkyおよびBodanszky(1984)The
Practice of Peptide Synthesis、Spring
er−Verlag、New York;およびBodanszky(1984
)The Principles of Peptide Synthesis
、Springer−Verlag、New York(これらは全て、本明細
書中に参考として援用される)。例えば、アジドプロセス、酸塩化物プロセス、
酸無水物プロセス、混合無水物プロセス、活性エステルプロセス(例えば、p−
ニトロフェニルエステル、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはシア
ノメチルエステル)、カルボジイミダゾールプロセス、酸化還元プロセス、また
はジシクロヘキシルカルボジイミド(DCCD)/付加プロセスが使用され得る
。固相合成および液相合成の両方は、上記のプロセスに適用可能である。類似の
技術が、部分的なDCRS3またはDCRS4配列と共に使用され得る。
【0090】
DCRS3またはDCRS4タンパク質、フラグメントまたは誘導体が、ペプ
チド合成において代表的に使用されるような、上記のプロセスに従って適切に調
製され、これは、一般に、いわゆる段階プロセス(これは、アミノ酸を末端アミ
ノ酸に1つずつ順番に縮合させる工程を含む)によるか、または末端アミノ酸に
ペプチドフラグメントを結合させることによる。結合反応において使用されない
アミノ基は、不正確な位置での結合を予防するために保護されねばならない。
チド合成において代表的に使用されるような、上記のプロセスに従って適切に調
製され、これは、一般に、いわゆる段階プロセス(これは、アミノ酸を末端アミ
ノ酸に1つずつ順番に縮合させる工程を含む)によるか、または末端アミノ酸に
ペプチドフラグメントを結合させることによる。結合反応において使用されない
アミノ基は、不正確な位置での結合を予防するために保護されねばならない。
【0091】
固相合成が適用される場合、C末端アミノ酸は、そのカルボキシル基を介して
不溶性キャリアまたは支持体に結合される。その不溶性キャリアは、それが反応
性カルボキシル基への結合能を有する限り、特に限定されない。このような不溶
性のキャリアの例は、ハロメチル樹脂(例えば、クロロメチル樹脂またはブロモ
メチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert−アルキルオキ
シカルボニルヒドラジド化樹脂など)を含む。
不溶性キャリアまたは支持体に結合される。その不溶性キャリアは、それが反応
性カルボキシル基への結合能を有する限り、特に限定されない。このような不溶
性のキャリアの例は、ハロメチル樹脂(例えば、クロロメチル樹脂またはブロモ
メチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、フェノール樹脂、tert−アルキルオキ
シカルボニルヒドラジド化樹脂など)を含む。
【0092】
アミノ基保護アミノ酸は、その活性化されたカルボキシル基と先に形成された
ペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチ
ドを段階的に合成する。完全な配列を合成した後、ペプチドを、不溶性キャリア
から分離して、そのペプチドを産生する。この固相アプローチは、Merrif
ieldら(1963)、J.Am.Chem.Soc.85:2149−21
56(本明細書中に参考として援用される)によって一般的に記載される。
ペプチドまたは鎖の反応性アミノ基との縮合を介して順番に結合されて、ペプチ
ドを段階的に合成する。完全な配列を合成した後、ペプチドを、不溶性キャリア
から分離して、そのペプチドを産生する。この固相アプローチは、Merrif
ieldら(1963)、J.Am.Chem.Soc.85:2149−21
56(本明細書中に参考として援用される)によって一般的に記載される。
【0093】
調製されたタンパク質およびそのフラグメントは、ペプチド分離の手段(例え
ば、抽出、沈澱、電気泳動および種々の形態のクロマトグラフィーなど)によっ
て反応混合物から単離および精製され得る。本発明のレセプターは、その所望さ
れる用途に応じて、種々の程度の純度で入手され得る。精製は、本明細書に開示
されるタンパク質精製技術の使用によって(以下を参照のこと)、または免疫吸
着アフィニティークロマトグラフィーの方法において記載される本明細書中の抗
体の使用によって、達成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフ
ィーは、例えば、まずその抗体を固相支持体に結合し、次いでその結合された抗
体に、適切な細胞の可溶化溶解物、レセプターを発現する他の細胞の溶解物、あ
るいはDNA技術の結果としてこのタンパク質を産生する細胞の溶解物または上
清を接触させることによって実行される。下記を参照のこと。
ば、抽出、沈澱、電気泳動および種々の形態のクロマトグラフィーなど)によっ
て反応混合物から単離および精製され得る。本発明のレセプターは、その所望さ
れる用途に応じて、種々の程度の純度で入手され得る。精製は、本明細書に開示
されるタンパク質精製技術の使用によって(以下を参照のこと)、または免疫吸
着アフィニティークロマトグラフィーの方法において記載される本明細書中の抗
体の使用によって、達成され得る。この免疫吸着アフィニティークロマトグラフ
ィーは、例えば、まずその抗体を固相支持体に結合し、次いでその結合された抗
体に、適切な細胞の可溶化溶解物、レセプターを発現する他の細胞の溶解物、あ
るいはDNA技術の結果としてこのタンパク質を産生する細胞の溶解物または上
清を接触させることによって実行される。下記を参照のこと。
【0094】
一般に、精製されたタンパク質は、少なくとも約40%純粋であり、通常少な
くとも約50%純粋であり、通常少なくとも約60%純粋であり、代表的に少な
くとも約70%純粋であり、より代表的には少なくとも約80%純粋であり、好
ましくは少なくとも約90%純粋であり、より好ましくは少なくとも約95%純
粋であり、および特定の実施形態において、97%〜99%以上純粋である。純
度は、通常、重量基準であるが、またモル基準でもあり得る。異なるアッセイが
、適切な場合、適用される。個々のタンパク質は精製され、その後合わせられ得
る。
くとも約50%純粋であり、通常少なくとも約60%純粋であり、代表的に少な
くとも約70%純粋であり、より代表的には少なくとも約80%純粋であり、好
ましくは少なくとも約90%純粋であり、より好ましくは少なくとも約95%純
粋であり、および特定の実施形態において、97%〜99%以上純粋である。純
度は、通常、重量基準であるが、またモル基準でもあり得る。異なるアッセイが
、適切な場合、適用される。個々のタンパク質は精製され、その後合わせられ得
る。
【0095】
(VI.抗体)
抗体は、種々の哺乳動物(例えば、霊長類)のDCRS3またはDCRS4の
タンパク質ならびにそのフラグメント(天然に存在するネイティブな形態および
それらの組換え形態の両方)に対して惹起され得、その差異は、活性なレセプタ
ーに対する抗体が、ネイティブな立体構造においてのみ存在するエピトープをよ
り認識するようであるということである。変性された抗原の検出はまた、例えば
、ウエスタン分析において、有用であり得る。抗イディオタイプ抗体がまた、意
図され、これは、天然のレセプターまたは抗体のアゴニストまたはアンタゴニス
トとして有用である。
タンパク質ならびにそのフラグメント(天然に存在するネイティブな形態および
それらの組換え形態の両方)に対して惹起され得、その差異は、活性なレセプタ
ーに対する抗体が、ネイティブな立体構造においてのみ存在するエピトープをよ
り認識するようであるということである。変性された抗原の検出はまた、例えば
、ウエスタン分析において、有用であり得る。抗イディオタイプ抗体がまた、意
図され、これは、天然のレセプターまたは抗体のアゴニストまたはアンタゴニス
トとして有用である。
【0096】
タンパク質の予め決定されたフラグメントに対する抗体(結合フラグメントお
よび単鎖バージョンを含む)は、そのフラグメントと免疫原性タンパク質との結
合体での動物の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体
を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常なタンパク質もしくは欠
損性タンパク質への結合についてスクリーニングされ得るか、またはアゴニスト
活性もしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。これらのモ
ノクローナル抗体は通常、少なくとも約1mM、より通常には少なくとも約30
0μM、代表的には少なくとも約100μM、より代表的には少なくとも約30
μM、好ましくは少なくとも約10μM、およびより好ましくは少なくとも約3
μMまたはそれよりも良好なKDで結合する。
よび単鎖バージョンを含む)は、そのフラグメントと免疫原性タンパク質との結
合体での動物の免疫によって惹起され得る。モノクローナル抗体は、所望の抗体
を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、正常なタンパク質もしくは欠
損性タンパク質への結合についてスクリーニングされ得るか、またはアゴニスト
活性もしくはアンタゴニスト活性についてスクリーニングされ得る。これらのモ
ノクローナル抗体は通常、少なくとも約1mM、より通常には少なくとも約30
0μM、代表的には少なくとも約100μM、より代表的には少なくとも約30
μM、好ましくは少なくとも約10μM、およびより好ましくは少なくとも約3
μMまたはそれよりも良好なKDで結合する。
【0097】
本発明の抗体(抗原結合フラグメントを含む)は、有意な診断的または治療学
的な価値を有し得る。それらは、レセプターに結合しそしてリガンドへの結合を
阻害するか、またはレセプターが生物学的応答を誘発する(例えば、その基質に
作用する)能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、
非中和抗体として有用であり得、そしてトキシンまたは放射性核種に結合されて
、産生細胞(またはインターロイキンの供給源に局在化される細胞)を結合し得
る。さらに、これらの抗体は、薬物または他の治療薬剤に、直接的に、またはリ
ンカーの手段によって間接的にのいずれかで、結合され得る。
的な価値を有し得る。それらは、レセプターに結合しそしてリガンドへの結合を
阻害するか、またはレセプターが生物学的応答を誘発する(例えば、その基質に
作用する)能力を阻害する、強力なアンタゴニストであり得る。それらはまた、
非中和抗体として有用であり得、そしてトキシンまたは放射性核種に結合されて
、産生細胞(またはインターロイキンの供給源に局在化される細胞)を結合し得
る。さらに、これらの抗体は、薬物または他の治療薬剤に、直接的に、またはリ
ンカーの手段によって間接的にのいずれかで、結合され得る。
【0098】
本発明の抗体はまた、診断的適用において有用であり得る。捕捉抗体または非
中和抗体として、これらは、リガンド結合または基質結合を阻害することなくレ
セプターに結合し得る。中和抗体として、これらは、競合結合アッセイにおいて
有用であり得る。これらはまた、リガンドの検出または定量に有用である。これ
らは、それぞれのタンパク質のウエスタンブロット分析あるいは免疫沈降または
免疫精製のための試薬として使用され得る。同様に、核酸およびタンパク質は、
アフィニティー精製または検出方法のための固体基質に固定され得る。この基質
は、例えば、固体樹脂ビーズまたはプラスチックシートであり得る。
中和抗体として、これらは、リガンド結合または基質結合を阻害することなくレ
セプターに結合し得る。中和抗体として、これらは、競合結合アッセイにおいて
有用であり得る。これらはまた、リガンドの検出または定量に有用である。これ
らは、それぞれのタンパク質のウエスタンブロット分析あるいは免疫沈降または
免疫精製のための試薬として使用され得る。同様に、核酸およびタンパク質は、
アフィニティー精製または検出方法のための固体基質に固定され得る。この基質
は、例えば、固体樹脂ビーズまたはプラスチックシートであり得る。
【0099】
タンパク質フラグメントは、免疫原として使用される融合されたポリペプチド
または共有結合されたポリぺプチドのように、他の物質(特に、ポリぺプチド)
に結合され得る。哺乳動物サイトカインレセプターおよびフラグメントは、種々
の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、
破傷風トキソイドなど)に融合されるか、または共有結合的に連結され得る。ポ
リクローナル抗血清を調製する方法の記載については、Microbiolog
y、Hoeber Medical Division、HarperおよびR
ow、1969;Landsteiner(1962)Specificity
of Serological Reactions、Dover Publ
ications、New York;およびWilliamsら(1967)
Methods in Immunology and Immunochem
istry、第1巻 Academic Press、New York;(こ
れらは各々、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。代表的な方法
は、抗原での動物の超免疫を含む。次いで、この動物の血液を、繰返しの免疫の
すぐ後に回収し、そしてγグロブリンを単離する。
または共有結合されたポリぺプチドのように、他の物質(特に、ポリぺプチド)
に結合され得る。哺乳動物サイトカインレセプターおよびフラグメントは、種々
の免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、
破傷風トキソイドなど)に融合されるか、または共有結合的に連結され得る。ポ
リクローナル抗血清を調製する方法の記載については、Microbiolog
y、Hoeber Medical Division、HarperおよびR
ow、1969;Landsteiner(1962)Specificity
of Serological Reactions、Dover Publ
ications、New York;およびWilliamsら(1967)
Methods in Immunology and Immunochem
istry、第1巻 Academic Press、New York;(こ
れらは各々、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。代表的な方法
は、抗原での動物の超免疫を含む。次いで、この動物の血液を、繰返しの免疫の
すぐ後に回収し、そしてγグロブリンを単離する。
【0100】
いくつかの例において、種々の哺乳動物宿主(例えば、マウス、齧歯類、霊長
類、ヒトなど)からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このような
モノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら(
編)Basic and Clinical Immunology(第4版)
、Lange Medical Publications、Los Alto
s、CAおよびそこに引用される参考文献;HarlowおよびLane(19
88)Antibodies:A Laboratory Manual、CS
H Press;Goding(1986)Monoclonal Antib
odies:Principles and Practice(第2版)Ac
ademic Press、New York;および特に、Kohlerおよ
びMilstein(1975)Nature 256:495−497(これ
は、モノクローナル抗体を作製する1つの方法を議論する)において、見出され
得る。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。簡
潔にまとめると、この方法は、免疫原を動物に注射する工程を包含する。次いで
、この動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、次いで、この細胞を骨
髄腫細胞と融合する。結果は、ハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」で
あり、これはインビトロで増殖(reproduce)させることが可能である
。次いで、このハイブリドーマの集団をスクリーニングして、個々のクローンを
単離し、このクローンの各々は、この免疫原に対する単一の抗体種を分泌する。
この様式において、得られる個々の抗体種は、この免疫動物由来の不死化および
クローン化された単一B細胞の産物であり、これは、免疫原性物質上の認識され
る特異的部位に応答して作製される。
類、ヒトなど)からモノクローナル抗体を調製することが望ましい。このような
モノクローナル抗体を調製するための技術の記載は、例えば、Stitesら(
編)Basic and Clinical Immunology(第4版)
、Lange Medical Publications、Los Alto
s、CAおよびそこに引用される参考文献;HarlowおよびLane(19
88)Antibodies:A Laboratory Manual、CS
H Press;Goding(1986)Monoclonal Antib
odies:Principles and Practice(第2版)Ac
ademic Press、New York;および特に、Kohlerおよ
びMilstein(1975)Nature 256:495−497(これ
は、モノクローナル抗体を作製する1つの方法を議論する)において、見出され
得る。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。簡
潔にまとめると、この方法は、免疫原を動物に注射する工程を包含する。次いで
、この動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から採取し、次いで、この細胞を骨
髄腫細胞と融合する。結果は、ハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」で
あり、これはインビトロで増殖(reproduce)させることが可能である
。次いで、このハイブリドーマの集団をスクリーニングして、個々のクローンを
単離し、このクローンの各々は、この免疫原に対する単一の抗体種を分泌する。
この様式において、得られる個々の抗体種は、この免疫動物由来の不死化および
クローン化された単一B細胞の産物であり、これは、免疫原性物質上の認識され
る特異的部位に応答して作製される。
【0101】
他の適切な技術としては、抗原性ポリぺプチドあるいはファージベクターまた
は同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択への、インビトロでのリン
パ球の曝露を含む。Huseら(1989)「Generation of a
Large Combinatorial Library of the
Immunoglobulin Repertorie in Pharge
Lambda」、Science 246:1275−1281;およびWar
dら(1989)Nature 341:544−546(これらのそれぞれは
、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。本発明のポリぺプチドお
よび抗体は、改変を伴うかまたは伴わないで使用され得、これにはキメラ抗体ま
たはヒト化抗体を含む。しばしば、ポリぺプチドおよび抗体は、共有結合的にま
たは非共有結合的にのいずれかで、検出可能なシグナルを提供する物質を結合す
ることによって標識される。広範な種々の標識および結合体化技術が公知であり
、そして科学文献および特許文献の両方において、広範に報告される。適切な標
識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学
発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許と
しては、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3
,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;
同第4,275,149号;および同第4,366,241号が挙げられる。ま
た、組換え免疫グロブリンまたはキメラ免疫グロブリンが生成され得るか(Ca
billy、米国特許第4,816,567号を参照のこと);またはトランス
ジェニックマウスにおいて作製され得る(Mendezら(1997)Natu
re Genetics 15:146−156を参照のこと)。これらの参考
文献は、本明細書中に参考として援用される。
は同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択への、インビトロでのリン
パ球の曝露を含む。Huseら(1989)「Generation of a
Large Combinatorial Library of the
Immunoglobulin Repertorie in Pharge
Lambda」、Science 246:1275−1281;およびWar
dら(1989)Nature 341:544−546(これらのそれぞれは
、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。本発明のポリぺプチドお
よび抗体は、改変を伴うかまたは伴わないで使用され得、これにはキメラ抗体ま
たはヒト化抗体を含む。しばしば、ポリぺプチドおよび抗体は、共有結合的にま
たは非共有結合的にのいずれかで、検出可能なシグナルを提供する物質を結合す
ることによって標識される。広範な種々の標識および結合体化技術が公知であり
、そして科学文献および特許文献の両方において、広範に報告される。適切な標
識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光部分、化学
発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許と
しては、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3
,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;
同第4,275,149号;および同第4,366,241号が挙げられる。ま
た、組換え免疫グロブリンまたはキメラ免疫グロブリンが生成され得るか(Ca
billy、米国特許第4,816,567号を参照のこと);またはトランス
ジェニックマウスにおいて作製され得る(Mendezら(1997)Natu
re Genetics 15:146−156を参照のこと)。これらの参考
文献は、本明細書中に参考として援用される。
【0102】
本発明の抗体はまた、DCRS3タンパク質またはポリペプチドの単離におけ
る、アフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。抗体が固体支持
体(例えば、アガロース、Sephadexなどのような粒子)に連結されてい
るカラムを調製し得、ここで、細胞溶解物を、カラムに通過させ得、カラムを洗
浄し、続いて、漸増濃度の穏やかな変性剤で洗浄し、これにより、精製タンパク
質を放出させる。あるいは、このタンパク質を使用して、抗体を精製し得る。適
切な交差吸収または枯渇が適用され得る。
る、アフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る。抗体が固体支持
体(例えば、アガロース、Sephadexなどのような粒子)に連結されてい
るカラムを調製し得、ここで、細胞溶解物を、カラムに通過させ得、カラムを洗
浄し、続いて、漸増濃度の穏やかな変性剤で洗浄し、これにより、精製タンパク
質を放出させる。あるいは、このタンパク質を使用して、抗体を精製し得る。適
切な交差吸収または枯渇が適用され得る。
【0103】
抗体はまた、特定の発現産物について、発現ライブラリーをスクリーニングす
るために使用され得る。通常、このような手順において使用される抗体は、抗体
結合によって抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
るために使用され得る。通常、このような手順において使用される抗体は、抗体
結合によって抗原の存在の容易な検出を可能にする部分で標識される。
【0104】
サイトカインレセプターに対して惹起される抗体はまた、抗イディオタイプ抗
体を惹起するために使用される。これらは、タンパク質の発現、またはそのタン
パク質を発現する細胞に関連する、種々の免疫学的状態を検出または診断するの
に有用である。これらはまた、リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとし
て有用であり、天然に存在するリガンドについての、競合的なインヒビターまた
は置換体であり得る。
体を惹起するために使用される。これらは、タンパク質の発現、またはそのタン
パク質を発現する細胞に関連する、種々の免疫学的状態を検出または診断するの
に有用である。これらはまた、リガンドのアゴニストまたはアンタゴニストとし
て有用であり、天然に存在するリガンドについての、競合的なインヒビターまた
は置換体であり得る。
【0105】
規定された免疫原(例えば、配列番号2、25、5、28、または31のアミ
ノ酸配列からなる免疫原)に対して生成された抗体と特異的に結合するか、また
はこのような抗体と特異的に免疫反応性であるサイトカインレセプタータンパク
質は、代表的に、イムノアッセイにおいて測定される。イムノアッセイは、代表
的には、例えば、配列番号2、25、5、28、または31のタンパク質に対し
て惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他のサイトカイ
ンレセプターファミリーメンバー(例えば、IL−11レセプターサブユニット
α、IL−6レセプターサブユニットαまたはp40(好ましくは同じ種由来の
))に対して、低い交差反応性を有するように選択され、そしてこのような交差
反応性はいずれも、イムノアッセイで使用する前に免疫吸着法により除去される
。
ノ酸配列からなる免疫原)に対して生成された抗体と特異的に結合するか、また
はこのような抗体と特異的に免疫反応性であるサイトカインレセプタータンパク
質は、代表的に、イムノアッセイにおいて測定される。イムノアッセイは、代表
的には、例えば、配列番号2、25、5、28、または31のタンパク質に対し
て惹起されたポリクローナル抗血清を使用する。この抗血清は、他のサイトカイ
ンレセプターファミリーメンバー(例えば、IL−11レセプターサブユニット
α、IL−6レセプターサブユニットαまたはp40(好ましくは同じ種由来の
))に対して、低い交差反応性を有するように選択され、そしてこのような交差
反応性はいずれも、イムノアッセイで使用する前に免疫吸着法により除去される
。
【0106】
イムノアッセイで使用する抗血清を生成するために、例えば、配列番号2、2
5、5、28、または31のタンパク質を、本明細書に記載されるように単離す
る。例えば、組換えタンパク質を哺乳動物細胞株で生成し得る。適切な宿主、例
えば、Balb/cのようなマウスの同系交配系統を、代表的には標準的アジュ
バント(例えば、フロイントアジュバント)および標準的マウス免疫プロトコル
(HarlowおよびLane、前出)を使用して、選択されたタンパク質で免
疫する。あるいは、本明細書中に開示された配列に由来し、そしてキャリアタン
パク質に結合体化させた合成ペプチドを免疫原に使用し得る。ポリクローナル血
清を収集し、イムノアッセイ(例えば、固体支持体上に固定した免疫原による固
相イムノアッセイ)において免疫原タンパク質に対して力価測定する。力価が1
04以上のポリクローナル抗血清が選択され、他のサイトカインレセプターファ
ミリーメンバー(例えば、IL−2、IL−7、IL−9、またはEPOレセプ
ターサブユニット)に対する交差反応性について、HarlowおよびLane
、前述、570−573頁に記載されるような競合結合イムノアッセイを使用し
て試験される。好ましくは、少なくとも2つのサイトカインレセプターファミリ
ーメンバーが、この測定において使用される。これらのサイトカインレセプター
ファミリーメンバーは、組換えタンパク質として生成され得、そして本明細書に
記載される標準的分子生物学およびタンパク質化学技術を使用して単離され得る
。
5、5、28、または31のタンパク質を、本明細書に記載されるように単離す
る。例えば、組換えタンパク質を哺乳動物細胞株で生成し得る。適切な宿主、例
えば、Balb/cのようなマウスの同系交配系統を、代表的には標準的アジュ
バント(例えば、フロイントアジュバント)および標準的マウス免疫プロトコル
(HarlowおよびLane、前出)を使用して、選択されたタンパク質で免
疫する。あるいは、本明細書中に開示された配列に由来し、そしてキャリアタン
パク質に結合体化させた合成ペプチドを免疫原に使用し得る。ポリクローナル血
清を収集し、イムノアッセイ(例えば、固体支持体上に固定した免疫原による固
相イムノアッセイ)において免疫原タンパク質に対して力価測定する。力価が1
04以上のポリクローナル抗血清が選択され、他のサイトカインレセプターファ
ミリーメンバー(例えば、IL−2、IL−7、IL−9、またはEPOレセプ
ターサブユニット)に対する交差反応性について、HarlowおよびLane
、前述、570−573頁に記載されるような競合結合イムノアッセイを使用し
て試験される。好ましくは、少なくとも2つのサイトカインレセプターファミリ
ーメンバーが、この測定において使用される。これらのサイトカインレセプター
ファミリーメンバーは、組換えタンパク質として生成され得、そして本明細書に
記載される標準的分子生物学およびタンパク質化学技術を使用して単離され得る
。
【0107】
競合結合形式のイムノアッセイが、交差反応性測定に使用され得る。例えば、
配列番号2、25、5、28、または31のタンパク質を、固体支持体に固定し
得る。このアッセイに添加されるタンパク質は、固定された抗原に対する抗血清
の結合と競合する。固定されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する上記
タンパク質の能力を、このタンパク質(例えば、IL−2、IL−7、IL−9
、またはEPOレセプターサブユニット)の能力と比較する。上記タンパク質に
対するパーセント交差反応性を、標準的算出法を使用して算出する。上記に列挙
した各タンパク質との交差反応性が10%より低い抗血清を選択およびプールす
る。次いで、上記に列挙したタンパク質との免疫吸着法により、交差反応抗体を
プール抗血清から取り出す。
配列番号2、25、5、28、または31のタンパク質を、固体支持体に固定し
得る。このアッセイに添加されるタンパク質は、固定された抗原に対する抗血清
の結合と競合する。固定されたタンパク質に対する抗血清の結合と競合する上記
タンパク質の能力を、このタンパク質(例えば、IL−2、IL−7、IL−9
、またはEPOレセプターサブユニット)の能力と比較する。上記タンパク質に
対するパーセント交差反応性を、標準的算出法を使用して算出する。上記に列挙
した各タンパク質との交差反応性が10%より低い抗血清を選択およびプールす
る。次いで、上記に列挙したタンパク質との免疫吸着法により、交差反応抗体を
プール抗血清から取り出す。
【0108】
次いで、免疫吸着およびプールした抗血清を、上記のように、競合結合イムノ
アッセイで使用し、第2のタンパク質を免疫原タンパク質(例えば、配列番号2
のDCRS3様タンパク質)と比較する。この比較を行うため、この2つのタン
パク質を広範囲の濃度でそれぞれアッセイし、そして固定されたタンパク質への
抗血清の結合を50%阻害するのに必要な各タンパク質量を測定する。必要とさ
れる第2のタンパク質量が、必要とされる分泌タンパク質のタンパク質量の2倍
より少ない場合、第2のタンパク質は、免疫原に対して生成した抗体と特異的に
結合すると言われる。
アッセイで使用し、第2のタンパク質を免疫原タンパク質(例えば、配列番号2
のDCRS3様タンパク質)と比較する。この比較を行うため、この2つのタン
パク質を広範囲の濃度でそれぞれアッセイし、そして固定されたタンパク質への
抗血清の結合を50%阻害するのに必要な各タンパク質量を測定する。必要とさ
れる第2のタンパク質量が、必要とされる分泌タンパク質のタンパク質量の2倍
より少ない場合、第2のタンパク質は、免疫原に対して生成した抗体と特異的に
結合すると言われる。
【0109】
これらのサイトカインレセプタータンパク質は、これまで同定された少なくと
も6個の遺伝子を含む相同性タンパク質のファミリーのメンバーであることが理
解される。DCRS3またはDCRS4のような特定の遺伝子生成物に対して、
この用語は、本明細書に開示したアミノ酸配列だけではなく、対立遺伝子、非対
立遺伝子または種改変体である他のタンパク質をもいう。また、この用語は、単
一の部位変異のような従来の組換え技術を使用する意図的な変異によるか、また
はそれぞれのタンパク質をコードするDNAの短い部分を切除することによるか
、または新規アミノ酸の置換するかもしくは新規アミノ酸の付加により導入され
た非天然の変異を含むことが理解される。代表的にはこのような重大でない改変
は、本来の分子の免疫同一性および/またはその生物学的活性を実質的に維持す
る。従って、これらの改変は、示された天然に存在するDCRS3またはDCR
S4タンパク質と特異的に免疫反応性であるタンパク質を含む。タンパク質を適
切な細胞株で発現させ、そして例えばトランスフェクトされたリンパ球に及ぼす
適切な効果を測定することにより、改変タンパク質の生物学的特性が決定され得
る。重大でないと考えられる特定のタンパク質の改変には、サイトカインレセプ
ターファミリーについて上で総括して記載したように、類似した化学特性を有す
るアミノ酸の保存的置換が含まれる。タンパク質をサイトカインレセプタータン
パク質と最適にアラインメントさせ、そして本明細書に記載した従来のイムノア
ッセイを使用して免疫同一性を測定することにより、本発明のタンパク質組成物
を決定し得る。
も6個の遺伝子を含む相同性タンパク質のファミリーのメンバーであることが理
解される。DCRS3またはDCRS4のような特定の遺伝子生成物に対して、
この用語は、本明細書に開示したアミノ酸配列だけではなく、対立遺伝子、非対
立遺伝子または種改変体である他のタンパク質をもいう。また、この用語は、単
一の部位変異のような従来の組換え技術を使用する意図的な変異によるか、また
はそれぞれのタンパク質をコードするDNAの短い部分を切除することによるか
、または新規アミノ酸の置換するかもしくは新規アミノ酸の付加により導入され
た非天然の変異を含むことが理解される。代表的にはこのような重大でない改変
は、本来の分子の免疫同一性および/またはその生物学的活性を実質的に維持す
る。従って、これらの改変は、示された天然に存在するDCRS3またはDCR
S4タンパク質と特異的に免疫反応性であるタンパク質を含む。タンパク質を適
切な細胞株で発現させ、そして例えばトランスフェクトされたリンパ球に及ぼす
適切な効果を測定することにより、改変タンパク質の生物学的特性が決定され得
る。重大でないと考えられる特定のタンパク質の改変には、サイトカインレセプ
ターファミリーについて上で総括して記載したように、類似した化学特性を有す
るアミノ酸の保存的置換が含まれる。タンパク質をサイトカインレセプタータン
パク質と最適にアラインメントさせ、そして本明細書に記載した従来のイムノア
ッセイを使用して免疫同一性を測定することにより、本発明のタンパク質組成物
を決定し得る。
【0110】
(VII.キットおよび定量)
本発明のサイトカインレセプター様分子の天然に存在する形態および組換え形
態は共に、キットおよびアッセイ法において特に有用である。例えば、これらの
方法はまた、結合活性(例えば、これらのタンパク質に対するリガンド)につい
てのスクリーニングに適用される。最近、いくつかの自動化アッセイ法が開発さ
れており、1年当たり何万もの化合物のスクリーニングを可能にしている。例え
ば、BIOMEK自動化ワークステーション、Beckman Instrum
ents,Palo Alto,California、およびFodorら、
(1991)Science 251:767−773(これらは、参考として
本明細書中に援用される)を参照のこと。後者は、固体基質上に合成された複数
の規定されたポリマーによる結合を試験する手段を記載している。リガンドまた
はアゴニスト/アンタゴニストの相同性タンパク質のスクリーニングに適したア
ッセイの開発は、本発明により提供されるように、大量の精製可溶性サイトカイ
ンレセプターが活性状態で入手可能なことにより、非常に容易にされ得る。
態は共に、キットおよびアッセイ法において特に有用である。例えば、これらの
方法はまた、結合活性(例えば、これらのタンパク質に対するリガンド)につい
てのスクリーニングに適用される。最近、いくつかの自動化アッセイ法が開発さ
れており、1年当たり何万もの化合物のスクリーニングを可能にしている。例え
ば、BIOMEK自動化ワークステーション、Beckman Instrum
ents,Palo Alto,California、およびFodorら、
(1991)Science 251:767−773(これらは、参考として
本明細書中に援用される)を参照のこと。後者は、固体基質上に合成された複数
の規定されたポリマーによる結合を試験する手段を記載している。リガンドまた
はアゴニスト/アンタゴニストの相同性タンパク質のスクリーニングに適したア
ッセイの開発は、本発明により提供されるように、大量の精製可溶性サイトカイ
ンレセプターが活性状態で入手可能なことにより、非常に容易にされ得る。
【0111】
前述のリガンドスクリーニング技術での使用のために、精製されたDCRS3
またはDCRS4はプレート上に直接コートされ得る。しかし、これらのタンパ
ク質に対する非中和抗体は、例えば、診断的な使用において、有用な固相上に各
レセプターを固定化する捕獲抗体として使用され得る。
またはDCRS4はプレート上に直接コートされ得る。しかし、これらのタンパ
ク質に対する非中和抗体は、例えば、診断的な使用において、有用な固相上に各
レセプターを固定化する捕獲抗体として使用され得る。
【0112】
本発明はまた、様々な診断用キットにおける、DCRS3またはDCRS4、
そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用、ならびにタンパ
ク質またはそのリガンドの存在を検出する方法も意図される。あるいは、または
さらに、この分子に対する抗体が、キットおよび方法に組み込まれ得る。代表的
には、キットは、DCRS3もしくはDCRS4ペプチド、または遺伝子セグメ
ント、あるいは一方もしくは他方を認識する試薬のいずれかを含む区画を有する
。代表的には、ペプチドの場合、認識試薬はレセプターまたは抗体であり、ある
いは遺伝子セグメントの場合には、通常、ハイブリダイゼーションプローブであ
る。
そのフラグメント、ペプチド、およびそれらの融合産物の使用、ならびにタンパ
ク質またはそのリガンドの存在を検出する方法も意図される。あるいは、または
さらに、この分子に対する抗体が、キットおよび方法に組み込まれ得る。代表的
には、キットは、DCRS3もしくはDCRS4ペプチド、または遺伝子セグメ
ント、あるいは一方もしくは他方を認識する試薬のいずれかを含む区画を有する
。代表的には、ペプチドの場合、認識試薬はレセプターまたは抗体であり、ある
いは遺伝子セグメントの場合には、通常、ハイブリダイゼーションプローブであ
る。
【0113】
例えば、サンプル中のDCRS3の濃度測定に好ましいキットは、代表的には
、DCRS3に対する既知の結合親和性を有する標識化化合物(例えば、リガン
ドまたは抗体)、ポジティブコントロールとしてDCRS3の供給源(天然に存
在する、または組換え体)、および遊離の標識化合物(例えば、試験サンプル中
のDCRS3を固定化する固相)から結合を分離する手段、を含む。試薬を含む
区画、および説明書が、通常提供される。キットを含む適切な核酸またはタンパ
ク質もまた、提供される。
、DCRS3に対する既知の結合親和性を有する標識化化合物(例えば、リガン
ドまたは抗体)、ポジティブコントロールとしてDCRS3の供給源(天然に存
在する、または組換え体)、および遊離の標識化合物(例えば、試験サンプル中
のDCRS3を固定化する固相)から結合を分離する手段、を含む。試薬を含む
区画、および説明書が、通常提供される。キットを含む適切な核酸またはタンパ
ク質もまた、提供される。
【0114】
哺乳動物DCRS3またはペプチドフラグメントに特異的な抗原結合フラグメ
ントあるいはレセプターフラグメントを含む抗体は、上昇したレベルのリガンド
および/またはそのフラグメントの存在を検出するための診断的な適用に有用で
ある。診断アッセイは、均質性(遊離試薬と抗体−抗原複合体との間の分離工程
を含まない)または異質性(分離工程を含む)であり得る。種々の市販のアッセ
イ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合イムノソルベント検定
法(ELISA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、酵素増幅イムノアッセイ技
術(EMIT)、基質−標識化蛍光イムノアッセイ(SLFIA)など)が存在
する。例えば、標識され、かつサイトカインレセプターまたはその特定のフラグ
メントに対する抗体を認識する二次抗体を使用することにより、非標識化抗体が
使用され得る。これらのアッセイもまた、文献で広範囲に議論されている。例え
ば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies:A La
boratory Manual,CSH.、ならびにColigan(編、1
991および定期的な補遺)、Current Protocols In I
mmunology Greene/Wiley,New Yorkを参照のこ
と。
ントあるいはレセプターフラグメントを含む抗体は、上昇したレベルのリガンド
および/またはそのフラグメントの存在を検出するための診断的な適用に有用で
ある。診断アッセイは、均質性(遊離試薬と抗体−抗原複合体との間の分離工程
を含まない)または異質性(分離工程を含む)であり得る。種々の市販のアッセ
イ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合イムノソルベント検定
法(ELISA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、酵素増幅イムノアッセイ技
術(EMIT)、基質−標識化蛍光イムノアッセイ(SLFIA)など)が存在
する。例えば、標識され、かつサイトカインレセプターまたはその特定のフラグ
メントに対する抗体を認識する二次抗体を使用することにより、非標識化抗体が
使用され得る。これらのアッセイもまた、文献で広範囲に議論されている。例え
ば、HarlowおよびLane(1988)Antibodies:A La
boratory Manual,CSH.、ならびにColigan(編、1
991および定期的な補遺)、Current Protocols In I
mmunology Greene/Wiley,New Yorkを参照のこ
と。
【0115】
抗イディオタイプの抗体は、サイトカインレセプターのアゴニストまたはアン
タゴニストとして作用する類似の用途を有し得る。これらは、適切な状況下で治
療用試薬として有用であるようである。
タゴニストとして作用する類似の用途を有し得る。これらは、適切な状況下で治
療用試薬として有用であるようである。
【0116】
しばしば、診断アッセイのための試薬は、アッセイの感受性を最適化するため
に、キットに補充される。本発明について、アッセイの性質、プロトコル、およ
び標識に依存して、標識化または非標識化抗体あるいは標識化リガンドのいずれ
かが提供される。これは、通常、緩衝剤、安定化剤、酵素の基質などのようなシ
グナルの産生に必要な材料などの他の添加物と組み合わされる。好ましくは、キ
ットはまた、適切な使用および使用後の含有物の廃棄についての説明書を包含す
る。代表的には、キットは、有用な各試薬の区画を有し、そして適切な使用およ
び試薬の廃棄についての説明書を含む。望ましくは、試薬は乾燥した凍結乾燥粉
末として提供され、この試薬は、アッセイを行うのに適した濃度を有する水性媒
体中で再構成され得る。
に、キットに補充される。本発明について、アッセイの性質、プロトコル、およ
び標識に依存して、標識化または非標識化抗体あるいは標識化リガンドのいずれ
かが提供される。これは、通常、緩衝剤、安定化剤、酵素の基質などのようなシ
グナルの産生に必要な材料などの他の添加物と組み合わされる。好ましくは、キ
ットはまた、適切な使用および使用後の含有物の廃棄についての説明書を包含す
る。代表的には、キットは、有用な各試薬の区画を有し、そして適切な使用およ
び試薬の廃棄についての説明書を含む。望ましくは、試薬は乾燥した凍結乾燥粉
末として提供され、この試薬は、アッセイを行うのに適した濃度を有する水性媒
体中で再構成され得る。
【0117】
診断アッセイの上記の構成成分は、改変を行うことなく使用され得るか、また
は種々の方法において改変され得る。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直
接または間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合することによって達
成され得る。多くのこれらのアッセイにおいて、試験化合物、サイトカインレセ
プター、またはそれに対する抗体は、直接または間接のいずれかで標識され得る
。直接標識についての可能性は、標識基:放射性標識(例えば、125I)、酵素
(米国特許第3,645,090号)(例えば、ペルオキシダーゼおよびアルカ
リホスファターゼ、ならびに蛍光標識(米国特許第3,940,475号)(こ
れは、蛍光強度における変化、波長シフト、または蛍光偏光をモニターし得る)
を含む。これらの特許の両方は、本明細書中に参考として援用される。間接標識
についての可能性としては、1つの構成成分のビオチン化、続いて上記の標識基
の一つに結合したアビジンへの結合が挙げられる。
は種々の方法において改変され得る。例えば、標識は、検出可能なシグナルを直
接または間接的に提供する部分を共有結合または非共有結合することによって達
成され得る。多くのこれらのアッセイにおいて、試験化合物、サイトカインレセ
プター、またはそれに対する抗体は、直接または間接のいずれかで標識され得る
。直接標識についての可能性は、標識基:放射性標識(例えば、125I)、酵素
(米国特許第3,645,090号)(例えば、ペルオキシダーゼおよびアルカ
リホスファターゼ、ならびに蛍光標識(米国特許第3,940,475号)(こ
れは、蛍光強度における変化、波長シフト、または蛍光偏光をモニターし得る)
を含む。これらの特許の両方は、本明細書中に参考として援用される。間接標識
についての可能性としては、1つの構成成分のビオチン化、続いて上記の標識基
の一つに結合したアビジンへの結合が挙げられる。
【0118】
遊離のリガンドから結合したもの、あるいは遊離の試験化合物から結合したも
のを分離する多くの方法もまた存在する。サイトカインレセプターは、種々のマ
トリクスに固定され得、続いて洗浄され得る。適切なマトリックスは、ELIS
Aプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックを含む。レセプタ
ーをマトリックスに固定する方法としては、プラスチックへの直接接着、捕捉抗
体の使用、化学結合、およびビオチン−アビジンが挙げられるがこれらに限定さ
れない。このアプローチの最後の工程は、いくつかの方法(これは、例えばポリ
エチレングリコールのような有機溶媒または硫酸アンモニウムのような塩を利用
する方法を含む)のいずれかによる抗体/抗原複合体の沈殿を含む。他の適切な
分離技術は、Rattleら(1984)Clin.Chem.30:1457
−1461に記載されるフルオレセイン抗体磁化粒子方法、および米国特許第4
,659,678号に記載されるような二重抗体磁性粒子分離(これらの各々は
、本明細書において参考として援用される)を含むが、これに限定されない。
のを分離する多くの方法もまた存在する。サイトカインレセプターは、種々のマ
トリクスに固定され得、続いて洗浄され得る。適切なマトリックスは、ELIS
Aプレート、フィルター、およびビーズのようなプラスチックを含む。レセプタ
ーをマトリックスに固定する方法としては、プラスチックへの直接接着、捕捉抗
体の使用、化学結合、およびビオチン−アビジンが挙げられるがこれらに限定さ
れない。このアプローチの最後の工程は、いくつかの方法(これは、例えばポリ
エチレングリコールのような有機溶媒または硫酸アンモニウムのような塩を利用
する方法を含む)のいずれかによる抗体/抗原複合体の沈殿を含む。他の適切な
分離技術は、Rattleら(1984)Clin.Chem.30:1457
−1461に記載されるフルオレセイン抗体磁化粒子方法、および米国特許第4
,659,678号に記載されるような二重抗体磁性粒子分離(これらの各々は
、本明細書において参考として援用される)を含むが、これに限定されない。
【0119】
種々の標識へ、タンパク質またはフラグメントを連結するための方法は,文献
において広範に報告されており、そしてここでは詳細な議論を必要としない。こ
れらの技術の多くは,ペプチド結合を形成するためのカルボジイミドまたは活性
エステルのいずれかの使用を介した活性化カルボキシル基の使用、連結のために
、活性化ハロゲン(例えば、クロロアセチル)または活性化オレフィン(例えば
、マレイミド)を用いたメルカプト基の反応によるチオエーテルの形成などを含
む。融合タンパク質もまた、これらの適用において用途が見出される。
において広範に報告されており、そしてここでは詳細な議論を必要としない。こ
れらの技術の多くは,ペプチド結合を形成するためのカルボジイミドまたは活性
エステルのいずれかの使用を介した活性化カルボキシル基の使用、連結のために
、活性化ハロゲン(例えば、クロロアセチル)または活性化オレフィン(例えば
、マレイミド)を用いたメルカプト基の反応によるチオエーテルの形成などを含
む。融合タンパク質もまた、これらの適用において用途が見出される。
【0120】
本発明の別の診断的局面は、サイトカインレセプターの配列から採取したオリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列は、免
疫学的障害を有すると疑われる患者におけるそれぞれのサイトカインレセプター
のレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよびDNAの
両方のヌクレオチド配列の調製、配列の標識、および好ましいサイズの配列は、
文献において、充分な記載および議論がなされている(receive)。通常
、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常少なく
とも約18ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブ
は数キロベースにまで及び得る。種々の標識、最も一般的には、放射性核種、特
に32Pが使用され得る。しかし、他の技術もまた、使用され得る。例えば、ポリ
ヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変ヌクレオチドの使用である。次いで
、ビオチンは、アビジンまたは抗体への結合のための部位として作用し、これは
、広範で種々の標識(例えば、放射性核種、蛍光剤、酵素など)で標識され得る
。あるいは、特定の二重鎖(DNA二重鎖、RNA二重鎖、DNA−RNAハイ
ブリッド二重鎖、またはDNA−タンパク質二重鎖を含む)を認識し得る抗体が
使用され得る。次いで抗体は、標識され得、そして二重鎖が表面に結合し、その
結果、表面上の二重鎖の形成に際して二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得
るアッセイが、行われる。新規のアンチセンスRNAに対するプローブの使用は
、従来の技術(例えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナスス
クリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド遊離翻訳(hybrid r
eleased translation)(HRT)、およびハイブリッド拘
束翻訳(hybrid arrested translation)(HAR
T))において行われ得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のよ
うな増幅技術を含む。
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列の使用を含む。これらの配列は、免
疫学的障害を有すると疑われる患者におけるそれぞれのサイトカインレセプター
のレベルを検出するためのプローブとして使用され得る。RNAおよびDNAの
両方のヌクレオチド配列の調製、配列の標識、および好ましいサイズの配列は、
文献において、充分な記載および議論がなされている(receive)。通常
、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも約14ヌクレオチド、通常少なく
とも約18ヌクレオチドを有するべきであり、そしてポリヌクレオチドプローブ
は数キロベースにまで及び得る。種々の標識、最も一般的には、放射性核種、特
に32Pが使用され得る。しかし、他の技術もまた、使用され得る。例えば、ポリ
ヌクレオチドへの導入のためのビオチン改変ヌクレオチドの使用である。次いで
、ビオチンは、アビジンまたは抗体への結合のための部位として作用し、これは
、広範で種々の標識(例えば、放射性核種、蛍光剤、酵素など)で標識され得る
。あるいは、特定の二重鎖(DNA二重鎖、RNA二重鎖、DNA−RNAハイ
ブリッド二重鎖、またはDNA−タンパク質二重鎖を含む)を認識し得る抗体が
使用され得る。次いで抗体は、標識され得、そして二重鎖が表面に結合し、その
結果、表面上の二重鎖の形成に際して二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得
るアッセイが、行われる。新規のアンチセンスRNAに対するプローブの使用は
、従来の技術(例えば、核酸ハイブリダイゼーション、プラスおよびマイナスス
クリーニング、組換えプロービング、ハイブリッド遊離翻訳(hybrid r
eleased translation)(HRT)、およびハイブリッド拘
束翻訳(hybrid arrested translation)(HAR
T))において行われ得る。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のよ
うな増幅技術を含む。
【0121】
他のマーカーの定性的存在または定量的存在についてもまた試験する診断キッ
トもまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多重指標
の組合せに依存し得る。従って、キットはマーカーの組み合わせについて試験し
得る。例えば、Vialletら、(1989)Progress in Gr
owth Factor Res.1;89−97を参照のこと。
トもまた、意図される。診断または予後は、マーカーとして使用される多重指標
の組合せに依存し得る。従って、キットはマーカーの組み合わせについて試験し
得る。例えば、Vialletら、(1989)Progress in Gr
owth Factor Res.1;89−97を参照のこと。
【0122】
(VIII.治療的有用性)
本発明は、有意な治療的価値を有する試薬を提供する。例えば、Levitz
ki(1996)Curr.Opin.Cell.Biol.8:239−24
4を参照のこと。サイトカインレセプター(天然に存在するかまたは組換え)、
そのフラグメント、ムテインレセプター、および抗体、ならびにこのレセプター
または抗体に対する結合親和性を有するとして同定された化合物は、これらのリ
ガンドのレセプターの異常な発現を示す状態の処置において有用であるはずであ
る。このような異常性は、代表的には、免疫障害によって明らかにされる。さら
に、本発明は、リガンドへの応答の異常な発現または異常な誘発と関連する、種
々の疾患または障害において治療的価値を提供するはずである。例えば、IL−
1リガンドは、形態発生(例えば、背腹極性決定および免疫応答、特に初期の生
得性応答)に関与することが示唆されている。例えば、Sunら(1991)E
ur.J.Biochem.196:247−254;およびHultmark
(1994)Nature 367:116−117を参照のこと。
ki(1996)Curr.Opin.Cell.Biol.8:239−24
4を参照のこと。サイトカインレセプター(天然に存在するかまたは組換え)、
そのフラグメント、ムテインレセプター、および抗体、ならびにこのレセプター
または抗体に対する結合親和性を有するとして同定された化合物は、これらのリ
ガンドのレセプターの異常な発現を示す状態の処置において有用であるはずであ
る。このような異常性は、代表的には、免疫障害によって明らかにされる。さら
に、本発明は、リガンドへの応答の異常な発現または異常な誘発と関連する、種
々の疾患または障害において治療的価値を提供するはずである。例えば、IL−
1リガンドは、形態発生(例えば、背腹極性決定および免疫応答、特に初期の生
得性応答)に関与することが示唆されている。例えば、Sunら(1991)E
ur.J.Biochem.196:247−254;およびHultmark
(1994)Nature 367:116−117を参照のこと。
【0123】
組換えサイトカインレセプター、ムテイン、アゴニスト、またはそれらに対す
るアンタゴニスト抗体、あるいは抗体は精製され、次いで患者に投与され得る。
これらの試薬は、さらなる活性成分とともに治療的使用のために、例えば、従来
の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中で、生理的に無害な安定剤および
賦形剤とともに合わされ得る。これらの組み合わせは、例えば、濾過により滅菌
され得、そして投薬バイアル中における凍結乾燥によるような投薬形態または安
定化した水性調製物中における保存物へと配置される。本発明はまた、相補的結
合ではない抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。
るアンタゴニスト抗体、あるいは抗体は精製され、次いで患者に投与され得る。
これらの試薬は、さらなる活性成分とともに治療的使用のために、例えば、従来
の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤中で、生理的に無害な安定剤および
賦形剤とともに合わされ得る。これらの組み合わせは、例えば、濾過により滅菌
され得、そして投薬バイアル中における凍結乾燥によるような投薬形態または安
定化した水性調製物中における保存物へと配置される。本発明はまた、相補的結
合ではない抗体またはその結合フラグメントの使用を意図する。
【0124】
サイトカインレセプターまたはそのフラグメントを用いたリガンドスクリーニ
ングを行って、レセプターに対する結合親和性を有する分子を同定し得る。次い
で、続く生物学的アッセイを利用して推定リガンドが競合的な結合(これは、内
因性の刺激活性をブロックし得る)を提供し得るか否かを決定し得る。レセプタ
ーフラグメントは、リガンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまた
はアンタゴニストとして使用され得る。同様に、内因性刺激活性を有する化合物
は、レセプターを活性化し得、従って、この化合物は、リガンドの活性を刺激(
例えば、シグナル伝達の誘発)するという点で、アゴニストである。本発明はさ
らに、サイトカインレセプターに対する抗体のアンタゴニストとしての治療的用
途を意図する。
ングを行って、レセプターに対する結合親和性を有する分子を同定し得る。次い
で、続く生物学的アッセイを利用して推定リガンドが競合的な結合(これは、内
因性の刺激活性をブロックし得る)を提供し得るか否かを決定し得る。レセプタ
ーフラグメントは、リガンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまた
はアンタゴニストとして使用され得る。同様に、内因性刺激活性を有する化合物
は、レセプターを活性化し得、従って、この化合物は、リガンドの活性を刺激(
例えば、シグナル伝達の誘発)するという点で、アゴニストである。本発明はさ
らに、サイトカインレセプターに対する抗体のアンタゴニストとしての治療的用
途を意図する。
【0125】
有効な治療に必要な試薬の量は、多くの異なる因子に依存し、これには、投与
手段、標的部位、試薬の生理学的な寿命、薬理学的な寿命、患者の生理学的状態
、および投与される他の医薬品が含まれる。従って、処置投薬量を、力価測定し
て、安全性および効力を最適化するべきである。代表的には、インビトロで使用
される投薬量によって、これらの試薬のインサイチュでの投与のために有用な量
における、有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置についての有効用
量の動物試験は、ヒトの投薬量の予測的な指標をさらに提供する。種々の考慮事
項が以下に記載されている。例えば、Gilmanら(編)(1990)Goo
dmanおよびGilman:The Pharmacological Ba
ses of Therapeutics、第8版、Pergamon Pre
ss;およびRemington’s Pharmaceutical Sci
ences、第17版(1990)、Mack Publishing Co.
、Easton、Penn。これらは、各々が本明細書において参考として本明
細書によって援用される。投与方法は、そこに議論されており、そして以下、例
えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散などである。薬学的
に受容可能なキャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および、例えば、Mer
ck Index,Merck & Co.Rahway,New Jerse
yに記載された他の化合物が挙げられる。推定リガンドとそのレセプターとの間
の予想される高親和性結合、またはターンオーバー数に起因して、まず、低用量
のこれらの試薬が、有効であることが予想される。そして、シグナル伝達経路に
より、極めて少量のリガンドが効果を有し得ることが示唆される。従って、投薬
量範囲は、通常、1mM濃度よりも低い量であり、代表的には、約10μM濃度
より低く、通常、約100nMより低く、好ましくは約10pM(ピコモル濃度
)より低く、そして最も好ましくは約1fM(フェムトモル濃度)より低い量で
、適切なキャリアと共に存在することが予想される。徐放性処方物または徐放性
装置が、しばしば、連続投与に利用される。
手段、標的部位、試薬の生理学的な寿命、薬理学的な寿命、患者の生理学的状態
、および投与される他の医薬品が含まれる。従って、処置投薬量を、力価測定し
て、安全性および効力を最適化するべきである。代表的には、インビトロで使用
される投薬量によって、これらの試薬のインサイチュでの投与のために有用な量
における、有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置についての有効用
量の動物試験は、ヒトの投薬量の予測的な指標をさらに提供する。種々の考慮事
項が以下に記載されている。例えば、Gilmanら(編)(1990)Goo
dmanおよびGilman:The Pharmacological Ba
ses of Therapeutics、第8版、Pergamon Pre
ss;およびRemington’s Pharmaceutical Sci
ences、第17版(1990)、Mack Publishing Co.
、Easton、Penn。これらは、各々が本明細書において参考として本明
細書によって援用される。投与方法は、そこに議論されており、そして以下、例
えば、経口、静脈内、腹腔内、または筋肉内投与、経皮拡散などである。薬学的
に受容可能なキャリアには、水、生理食塩水、緩衝液、および、例えば、Mer
ck Index,Merck & Co.Rahway,New Jerse
yに記載された他の化合物が挙げられる。推定リガンドとそのレセプターとの間
の予想される高親和性結合、またはターンオーバー数に起因して、まず、低用量
のこれらの試薬が、有効であることが予想される。そして、シグナル伝達経路に
より、極めて少量のリガンドが効果を有し得ることが示唆される。従って、投薬
量範囲は、通常、1mM濃度よりも低い量であり、代表的には、約10μM濃度
より低く、通常、約100nMより低く、好ましくは約10pM(ピコモル濃度
)より低く、そして最も好ましくは約1fM(フェムトモル濃度)より低い量で
、適切なキャリアと共に存在することが予想される。徐放性処方物または徐放性
装置が、しばしば、連続投与に利用される。
【0126】
サイトカインレセプター、そのフラグメント、および抗体またはそのフラグメ
ント、アンタゴニストおよびアゴニストが、処置される宿主に直接投与され得る
か、または化合物のサイズに依存して、オボアルブミンまたは血清アルブミンな
どのキャリアタンパク質にそれらを結合させた後、投与されるのが望ましくあり
得る。治療用処方物を、従来の多くの投薬処方において投与し得る。活性成分を
単独投与することは可能であるが、薬学的処方物として活性成分を提示させるの
が好ましい。処方物は、上記に規定したような少なくとも一種の活性成分を、一
種以上のその受容可能なキャリアと共に含む。各キャリアは、他の成分と適合性
があり、患者にとって有害ではないという意味で、薬学的および生理学的の両方
で受容可能でなければならない。処方物は、経口、直腸内、鼻腔内または非経口
的(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)投与に適したものを含む。処方物
は、都合良く、単位投薬量形態で存在し得、そして薬学分野において周知の方法
により調製され得る。例えば、Gilmanら(編)(1990年)Goodm
an and Gilman:The Pharmacological Ba
ses of Therapeutics,第8版,Pergamon Pre
ss;およびRemington’s Pharmaceutical Sci
ences,第17版(1990),Mack Publishing Co.
,Easton,Penn.;Avisら(編、1993年)Pharmace
utical Dosage Forms:Parenteral Medic
ations Dekker,NY;Liebermanら(編、1990年)
Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets
Dekker,NY;およびLiebermanら(編、1990年)Phar
maceutical Dosage Forms:Disperse Sys
tems Dekker,NYを参照のこと。本発明の治療は、他の治療的薬剤
(特に、他のサイトカインレセプターファミリーのメンバーのアゴニストまたは
アンタゴニスト)と組み合わせられ得るか、またはそれらに付随して使用され得
る。
ント、アンタゴニストおよびアゴニストが、処置される宿主に直接投与され得る
か、または化合物のサイズに依存して、オボアルブミンまたは血清アルブミンな
どのキャリアタンパク質にそれらを結合させた後、投与されるのが望ましくあり
得る。治療用処方物を、従来の多くの投薬処方において投与し得る。活性成分を
単独投与することは可能であるが、薬学的処方物として活性成分を提示させるの
が好ましい。処方物は、上記に規定したような少なくとも一種の活性成分を、一
種以上のその受容可能なキャリアと共に含む。各キャリアは、他の成分と適合性
があり、患者にとって有害ではないという意味で、薬学的および生理学的の両方
で受容可能でなければならない。処方物は、経口、直腸内、鼻腔内または非経口
的(皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む)投与に適したものを含む。処方物
は、都合良く、単位投薬量形態で存在し得、そして薬学分野において周知の方法
により調製され得る。例えば、Gilmanら(編)(1990年)Goodm
an and Gilman:The Pharmacological Ba
ses of Therapeutics,第8版,Pergamon Pre
ss;およびRemington’s Pharmaceutical Sci
ences,第17版(1990),Mack Publishing Co.
,Easton,Penn.;Avisら(編、1993年)Pharmace
utical Dosage Forms:Parenteral Medic
ations Dekker,NY;Liebermanら(編、1990年)
Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets
Dekker,NY;およびLiebermanら(編、1990年)Phar
maceutical Dosage Forms:Disperse Sys
tems Dekker,NYを参照のこと。本発明の治療は、他の治療的薬剤
(特に、他のサイトカインレセプターファミリーのメンバーのアゴニストまたは
アンタゴニスト)と組み合わせられ得るか、またはそれらに付随して使用され得
る。
【0127】
(IX.スクリーニング)
DCRS3またはDCRS4またはそのフラグメントを使用する薬物スクリー
ニングは、レセプターサブユニットへの結合親和性を有する化合物を同定するた
めに実施され得、これは会合した成分の単離する工程を包含する。次いで、その
後の生物学的アッセイを利用して、化合物が本来の刺激活性を有し、それ故リガ
ンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストである
か否かを決定する。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、レセプターを活
性化し得、故にサイトカインリガンドの活性を刺激するという点で、アゴニスト
である。本発明は、さらに、サイトカインのアゴニストまたはアンタゴニストと
してのレセプターに対する抗体の治療用途を意図する。
ニングは、レセプターサブユニットへの結合親和性を有する化合物を同定するた
めに実施され得、これは会合した成分の単離する工程を包含する。次いで、その
後の生物学的アッセイを利用して、化合物が本来の刺激活性を有し、それ故リガ
ンドの活性をブロックするという点で、ブロッカーまたはアンタゴニストである
か否かを決定する。同様に、固有の刺激活性を有する化合物は、レセプターを活
性化し得、故にサイトカインリガンドの活性を刺激するという点で、アゴニスト
である。本発明は、さらに、サイトカインのアゴニストまたはアンタゴニストと
してのレセプターに対する抗体の治療用途を意図する。
【0128】
同様に、複数のタンパク質を含む複合体が、複合体を認識し得る、リガンドま
たは試薬をスクリーニングするために使用され得る。多くのサイトカインレセプ
ターは、少なくとも2つのサブユニットを含み、それは同一であり得るか、また
は別個のものであり得る。あるいは、膜貫通レセプターは、別の溶解性タンパク
質(例えば、第二のレセプターサブユニットとして機能する)に関連したサイト
カイン様リガンドを含む複合体に結合し得る。
たは試薬をスクリーニングするために使用され得る。多くのサイトカインレセプ
ターは、少なくとも2つのサブユニットを含み、それは同一であり得るか、また
は別個のものであり得る。あるいは、膜貫通レセプターは、別の溶解性タンパク
質(例えば、第二のレセプターサブユニットとして機能する)に関連したサイト
カイン様リガンドを含む複合体に結合し得る。
【0129】
薬物スクリーニングの1つの方法は、別のサイトカインレセプターサブユニッ
トと組み合わせて、例えば、DCRS3を発現する組換えDNA分子で安定に形
質転換される真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。他の機能的レセプ
ターから分離されたレセプターを発現する細胞を単離し得る。このような細胞は
、生存可能なまたは固定された形態のいずれかで、標準的な抗原/抗原またはリ
ガンド/レセプター結合アッセイのために使用され得る。Parceら(198
9)Science 246:243−247;およびOwickiら(199
0)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 87:4007−40
11(これらは、細胞性応答を検出するための感度の高い方法を記載する)もま
た参照のこと。競合アッセイが、特に有用であり、ここで、細胞(推定のリガン
ドの供給源)が、リガンドに対する既知の結合親和性を有する標識化レセプター
または標識化抗体(例えば、125I−抗体)および結合組成物に対する結合親和
性が測定される試験サンプルと接触されそしてインキュベートされる。次いで、
結合した標識結合組成物および遊離標識結合組成物を分離して、リガンド結合の
程度を評価する。結合した試験化合物の量は、公知の供給源に対する標識化レセ
プター結合の量に反比例する。多くの技法を使用して、遊離のリガンドから結合
したものを分離し得、リガンド結合の程度を評価し得る。この分離工程は、代表
的には、フィルターへの接着その後の洗浄、プラスチックへの接着その後の洗浄
、または細胞膜の遠心分離のような手順を包含し得る。生細胞もまた、サイトカ
イン媒介機能、例えば第2メッセンジャーレベル、すなわちCa++;細胞増殖;
イノシトールリン酸プール変換(pool change);などに対する薬物
の効果についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの検出方法は
、分離工程の削除を可能にする(例えば、近接感度検出システム)。カルシウム
感受性色素は、蛍光定量器(fluorimeter)または蛍光細胞選別装置
を用いて、Ca++レベルを検出するのに有用である。
トと組み合わせて、例えば、DCRS3を発現する組換えDNA分子で安定に形
質転換される真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。他の機能的レセプ
ターから分離されたレセプターを発現する細胞を単離し得る。このような細胞は
、生存可能なまたは固定された形態のいずれかで、標準的な抗原/抗原またはリ
ガンド/レセプター結合アッセイのために使用され得る。Parceら(198
9)Science 246:243−247;およびOwickiら(199
0)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 87:4007−40
11(これらは、細胞性応答を検出するための感度の高い方法を記載する)もま
た参照のこと。競合アッセイが、特に有用であり、ここで、細胞(推定のリガン
ドの供給源)が、リガンドに対する既知の結合親和性を有する標識化レセプター
または標識化抗体(例えば、125I−抗体)および結合組成物に対する結合親和
性が測定される試験サンプルと接触されそしてインキュベートされる。次いで、
結合した標識結合組成物および遊離標識結合組成物を分離して、リガンド結合の
程度を評価する。結合した試験化合物の量は、公知の供給源に対する標識化レセ
プター結合の量に反比例する。多くの技法を使用して、遊離のリガンドから結合
したものを分離し得、リガンド結合の程度を評価し得る。この分離工程は、代表
的には、フィルターへの接着その後の洗浄、プラスチックへの接着その後の洗浄
、または細胞膜の遠心分離のような手順を包含し得る。生細胞もまた、サイトカ
イン媒介機能、例えば第2メッセンジャーレベル、すなわちCa++;細胞増殖;
イノシトールリン酸プール変換(pool change);などに対する薬物
の効果についてスクリーニングするために使用され得る。いくつかの検出方法は
、分離工程の削除を可能にする(例えば、近接感度検出システム)。カルシウム
感受性色素は、蛍光定量器(fluorimeter)または蛍光細胞選別装置
を用いて、Ca++レベルを検出するのに有用である。
【0130】
(X.リガンド)
本明細書におけるDCRS3またはDCRS4の説明は、上記のように、リガ
ンドを同定する手段を提供する。このようなリガンドは、適度に高い親和性を有
するそれぞれのレセプターと特異的に結合するはずである。種々の構築物が、利
用可能となり、これによっていずれのレセプターの標識方法によってもそのリガ
ンドを検出し得る。例えば、サイトカインレセプターの直接標識、二次標識のた
めのマーカー(例えば、FLAGまたは他のエピトープタグ等)を融合させるこ
とにより、レセプターの検出を可能にする。これは、生化学的精製のための親和
性方法、または発現クローニングアプローチでの標識化もしくは選択のように、
組織学的であり得る。ツーハイブリッド選択系もまた、利用可能なサイトカイン
レセプター配列を有する適切な構築物の作製に応用され得る。例えば、Fiel
dsおよびSong(1989)Nature 340:245−246を参照
のこと。
ンドを同定する手段を提供する。このようなリガンドは、適度に高い親和性を有
するそれぞれのレセプターと特異的に結合するはずである。種々の構築物が、利
用可能となり、これによっていずれのレセプターの標識方法によってもそのリガ
ンドを検出し得る。例えば、サイトカインレセプターの直接標識、二次標識のた
めのマーカー(例えば、FLAGまたは他のエピトープタグ等)を融合させるこ
とにより、レセプターの検出を可能にする。これは、生化学的精製のための親和
性方法、または発現クローニングアプローチでの標識化もしくは選択のように、
組織学的であり得る。ツーハイブリッド選択系もまた、利用可能なサイトカイン
レセプター配列を有する適切な構築物の作製に応用され得る。例えば、Fiel
dsおよびSong(1989)Nature 340:245−246を参照
のこと。
【0131】
本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照することにより最も良く理解される
が、これらは発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
が、これらは発明を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【0132】
(実施例)
(I.一般的な方法)
いくつかの標準的な方法を、記述または参照する(例えば、Maniatis
ら、(1982)Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor Press;Sambroo
kら、(1989)Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual、(第2版)、第1〜3巻、CSH Press,NY;
またはAusubelら、(1987および補遺)Current Proto
cols in Molecular Biology、Greene/Wil
ey、New York)。タンパク質の精製のための方法としては、硫酸アン
モニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などの
ような方法が挙げられる。例えば、Ausubelら、(1987および周期的
な補遺);Coliganら、(編1996年)および定期的な補遺、Curr
ent Protocols In Protein Science Gre
ene/Wiley,New York;Deutscher(1990)「G
uide to Protein Purification」Methods
in Enzymology、第182巻およびこのシリーズの他の巻;なら
びにタンパク質精製製品の使用の際の製造業社の文献(例えば、Pharmac
ia、Piscataway、N.J.、またはBio−Rad、Richmo
nd、CA.)を参照のこと。組換え技術と組み合わせて、適切なセグメント(
例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去配列を介して融合され得る等価物
)への融合を可能にする。例えば、Hochuli(1990)「Purifi
cation of Recombinant Proteins with
Metal Chelate Absorbent」 Setlow(編)Ge
netic Engineering,Principle and Meth
ods 12:87−98、Plenum Press,N.Y.;およびCr
oweら、(1992)QIAexpress:The High Level
Expression & Protein Purification S
ystem QUIAGEN,Inc.、Chatsworth、CAを参照の
こと。
ら、(1982)Molecular Cloning,A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor Press;Sambroo
kら、(1989)Molecular Cloning:A Laborat
ory Manual、(第2版)、第1〜3巻、CSH Press,NY;
またはAusubelら、(1987および補遺)Current Proto
cols in Molecular Biology、Greene/Wil
ey、New York)。タンパク質の精製のための方法としては、硫酸アン
モニウム沈殿、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化などの
ような方法が挙げられる。例えば、Ausubelら、(1987および周期的
な補遺);Coliganら、(編1996年)および定期的な補遺、Curr
ent Protocols In Protein Science Gre
ene/Wiley,New York;Deutscher(1990)「G
uide to Protein Purification」Methods
in Enzymology、第182巻およびこのシリーズの他の巻;なら
びにタンパク質精製製品の使用の際の製造業社の文献(例えば、Pharmac
ia、Piscataway、N.J.、またはBio−Rad、Richmo
nd、CA.)を参照のこと。組換え技術と組み合わせて、適切なセグメント(
例えば、FLAG配列またはプロテアーゼ除去配列を介して融合され得る等価物
)への融合を可能にする。例えば、Hochuli(1990)「Purifi
cation of Recombinant Proteins with
Metal Chelate Absorbent」 Setlow(編)Ge
netic Engineering,Principle and Meth
ods 12:87−98、Plenum Press,N.Y.;およびCr
oweら、(1992)QIAexpress:The High Level
Expression & Protein Purification S
ystem QUIAGEN,Inc.、Chatsworth、CAを参照の
こと。
【0133】
コンピューター配列分析を、例えば、GCG(U.Wisconsin)およ
びGenBank供給源からのプログラムを含む、入手可能なソフトウェアプロ
グラムを用いて実行する。公の配列データベースはまた、例えば、GenBan
kなどからのデータベースを使用した。
びGenBank供給源からのプログラムを含む、入手可能なソフトウェアプロ
グラムを用いて実行する。公の配列データベースはまた、例えば、GenBan
kなどからのデータベースを使用した。
【0134】
IL−10レセプターに対して適用可能な多くの技術は、例えば、USSN0
8/110,683号(これは、本明細書中に参考として援用される)(IL−
10レセプター)に記述されるようにDCRS3またはDCRS4に対して適用
され得る。
8/110,683号(これは、本明細書中に参考として援用される)(IL−
10レセプター)に記述されるようにDCRS3またはDCRS4に対して適用
され得る。
【0135】
(II.コンピューター分析)
サイトカインレセプターに関するヒト配列を、例えば、BLASTサーバー(
Altschulら、(1994)Nature Genet.6:119−1
29)を用いてゲノム配列データベースから同定した。標準的な分析プログラム
を用いて、構造を評価し得る(例えば、PHD(RostおよびSander(
1994)Proteins 19:55−72)およびDSC(Kingおよ
びSternberg(1996)Protein Sci.5:2298−2
310))。標準的な比較ソフトウェアとしては、例えば、Altschulら
、(1990)J.Mol.Biol.215:403−10;Waterma
n(1995)Introduction to Computational
Biology:Maps,Sequences,and Genomes
Chapman & Hall;LanderおよびWaterman(編、1
995)Calculating the Secrets of Life:
Applications of the Mathematical Sci
ences in Molecular Biology National
Academy Press;ならびにSpeedおよびWaterman(編
、1996)Genetic Mapping and DNA Sequen
cing(IMA Volumes in Mathematics and
Its Applications、第81巻)Springer Verla
gが挙げられる。
Altschulら、(1994)Nature Genet.6:119−1
29)を用いてゲノム配列データベースから同定した。標準的な分析プログラム
を用いて、構造を評価し得る(例えば、PHD(RostおよびSander(
1994)Proteins 19:55−72)およびDSC(Kingおよ
びSternberg(1996)Protein Sci.5:2298−2
310))。標準的な比較ソフトウェアとしては、例えば、Altschulら
、(1990)J.Mol.Biol.215:403−10;Waterma
n(1995)Introduction to Computational
Biology:Maps,Sequences,and Genomes
Chapman & Hall;LanderおよびWaterman(編、1
995)Calculating the Secrets of Life:
Applications of the Mathematical Sci
ences in Molecular Biology National
Academy Press;ならびにSpeedおよびWaterman(編
、1996)Genetic Mapping and DNA Sequen
cing(IMA Volumes in Mathematics and
Its Applications、第81巻)Springer Verla
gが挙げられる。
【0136】
(III.全長DCRS3またはDCRS4 cDNAのクローニング;染色
体の位置決定) DCRS3またはDCRS4配列由来のPCRプライマーを使用して、ヒトc
DNAライブラリーを調査する。配列は、例えば、表1または表3(好ましくは
、配列の末端に隣接した配列)から得られ得る。霊長類、げっ歯類、または他の
種のDCRS3またはDCRS4についての全長cDNAを、例えば、λgt1
0ファージのDNAハイブリダイゼーションスクリーニングによってクローン化
する。PCR反応を、適切な条件下でT.aquaticus Taqplus
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行う。
体の位置決定) DCRS3またはDCRS4配列由来のPCRプライマーを使用して、ヒトc
DNAライブラリーを調査する。配列は、例えば、表1または表3(好ましくは
、配列の末端に隣接した配列)から得られ得る。霊長類、げっ歯類、または他の
種のDCRS3またはDCRS4についての全長cDNAを、例えば、λgt1
0ファージのDNAハイブリダイゼーションスクリーニングによってクローン化
する。PCR反応を、適切な条件下でT.aquaticus Taqplus
DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行う。
【0137】
局在の実験的な確認のために、染色体スプレッドを調製する。インサイチュハ
イブリダイゼーションを、72時間培養したフィトヘムアグルチニン刺激したヒ
トリンパ球から得た染色体調製物に対して実行する。良質のハイブリダイゼーシ
ョン後の染色体バンド形成を確実にするために、培養(60μg/mlの培地)
の最後の7時間、5−ブロモデオキシウリジンを添加した。
イブリダイゼーションを、72時間培養したフィトヘムアグルチニン刺激したヒ
トリンパ球から得た染色体調製物に対して実行する。良質のハイブリダイゼーシ
ョン後の染色体バンド形成を確実にするために、培養(60μg/mlの培地)
の最後の7時間、5−ブロモデオキシウリジンを添加した。
【0138】
プライマーの助けを用いて増幅されたPCRフラグメントを、適切なベクター
にクローン化する。このベクターを3Hでのニックトランスレーションによって
標識する。放射性標識プローブを、Matteiら(1985)Hum.Gen
et.69:327−331に記載のように、最終濃度200ng/mlのハイ
ブリダイゼーション溶液で、中期スプレッドにハイブリダイズさせる。
にクローン化する。このベクターを3Hでのニックトランスレーションによって
標識する。放射性標識プローブを、Matteiら(1985)Hum.Gen
et.69:327−331に記載のように、最終濃度200ng/mlのハイ
ブリダイゼーション溶液で、中期スプレッドにハイブリダイズさせる。
【0139】
核トラックエマルジョン(KODAK NTB2)でコーティングした後、ス
ライドを露出させる。バンド形成手順の間の銀粒の任意のスリッピングを避ける
ために、染色体スプレッドを緩衝化ギムザ溶液でまず染色し、そして中期を写真
撮影する。次いで、蛍光色素−光分解−ギムザ(FPG)法によってRバンド形
成を行い、そして中期を再度写真撮影し、その後分析する。
ライドを露出させる。バンド形成手順の間の銀粒の任意のスリッピングを避ける
ために、染色体スプレッドを緩衝化ギムザ溶液でまず染色し、そして中期を写真
撮影する。次いで、蛍光色素−光分解−ギムザ(FPG)法によってRバンド形
成を行い、そして中期を再度写真撮影し、その後分析する。
【0140】
同様の適切な方法を、他の種に対して用いる。
【0141】
(IV.DCRS2 mRNAの位置決定)
1レーンあたり約2μgのポリ(A)+RNAを含む、ヒト複合組織(Cat
番号1,2)およびガン細胞株のブロット(Cat番号7757−1)を、Cl
ontech(Palo Alto,CA)から購入する。プローブを、例えば
、Amersham Rediprime ランダムプライマー標識キット(R
PN1633)を使用して、[α−32P]dATPで放射標識する。プレハイブ
リダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、例えば、0.5M Na2
HPO4、7% SDS、0.5M EDTA(pH 8.0)中、65℃にて
行う。高ストリンジェンシーの洗浄を、最初に2回、2×SSC、0.1% S
DSで40分間、続く洗浄を0.1×SSC、0.1% SDSで20分間、6
5℃にて行う。次いで、膜を増感スクリーンの存在下で−70℃にてX線フィル
ム(Kodak)に露光した。cDNAライブラリーのサザンによるより詳細な
研究を、選択された適切なヒトDCRS3クローンを用いて行って、造血細胞の
サブセットまたは他の細胞のサブセットにおけるそれらの発現を調べる。
番号1,2)およびガン細胞株のブロット(Cat番号7757−1)を、Cl
ontech(Palo Alto,CA)から購入する。プローブを、例えば
、Amersham Rediprime ランダムプライマー標識キット(R
PN1633)を使用して、[α−32P]dATPで放射標識する。プレハイブ
リダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、例えば、0.5M Na2
HPO4、7% SDS、0.5M EDTA(pH 8.0)中、65℃にて
行う。高ストリンジェンシーの洗浄を、最初に2回、2×SSC、0.1% S
DSで40分間、続く洗浄を0.1×SSC、0.1% SDSで20分間、6
5℃にて行う。次いで、膜を増感スクリーンの存在下で−70℃にてX線フィル
ム(Kodak)に露光した。cDNAライブラリーのサザンによるより詳細な
研究を、選択された適切なヒトDCRS3クローンを用いて行って、造血細胞の
サブセットまたは他の細胞のサブセットにおけるそれらの発現を調べる。
【0142】
あるいは、2つの適切なプライマーを表1または3から選択する。RT−PC
Rを、メッセージの存在について選択された適切なmRNAサンプル(例えば、
この遺伝子を発現するサンプル)に対して用いて、cDNAを生成する。
Rを、メッセージの存在について選択された適切なmRNAサンプル(例えば、
この遺伝子を発現するサンプル)に対して用いて、cDNAを生成する。
【0143】
全長クローンを、PCRシグナルによって前もって選択された適切な組織由来
のcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションによって単離し得る。ノーザ
ンブロットを行い得る。
のcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションによって単離し得る。ノーザ
ンブロットを行い得る。
【0144】
DCRS3またはDCRS4をコードする遺伝子のメッセージを、適切な技術
(例えば、PCR、免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションまたは他の技術)に
よってアッセイする。組織および器官のcDNAの調製物は、例えば、Clon
tech,Mountain View,CAから入手可能である。天然の発現
の供給源の同定は記載されるように有用である。そして、機能的レセプターサブ
ユニット対形成の同定は、細胞が、サイトカインリガンドの各々に対する生理学
的応答性を生じるレセプターサブユニットの組み合わせを発現するという予測を
可能にする。
(例えば、PCR、免疫アッセイ、ハイブリダイゼーションまたは他の技術)に
よってアッセイする。組織および器官のcDNAの調製物は、例えば、Clon
tech,Mountain View,CAから入手可能である。天然の発現
の供給源の同定は記載されるように有用である。そして、機能的レセプターサブ
ユニット対形成の同定は、細胞が、サイトカインリガンドの各々に対する生理学
的応答性を生じるレセプターサブユニットの組み合わせを発現するという予測を
可能にする。
【0145】
マウス分布のために、例えば、サザン分析が行われ得る:1次増幅したcDN
Aライブラリー由来のDNA(5μg)を、適切な制限酵素を用いて消化し、挿
入物を離し、1%アガロースゲルに流し、そしてナイロン膜(Schleich
er and Schuell、Keene、NH)に転写した。
Aライブラリー由来のDNA(5μg)を、適切な制限酵素を用いて消化し、挿
入物を離し、1%アガロースゲルに流し、そしてナイロン膜(Schleich
er and Schuell、Keene、NH)に転写した。
【0146】
マウスmRNAの単離のためのサンプルとしては、以下が挙げられ得る:休止
マウス繊維芽細胞性L細胞株(C200);Braf:ER(エストロゲンレセ
プターに対するBraf融合物)トランスフェクト細胞(コントロール)(C2
01);T細胞(TH1極性化した)(Mel14明,脾臓由来の、IFNγお
よび抗IL−4で7日間極性化したCD4+細胞;T200);T細胞(TH2
極性化した)(Mel14明,脾臓由来の、IL−4および抗IFNγで7日間
極性化したCD4+細胞;T201);T細胞(高度にTH1極性化した)(O
penshawら(1995)J.Exp.Med.182:1357−136
7を参照のこと;抗CD3で2、6、16時間活性化し、プールした;T202
);T細胞(高度にTH2極性化した)(Openshawら(1995)J.
Exp.Med.182:1357−1367を参照のこと;抗CD3で2、6
、16時間活性化し、プールした;T203);CD44−CD25+プレT細
胞(胸腺から分類した)(T204);TH1 T細胞クローン D1.1(抗
原での最後の刺激後3週間休止する)(T205);TH1 T細胞クローンD
1.1(10μg/ml ConAを15時間刺激した)(T206);TH2
T細胞クローンCDC35(抗原での最後の刺激後3週間休止する)(T20
7);TH2 T細胞クローンCDC35(10 μg/ml ConAを15
時間刺激した)(T208);Mel14+脾臓由来ナイーブT細胞(休止)(
T209);Mel14+ T細胞(IFN−γ/IL−12/抗IL−4でT
h1を6、12、24時間極性化し、プールした)(T210);Mel14+
T細胞(IL−4/抗IFN−γでTh2を6、13、24時間極性化し、プ
ールした)(T211);未刺激成熟B細胞白血病細胞株A20(B200);
未刺激B細胞株CH12(B201);未刺激脾臓由来大B細胞(B202);
全脾臓由来B細胞(LPS活性化した)(B203);脾臓由来のメトリザマイ
ド富化樹状細胞(休止)(D200);骨髄由来の樹状細胞(休止)(D201
);LPSで4時間活性化した単球細胞株RAW264.7(M200);GM
およびM−CSF由来骨髄マクロファージ(M201);マクロファージ細胞株
J774(休止)(M202);0.5、1、3、6、12時間プールしたマク
ロファージ細胞株J774+LPS+抗IL10(M203);0.5、1、3
、5、12時間プールしたマクロファージ細胞株J774+LPS+IL10(
M204);エアロゾルでチャレンジしたマウス肺組織(Th2プライマー、7
、14、23時間プールしたエアロゾルOVAチャレンジ)(Garlisiら
、(1995)Clinical Immunology and Immun
opathology 75:75−83を参照のこと;X206);Nipp
ostrongulus−感染肺組織(Coffmanら、(1989)Sci
ence 245:308−310を参照のこと;X200);全成人肺(正常
)(O200);全肺rag−1(Schwartら(1993)Immuno
deficiency 4:249−252を参照のこと;O205);IL−
10 K.O.脾臓(Kuhn ら、(1991)Cell 75:263−2
74を参照のこと;X201);全成人脾臓(正常)(O201);全脾臓ra
g−1(O207);IL−10 K.O.パイアー斑(O202);全パイア
ー斑(正常)(O210);IL−10 K.O.腸間膜リンパ節(X203)
;全腸間膜リンパ節(正常)(O211);IL−10 K.O.結腸(X20
3);全結腸(正常)(O212);NOD マウス膵臓(Makinoら、(
1980)Jikken Dobutsu 29:1−13を参照のこと;X2
05);全胸腺rag−1(O208);全腎臓rag−1(0209);全心
臓rag−1(O202);全脳rag−1(O203);全精巣rag−1(
O204);全肝臓rag−1(O206);ラット正常関節組織(O300)
;ラット関節炎関節組織(X300)。
マウス繊維芽細胞性L細胞株(C200);Braf:ER(エストロゲンレセ
プターに対するBraf融合物)トランスフェクト細胞(コントロール)(C2
01);T細胞(TH1極性化した)(Mel14明,脾臓由来の、IFNγお
よび抗IL−4で7日間極性化したCD4+細胞;T200);T細胞(TH2
極性化した)(Mel14明,脾臓由来の、IL−4および抗IFNγで7日間
極性化したCD4+細胞;T201);T細胞(高度にTH1極性化した)(O
penshawら(1995)J.Exp.Med.182:1357−136
7を参照のこと;抗CD3で2、6、16時間活性化し、プールした;T202
);T細胞(高度にTH2極性化した)(Openshawら(1995)J.
Exp.Med.182:1357−1367を参照のこと;抗CD3で2、6
、16時間活性化し、プールした;T203);CD44−CD25+プレT細
胞(胸腺から分類した)(T204);TH1 T細胞クローン D1.1(抗
原での最後の刺激後3週間休止する)(T205);TH1 T細胞クローンD
1.1(10μg/ml ConAを15時間刺激した)(T206);TH2
T細胞クローンCDC35(抗原での最後の刺激後3週間休止する)(T20
7);TH2 T細胞クローンCDC35(10 μg/ml ConAを15
時間刺激した)(T208);Mel14+脾臓由来ナイーブT細胞(休止)(
T209);Mel14+ T細胞(IFN−γ/IL−12/抗IL−4でT
h1を6、12、24時間極性化し、プールした)(T210);Mel14+
T細胞(IL−4/抗IFN−γでTh2を6、13、24時間極性化し、プ
ールした)(T211);未刺激成熟B細胞白血病細胞株A20(B200);
未刺激B細胞株CH12(B201);未刺激脾臓由来大B細胞(B202);
全脾臓由来B細胞(LPS活性化した)(B203);脾臓由来のメトリザマイ
ド富化樹状細胞(休止)(D200);骨髄由来の樹状細胞(休止)(D201
);LPSで4時間活性化した単球細胞株RAW264.7(M200);GM
およびM−CSF由来骨髄マクロファージ(M201);マクロファージ細胞株
J774(休止)(M202);0.5、1、3、6、12時間プールしたマク
ロファージ細胞株J774+LPS+抗IL10(M203);0.5、1、3
、5、12時間プールしたマクロファージ細胞株J774+LPS+IL10(
M204);エアロゾルでチャレンジしたマウス肺組織(Th2プライマー、7
、14、23時間プールしたエアロゾルOVAチャレンジ)(Garlisiら
、(1995)Clinical Immunology and Immun
opathology 75:75−83を参照のこと;X206);Nipp
ostrongulus−感染肺組織(Coffmanら、(1989)Sci
ence 245:308−310を参照のこと;X200);全成人肺(正常
)(O200);全肺rag−1(Schwartら(1993)Immuno
deficiency 4:249−252を参照のこと;O205);IL−
10 K.O.脾臓(Kuhn ら、(1991)Cell 75:263−2
74を参照のこと;X201);全成人脾臓(正常)(O201);全脾臓ra
g−1(O207);IL−10 K.O.パイアー斑(O202);全パイア
ー斑(正常)(O210);IL−10 K.O.腸間膜リンパ節(X203)
;全腸間膜リンパ節(正常)(O211);IL−10 K.O.結腸(X20
3);全結腸(正常)(O212);NOD マウス膵臓(Makinoら、(
1980)Jikken Dobutsu 29:1−13を参照のこと;X2
05);全胸腺rag−1(O208);全腎臓rag−1(0209);全心
臓rag−1(O202);全脳rag−1(O203);全精巣rag−1(
O204);全肝臓rag−1(O206);ラット正常関節組織(O300)
;ラット関節炎関節組織(X300)。
【0147】
ヒトmRNAの単離のためのサンプルとしては、以下が挙げられ得る:末梢血
単核細胞(単球、T細胞、NK細胞、顆粒球、B細胞)(休止)(T100);
末梢血単核細胞(抗CD3で2、6、12時間活性化し、プールした)(T10
1);T細胞TH0クローンMot72(休止)(T102);T細胞TH0ク
ローンMot72(抗CD28および抗CD3で3、6、12時間活性化し、プ
ールした)(T103);T細胞TH0クローンMot72(特異的ペプチドで
2、7、12時間アネルギー処理し、プールした)(T104);T細胞TH1
クローンHY06(休止)(T107);T細胞、TH1クローンHY06(抗
CD28および抗CD3で3、6、12時間活性化し、プールした)(T108
);T細胞、TH1クローンHY06(特異的ペプチドで2、6、12時間アネ
ルギー処理し、プールした)(T109);T細胞、TH2クローンHY935
(休止)(T110);T細胞、TH2クローンHY935(抗CD28および
抗CD3で2、7、12時間活性化し、プールした)(T111);T細胞CD
4+CD45RO− T細胞(抗CD28、IL−4、および抗IFN−γにお
いて27日間極性化し、TH2極性化し、抗CD3および抗CD28で4時間活
性化した)(T116);T細胞腫瘍株ジャーカットおよびHut78(休止)
(T117);T細胞クローン、プールしたAD130.2、Tc783.12
、Tc783.13、Tc783.58、Tc782.69(休止)(T118
);T細胞ランダムγδT細胞クローン(休止)(T119);脾細胞(休止)
(B100);脾細胞(抗CD40およびIL−4で活性化した)(B101)
;B細胞EBV株、プールしたWT49、RSB、JY、CVIR、721.2
21、RM3、HSY(休止)(B102);B細胞株JY(PMAおよびイオ
ノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(B103);プールしたNK
20クローン(休止)(K100);プールしたNK20クローン(PMAおよ
びイオノマイシンで6時間活性化した)(K101);NKLクローン(LGL
白血病患者の末梢血由来、IL−2処理した)(K106);NK細胞傷害性ク
ローン640−A30−1(休止)(K107);造血前駆株TF1(PMAお
よびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(C100);U93
7前単球株(休止)(M100);U937前単球株(PMAおよびイオノマイ
シンで1、6時間活性化し、プールした)(M101);溶離した単球(elu
triated monocyte)(LPS、IFNγ、抗IL−10で1、
2、6、12、24時間活性化し、プールした)(M102);溶離した単球(
LPS、IFNγ、IL−10で1、2、6、12、24時間活性化し、プール
した)(M103);溶離した単球(LPS、IFNγ、抗IL−10で4、1
6時間活性化し、プールした)(M106);溶離した単球(LPS、IFNγ
、IL−10で4、16時間活性化し、プールした)(M107);溶離した単
球(LPSで1時間活性化した(M108);溶離した単球(LPSで6時間活
性化した)(M109);DC 70% CD1a+(CD34+GM−CSF
、TNFα12日間由来、休止)(D101);DC 70% CD1a+(C
D34+ GM−CSF、TNFα12日間由来、PMAおよびイオノマイシン
で1時間活性化した)(D102);DC 70% CD1a+(CD34+
GM−CSF、TNFα12日間由来、PMAおよびイオノマイシンで6時間活
性化した)(D103);DC 95% CD1a+(CD34+ GM−CS
F、TNFα12日間FACS選別由来、PMAおよびイオノマイシンで1、6
時間活性化し、プールした)(D104);DC 95% CD14+(CD3
4+ GM−CSF、TNFα12日間FACS選別由来、PMAおよびイオノ
マイシンで1、6時間活性化し、プールした)(D105);DC CD1a+
CD86+(CD34+ GM−CSF、TNFα12日間FACS選別由来
、PMAおよびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(D106
);DC(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、休止)(D107);D
C(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、休止)(D108);DC(単
球GM−CSF、IL−4 5日間由来、LPSで4、16時間活性化し、プー
ルした)(D109);DC(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、TN
Fα、単球上清(supe)で4、16時間活性化し、プールした)(D110
);平滑筋腫L11良性腫瘍(X101);正常子宮筋層M5(O115);悪
性平滑筋肉腫GS1(X103);肺繊維芽細胞肉腫株MRC5(PMAおよび
イオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(C101);腎臓上皮癌
細胞株CHA(PMAおよびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした
)(C102);28週齢雄性胎児腎(O100);28週齢雄性胎児肺(O1
01);28週齢雄性胎児肝臓(O102);28週齢雄性胎児心臓(O103
);28週齢雄性胎児脳(O104);28週齢雄性胎児胆嚢(O106);2
8週齢雄性胎児小腸(O107);28週齢雄性胎児脂肪組織(O108);2
5週齢雌性胎児卵巣(O109);25週齢雌性胎児子宮(O110);28週
齢雄性胎児精巣(O111);28週齢雄性胎児脾臓(O112);成人の28
週齢胎盤(O113);および12歳由来の炎症扁桃(X100)。
単核細胞(単球、T細胞、NK細胞、顆粒球、B細胞)(休止)(T100);
末梢血単核細胞(抗CD3で2、6、12時間活性化し、プールした)(T10
1);T細胞TH0クローンMot72(休止)(T102);T細胞TH0ク
ローンMot72(抗CD28および抗CD3で3、6、12時間活性化し、プ
ールした)(T103);T細胞TH0クローンMot72(特異的ペプチドで
2、7、12時間アネルギー処理し、プールした)(T104);T細胞TH1
クローンHY06(休止)(T107);T細胞、TH1クローンHY06(抗
CD28および抗CD3で3、6、12時間活性化し、プールした)(T108
);T細胞、TH1クローンHY06(特異的ペプチドで2、6、12時間アネ
ルギー処理し、プールした)(T109);T細胞、TH2クローンHY935
(休止)(T110);T細胞、TH2クローンHY935(抗CD28および
抗CD3で2、7、12時間活性化し、プールした)(T111);T細胞CD
4+CD45RO− T細胞(抗CD28、IL−4、および抗IFN−γにお
いて27日間極性化し、TH2極性化し、抗CD3および抗CD28で4時間活
性化した)(T116);T細胞腫瘍株ジャーカットおよびHut78(休止)
(T117);T細胞クローン、プールしたAD130.2、Tc783.12
、Tc783.13、Tc783.58、Tc782.69(休止)(T118
);T細胞ランダムγδT細胞クローン(休止)(T119);脾細胞(休止)
(B100);脾細胞(抗CD40およびIL−4で活性化した)(B101)
;B細胞EBV株、プールしたWT49、RSB、JY、CVIR、721.2
21、RM3、HSY(休止)(B102);B細胞株JY(PMAおよびイオ
ノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(B103);プールしたNK
20クローン(休止)(K100);プールしたNK20クローン(PMAおよ
びイオノマイシンで6時間活性化した)(K101);NKLクローン(LGL
白血病患者の末梢血由来、IL−2処理した)(K106);NK細胞傷害性ク
ローン640−A30−1(休止)(K107);造血前駆株TF1(PMAお
よびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(C100);U93
7前単球株(休止)(M100);U937前単球株(PMAおよびイオノマイ
シンで1、6時間活性化し、プールした)(M101);溶離した単球(elu
triated monocyte)(LPS、IFNγ、抗IL−10で1、
2、6、12、24時間活性化し、プールした)(M102);溶離した単球(
LPS、IFNγ、IL−10で1、2、6、12、24時間活性化し、プール
した)(M103);溶離した単球(LPS、IFNγ、抗IL−10で4、1
6時間活性化し、プールした)(M106);溶離した単球(LPS、IFNγ
、IL−10で4、16時間活性化し、プールした)(M107);溶離した単
球(LPSで1時間活性化した(M108);溶離した単球(LPSで6時間活
性化した)(M109);DC 70% CD1a+(CD34+GM−CSF
、TNFα12日間由来、休止)(D101);DC 70% CD1a+(C
D34+ GM−CSF、TNFα12日間由来、PMAおよびイオノマイシン
で1時間活性化した)(D102);DC 70% CD1a+(CD34+
GM−CSF、TNFα12日間由来、PMAおよびイオノマイシンで6時間活
性化した)(D103);DC 95% CD1a+(CD34+ GM−CS
F、TNFα12日間FACS選別由来、PMAおよびイオノマイシンで1、6
時間活性化し、プールした)(D104);DC 95% CD14+(CD3
4+ GM−CSF、TNFα12日間FACS選別由来、PMAおよびイオノ
マイシンで1、6時間活性化し、プールした)(D105);DC CD1a+
CD86+(CD34+ GM−CSF、TNFα12日間FACS選別由来
、PMAおよびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(D106
);DC(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、休止)(D107);D
C(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、休止)(D108);DC(単
球GM−CSF、IL−4 5日間由来、LPSで4、16時間活性化し、プー
ルした)(D109);DC(単球GM−CSF、IL−4 5日間由来、TN
Fα、単球上清(supe)で4、16時間活性化し、プールした)(D110
);平滑筋腫L11良性腫瘍(X101);正常子宮筋層M5(O115);悪
性平滑筋肉腫GS1(X103);肺繊維芽細胞肉腫株MRC5(PMAおよび
イオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした)(C101);腎臓上皮癌
細胞株CHA(PMAおよびイオノマイシンで1、6時間活性化し、プールした
)(C102);28週齢雄性胎児腎(O100);28週齢雄性胎児肺(O1
01);28週齢雄性胎児肝臓(O102);28週齢雄性胎児心臓(O103
);28週齢雄性胎児脳(O104);28週齢雄性胎児胆嚢(O106);2
8週齢雄性胎児小腸(O107);28週齢雄性胎児脂肪組織(O108);2
5週齢雌性胎児卵巣(O109);25週齢雌性胎児子宮(O110);28週
齢雄性胎児精巣(O111);28週齢雄性胎児脾臓(O112);成人の28
週齢胎盤(O113);および12歳由来の炎症扁桃(X100)。
【0148】
同様のサンプルは、評価のために他の種において単離し得る。
【0149】
(V.DCRS3またはDCRS4の種相対物のクローニング)
種々のストラテジーを用いて、DCRS3またはDCRS4の種相対物を、好
ましくは他の霊長類またはげっ歯類から得る。1つの方法は、密接に関連した種
のDNAプローブを使用するクロスハイブリダイゼーションによる方法である。
中間段階として、進化的に類似の種を調査するのは有用であり得る。別の方法は
、遺伝子間(例えば、高度に保存されたかもしくは保存されていないポリペプチ
ドまたはヌクレオチド配列の領域)の類似性または相違するブロックの同定に基
づく特異的なPCRプライマーを用いることによる方法である。抗体ベースのス
クリーニング法もまた例えば、発現クローニングにおいて利用可能である。
ましくは他の霊長類またはげっ歯類から得る。1つの方法は、密接に関連した種
のDNAプローブを使用するクロスハイブリダイゼーションによる方法である。
中間段階として、進化的に類似の種を調査するのは有用であり得る。別の方法は
、遺伝子間(例えば、高度に保存されたかもしくは保存されていないポリペプチ
ドまたはヌクレオチド配列の領域)の類似性または相違するブロックの同定に基
づく特異的なPCRプライマーを用いることによる方法である。抗体ベースのス
クリーニング法もまた例えば、発現クローニングにおいて利用可能である。
【0150】
(VI.哺乳動物DCRS3またはDCRS4タンパク質の産生)
適切な(例えば、GST)融合構築物を、例えば、E.coliで発現させる
ために操作する。例えば、マウスIGIF pGexプラスミドを構築し、そし
てE.coliに形質転換する。新たに形質転換した細胞を、例えば、50μg
/mlアンピシリン含有LB培地で増殖させ、そしてIPTG(Sigma,S
t.Louis,MO)で誘導する。一晩の誘導後、この細菌を収集し、そして
例えば、DCRS3タンパク質を含むペレットを単離する。このペレットを、例
えば、TE緩衝液(50mM Tris−塩基 pH8.0, 10mM ED
TAおよび2mMペファブロック(pefabloc))2リットル中でホモジ
ナイズする。この物質を、微量流動化装置(microfluidizer)(
Microfluidics,Newton,MA)を三回通過させる。流動化
した上清を、Sorvall GS−3ローターにより13,000rpmで1
時間スピンダウンさせる。得られたこのサイトカインレセプタータンパク質含有
上清を濾過し、そして50mM Tris−塩基 pH8.0で平衡化したグル
タチオン−SEPHAROSEカラムに通す。DCRS3−GST融合タンパク
質を含む画分をプールし、そして例えば、トロンビン(Enzyme Rese
arch Laboratories,Inc.,South Bend,IN
)で切断する。次いで、切断したプールを、50mM Tris−塩基で平衡化
したQ−SEPHAROSEカラムに通す。DCRS3を含む画分をプールし、
そして冷却した蒸留H2Oで希釈して伝導率を低下させ、そして新鮮なQ−Se
pharoseカラム単独に、または続いて免疫アフィニティー抗体カラムに戻
して通した。DCRS3タンパク質を含む画分をプールし、アリコートにし、そ
して−70℃の冷凍庫で保存する。
ために操作する。例えば、マウスIGIF pGexプラスミドを構築し、そし
てE.coliに形質転換する。新たに形質転換した細胞を、例えば、50μg
/mlアンピシリン含有LB培地で増殖させ、そしてIPTG(Sigma,S
t.Louis,MO)で誘導する。一晩の誘導後、この細菌を収集し、そして
例えば、DCRS3タンパク質を含むペレットを単離する。このペレットを、例
えば、TE緩衝液(50mM Tris−塩基 pH8.0, 10mM ED
TAおよび2mMペファブロック(pefabloc))2リットル中でホモジ
ナイズする。この物質を、微量流動化装置(microfluidizer)(
Microfluidics,Newton,MA)を三回通過させる。流動化
した上清を、Sorvall GS−3ローターにより13,000rpmで1
時間スピンダウンさせる。得られたこのサイトカインレセプタータンパク質含有
上清を濾過し、そして50mM Tris−塩基 pH8.0で平衡化したグル
タチオン−SEPHAROSEカラムに通す。DCRS3−GST融合タンパク
質を含む画分をプールし、そして例えば、トロンビン(Enzyme Rese
arch Laboratories,Inc.,South Bend,IN
)で切断する。次いで、切断したプールを、50mM Tris−塩基で平衡化
したQ−SEPHAROSEカラムに通す。DCRS3を含む画分をプールし、
そして冷却した蒸留H2Oで希釈して伝導率を低下させ、そして新鮮なQ−Se
pharoseカラム単独に、または続いて免疫アフィニティー抗体カラムに戻
して通した。DCRS3タンパク質を含む画分をプールし、アリコートにし、そ
して−70℃の冷凍庫で保存する。
【0151】
CDスペクトルのサイトカインレセプタータンパク質との比較により、このタ
ンパク質が正確に折り畳まれていることを示唆し得る。Hazudaら、(19
69)J.Biol.Chem.264:1689−1693を参照のこと。 (VII.DCRS3またはDCRS4に特異的な抗体の調製) 近交系Balb/cマウスを、組換え形態のタンパク質(例えば、精製したD
CRS3または安定なトランスフェクトしたNIH−3T3細胞で腹腔内免疫す
る。動物を、適切な時点で、タンパク質(さらなるアジュバントを含むか、また
は含まない)でブーストし、抗体の産生をさらに刺激する。血清を収集するか、
またはハイブリドーマを収集した脾臓で産生する。
ンパク質が正確に折り畳まれていることを示唆し得る。Hazudaら、(19
69)J.Biol.Chem.264:1689−1693を参照のこと。 (VII.DCRS3またはDCRS4に特異的な抗体の調製) 近交系Balb/cマウスを、組換え形態のタンパク質(例えば、精製したD
CRS3または安定なトランスフェクトしたNIH−3T3細胞で腹腔内免疫す
る。動物を、適切な時点で、タンパク質(さらなるアジュバントを含むか、また
は含まない)でブーストし、抗体の産生をさらに刺激する。血清を収集するか、
またはハイブリドーマを収集した脾臓で産生する。
【0152】
あるいは、Balb/cマウスを、遺伝子もしくはそのフラグメントで形質転
換した細胞(内因性細胞または外因性細胞のいずれか)で免疫するか、または抗
原の発現を富化した単離された膜で免疫する。血清を適切な時点で、代表的には
多くのさらなる投与後に収集する。種々の遺伝子治療技術は、例えば、免疫応答
を生成するためのインサイチュでのタンパク質産生において有用であり得る。血
清または抗体の調製物を、クロス吸収(cross−absorb)または免疫
選択して、規定された特異性および高親和性の実質的に精製された抗体を調製し
得る。
換した細胞(内因性細胞または外因性細胞のいずれか)で免疫するか、または抗
原の発現を富化した単離された膜で免疫する。血清を適切な時点で、代表的には
多くのさらなる投与後に収集する。種々の遺伝子治療技術は、例えば、免疫応答
を生成するためのインサイチュでのタンパク質産生において有用であり得る。血
清または抗体の調製物を、クロス吸収(cross−absorb)または免疫
選択して、規定された特異性および高親和性の実質的に精製された抗体を調製し
得る。
【0153】
モノクローナル抗体を作製し得る。例えば、脾細胞を、適切な融合パートナー
と融合し、そしてハイブリドーマを標準手順により増殖培地で選択する。ハイブ
リドーマの上清を、DCRS3に結合する抗体の存在について、例えば、ELI
SAまたは他のアッセイによりスクリーニングする。特定のDCRS3の実施形
態を特異的に認識する抗体もまた、選択または調製され得る。
と融合し、そしてハイブリドーマを標準手順により増殖培地で選択する。ハイブ
リドーマの上清を、DCRS3に結合する抗体の存在について、例えば、ELI
SAまたは他のアッセイによりスクリーニングする。特定のDCRS3の実施形
態を特異的に認識する抗体もまた、選択または調製され得る。
【0154】
別の方法において、合成ペプチドまたは精製タンパク質を免疫系に提示し、モ
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成する。例えば、Coliga
n(1991版)Current Protocols in Immunol
ogy,Wiley/Greene;ならびにHarlowおよびLane(1
989)Antibodies:A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Pressを参照のこと。適切な状況に
おいて、結合試薬を上記のように(例えば、蛍光または他の方法)標識するか、
またはパンニング法のための基体に固定化するかのいずれかである。核酸はまた
、動物の細胞に導入されて抗原(これは、免疫応答を誘発するのに役立つ)を産
生し得る。例えば、Wangら、(1993)Proc.Nat’l.Acad
.Sci.90:4156−4160;Barryら、(1994)BioTe
chniques16:616−619;およびXiangら、(1995)I
mmunity 2:129−135を参照のこと。
ノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成する。例えば、Coliga
n(1991版)Current Protocols in Immunol
ogy,Wiley/Greene;ならびにHarlowおよびLane(1
989)Antibodies:A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Pressを参照のこと。適切な状況に
おいて、結合試薬を上記のように(例えば、蛍光または他の方法)標識するか、
またはパンニング法のための基体に固定化するかのいずれかである。核酸はまた
、動物の細胞に導入されて抗原(これは、免疫応答を誘発するのに役立つ)を産
生し得る。例えば、Wangら、(1993)Proc.Nat’l.Acad
.Sci.90:4156−4160;Barryら、(1994)BioTe
chniques16:616−619;およびXiangら、(1995)I
mmunity 2:129−135を参照のこと。
【0155】
(VIII.DCRSを有する融合タンパク質の産生)
種々の融合構築物を、DCRSを用いて作製する。この適切な遺伝子の部分を
、エピトープタグ(例えば、FLAGタグ)、またはツーハイブリッドシステム
構築物に融合する。例えば、FieldsおよびSong(1989)Natu
re 340:245−246を参照のこと。
、エピトープタグ(例えば、FLAGタグ)、またはツーハイブリッドシステム
構築物に融合する。例えば、FieldsおよびSong(1989)Natu
re 340:245−246を参照のこと。
【0156】
このエピトープタグを、結合パートナー(例えば、それぞれのサイトカインレ
セプターのためのリガンド)を検出する抗FLAG抗体での検出を用いる発現ク
ローニング手順に使用し得る。ツーハイブリッドシステムはまた、DCRSに特
異的に結合するタンパク質を単離するために使用され得る。
セプターのためのリガンド)を検出する抗FLAG抗体での検出を用いる発現ク
ローニング手順に使用し得る。ツーハイブリッドシステムはまた、DCRSに特
異的に結合するタンパク質を単離するために使用され得る。
【0157】
(IX.構造活性相関)
特定の残基の重要性に関する情報を、標準的手順および分析を使用して決定す
る。標準的変異誘発分析を、例えば、所定の位置(例えば、上記で同定した位置
)で多くの異なる改変体を作製し、そしてこの改変体の生物学的活性を評価する
ことにより行う。これを、活性を改変する位置を決定するまで、または生物学的
活性を保持、ブロック、もしくは調節のいずれかをさせるために置換され得る残
基を決定するために特定の位置に焦点をあてるまで実施し得る。
る。標準的変異誘発分析を、例えば、所定の位置(例えば、上記で同定した位置
)で多くの異なる改変体を作製し、そしてこの改変体の生物学的活性を評価する
ことにより行う。これを、活性を改変する位置を決定するまで、または生物学的
活性を保持、ブロック、もしくは調節のいずれかをさせるために置換され得る残
基を決定するために特定の位置に焦点をあてるまで実施し得る。
【0158】
あるいは、天然の改変体の分析は、どの位置が天然の変異に寛容かを示し得る
。これは、個体間、または株間もしくは種間のバリエーションの集団分析から生
じ得る。選択した個体由来のサンプルを、例えば、PCR分析および配列決定に
より分析する。これにより、集団多型の評価が可能になる。
。これは、個体間、または株間もしくは種間のバリエーションの集団分析から生
じ得る。選択した個体由来のサンプルを、例えば、PCR分析および配列決定に
より分析する。これにより、集団多型の評価が可能になる。
【0159】
(X.DCRSのためのリガンドの単離)
サイトカインレセプターを、特異的結合試薬として使用し、抗体が使用される
のと同様に、その結合特異性の利点を利用することにより、その結合パートナー
を同定し得る。結合レセプターは、レセプターサブユニットのヘテロ二量体であ
り得る;または例えば、別のサブユニットを有するDCRSの複合体を含み得る
。結合試薬は、上記のように(例えば、蛍光または他の方法で)標識するか、ま
たはパンニング法の基体に固定するかのいずれかである。
のと同様に、その結合特異性の利点を利用することにより、その結合パートナー
を同定し得る。結合レセプターは、レセプターサブユニットのヘテロ二量体であ
り得る;または例えば、別のサブユニットを有するDCRSの複合体を含み得る
。結合試薬は、上記のように(例えば、蛍光または他の方法で)標識するか、ま
たはパンニング法の基体に固定するかのいずれかである。
【0160】
結合組成物を使用して、結合パートナー(すなわち、好ましくは膜と会合した
、リガンド)を発現する細胞株から作製した発現ライブラリーのスクリーニング
を行う。標準的染色技術を使用して、表面に発現されるリガンドを検出または選
別するか、または表面に発現する形質転換細胞をパンニングによりスクリーニン
グする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色または免疫蛍光手順により
行う。McMahanら、(1991)EMBO J.10:2821−283
2もまた参照のこと。
、リガンド)を発現する細胞株から作製した発現ライブラリーのスクリーニング
を行う。標準的染色技術を使用して、表面に発現されるリガンドを検出または選
別するか、または表面に発現する形質転換細胞をパンニングによりスクリーニン
グする。細胞内発現のスクリーニングを、種々の染色または免疫蛍光手順により
行う。McMahanら、(1991)EMBO J.10:2821−283
2もまた参照のこと。
【0161】
例えば、0日目に、2チャンバーパーマノックス(permanox)スライ
ドを、チャンバーあたり1mlのフィブロネクチン(PBS中10ng/ml)
で、室温にて30分間、予め被覆する。PBSで1回リンスする。次に、COS
細胞を、1.5mlの増殖培地中、2〜3×105細胞/チャンバーでプレーテ
ィングする。37℃で一晩インキュベートする。
ドを、チャンバーあたり1mlのフィブロネクチン(PBS中10ng/ml)
で、室温にて30分間、予め被覆する。PBSで1回リンスする。次に、COS
細胞を、1.5mlの増殖培地中、2〜3×105細胞/チャンバーでプレーテ
ィングする。37℃で一晩インキュベートする。
【0162】
各サンプルについて、1日目に、無血清DME中の66μg/ml DEAE
−デキストラン、66μMクロロキン、および4μg DNAの溶液0.5ml
を調製する。各セットについて、例えば、1および1/200希釈のDCRS−
FLAG cDNAの陽性コントロール、ならびに陰性モックを調製する。細胞
を無血清DMEでリンスする。DNA溶液を添加し、そして37℃で5時間イン
キュベートする。培地を除去し、そしてDME中の10%DMSOの0.5ml
を2.5分間添加する。これを除去し、DMEで一度洗浄する。1.5mlの増
殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。
−デキストラン、66μMクロロキン、および4μg DNAの溶液0.5ml
を調製する。各セットについて、例えば、1および1/200希釈のDCRS−
FLAG cDNAの陽性コントロール、ならびに陰性モックを調製する。細胞
を無血清DMEでリンスする。DNA溶液を添加し、そして37℃で5時間イン
キュベートする。培地を除去し、そしてDME中の10%DMSOの0.5ml
を2.5分間添加する。これを除去し、DMEで一度洗浄する。1.5mlの増
殖培地を添加し、そして一晩インキュベートする。
【0163】
2日目、培地を交換する。3または4日目、細胞を固定し、そして染色する。
細胞をHank緩衝化生理食塩水溶液(Hank’s Buffered Sa
line Solution)(HBSS)で二回リンスし、そして4%パラホ
ルムアルデヒド(PFA)/グルコースで5分間固定する。HBSSで3回洗浄
する。すべての液体を除去した後、スライドを−80℃で保存し得る。各チャン
バーについて、0.5mlインキュベーションを以下のように行う。32μl/
mlの1M NaN3を含むHBSS/サポニン(0.1%)を、20分間添加
する。次に、細胞をHBSS/サポニンで1回洗浄する。適切なDCRSまたは
DCRS/抗体複合体を細胞に添加し、そして30分間インキュベートする。細
胞をHBSS/サポニンで二回洗浄する。適切な場合、1次抗体を30分間添加
する。2次抗体、例えば、ベクター抗マウス抗体を1/200希釈で添加し、そ
して30分間インキュベートする。ELISA溶液(例えば、Vector E
lite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液)を調製し、そして30分間
プレインキュベートする。例えば、HBSS/サポニン2.5ml当たり、溶液
A(アビジン)1滴および溶液B(ビオチン)1滴を使用する。細胞をHBSS
/サポニンで二回洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、そして30分間イン
キュベートする。細胞をHBSSで二回洗浄し、二回目の洗浄を2分間行い、こ
れは細胞を閉鎖する。次いで、Vectorジアミノ安息香酸(DAB)を5〜
10分間添加する。ガラス蒸留水5ml当たり、緩衝液2滴に加えてDAB 4
滴およびH2O2 2滴を使用する。チャンバーを注意深く除去し、そしてスライ
ドを水中でリンスする。数分間、風乾し、次いでCrystal Mount1
滴を添加し、そしてカバースリップを加える。85〜90℃で5分間焼く。
細胞をHank緩衝化生理食塩水溶液(Hank’s Buffered Sa
line Solution)(HBSS)で二回リンスし、そして4%パラホ
ルムアルデヒド(PFA)/グルコースで5分間固定する。HBSSで3回洗浄
する。すべての液体を除去した後、スライドを−80℃で保存し得る。各チャン
バーについて、0.5mlインキュベーションを以下のように行う。32μl/
mlの1M NaN3を含むHBSS/サポニン(0.1%)を、20分間添加
する。次に、細胞をHBSS/サポニンで1回洗浄する。適切なDCRSまたは
DCRS/抗体複合体を細胞に添加し、そして30分間インキュベートする。細
胞をHBSS/サポニンで二回洗浄する。適切な場合、1次抗体を30分間添加
する。2次抗体、例えば、ベクター抗マウス抗体を1/200希釈で添加し、そ
して30分間インキュベートする。ELISA溶液(例えば、Vector E
lite ABC西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液)を調製し、そして30分間
プレインキュベートする。例えば、HBSS/サポニン2.5ml当たり、溶液
A(アビジン)1滴および溶液B(ビオチン)1滴を使用する。細胞をHBSS
/サポニンで二回洗浄する。ABC HRP溶液を添加し、そして30分間イン
キュベートする。細胞をHBSSで二回洗浄し、二回目の洗浄を2分間行い、こ
れは細胞を閉鎖する。次いで、Vectorジアミノ安息香酸(DAB)を5〜
10分間添加する。ガラス蒸留水5ml当たり、緩衝液2滴に加えてDAB 4
滴およびH2O2 2滴を使用する。チャンバーを注意深く除去し、そしてスライ
ドを水中でリンスする。数分間、風乾し、次いでCrystal Mount1
滴を添加し、そしてカバースリップを加える。85〜90℃で5分間焼く。
【0164】
プールの陽性染色を評価し、そして結合の原因となる単一遺伝子を単離するま
で進行的にサブクローニングする。
で進行的にサブクローニングする。
【0165】
あるいは、レセプター試薬を使用し、推定リガンドを発現する細胞をアフィニ
ティー精製するか、または選別する。例えば、Sambrookら、またはAu
subelらを参照のこと。
ティー精製するか、または選別する。例えば、Sambrookら、またはAu
subelらを参照のこと。
【0166】
別のストラテジーは、パンニングにより膜結合型レセプターについてスクリー
ニングすることである。レセプターcDNAを、上記のように構築する。固定化
は、例えば、DCRS融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体を使用す
るか、または1次抗体に対して惹起された抗体を使用することにより達成され得
る。選択および増幅の反復周期により、適切なクローンが富化され、その結果、
レセプターを発現するクローンが単離される。
ニングすることである。レセプターcDNAを、上記のように構築する。固定化
は、例えば、DCRS融合構築物のFLAG配列を認識する適切な抗体を使用す
るか、または1次抗体に対して惹起された抗体を使用することにより達成され得
る。選択および増幅の反復周期により、適切なクローンが富化され、その結果、
レセプターを発現するクローンが単離される。
【0167】
ファージ発現ライブラリーを、哺乳動物DCRSによりスクリーニングし得る
。適切な標識技術、例えば、抗FLAG抗体は、適切なクローンの特異的な標識
を可能にする。
。適切な標識技術、例えば、抗FLAG抗体は、適切なクローンの特異的な標識
を可能にする。
【0168】
本明細書中におけるすべての引用物は、各個々の刊行物または特許出願が、参
考として援用されることが特別にかつ個々に示されるのと同程度に、本明細書中
に参考として援用される。
考として援用されることが特別にかつ個々に示されるのと同程度に、本明細書中
に参考として援用される。
【0169】
当業者にとって明白なように、本発明の多くの改変および変更は、本発明の精
神および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。本明細書中に記載される特定
の実施形態は、例示として提供するだけであり、そして本発明は、このような特
許請求の範囲が権利を付与される等価物の全範囲を伴う添付の特許請求の範囲の
用語により制限される;そして本発明は本明細書に実施例として提示した特定の
実施形態により制限されない。
神および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。本明細書中に記載される特定
の実施形態は、例示として提供するだけであり、そして本発明は、このような特
許請求の範囲が権利を付与される等価物の全範囲を伴う添付の特許請求の範囲の
用語により制限される;そして本発明は本明細書に実施例として提示した特定の
実施形態により制限されない。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 37/02 C07K 16/28
C07K 14/715 19/00
16/28 C12N 1/15
19/00 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 15/00 ZNAA
1/21 5/00 A
5/10 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF
,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,
ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G
M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ
,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,
MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,
AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B
Z,CA,CH,CN,CR,CZ,DE,DK,DM
,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,HR,
HU,ID,IL,IN,IS,JP,KG,KR,K
Z,LC,LK,LR,LT,LU,LV,MA,MD
,MG,MK,MN,MX,MZ,NO,NZ,PL,
PT,RO,RU,SE,SG,SI,SK,SL,T
J,TM,TR,TT,TZ,UA,UZ,VN,YU
,ZA
(72)発明者 ゴーマン, ダニエル エム.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94560,
ニュワーク, セントラル アベニュー
6371
Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA07
DA02 DA05 DA06 DA11 DA12
EA02 EA04 GA11 HA12
4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X
AA93Y AB01 BA02 CA24
CA44 CA46
4C084 AA01 AA14 AA17 BA01 BA02
BA08 BA21 BA22 BA23 BA44
CA18 CA53 CA56 CA59 DA45
MA52 MA55 MA59 MA60 NA13
NA14 ZB072
4C085 AA13 AA14 AA15 BB11 CC02
CC21 CC23 CC32 EE01 GG01
GG08
4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40
DA51 DA75 EA22 EA50 FA72
FA74
Claims (21)
- 【請求項1】 組成物であって、以下: a)配列番号5、28、または31のセグメントと同一である少なくとも4個
連続したアミノ酸の少なくとも3つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に
純粋なDCRS4ポリペプチドまたは組換えDCRS4ポリペプチド; b)配列番号5、28、または31のセグメントと同一である少なくとも5個
連続したアミノ酸の少なくとも2つの異なる非重複セグメントを含む、実質的に
純粋なDCRS4ポリペプチドまたは組換えDCRS4ポリペプチド; c)成熟型の配列番号5、28、または31を含む天然配列のDCRS4;お
よび d)DCRS4配列を含む融合ポリペプチド から選択される物質の、組成物。 - 【請求項2】 請求項1に記載の実質的に純粋な抗原性DCRS4ポリペプ
チドまたは単離された抗原性DCRS4ポリペプチドであって、ここで、同一で
ある前記異なる非重複セグメントが: a)少なくとも8個連続したアミノ酸である1つのセグメントを含むか; b)少なくとも4個連続したアミノ酸である1つのセグメントおよび少なくと
も5個のアミノ酸である第2のセグメントを含むか; c)少なくとも4個連続したアミノ酸、少なくとも5個連続したアミノ酸およ
び少なくとも6個連続したアミノ酸である、少なくとも3つのセグメントを含む
か、または d)少なくとも12個連続したアミノ酸である1つのセグメントを含む、 ポリペプチド。 - 【請求項3】 請求項1に記載の組成物であって、ここで、前記DCRS4
ポリペプチドが: i)表3の成熟配列を含むか; ii)DCRS4の非グリコシル化形態であるか; iii)ヒトのような、霊長類由来であるか; iv)配列番号5、28、または31の少なくとも17個連続したアミノ
酸を含むか; v)配列番号5、28、または31の少なくとも7個連続したアミノ酸の
少なくとも4個の非重複セグメントを示すか; vi)エキソン境界をまたぐ各端において少なくとも3個連続したアミノ
酸の配列を含むか; vii)DCRS4の天然の対立遺伝子改変体であるか; viii)少なくとも約30アミノ酸の長さを有するか; ix)霊長類DCRS4に特異的である少なくとも2つの非重複エピトー
プを示すか; x)グリコシル化されているか; xi)天然のグリコシル化を伴って少なくとも30kDの分子量を有する
か; xii)合成ポリペプチドであるか; xiii)固体基材に付着されているか; xiv)別の化学的部分に結合されているか; xv)天然の配列から5個以下置換されているか;または xvi)天然の配列由来の欠失改変体もしくは挿入改変体である、 組成物。 - 【請求項4】 以下を含む、組成物: a)実質的に純粋なDCRS4および別のサイトカインレセプターファミリー
のメンバー; b)無菌性の請求項1に記載のDCRS4ポリペプチド; c)請求項1に記載のDCRS4ポリペプチド、およびキャリアであって、こ
こで該キャリアは: i)水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性化合物であり;そ
して/または ii)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与のため
に処方されている、DCRS4ポリペプチドおよびキャリア。 - 【請求項5】 請求項1に記載の融合ポリペプチドであって、以下: a)表3に記載の成熟タンパク質配列; b)FLAG配列、His6配列、もしくはIg配列を含む、検出タグもしく
は精製タグ;または c)別のサイトカインレセプタータンパク質の配列 を含む、融合ポリペプチド。 - 【請求項6】 キットであって、請求項1に記載のポリペプチド、および以
下を含む、キット: a)該タンパク質もしくはポリペプチドを含む区画;または b)該キットにおける試薬の使用もしくは廃棄についての説明書。 - 【請求項7】 抗体に由来する抗原結合部位を含む結合化合物であって、該
結合化合物は、請求項1に記載の天然のDCRS4ポリペプチドに特異的に結合
し、ここで: a)該結合化合物が、容器の中にあるか; b)該ポリペプチドが、ヒト由来であるか; c)該結合化合物が、Fvフラグメント、Fabフラグメント、またはFab
2フラグメントであるか; d)該結合化合物が、別の化学的部分に結合されているか;あるいは e)該抗体が: i)表3の成熟ポリペプチドのペプチド配列に対して惹起されるか; ii)成熟DCRS4に対して惹起されるか; iii)精製されたヒトDCRS4に対して惹起されるか; iv)免疫選択されるか; v)ポリクローナル抗体であるか; vi)変性DCRS4に結合するか; vii)少なくとも30μMの、抗原に対するKdを示すか; viii)固体基材に付着され、該固体基材としては、ビーズもしくはプ
ラスチック膜が挙げられるか; ix)滅菌組成物中にあるか;または x)検出可能に標識され、該標識には、放射性標識もしくは蛍光標識が挙
げられる、 結合化合物。 - 【請求項8】 請求項7に記載の結合化合物、および以下を含む、キット: a)該結合化合物を含む区画;または b)該キットにおける試薬の使用もしくは廃棄についての説明書。
- 【請求項9】 抗原:抗体複合体を生成する方法であって、適切な条件下で
、霊長類DCRS4ポリペプチドを請求項7に記載の抗体と接触させる工程であ
って、それによって該複合体の形成を可能にする、工程、を包含する、方法。 - 【請求項10】 請求項9に記載の方法であって、ここで: a)前記複合体が、他のサイトカインレセプターから精製されるか; b)該複合体が、他の抗体から精製されるか; c)前記接触させる工程が、インターフェロンを含むサンプルを用いるか; d)該接触させる工程が、前記抗原の定量的検出を可能にするか; e)該接触させる工程が、前記抗体を含むサンプルを用いるか;または f)該接触させる工程が、該抗体の定量的検出を可能にする、 方法。
- 【請求項11】 以下を含む、組成物: a)無菌性の請求項7に記載の結合化合物、あるいは b)請求項7に記載の結合化合物およびキャリアであって、ここで、該キャリ
アが: i)水、生理食塩水、および/もしくは緩衝液を含む水性化合物であり;
そして/または ii)経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与、または非経口投与のた
めに処方されている、結合化合物およびキャリア。 - 【請求項12】 請求項1に記載のDCRS4ポリペプチドをコードする、
単離された核酸または組換え核酸であって、ここで: a)DCRS4が、ヒト由来であるか;あるいは b)該核酸が: i)表3に記載の抗原性ペプチド配列をコードするか; ii)表3に記載の複数の抗原性ペプチド配列をコードするか; iii)少なくとも13個連続したヌクレオチドにわたって、前記セグメ
ントをコードする天然のcDNAに対して同一性を示すか; iv)発現ベクターであるか; v)複製起点をさらに含むか; vi)天然の供給源由来であるか; vii)検出可能な標識を含むか; viii)合成ヌクレオチド配列を含むか; ix)6kb未満、好ましくは3kb未満であるか; x)霊長類由来であるか; xi)天然の全長コード配列を含むか; xii)該DCRS4をコードする遺伝子についてのハイブリダイゼーシ
ョンプローブであるか;または xiii)PCRプライマー、PCR産物、もしくは変異誘発プライマー
である、 核酸。 - 【請求項13】 請求項12に記載の組換え核酸を含む、細胞または組織。
- 【請求項14】 請求項13に記載の細胞であって、ここで該細胞は、以下
: a)原核生物細胞; b)真核生物細胞; c)細菌細胞; d)酵母細胞; e)昆虫細胞; f)哺乳動物細胞; g)マウス細胞; h)霊長類細胞;または i)ヒト細胞、 である、細胞。 - 【請求項15】 請求項12に記載の核酸、および以下を含む、キット: a)該核酸を含む区画; b)霊長類DCRS3をさらに含む区画;または c)該キットにおける試薬の使用もしくは廃棄についての説明書。
- 【請求項16】 核酸であって、該核酸は、以下: a)30℃および2M未満の塩で30分間の洗浄条件下で、配列番号4、27
、または30のコード部分にハイブリダイズするか;または b)少なくとも約30個連続したヌクレオチドのストレッチにわたって、霊長
類DCRS4に対して同一性を示す、 核酸。 - 【請求項17】 請求項16に記載の核酸であって、ここで: a)前記洗浄条件が、45℃および/もしくは500mMの塩であるか;また
は b)前記ストレッチが、少なくとも55個連続したヌクレオチドである、 核酸。 - 【請求項18】 請求項16に記載の核酸であって、ここで: a)前記洗浄条件が、55℃および/もしくは150mMの塩であるか;また
は b)前記ストレッチが、少なくとも75個連続したヌクレオチドである、 核酸。 - 【請求項19】 細胞または組織培養細胞の生理機能または発達を調節する
方法であって、該細胞と、哺乳動物DCRS4のアゴニストまたはアンタゴニス
トとを接触させる工程を包含する、方法。 - 【請求項20】 請求項19に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、
DCRS4および別のサイトカインレセプターサブユニットをコードする核酸を
用いて形質転換される、方法。 - 【請求項21】 配列番号2および配列番号25から選択されるアミノ酸配
列を含む、ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US44306099A | 1999-11-18 | 1999-11-18 | |
US09/443,060 | 1999-11-18 | ||
US17032099P | 1999-12-13 | 1999-12-13 | |
US60/170,320 | 1999-12-13 | ||
PCT/US2000/031363 WO2001036467A2 (en) | 1999-11-18 | 2000-11-16 | Mammalian receptor proteins; related reagents and methods |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003523179A true JP2003523179A (ja) | 2003-08-05 |
Family
ID=26865975
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001538956A Withdrawn JP2003523179A (ja) | 1999-11-18 | 2000-11-16 | 哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1230368A2 (ja) |
JP (1) | JP2003523179A (ja) |
AU (1) | AU1919201A (ja) |
CA (1) | CA2392109A1 (ja) |
MX (1) | MXPA02005058A (ja) |
WO (1) | WO2001036467A2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009183289A (ja) * | 2001-03-27 | 2009-08-20 | Zymogenetics Inc | ヒトサイトカイン受容体 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7198789B2 (en) | 1998-03-17 | 2007-04-03 | Genetics Institute, Llc | Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity |
US6057128A (en) | 1998-03-17 | 2000-05-02 | Genetics Institute, Inc. | MU-1, member of the cytokine receptor family |
EP1234035B1 (en) | 1999-12-03 | 2010-02-24 | ZymoGenetics, Inc. | Human cytokine receptor |
US20030170823A1 (en) | 1999-12-23 | 2003-09-11 | Presnell Scott R. | Novel cytokine ZCYTO18 |
ATE547525T1 (de) | 2000-08-08 | 2012-03-15 | Zymogenetics Inc | Lösliche zcyctor 11 cytokinrezeptoren |
US7268223B2 (en) | 2000-09-22 | 2007-09-11 | Wyeth | Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof |
US7094570B2 (en) | 2003-03-11 | 2006-08-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF/IL-22 receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof |
EP1191035A3 (de) * | 2000-09-25 | 2002-04-17 | Schering Aktiengesellschaft | Drei Mitglieder der Zytokinrezeptorfamilie Klasse II |
MXPA03006218A (es) * | 2001-01-12 | 2004-09-13 | Inst Genetics Llc | Receptor de citosina tipo 2 y acidos nucleicos que codifican para lo mismo. |
WO2002070655A2 (en) | 2001-03-02 | 2002-09-12 | Zymogenetics, Inc. | Mouse cytokine receptor |
US7265211B2 (en) | 2002-03-22 | 2007-09-04 | Zymogenetics, Inc. | Anti-IL-TIF antibodies and methods of making |
GB0216661D0 (en) * | 2002-07-17 | 2002-08-28 | Ares Trading Sa | Protein |
MXPA05009556A (es) | 2003-03-14 | 2005-11-16 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra receptor de il-21 humano y sus usos. |
EP1606316A2 (en) | 2003-03-24 | 2005-12-21 | ZymoGenetics, Inc. | Anti-il-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation |
WO2006047249A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-05-04 | Zymogenetics, Inc. | Anti-il-22ra antibodies and binding partners and methods of using in inflammation |
AU2006342792A1 (en) | 2005-12-02 | 2007-11-08 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to IL-22 and IL-22R |
US12012441B2 (en) | 2020-10-26 | 2024-06-18 | Neptune Biosciences Llc | Engineered human IL-21 cytokines and methods for using the same |
WO2023187201A1 (en) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Universite Catholique De Louvain | Thrombopoietin receptor fragments and uses thereof |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2011450C (en) * | 1989-03-07 | 2002-06-04 | Tadatsugu Taniguchi | Recombinant b-chain of the il-2 receptor |
US5945511A (en) * | 1997-02-20 | 1999-08-31 | Zymogenetics, Inc. | Class II cytokine receptor |
US5965704A (en) * | 1997-08-05 | 1999-10-12 | Zymogenetics, Inc. | Class two cytokine receptor-11 |
AU2661199A (en) * | 1998-02-06 | 1999-08-23 | Schering Corporation | Mammalian receptor proteins; related reagents and methods |
AU5104799A (en) * | 1998-08-04 | 2000-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Novel orphan cytokine receptors |
EP1124851A1 (en) * | 1998-11-06 | 2001-08-22 | Smithkline Beecham Corporation | Hnovilr |
WO2000069880A1 (en) * | 1999-05-18 | 2000-11-23 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Il-9/il-2 receptor-like molecules and uses thereof |
EP1234035B1 (en) * | 1999-12-03 | 2010-02-24 | ZymoGenetics, Inc. | Human cytokine receptor |
AU2292601A (en) * | 1999-12-23 | 2001-07-03 | Zymogenetics Inc. | Novel cytokine zcyto18 |
-
2000
- 2000-11-16 AU AU19192/01A patent/AU1919201A/en not_active Abandoned
- 2000-11-16 WO PCT/US2000/031363 patent/WO2001036467A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-11-16 CA CA002392109A patent/CA2392109A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-16 JP JP2001538956A patent/JP2003523179A/ja not_active Withdrawn
- 2000-11-16 MX MXPA02005058A patent/MXPA02005058A/es unknown
- 2000-11-16 EP EP00982122A patent/EP1230368A2/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009183289A (ja) * | 2001-03-27 | 2009-08-20 | Zymogenetics Inc | ヒトサイトカイン受容体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001036467A3 (en) | 2002-05-10 |
WO2001036467A2 (en) | 2001-05-25 |
CA2392109A1 (en) | 2001-05-25 |
MXPA02005058A (es) | 2002-11-07 |
AU1919201A (en) | 2001-05-30 |
EP1230368A2 (en) | 2002-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5073909B2 (ja) | 哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法 | |
JP2003534013A (ja) | 哺乳動物レセプタータンパク質;関連試薬および方法 | |
JP2004509617A (ja) | 哺乳動物遺伝子;関連試薬および方法 | |
JP2015007129A (ja) | 哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法 | |
JP2002514083A (ja) | ヒトToll様レセプタータンパク質、関連する試薬および方法 | |
JP2003523179A (ja) | 哺乳動物レセプタータンパク質;関連する試薬および方法 | |
JP2012072186A (ja) | Ox2レセプターホモログ | |
WO1999040195A1 (en) | Mammalian receptor proteins; related reagents and methods | |
JP2002505879A (ja) | ヒトレセプタータンパク質;関連する試薬および方法 | |
US6326472B1 (en) | Human receptor proteins; related reagents and methods | |
US20030082734A1 (en) | Mammalian receptor proteins; related reagents and methods | |
WO1999019480A2 (en) | Human receptor proteins; related reagents and methods | |
AU2008203172B2 (en) | OX2 receptor homologs | |
MXPA00008848A (en) | Human receptor proteins;related reagents and methods | |
MXPA00003774A (en) | Human receptor proteins;related reagents and methods |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080205 |