MXPA05009556A

MXPA05009556A - Anticuerpos contra receptor de il-21 humano y sus usos.

Info

Publication number: MXPA05009556A
Application number: MXPA05009556A
Authority: MX
Inventors: Witek Joanne
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2005-11-16
Also published as: CL2004000534A1; ZA200507067B; DE602004025332D1; US8143385B2; WO2004083249A2; WO2004083249A3; CN102040662A; CO5660297A2; KR20050119120A; US20100297151A1; EP2184298A1; US20040265960A1; NZ542306A; US7495085B2; EP1603949B8; EP1603949B1; NO20054170D0; BRPI0408315A; JP2007525159A; AU2004221876A1

Abstract

La presente invencion proporciona anticuerpos humanos y fragmentos de union al antigeno de los mismos que se unen especificamente al receptor humano de la interleuquina-21 (IL-21R). Los anticuerpos pueden actuar como antagonistas de la actividad de IL-21R, modulando por lo tanto las respuestas inmunes en general y aquellas en las que interviene IL-21R en particular. Las composiciones descritas y los metodos se pueden utilizar por ejemplo, en el diagnostico, tratamiento o prevencion de trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, alergias, rechazo a transplantes, cancer y otros trastornos del sistema inmunologico.

Description

ANTICUERPOS CONTRA RECEPTOR DE IL-21 HUMANO Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos humanos, y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen al receptor de interleuquina-21 (IL-21) , en particular, al receptor de IL-21 humano, y su uso en la regulación de respuestas inmunes mediadas por el receptor de IL-21. Los anticuerpos descritos en la presente son útiles para diagnosticar, prevenir y/o tratar trastornos inmunes, por ejemplo, trastornos autoinmunes . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los antigenos inician las respuestas inmunes y activan las dos poblaciones más grandes de linfocitos : células T y células B. Después de unirse a antígeno, las células T proliferan y se diferencian en células efectoras, mientras que las células B proliferan y se diferencian en células plasmáticas que segregan anticuerpos . La proliferación y diferenciación de linfocitos son reguladas por proteínas extracelulares . Algunas de éstas proteínas se denominan citoquinas, que son proteínas pequeñas (<30 kDa) segregadas por linfocitos y otros tipos de células. La interleuquina-21 (IL-21) es una citoquina recientemente descubierta, que está íntimamente relacionada EF. 166672 con IL-2, IL-4 e IL-15 (Parrish Novak y colaboradores (2000) Nature 408: 57-63) . La IL-21 humana tiene un peso molecular de aproximadamente 15 kDa, que consiste de 131 aminoácidos y comparte aproximadamente un 57% de identidad con la IL-21 de ratón. La IL21 es producida principalmente por células T CD4+ activadas. El receptor de IL-21 (IL-21R) es una proteína transmembrana de unión a IL-21 que pertenece a la familia de receptores de citoquinas de clase 1. Las IL-21R, tanto humanas como de ratón, se describen en el documento WO 01/85792, incorporado a la presente a modo de referencia. El tamaño predicho para la IL-21R es de aproximadamente 529 aminoácidos. La IL-21R muestra una gran homología de secuencia con la cadena ß del receptor de IL-2 y la cadena a del receptor de IL-4 (Ozaki y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:11439-11444). Las secuencias de aminoácidos de la IL-21R humana y ratón comparten una identidad de aproximadamente 62%. Una vez que se une, la IL-21R se asocia con la cadena del receptor de citoquina gamma (ye) común que es compartida por los receptores para IL-2, ZL-3, IL-4, IL-7, IL-9, L-13 e IL-15 (Ozaki y colaboradores (2000) supra; Asao y colaboradores (2001) J. Immunol . 167:1-5). La IL-21R se expresa principalmente en tejidos linfoides, tales como células B, células T y células asesinas naturales ( K, por sus siglas en inglés) . La amplia distribución en el tejido linfoide de IL-21R sugiere que la IL-21 puede jugar un papel en la regulación inmune. En efecto, los estudios in vitro han demostrado que IL-21 modula significativamente la función de las células B, células T CD4+ y CD8+ y las células NK (Parrish-Novak y colaboradores (2000) supra; asaian, M. T. y colaboradores (2002) I unity. 16:559-569). Se ha demostrado también que IL-21 e IL-21R son importantes para la modulación de la actividad de macrofagos y células sinoviales. Por ejemplo, IL-21 aumenta la proliferación de células B estimuladas con anticuerpos anti-CD40 y suprime la proliferación de células B estimuladas con anti-IgM y IL-4. La IL-21 aumenta la proliferación y actividad citolítica de las células T y células NK humanas. La IL-21 también interviene en la expresión de las citoquinas, quimicqiiinas o sus combinaciones, segregadas por las células T, células NK, macrofagos y células sinoviales. Debido a la dependencia de IL-21 de las células B, células T, células NK, macrofagos y células sinoviales, una alteración de la unión de IL-21 a IL-21R puede afectar determinadas respuestas inmunes . Tal manipulación proporciona un medio para el tratamiento de trastornos del sistema inmunológico, tales como trastornos asociados con enfermedades autoinmunes, trastornos inflamatorios, alergias, rechazo de transplantes, cáncer, deficiencia inmunológica y otros trastornos. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente solicitud proporciona anticuerpos que se unen al receptor de IL-21 ("IL-21R"), en particular, el receptor de la IL-21 humana, con gran afinidad y especificidad. En una modalidad, un anticuerpo reduce, inhibe o antagoniza la actividad de la IL-21R. Tales anticuerpos pueden ser utilizados para regular las respuestas inmunes o trastornos inmunes asociados a células antagonizando la actividad de la IL-21R. En otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-21R puede ser utilizado con fines de diagnóstico o como un anticuerpo marcado para suministrar un agente citotóxico o terapéutico a una célula que expresa IL-21R. Por lo tanto, los anticuerpos anti-IL-2IR de la invención son útiles en el diagnóstico y tratamiento de patologías inmunes asociadas a células (por ejemplo, patologías asociadas con la actividad de por lo menos una de: células T (células T CD8+, CD4+) , células NK, células B, macrófagos y megacariocitos, incluyendo el rechazo a transplantes y trastornos autoinmunes) . Por consiguiente, en un aspecto la invención ofrece un anticuerpo aislado que se une a la IL-21R, en particular, IL-21R humana. El anticuerpo anti-IL-21R puede presentar por lo menos una de las siguientes características: (1) es un anticuerpo de especificidad única o monoclonal; (2) es un anticuerpo humano o generado in vitro,- (3) se une a la IL-21R, en particular, al dominio extracelular de la IL-21R humana, con una afinidad constante (Ka) de por lo menos 106 M"1 y (4) inhibe la unión de la IL-21 a IL-21R con una CI50 de 10 nM o menor como una IgG, por ejemplo, medida con el ensayo basado en células descrito en el Ejemplo 9, o inhibe la unión de un anticuerpo a una IL-21R con una CI50 de 10 nM o menor, por ejemplo, medida con el ensayo de unión al epitope descrito en el Ejemplo 11. Las modalidades ilustrativas no limitantes de los anticuerpos de la invención se denominan, en la presente como, "MUF", "MUF-germinal" , "MU11" , "18G4" , "18A5", "19F5", "CP5G2" y "R18" . Los anticuerpos de la invención se pueden unir especialmente al dominio extracelular de una IL-21R, por ejemplo, aproximadamente 20 a 235 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 (IL-21R humana) , o una secuencia que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma. En otras modalidades, los anticuerpos se unen especialmente a un fragmento de una IL-21R, por ejemplo, un fragmento de por lo menos 10, 20, 50, 75, 100, 150 ó 200 aminoácidos contiguos a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:43, o una secuencia que es por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma. En otras modalidades, un anticuerpo se une al dominio extracelular de una IL-21R e inhibe competitivamente la unión de ,MUF" , W ÜF-germinal", "MU11" , "18G4", "18A5", "19F5", "CP5G2" o "R18" a su epitope blanco. En aún otras modalidades, un anticuerpo se une al dominio extracelular de una IL-21R e inhibe competitivamente la unión de IL-21 a la IL-21R. Tal inhibición de la unión de IL-21 a sus receptores por un anticuerpo de la invención se puede medir con uno o más de los ensayos proporcionados en la presente. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención incluye un dominio VH, un dominio VL o una combinación de los mismos, del fragmento scF de "MUF" , "MUF-germinal", "MU11" , "18G4" , "18A5", "19F5" , "CP5G2" o "R18" . Por ejemplo, un anticuerpo incluye un dominio VH y/o VL que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO:l, 19, 47, 65, 83, 101, 119 ó 137 para VH y SEQ ID NO: 2, 20, 48, 66, 84, 102, 120 ó 138 para VL) , o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma, o que se diferencien en no menos de 1, 2, 5, 10 ó 15 residuos de aminoácidos de las SEQ ID NO:l, 2, 19, 20, 47, 48, 65, 66, 83, 84, 101, 102, 119, 120, 137 ó 138). En otra modalidad, el anticuerpo incluye un dominio VH y/o VL codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO: 10, 28, 56, 74, 92, 110, 128 ó 146 para VH y SEQ ID NO: 11, 29, 57, 75, 93, 111, 129 ó 147 para VL) , o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idéntica a la misma, o que difiere por no más de 3 , 6, 15, 30 ó 45 nucleótidos de las SEQ ID NO: 10, 11, 28, 29, 56, 57, 74, 75, 92, 93, 110, 111, 128, 129, 146 ó 147). Generalmente, los dominios VH y VL en un fragmento scFv están unidos por una secuencia ligadora. En otras modalidades, el anticuerpo incluye un dominio scFv que tiene una de secuencia de aminoácidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO: 3, 21, 49, 67, 85, 103, 121 ó 139) o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idéntica a la misma o que difiere por no más de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30 6 35 residuos de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3, 21, 49, 67, 85, 103, 121 ó 139) . En otra modalidad, el anticuerpo incluye un dominio scFv codificado por un ácido nucleico que tiene una la secuencia de nucleótidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO: 12, 30, 58, 76, 94, 112, 130 ó 148), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma, o que difiere por no más de 3 , 6, 15, 30, 45, 60, 90 ó 105 nucleótidos de las SEQ ID NO: 12, 30, 58, 76, 94, 112, 130 ó 148) . En aún otras modalidades, el anticuerpo comprende por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR) de estos dominios VH y VL. Por ejemplo, el anticuerpo puede incluir una, dos o tres CDR del dominio VH (por ejemplo, Hl, H2 y H3) que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID N0:4, 5, 6, 22, 23, 24, 50, 51, 52, 68, 69, 70, 86, 87, 88, 104, 105, 106, 122, 123, 124, 140, 141 ó 142), o una secuencia sustancialmente homologa a las mismas (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idéntica a la misma) . En algunas modalidades, una secuencia que es sustancialmente homologa a las secuencias de aminoácidos de Hl, H2 ó H3 como se muestran en las SEQ ID N0:4, 5, 6, 22, 23, 24, 50, 51, 52, 68, 69, 70, 86, 87, 88, 104, 105, 106, 122, 123, 124, 140, 141 Ó 142, incluyen una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadores . En otra modalidad, el anticuerpo puede incluir una, dos o tres CDR del dominio VL (por ejemplo, Ll, L2 y L3) que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestran en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO:7, 8, 9, 25, 26, 27, 53, 54, 55, 71, 72, 73, 89, 90, 91, 107, 108, 109, 125, 126, 127, 143, 144 ó 145), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma) . En algunas modalidades, una secuencia que es sustancialmente homologa de las secuencias de aminoácidos de Ll, L2 ó L3 como se muestran en las SEQ ID NO: 7, 8, 9, 25, 26, 27, 53, 54, 55, 71, 72, 73, 89, 90, 91, 107, 108, 109, 125, 126, 127,143, 144 ó 145 incluyen una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras . En aún otra modalidad, un anticuerpo comprende una CDR del dominio VH de MÜF, MU11, MUF-germinal, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 o R18, que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124 ó 142), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idéntica a la misma) , que incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras . Un anticuerpo de acuerdo a la invención puede no sólo comprender una región variable de cadena pesada que incluya una sola CDR, tal como H3, o cualquiera de las combinaciones de Hl, H2 y H3. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo puede incluir una CDR (H3) en combinación con una CDR2 (H2) . En otras modalidades, un anticuerpo puede incluir una CDR3 (H3) en combinación con una CDR1 (Hl) o una combinación de las CDR Hl y H2. Sin embargo, preferiblemente, el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada que comprende una CDR3 (H3) , como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, 142 y sustituciones de aminoácidos conservadoras de las mismas, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos, ya sea solas o en combinación con una o ambas Hl y H2.

Similarmente , en algunas modalidades, un anticuerpo comprende una CDR del dominio VL de MUF, MU11, UF-germinal, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 ó R18, por ejemplo, una CDR L3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en las Tablas 1A y IB (SEQ ID NO:9, 27, 55, 73, 91, 109, 127 ó 145), o una secuencia sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más idéntica a la misma) , que incluye una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. Un anticuerpo de acuerdo a la invención puede comprender tanto una región de cadena ligera que incluye una única CDR, tal como L3 , como cualquier combinación de Ll, L2 y L3. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo puede incluir una L3 en combinación con una L2. En otras modalidades, un anticuerpo puede incluir una L3 en combinación con una Ll . En aún otra modalidad, el anticuerpo puede incluir una combinación de CDR Ll y L2. Sin embargo, preferiblemente, un anticuerpo incluye una región variable de cadena ligera que comprende una L3, como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, 145 y sustituciones de aminoácidos de las mismas, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras de las mismas, tanto solas como en combinación con una o ambas Ll y L2.

En algunas modalidades, un anticuerpo de la invención compite por la unión a IL-21R con un anticuerpo que incluye un dominio VH que es por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 6 más del 99% idéntico a la secuencia aminoácidos como se muestra en las SEQ ID N0:1, 19, 47, 65, 83, 101, 119 ó 137, y un dominio VL que es por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó más del 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NO: 2, 20, 48, 66, 84, 102, 120 ó 138. En determinadas modalidades, un anticuerpo compite por la unión a IL-21R con un anticuerpo que incluye una región variable de cadena pesada que comprende por lo menos una CDR de cadena pesada elegida de la SEQ ID NO: 6, 24, 52, 70, 88, 106, 124, 142 y sustituciones de aminoácidos de las mismas, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras de las mismas. En determinadas modalidades, un anticuerpo de acuerdo a la invención compite por la unión a IL-21R, por ejemplo, la unión a IL-21R humana, con un anticuerpo que incluye una región variable de cadena ligera que comprende por lo menos una CDR de cadena ligera elegida de la SEQ ID NO:9, 27, 55, 73, 91, 109, 127, 145 y sustituciones de aminoácidos de las mismas, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras de las mismas . Un anticuerpo con el cual el anticuerpo de la invención compite por la unión a IL-21R, por ejemplo, IL-21R humana, puede incluir tanto una CDR de cadena pesada elegida de las SEQ ID N0:6, 24, 52, 70, 88, 106, 124 y 142, y una CDR de cadena ligera elegida de la SEQ ID NO: 9, 27, 55, 73, 91, 109, 127 y 145. En algunas modalidades, un anticuerpo de acuerdo a la invención incluye más de una CDR de cadena pesada elegida de las SEQ ID NO: 4, 5, 6 para MUF; SEQ ID NO: 22, 23, 24 para üll; SEQ ID NO: 50, 51, 52 para 18G4; SEQ ID NO:68, 69, 70 para 18A5; SEQ ID NO:86, 87, 88 para UF-germinal; SEQ ID NO:104, 105, 106 para 19F5; SEQ ID NO:122, 123, 124 para CP5G2; y SEQ ID NO:140, 141, 142 para R18, y/o una o más CDR de regiones variables de cadena ligera elegidas de la SEQ ID NO: 7, 8, 9 para MUF; SEQ ID NO: 25, 26,27 para MU11; SEQ ID NO: 53, 54, 55 para 18G4; SEQ ID NO: 71, 72, 73 para 18A5; SEQ ID NO: 89, 90, 91 para MUF-germinal : SEQ ID NO: 107, 108, 109 para 19F5; SEQ ID NO: 125, 126, 127 para CP5G2; y SEQ ID NO: 143, 144, 145 para R18. En aún otras modalidades, un anticuerpo de acuerdo con la invención compite con IL-21, por ejemplo, IL-21 humana, por la unión a la IL-21R, por ejemplo, IL-21R humana. Un anticuerpo de la invención puede ser de longitud completa (por ejemplo, incluye por lo menos una cadena pesada completa y por lo menos una cadena ligera completa) o puede incluir solamente un fragmento de unión al antigeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena única (scFv) ) . Un anticuerpo puede incluir una región constante, o una porción de la misma, seleccionada de cualquiera de: los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Por ejemplo, se pueden utilizar regiones constantes de cadena pesada de distintos isotipos, incluyendo: IgGi, IgG2, IgG3r lgG4, igM, igAx, IgA2, IgD e IgE. La región constante de cadena ligera se puede seleccionar entre kappa o lambda. Un anticuerpo puede ser una IgG o también puede ser IgGik, o IgGn. Un anticuerpo anti-IL-21R descrito en la presente puede ser derivatizada o ligada a otra molécula funcional (tal como otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab) ) . Por ejemplo, un anticuerpo de la invención se puede ligar funcionalmente (por ejemplo, por medio de acoplamiento químico, fusión genética, asociación no-covalente o de alguna otra manera) a por lo menos una entidad molecular adicional, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico) , toxina, radioisótopo, agente citotóxico o citostático, entre otros. En otro aspecto, la invención ofrece una composición farmacéutica que contiene por lo menos un anticuerpo anti-IL-21R y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede incluir además una combinación de por lo menos un anticuerpo anti-IL-2lR y por lo menos un agente terapéutico (por e emplo, citoquina e inhibidores del factor de crecimiento, inmunoinhibidores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, o combinaciones de los mismos, como se describe con más detalles en la presente) . Las combinaciones del anticuerpo anti-IL-21R y un agente terapéutico se encuentran también dentro del alcance de la invención. Las composiciones y combinaciones de la invención se pueden utilizar para regular las células inmunológicas dependientes de IL-21, tal como células B, células T, células NK, macrófagos y células sinoviales . En otro aspecto, la invención ofrece un método para el tratamiento de un sujeto que padece una enfermedad inmunológica asociada a células . El método incluye administrar al sujeto un anticuerpo anti-IL-21R en una cantidad suficiente para inhibir por lo menos una actividad de la IL-21R de células inmunológicas tratando de esa manera la enfermedad inmunológica asociada a células . El anticuerpo anti-IL-21R puede suministrarse al sujeto, solo o en combinación con otros agentes terapéuticos como se describe en la presente. El sujeto puede ser un mamífero que sufre de una patología inmunológica asociada a células (por ejemplo, una patología asociada con la actividad anómala de por lo menos una de: células T, células NK, células B, macrófagos y megacariocitos) . El sujeto puede ser un humano. Por ejemplo, el método puede utilizarse para tratar a un sujeto con un trastorno inmunológico asociado a células, tal como rechazo a transplantes y enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes pueden incluir diabetes mellitus (tipo 1) , artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática y espondilitis anquilosante) , esclerosis múltiple, miastenia gravis, vasculitis, lupus eritematoso sistemático, tiroiditis autoinmunológica, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eczemática) , psoriasis, escleroderma, asma, alergia, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por sus siglas en inglés) y enfermedad de Crohn. Es una modalidad de esta invención el tratamiento de una enfermedad artrítica (por ejemplo, un trastorno seleccionado de por lo menos uno de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática y espondilitis anquilosante) utilizando los anticuerpos anti-lL-21R de la presente invención. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de IL-21R en una muestra in vitro. Las muestras pueden incluir muestras biológicas, tal como suero, plasma, tejido y biopsia. El método objeto puede utilizarse para diagnosticar un trastorno, tal como un trastorno inmunológico, asociado a células como se describe en la presente. Los métodos incluyen: (1) poner en contacto la muestra o una muestra control con un anticuerpo anti-IL-21R y (2) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-21R y la muestra o la muestra control, en donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra con respecto a la muestra control indica la presencia de IL-21R en la muestra. En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de IL-21R in vivo (por ejemplo, diagnóstico por imágenes in vivo de un sujeto) . El método puede utilizarse para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno inmunológico asociado a células como se describe en la presente. El método incluye: (1) suministrar un anticuerpo anti-IL-21R a un sujeto o a un sujeto control bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo a IL-21R y (2) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo e IL-21R, en donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto con respecto a un control, por ejemplo un sujeto control, es indicativo de la presencia de IL-21R. Es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la invención de forma directa o indirecta con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido . Las sustancias detectables adecuadas incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos .

En otro aspecto, la invención proporciona un método para administrar o direccionar un agente, por ejemplo, un agente citotóxico o terapéutico, a una célula que expresa IL-21R in vivo. El método incluye la administración de un anticuerpo anti-IL-21R a un sujeto bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo a IL-21R. El anticuerpo puede acoplarse a un segundo grupo terapéutico, tal como una toxina. La descripción proporciona las secuencias de ácidos nucleicos de los dominios VH y VL de MUF, MUF-germinal , MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. También se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden por lo menos una CDR de MUF, MÜF-germinal , Müll, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. La descripción proporciona también vectores y células hospederas que comprenden tales ácidos nucleicos . La descripción comprende además métodos para producir nuevos dominios VH y VL y anticuerpos funcionales que comprenden todos o una porción de tales dominios derivados de los dominios VH o VL de MUF, MUF-germinal, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 o R18. Otros aspectos adicionales de la descripción se indicarán en parte en la descripción y en parte serán evidentes a partir de la descripción o se comprenderán a partir de la práctica de la invención. La invención se describe y define particularmente en las reivindicaciones y la descripción no debe considerarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones. La siguiente descripción detallada incluye ejemplos de representaciones de diversas modalidades de la invención, que no limitan a la invención como se reivindicó. Las Figuras adjuntas constituyen una parte de esta especificación y junto con la descripción sirven solo para ilustrar las modalidades y no limita la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A describe el resultado de un ELISA que muestra que U11 se une específicamente a una IL-21R humana. La figura IB describe el resultado de un ensayo de unión analizado por FACS que muestra que tanto MDF como MU11 se unen a la superficie de la IL-21R humana. La figura 1C describe el resultado de un ensayo de unión analizado por FACS que muestra que MUF se une a IL-21R en células B de ratón. La figura 2 describe el resultado de un ELISA que muestra que MUF inhibe la unión de IL-21 humana a IL-21R humana . La figura 3A describe el resultado de un ensayo de proliferación de células que muestra que la adición de MUF bloqueó la capacidad de IL-21 para aumentar la proliferación de células T CD4+ humanas. La figura 3B describe el resultado de un ensayo de proliferación de células que muestra que MU11 bloqueó la capacidad de IL-21 en el medio de cultivo de células COS para aumentar la proliferación de células T CD4+ en ratones. La figura 3C describe el resultado de un ensayo de proliferación de células que muestra que Müll bloqueó la capacidad de IL-21 en el medio de cultivo de células COS para aumentar la proliferación de células T CD8+ en ratones, de un modo dependiente de la dosis . La figura 4 describe el resultado de un ensayo de proliferación de células que muestra que tanto MUF scFv como MÜF IgG bloquearon la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de células Baf3Mu-l que expresan una IL-21R. Las Figuras 5A muestran que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblastos humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un aumento en la secreción de las quimioquinas MCP-1 y GRO. La figura 5B describe que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblastos humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un aumento de la secreción de las quimioquinas 1-309, TARC, Eotaxina, MDC, Lymph, SDFIB, IP-10, 1-TAC, MG y MP3B. Las Figuras 5C y 5D describen que la adición de IL-21 a sinoviocitos de tipo fibroblastos humanos aislados de pacientes con artritis conduce a un aumento en la secreción de las citoquinas IEN-alfa y TNF-alfa (FIG. 5C) e IL-6 e IL8 (FIG. 5D) .

La Figura 5E muestra que la IL-21 exacerba la artritis inducida por colágeno (CIA) en un modelo para artritis en ratón, medido por el índice de CIA. La figura 6 muestra que la IL-21 aumenta la proliferación de células C57BL/6J en una reacción de linfocitos mixtos, un modelo in vitro para rechazo de transplantes . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones A fin de ofrecer una mayor comprensión de la presente invención, primeramente se definirán determinados términos. Otras definiciones adicionales se mencionarán en la descripción detallada. El "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina o fragmento de la misma, y comprende cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión al antígeno. El no está limitado a anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecífieos, poliespecífieos, no específicos, humanizados, humanos, de cadenas únicas, quiméricas, sintéticas, recorribinantes, híbridos, mutados, injertados y generados in vitro. A menos que se encuentre asociado con la palabra "intacto", el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab' )2, Pv; scFv, Fd, dAb y otros fragmentos de anticuerpos que retienen la función de unión al antígeno. Generalmente, tales fragmentos comprenderán un dominio de unión al antígeno.

Los términos "dominio de unión al antígeno" y "fragmento de unión al antígeno" se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que es específicamente reconocida y ligada por el anticuerpo se conoce como "epítope" . Un dominio de unión al antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) ; sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y normalmente retienen alguna función de unión al antígeno del dominio de unión al antígeno intacto . Los ej emplos de fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen (1) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH/ CL y CH1 (2) un fragmento F(ab')2/ un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de unión; (3) un fragmento Fd que consiste de dos dominios VH y CH1; (4) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo del anticuerpo, (5) un fragmento dAb ( ard y colaboradores, (1989) Nature 341:544-546) , que consiste de un dominio VH; y (6) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, a pesar de que los dos dominios de los fragmentos Fv, VL y VH, son codificados por genes separados pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite obtenerlos como una cadena proteica única en donde las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv) ; ver, por ejemplo, Bird y colaboradores, (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica y se examina la utilidad de los fragmentos de la misma manera como se examinan los anticuerpos intactos . El término "cantidad efectiva" se refiere a una dosificación o cantidad que es suficiente para regular la actividad de IL-21R para mejorar los síntomas clínicos o lograr un resultado biológico deseado, por ejemplo, la actividad en células T y/o células B reducida, eliminación de autoinmunidad, eliminación de rechazo de transplantes, etc. El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana, como se describen por abaty colaboradores (Ver Rabat y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242) . Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos que no están codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones sustituidas por un residuo de aminoácido que no está codificado por la secuencia de la inmunoglobulina de la línea germinal humana. El término "actividad IL-21R" se refiere a por lo menos un proceso celular iniciado o interrumpido como resultado de la unión de IL-21 a IL-21R en la célula. Las actividades IL-21R incluyen por lo menos un de, pero sin limitarse a: (1) unión de IL-21 (por ejemplo, IL-21 humana) ; (2) asociación con moléculas de transducción de señales (por ejemplo, ye y/o JAK-1) ; (3) estimulación de la fosforilización de las proteínas STAT (por ejemplo, STAT5, STAT3 o una combinación de las mismas) ; (4) activación de las proteínas STAT; y (5) modulación (por ejemplo aumento o disminución) , proliferación, diferenciación, función celular efectora, actividad citolítica, secreción de citoquinas, supervivencia o combinaciones de las mismas, de células inmunológicas . Las células inmunológicas pueden incluir células T CD8+ y CD4+, células NK, células B, macrófagos y megacariocitos . La actividad IL-21R puede determinarse in vitro, por ejemplo, utilizando los ensayos de proliferación de células T que se describen en los Ejemplos 8 y 9. La actividad IL-21R también se puede determinar in vivo, por ejemplo, calificando el avance de una respuesta inmunológica o de un trastorno como se describe en el Ejemplo 12. La frase "inhibir" o "antagonizar" la actividad de IL-21R y sus relacionados se refiere a una reducción, inhibición o disminución de por lo menos una actividad de IL-2IR debido a la unión de un anticuerpo anti-IL-21R, donde la reducción está relacionada con la actividad de la IL-21R en ausencia del mismo anticuerpo. La actividad puede medirse como se describe en los Ejemplos 7, 8, 9 y 11. La inhibición o antagonismo no indica necesariamente una eliminación total de la actividad biológica del polipéptido IL-21R. Una reducción en la actividad puede ser de aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o mayor. El término "receptor de interleuquina-21" o "IL-21R" se refiere a un receptor de citoquina de clase 1, conocido también como NILR (documento O 01/85792; Parrish-Novak y colaboradores (2000) iVature 408:57-63; Ozaki y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:11439-114444) . Una vez que se unió al ligando, la IL-21R interactúa con una cadena receptora común de ? citoquina (ye) (Asao y colaboradores (2001) J. Immunol. 167:1-5), e induce la fosforilación de STAT1 y STAT3 (Asao y colaboradores (2001) supra o STAT5 (Ozaki y colaboradores (2000) supra) . La IL-21R muestra una amplia distribución en tejido linfoide. El término "IL-21R" se refiere a un receptor (que puede ser de mamífero) capaz de unirse a una IL-21 y tiene por lo menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácido de un polipéptido IL-21R natural de mamífero o un fragmento de la misma, por ejemplo, una de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEQ ID NO: 43 (humano) o SEQ ID NO: 45 (murino) o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácido sustancialmente idéntica, por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a una secuencias de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NO: 3 (humano) o SEQ ID NO: 45 (murino) o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleótidos de IL-21R natural de mamífero o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO: 44 (humano) o SEQ ID NO: 46 (murino) o un fragmento de las misma) ; (4) una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica, por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a una de las secuencias de nucleótidos como se muestra en las SEQ ID NO: 44 (humano) o SEQ ID NO: 46 (murino) o un fragmento de las mismas; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos degenerada de una secuencia de nucleótidos IL-21R natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO: 44 (humano) o SEQ ID NO: 46 (murino) o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una de las secuencias de nucleótidos anteriores bajo condiciones estrictas, por ejemplo, condiciones altamente estrictas. La IL-21R se puede unir a una IL-21 de origen mamífero, por ejemplo, humano o ratón. (Parrish-Novak y colaboradores (2000) supra) . Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo generado in vitro" se refiere a un anticuerpo en el cual parte o toda la región variable (por ejemplo, al menos una CDR) es generada en una selección de células no inmunológicas (por ejemplo, una expresión en fagos in vitro, chips de proteínas o cualquier otro método que permita evaluar las secuencias candidato por su capacidad para unirse a un antígeno) . Este término excluye las secuencias generadas por reordenamientos genómicos en una célula inmunológica. El término "aislado" se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de su medio ambiente natural . Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre del material molecular u otras proteínas de la fuente de células o tejidos de la deriva. El término se refiere también a las preparaciones donde la proteína aislada es suficientemente pura para su uso en composiciones farmacéuticas; o por lo menos pura en un 70-80% (p/p) ; o por lo menos en un 80-90% (p/p) ; o por lo menos en un 90-95%; o por lo menos pura en un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% (p/p) . La secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos precitada de la IL-21R humana se muestra en las SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 43, respectivamente. El análisis de la secuencia de aminoácidos de IL-21R humana (SEQ ID NO: 43) revela las siguientes características estructurales: una secuencia directriz (aproximadamente 1-19 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43) ; un motivo WSX S (aproximadamente 213-217 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43) ; un dominio transmembrana (aproximadamente 235-252 aminoácidos de la SEQ ID NO:43) ; un dominio extracelular (aproximadamente 1-235 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y 20-235 de la secuencia IL-21R madura) ; y un dominio intracelular de aproximadamente 253-538 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. Se cree que la IL-21R madura humana tiene la secuencia de 20-538 aminoácidos de la SEQ ID NO:43. El término "repertorio" se refiere a una colección genéticamente diversa de secuencias de nucleótidos derivadas completa o parcialmente de secuencias que codifican inmunoglobulinas . Las secuencias pueden generarse por reordenamientos ín vivo de los segmentos V, D y J de las cadenas pesadas, y los segmentos V y J de las cadenas ligeras. Alternativamente, las secuencias se pueden generar a partir de una célula como respuesta a lo cual se producen los reordenamientos que tienen lugar por ejemplo, por estimulación in vitro. Alternativamente, parte o todas las secuencias pueden obtenerse por procesamiento de ADN, sintesis de nucleótidos, mutagénesis y otros métodos, ver por ejemplo la Patente Norteamericana 5,565,332. Los términos "unión especifica", "unión selectiva" y "se une selectivamente" se refieren a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas . Las uniones selectivas se caracterizan por una alta afinidad y una moderada a baja capacidad que se distingue de las uniones no especificas que normalmente tienen una baja afinidad y una moderada a alta capacidad. Generalmente, la unión se considera especifica o selectiva cuando la constante de afinidad Ka es mayor de ÍO^M"1. Si es necesario, se puede reducir la unión no especifica sin afectar sustancialtnente la unión selectiva por medio de una variación de las condiciones de la unión. Las condiciones de unión apropiadas, tal como la concentración de anticuerpos, fuerza iónica de la solución, temperatura, tiempo permitido para la unión, concentración del agente de bloqueo (por ejemplo, albúmina de suero, caseína de leche) , etc . , pueden ser optimizadas por un experto utilizando técnicas de rutina. Las condiciones ilustrativas se definen en los Ejemplos 1-11, pero hay otras condiciones conocidas por los expertos en la técnica que se encuentran dentro del alcance de esta invención.

Tal como se utiliza en la presente, el . término "estricto" describe condiciones para la hibridación y lavado. Las condiciones estrictas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden consultarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En la referencia se describen métodos no acuosos y acuosos y se pueden utilizar cualquiera de ellos. Un ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a aproximadamente 45°C, seguida de por lo menos un lavado en SSC 0.2X, SDS 0.1% a 50°C. Un segundo ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida de por lo menos un lavado en SSC 0.2X, SDS 0.1% a 55°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida de por lo menos un lavado en SSC 0.2X, SDS 0.1% a 60°C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación estrictas es la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguida de por lo menos un lavado en SSC 0.2X, SDS 0.1% a 65°C. Las condiciones altamente estrictas incluyen una hibridación en fosfato sódico 0.5 M, SDS 7% a 65°C, seguida de por lo menos un lavado en SSC 0.2X, SDS 1% a 65°C. La frase "como se define sustancialmente" , "sustancialmente idéntico" o "sustancialmente homólogo" significa que la secuencia de aminoácidos o nucleótidos pertinente (por ejemplo, una CDR, o dominios VH o VL) será idéntica o tiene diferencias no sustanciales (a través de sustituciones de aminoácidos conservadas) en comparación a las secuencias establecidas . Las diferencias no sustanciales incluyen cambios menores de aminoácidos, tal como 1 ó 2 sustituciones en una secuencia de 5 aminoácidos de una región especifica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene por lo menos un 50% de afinidad del mismo. Las secuencias sustancialmente idénticas u homologas (por ejemplo de por lo menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas en la presente son también parte de esta solicitud. En otra modalidad, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior. Alternativamente, existe una identidad sustancial u homóloga cuando los segmentos de ácidos nucleicos se hibridizan bajo condiciones de hibridación selectiva (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente estrictas) , con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en una célula lisada o en una forma sustancialmente pura o parcialmente purificada. El porcentaje de identidad puede determinarse por medio de algoritmos de alineación estándar, por ejemplo, Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito por Alts ul y colaboradores ((1990) J. MoL Biol . , 215:403-410); el algoritmo de Needleman y colaboradores ((1970) J. Mol. Biol., 48:444-453); o el algoritmo de Meyers y colaboradores ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17). Un grupo de parámetros puede ser el de la matriz de calificación Blosum 62 con una penalidad por falta de coincidencia de 12, una penalidad de extensión de falta de coincidencia de 4 y una penalidad por falta de coincidencia debido al desplazamiento del marco de lectura de 5. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos pueden determinarse también por medio del uso de los algoritmos de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se han incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalidad por longitud de la falta de coincidencia de 12 y una penalidad por falta de coincidencia de 4. El término ^agente terapéutico" es una sustancia que trata o asiste al tratamiento de un trastorno médico. Como se utiliza en la presente, un agente terapéutico se refiere a una sustancia que al ser suministrada a un sujeto junto con el anticuerpo anti-IL-21R proporciona un mejor tratamiento comparado a la sola administración del anticuerpo anti-lL-21R o agente terapéutico. Estos agentes terapéuticos pueden incluir, pero sin limitarse a, sustancias que modulan células inmunes o respuestas inmunes de una manera que complementa la actividad IL-21R de anticuerpos anti-IL21R. Se describen en la presente ejemplos y usos de agentes terapéuticos no limitantes . Como se utiliza en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-IL-21R se refiere a una cantidad de un anticuerpo que sea efectiva, al ser administrada en dosis únicas o múltiples a un sujeto (tal como un paciente humano) , para tratar, prevenir, curar, demorar, reducir la severidad de, aminorar por lo menos un síntoma de un trastorno o trastorno recurrente o prolongar la supervivencia de un sujeto que no podría tener lugar sin el suministro de la sustancia. El término "tratamiento" se refiere a una medida preventiva o terapéutica. El tratamiento puede ser administrado a un sujeto que tiene un trastorno médico, o que haya adquirido el trastorno últimamente, a fin de prevenir, curar, demorar, reducir la severidad de, o aminorar uno o más síntomas de un trastorno recurrente o a fin de prolongar la supervivencia de un sujeto que no tendría lugar en ausencia del tratamiento . Anticuerpos anti-IL-21R La descripción proporciona nuevos anticuerpos anti-IL-21R que comprenden nuevos fragmentos de unión al antígeno. En general, los anticuerpos se pueden obtener, por ejemplo, usando técnicas con hibridomas tradicionales (Kohler y Milstein (1975) Nature, 256:495-499), métodos de ADN recombinante (Patente Norteamericana 4,816,567), o expresión en fagos utilizando bibliotecas de anticuerpos (Claxon y colaboradores (1991) Natura, 352:624-628; Marks y colaboradores (1991) J. Mol. Biol . , 222:581-597). Para consultas adicionales sobre técnicas de producción de anticuerpos, ver Antibodies: A Laboratory Manual, eds . Harlow y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La presente invención no está limitada a ninguna fuente, método de producción u otras características especiales particulares de un anticuerpo. Los anticuerpos intactos son inmunoglobulinas (Ig) , y son generalmente proteínas tetraméricas glicosiladas compuestas de dos cadenas ligeras (~25 kDa cada una) y dos cadenas pesadas (~50 kDa cada una) . Las cadenas ligeras se clasifican en dos isotipos (? y ?) y las cadenas pesadas se clasifican en cinco isotipos (A, D, E, G y M) . Algunos isotipos de cadenas pesadas se dividen además en subclases, por ejemplo, IgGx, IgG2, IgG3 e IgG4. El dominio y estructuras tridimensionales de diferentes anticuerpos son conocidos en la técnica (Harlow y colaboradores, supra) . En resumen, la cadena, ligera está compuesta por un dominio constante (CL) y un dominio variable (VL) N-terminal. La cadena pesada está compuesta por tres o cuatro dominios constantes (CH) / una región de unión y un dominio variable (VH) N-terminal. El CH adyacente al dominio VH se denomina CH1. Los dominios VH y VL contienen cuatro regiones de secuencias conservadas llamadas regiones de estructuras de trabajo (FR) (FR1, FR2 , FR3 y FR4 ) , que forman un sostén para tres regiones de secuencias hipervariables llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) . Las CDR (CDR1, CDR2 y CDR3 ) contienen la mayoría de los aminoácidos del anticuerpo que se unen específicamente al antígeno . Las CDR de cadena pesada se denominan Hl , H2 y H3 , mientras que las CDR de cadena ligera se denominan Ll, L2 y L3. El fragmento Fab (fragmento de unión al antígeno) consiste de los dominios VH-CHi y VL-CL unidos covalentemente por un enlace disulfito entre regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y consiste de los dominios VH y VL unidos no covalentemente. Para contrarrestar la tendencia de los dominios no covalentes a disociarse, se puede construir un fragmento Fv de cadena única (scFv) · El scFv contiene un polipéptido flexible que une (1) el extremo C-terminal de VH al extremo N-terminal de VL, o (2) el extremo C-terminal de al extremo N- terminal de VH . Se puede usar un péptido de 15-mer (GIy4Ser)3 como un ligador, pero hay otros enlazadores conocidos en la técnica. La diversidad de anticuerpos se crea utilizando múltiples genes de la línea germinal que codifican regiones variables y una variedad de eventos somáticos . Los eventos somáticos incluyen la recombinación de segmentos de genes variables y diversidad (D) y la unión de segmentos de genes (J) para obtener una región VH completa y la recombinación de segmentos de genes variables y de unión para obtener una región completa de VL . La CDR3 (H3) es la mayor fuente de diversidad molecular dentro de una secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, H3 puede ser tan corta como de dos residuos de aminoácidos o mayor de 26. El fragmento de unión a antígeno más pequeño es el Fv, que consiste de los dominios VH y VL. Es poco probable que los anticuerpos y composiciones que tienen secuencias de CDR idénticas o similares a las descritas en la presente se hayan generado independientemente. La secuencia de los genes de anticuerpos después del ensamblaje y mutación somática presenta una gran variación, y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas diferentes de anticuerpos (Immunoglobulin Genes, 2a ed. , eds . Jonio y colaboradores, Academic Press, San Diego, CA, 1995) . La presente descripción proporciona nuevas CDR derivadas de bibliotecas de genes de inmunoglobulinas humanos. La estructura que lleva una CDR es generalmente una cadena ligera o pesada del anticuerpo o una porción de las mismas, donde la CDR está localizada en una región de CDR natural. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables se pueden determinar como se describe en Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications , Bethesda, MD (1991) . Las secuencias de ADN y aminoácidos (AA) de las modalidades ilustrativas de los anticuerpos anti-IL-21R de esta invención, incluyendo sus fragmentos scFv, dominios VH y VL y CDR, se muestran en el Listado de Secuencias y se enumeren en las Tablas 1A y IB. Las modalidades específicas de los anticuerpos se identifican como MUF , MUF- germinal , MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CP5G2 y R18. Las posiciones de las CDR en los dominios VH y VL de los anticuerpos están indicadas en la Tabla 2.

Tabla 1A; Secuencias de AA y ADN de los dominios VH y VL Fv y REGION TIPO MUF MU11 18G4 18A5 VH AA SEQID 0:1 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO:47 SEQID O:65 VL AA SEQ ID N0:2 SEQ ID NO:20 SEQID O:48 SEQID O:66 scFv AA SEQ ID N0:3 SEQIDNO:21 SEQ ID NO:49 SEQ ID NO:67 Hl AA SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:22 SEQID O-.50 SEQID O:68 H2 AA SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:23 SEQIDNO:51 SEQ ID NO:69 H3 AA SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:70 Ll AA SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO:71 L2 AA SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:72 L3 AA SEQ ID NO :9 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:55 SEQ ID NO:73 VH ADN SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:56 SEQ ID NO:74 vL ADN SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:75 scFy ADN SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:58 SEQ ID O:76 Hl ADN SEQ ID NO: 13 SEQID O:31 SEQ ID NO: 59 SEQ ID N0.77 H2 ADN SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO-.32 SEQ ID NO.60 SEQ ID N0:78 H3 ADN SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:79 Ll ADN SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:80 L2 ADN SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:63 SEQIDNO:81 L3 ADN SEQID O:18 SEQID O:36 SEQ ID NO:64 SEQ ID NO: 82 Tabla IB: Secuencias de ?? y ADN de los dominios VH y VL Fv y CDR REGION IPO LINEA 19F5 CP5G2 R18 GERMINAL PLUF VH AA SEQ ID NO:83 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 119 SEQ ID NO: 137 VL AA SEQ ID NO:84 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 120 SEQ ID NO: 138 scFv AA SEQ ID NO:85 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 121 SEQ ID NO: 139 Hl AA SEQ ID NO:86 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 122 SEQ ID NO: 140 H2 AA SEQ ID NO:87 SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 123 SEQ ID NO: 141 H3 AA SEQ ID NO:88 SEQ ID NO: 106 SEQ ID NO: 124 SEQ ID NO: 142 Ll AA SEQ ID NO:89 SEQ ID NO: 107 SEQ ID NO: 125 SEQ ID NO: 143 L2 AA SEQ ID NO:90 SEQ ID NO: 108 SEQ ID NO: 126 SEQ ID NO: 144 L3 AA SEQ ID NO:91 SEQ ID NO: 109 SEQ ID NO: 127 SEQ ID NO: 145 VH ADN SEQ ID O:92 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO: 128 SEQ ID NO: 146 VL ADN SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:l l l SEQ ID NO: 129 SEQ ID NO: 147 scFv ADN SEQ ID NO:94 SEQ ID NO: 112 SEQ ID NO: 130 SEQ ID NO: 148 Hl ADN SEQ ID NO:95 SEQ ID NO: 113 SEQ ID NO: 131 SEQ ID NO: 149 IÍ2 ADN SEQ ID NO:96 SEQ ID NO: 114 SEQ ID NO: 132 SEQ ID NO: 150 H3 ADN SEQ ID NO:97 SEQ ID NO: 115 SEQ ID NO: 133 SEQ ID NO: 151 Ll ADN SEQ ID NO:98 SEQ ID NO: 116 SEQ ID NO: 134 SEQ ID NO: 152 L2 ADN SEQ ID NO:99 SEQ ID NO: 117 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 153 L3 ADN SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 118 SEQ ID NO: 136 SEQ ID NO: 154 Tabla 2 : Posiciones de CDR dentro de las Secuencias AA CDR LINEA GERMINAL MUF (SEQ ID NO:85) Hl 31-35 H2 50- 66 H3 99-105 Ll 156-166 L2 182-188 L3 221-233 Los anticuerpos anti-IL-21R de esta invención pueden comprender opcionalmente regiones constantes de anticuerpos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse por su extremo C-terminal a un dominio constante de cadena ligera como CK o ??. Similarmente, el dominio VH, o una porción del mismo, puede unirse a todas o parte de una de las cadenas pesadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y cualquier subclase de isotipos . Las regiones constantes son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, MD (1991) . En modalidades ejemplares, UF comprende dominios constantes de cadenas ligeras y pesadas de la IgGi^ humana y üll comprende dominios constantes de cadenas ligeras y pesadas de la IgGiK humana. En estos anticuerpos, las secuencias de cadenas pesadas fuera del dominio VH son idénticas. Las secuencias de ADN y aminoácidos para el fragmento C-terminal de la cadena ligera ? se muestran en la SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 39, respectivamente. Las secuencias de ADN y aminoácidos para el fragmento C-terminal de la cadena ? se muestran en la SEQ ID NO -.42 y SEQ ID NO: 41, respectivamente . Las secuencias de ADN y aminoácidos para el fragmento C- terminal de la cadena pesada de IgGi se muestran en la SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 37, respectivamente.

Determinadas modalidades comprenden un dominio VH, un dominio VL o una combinación de los mismos , del fragmento Fv de MÜF, MUF-germinal , MU11, 18G4, 18A5, 19F5, -CP5G2 o R18. Otras modalidades comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los dominios VH y VL. Los anticuerpos cuyas secuencias CDR se muestran en las SEQ ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25, 27, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 119,120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 ó 145 se encuentran comprendidas en el alcance de esta invención. Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo comprende un fragmento CDR3 (H3) del dominio VH de MÜF, MUF-germinal, MU11, 18G4, 18A5, 19F5, CPSG2 ó R18. En determinadas modalidades, los dominios VH y/o VL se pueden adecuar a la linea germinal, es decir, las regiones de estructuras de trabajo (FR, por sus siglas en inglés) de estos dominios son mutadas utilizando técnicas de biología molecular convencionales para que coincidan con aquellas producidas por células de la línea germinal . En otras modalidades, las secuencias FR continúan siendo diferentes de las secuencias consenso de la línea germinal. En una modalidad, la invención proporciona las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para el MÜF germinado. La secuencia de aminoácidos para el domino VH de MUF germinado se describe en las SEQ ID NO: 83 y 85. La secuencia de aminoácidos para el dominio VL de MÜF germinado se describe en las SEQ ID NO: 84 y 85. La secuencia de ácido nucleico para el dominio VH de MUF germinado se describe en las SEQ ID NO: 92 y 94 y para el dominio VL germinado se describe en las SEQ ID NO: 93 y 94. Las secuencias germinales para los dominios VH y VL pueden identificarse por medio de alineaciones de las secuencia de aminoácidos y ácido nucleico contra la base de datos VBASE (MRC Center for Protein Engineering, Reino Unido) . En algunas modalidades, las regiones FR de los scFv son mutadas en conformidad con las coincidencias más próximas en la base de datos VBASE y las porciones de CDR se mantienen intactas . En determinadas modalidades, los anticuerpos de esta invención reaccionan específicamente con un epítope en el dominio extracelular de la IL-21R humana. El dominio extracelular predicho consiste de una secuencia de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 235 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otras modalidades, los anticuerpos anti-IL-21R bloquean la unión de IL-21 a IL-21R. En otras modalidades, los anticuerpos anti-IL-21R reaccionan específicamente con un epítope en el dominio extracelular de la IL-21R de ratón. El dominio extracelular de la IL-21R murino consiste de una secuencia de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 236 aminoácidos de la SEQ ID NO: 45. El dominio extracelular de la IL-21R de ratón es aproximadamente 65% idéntico al equivalente humano. Se contempla que los anticuerpos de esta invención puedan unirse a otras proteínas, tales como proteínas recom inantes que comprendan el dominio extracelular de la IL-21R en su totalidad o en parte. Un experto en la técnica reconocerá que los anticuerpos descritos pueden usarse para detectar, medir y/o inhibir proteínas que difieran de alguna manera de la IL-21R. Por ejemplo, estas proteínas pueden ser homologas a la IL-21R. Se considera que los anticuerpos anti-IL-21R se pueden unir a proteínas que comprenden una secuencia que sea por lo menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a cualquier secuencia de por lo menos 100, 80, 60, 40 ó 20 aminoácidos contiguos en la secuencia establecida SEQ ID NO: 43. Además de los análisis de homología de secuencias, se puede conducir un mapeo de epítopes (ver por ejemplo Epítope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996) y análisis de la estructura secundaria y terciaria para identificar las estructuras tridimensionales específicas de los anticuerpos descritos en la presente y de sus complejos con antígenos. Tales métodos incluyen, pero sin limitarse a, cristalografía por rayos X (Engstom (1974) Biochem. Exp.

Biol., 11:7-13) y modelación en computadora de representaciones virtuales de los anticuerpos de la presente (Fletterick y colaboradores (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) . La descripción proporciona un método para obtener anticuerpos anti-IL-21R que comprende crear anticuerpos con secuencia (s) alterada (s) de los VH y/o VL de las Tablas 1A y IB. Tales anticuerpos pueden ser derivados por un experto utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se pueden introducir sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos en las regiones FR y/o CDR. Los cambios en la FR habitualmente se diseñan para mejorar la estabilidad e inmunogenicidad del anticuerpo, mientras que los cambios en la CDR se diseñan generalmente para aumentar la afinidad del anticuerpo por su antígeno. Los cambios que aumentan la afinidad pueden comprobarse alterando la secuencia de la CDR y midiendo la afinidad del anticuerpo por su blanco (ver Antibody Engineering, 2da ed. , Oxford (üniversity Press, ed. Borrebaeck, 1995) . Los anticuerpos cuyas secuencias de CDR difieren de manera no sustancial de las mostradas en las SEQ ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, S, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144 ó 145 están comprendidas dentro del alcance de la invención. Generalmente, esto involucra sustituciones de un aminoácido con un aminoácido que tenga carga similar, hidrofobicidad o estereoquímicas similares. Las sustituciones más drásticas en las regiones FR, en contraposición con las regiones CDR, pueden hacerse siempre que no afecten de manera adversa las propiedades de unión del anticuerpo. Las sustituciones también pueden realizarse para adaptar el anticuerpo a la linea germinal o para estabilizar el sitio de unión al antígeno . Las modificaciones conservadoras producirán moléculas que tienen características químicas y funcionales similares a las de la molécula que fue modificada. Por el contrario, las modificaciones sustanciales en las características químicas y/o funcionales de las moléculas pueden lograrse por medio de la selección de sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difiera significativamente en su efecto para mantener (1) la estructura principal de la molécula en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación en lámina o helicoidal, (2) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio de interés o (3) el tamaño de la molécula.

Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservadora" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo de manera que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede también ser sustituido con alanina, como se ha descrito anteriormente por "mutagénesis de barrido de alanina" (ver, por ejemplo, MacLennan y colaboradores, 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki y colaboradores, 1998, Adv. Biophys . 35:1-24). Las sustituciones de aminoácido deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica en el momento en que se desea efectuar esas sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos se pueden utilizar para identificar residuos importantes en la secuencia de las moléculas, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la presente. Las sustituciones de aminoácidos a modo de ejemplo se muestran en la Tabla 3. Tabla 3: Sustituciones de aminoácidos Residuos Ejemplos de Sustituciones Sustituciones más Originales Conservadoras Ala (A) Val, Leu, lie Val Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys Residuos Ejemplos de Sustituciones Sustituciones más Originales Conservadoras Asn (N) Gln Gln Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser, Ala Ser Gln (Q) Asn Asn Gly (G) Pro, Ala Ala His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg He (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu (L) Norleucina, lie, Val, Met, Ala, Phe lie Lys (K) Arg, ácido 1, 4-diamino-butírico, Gln, Asn Arg Met (M) Leu, Phe, lie Leu Phe (F) Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro (P) Ala Gly Ser (S) Thr, Ala, Cys Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr, Phe Tyr Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val (V) lie, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu En determinadas modalidades, las sustituciones de aminoácidos conservadoras comprenden también residuos de aminoácidos no naturales que generalmente se incorporan por síntesis química de péptidos más que por síntesis en sistemas biológicos .

En una modalidad, el método para elaborar una variante del dominio VH comprende agregar, eliminar o sustituir por lo menos un aminoácido en los dominios VH descritos , o combinar los dominios VH descritos con por lo menos un dominio VL, y evaluar la variante del dominio VH por la unión a IL-21R o modulación de la actividad de IL-21R. Un método análogo para obtener una variante del obminio VL comprende agregar, eliminar o sustituir por lo menos un aminoácido en los deminios VL descritos o combinar los deminios descritos VL con por lo menos un deminio VH y evaluar la variante del dominio VL por la unión a IL-21R o nodulación de la actividad de IL21R. Otro aspecto de la descripción proporciona un método para preparar fragmentos de unión al antígeno que se unen a IL-21R. El método comprende : (a) proporcionar un repertorio inicial de ácidos nucleicos que codifiquen un dominio VH al que le falta una o más de CDR1, 2 ó 3 o que contiene una CDR1, 2 ó 3 que puede ser reemplazada: (b) insertar o reemplazar la región CDR1, 2 ó 3 del repertorio inicial por un ácido nucleico que codifique una de las secuencias de aminoácidos definidas sustancialmente en la presente para una CDR1, 2 ó 3 VH, produciendo un repertorio de productos ; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos : (d) seleccionar un fragmento de unión al antígeno específico que se una a IL-21R; y (e) recuperar el fragmento de unión al antígeno específico o ácido nucleico que lo codifica. Un método análogo consiste en combinar las CDRl, 2 ó 3 de VL de la invención con un repertorio inicial de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL al que le falta una CDRl, 2 ó 3 o que contiene una CDRl, 2 ó 3 que puede ser reemplazada. Se puede utilizar la metodología de ADN recombinante para introducir una de las secuencias de CDR descritas en un repertorio de dominios VH o VL que no posean la respectiva CDR (Marks y colaboradores (BioTechnology (1992) 10:779-783). Por ejemplo, se puede utilizar un cebador adyacente al extremo 5' del dominio variable y un cebador para la tercera FR para generar un repertorio de secuencias de dominios variables que no posean CDR3. Este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo' descrito. El uso de técnicas análogas, permite entremezclar porciones de una de las secuencias de COR descritas con porciones de secuencias de CDR de otros anticuerpos para proporcionar un repertorio de fragmentos de unión a antígeno que se unan a IL-21R. Cualquiera de los repertorios puede expresarse luego en un sistema huésped, tal como la expresión en fagos (descrito en el documento WO 92/01047), de manera que sea posible seleccionar los fragmentos de unión al antígeno adecuados que se unan a IL-21R.

Otra alternativa emplea mutagénesis aleatoria de las secuencias VH o VL descritas para generar variantes de los dominios VH o VL que aún sean capaces de unirse a IL-21R. Una técnica que emplea PCR susceptible de error fue descrita por Gram y colaboradores {Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1992) 89:3576-3580) . Otro método utiliza mutagénesis directa de las secuencias VH o VL descritas. Tales técnicas fueron descritas por Barbas y colaboradores (Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1994) 91:3809-3813) y Schier y colaboradores (J. Mol. Biol . (1996) 263 : 551-567) . Una porción de un dominio variable comprenderá por lo menos una región CDR como se define sus tancialmente en la presente y, opcionalment , regiones de estructuras de trabajo in ervenientes de los dominios VH o VL definidos en la presente. La porción puede incluir la mitad C-terminal de la FR1 y/o la mitad N-terminal de la FR4. Los residuos adicionales en los extremos N-terminal o C-terminal del dominio variable pueden no ser los mismos residuos encontrados en los anticuerpos naturales. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante introduce normalmente residuos N- o C-terminales debido al uso de enlazadores . Algunos enlazadores pueden utilizarse para unir dominios variables a otros dominios variables (por ejemplo, anticuerpos) dominios constantes o marcas proteináceas . A pesar de que las modalidades ilustradas en los Ejemplos comprenden un par "coincidente" de dominios VH y VL, un experto en la técnica reconocerá que modalidades alternativas pueden comprender fragmentos de unión al antígeno que solamente contengan una única CDR, tanto del dominio VL como VH. Se puede utilizar cualquiera de los dominios de unión al antígeno específicos de cadena única para evaluar los dominios complementarios capaces de formar un fragmento de unión al antígeno específico de dos dominios capaz de, por ejemplo, unirse a IL-21R. La evaluación se puede efectuar utilizando métodos de expresión en fagos con el denominado enfoque combinatorio jerárquico doble descrito en el documento O 92/01047. En este enfoque, se utiliza una colonia individual que contenga un clon de cadena H ó L para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) , y el dominio de unión al antígeno específico de dos cadenas resultante es seleccionado de acuerdo a las técnicas de expresión en fagos como ya se describió . En otras modalidades alternativas, los anticuerpos anti-IL-21R pueden unirse a una proteína (por ejemplo, albúmina) por medio de métodos de entrecruzamiento químico o recombinantes . Los anticuerpos descritos pueden también unirse a una variedad de polímeros no proteináceos (por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos) de las maneras establecidas en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; Ó 4,179,337. Los anticuerpos pueden modificarse químicamente por conjugación covalente con un polímero, por ejemplo, para aumentar su vida media en la circulación sanguínea. Los ejemplos de polímeros y métodos de unión se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; y 4, 609,546. Los anticuerpos descritos pueden ser modificados para alterar su glicosilación; es decir, se puede eliminar o agregar por lo menos un grupo funcional de carbohidratos del anticuerpo. La eliminación o adición de sitios de glicosilación puede lograrse cambiando las secuencias de aminoácidos para eliminar o crear sitios de glicosilación consenso, que son conocidos en la técnica. Otro modo de agregar grupos funcionales de carbohidratos es el acoplamiento enzimático o químico de glicósidos a residuos de aminoácidos del anticuerpo (ver el documento WO 87/05330 y Aplin y colaboradores (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. , 22:259-306) . La eliminación de porciones de carbohidratos puede también lograrse química o enzimáticamente (ver Hakimuddin y colaboradores (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259:52; Edge y colaboradores (1981) Anal. Biochem., 118:131; Thotakura y colaboradores (1987) Meth. Enzymol. , 138:350). Los métodos para alterar una región constante de anticuerpos son conocidos en la técnica. Los anticuerpos con función alterada (por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector tal como FcR en una célula o el componente Cl del complemento) pueden producirse por reemplazo de por lo menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver por ejemplo, los documentos EP 388,151 Al, US 5,624,821 y US 5,648,260, cuyos contenidos se incorporan a la presente a modo de referencia) . Tipos similares de alteraciones podrían describirse, que si se aplicaran a un anticuerpo murino o de otra especie reducirla o eliminaría funciones similares. Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fe de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG, tal como una IgG humana) por la FcR (por ejemplo, Fe gamma Rl) o Clq. La afinidad puede alterarse por reemplazo en su cadena lateral de por lo menos un residuo especifico con por al menos un residuo que tenga una funcionalidad apropiada, o por introducción de un grupo funcional con carga, como un glutamato o aspartato, o quizás un residuo aromático no polar como fenilalanina, tirosina, triptófano o alanina (ver por ejemplo, el documento US 5,624,821).

Por ejemplo, el reemplazo del residuo 297 (asparagina) por alanina en una región constante de la IgG inhibe significativamente el reclutamiento de células efectoras, mientras que reduce levemente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad por Ciq (ver por ejemplo, el documento US 5,624,821) . La numeración de los residuos en la cadena pesada corresponde a la del Indice de los EE.UU. (ver Kabat y colaboradores, 1991 supra) . Esta alteración destruye el sitio de glicosilación y se cree que la presencia de carbohidratos es necesaria para la unión al receptor Fe . Se cree que cualquier otra sustitución en este sitio que destruya el sitio de glicosilación causa una reducción similar en la actividad lítica. Otras sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, un cambio de cualquiera de los residuos 318 (Glu) , 320 (Lys) y 322 (Lys) , por Ala, son también conocidas por no permitir que Ciq se una a la región Fe de los anticuerpos IgG (ver por ejemplo, el documento US 5, 624, 821) . Se pueden producir anticuerpos modificados que presentan una interacción reducida con el receptor Fe . Por ejemplo, se ha demostrado que en la IgG3 humana, que se une al receptor gamma Fe Rl humano, un cambio de Leu 235 por Glu destruye su interacción con el receptor. Las mutaciones en sitios cercanos o adyacentes en la región de unión de un anticuerpo (por ejemplo, reemplazo de los residuos 234, 236 ó 237 por Ala) pueden también utilizarse para afectar la afinidad del anticuerpo por el receptor gamma Fe Rl . La numeración de los residuos en la cadena pesada se basa en el Indice de EE.UU. (ver Rabat y colaboradores, 1991 supra) . Métodos adicionales para alterar la actividad lítica de un anticuerpo, por ejemplo, por alteración de por lo menos un aminoácido en la región N-terminal del dominio CH2, se describen en el documento WO 94/29351 de Morgan y colaboradores y en el documento US 5,624,821, cuyos contenidos se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia. Los anticuerpos de la presente invención se pueden marcar con un marcador funcional o detectable. Estos marcadores incluyen marcadores radioactivos (por ejemplo, 131I ó 99Tc) , marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) y otros grupos químicos funcionales (por ejemplo, biotina) . Un experto en la técnica apreciará que las modificaciones descritas anteriormente no son exhaustivas y que es posible efectuar muchas otras modificaciones a la luz de la presente descripción. Ácidos nucleicos, Sistemas de Clonación y Expresión La descripción proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos descritos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADN o ARN y pueden ser sintéticos (en su totalidad o parcialmente) o recom inantes (en su totalidad o parcialmente) . La referencia a una secuencia de nucleótidos, tal como se define en la presente, comprende una molécula de ADN con la secuencia especificada y comprende una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual T es sustituida por U. También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de codificación para una, dos o tres CDR, un dominio VH, un dominio VL o combinaciones de las mismas, como se describe en la presente, o una secuencia sustancialmente idéntica (por ejemplo una secuencia por lo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la misma, o que sea capaz de hibridizarse bajo condiciones estrictas con las secuencias descritas) . En otra modalidad, los ácidos nucleicos aislados tienen secuencias de nucleótidos que codifican regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo anti-IL-21R que tiene por lo menos una CDR seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 140, 141, 142, 143, 144 y 145 o una secuencia que codifica una CDR que difiere en uno o dos aminoácidos de las secuencias descritas en la presente. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una CDR incluye sustituciones de aminoácidos conservadoras de una o más de las secuencias de aminoácidos como se muestran en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 140, 141, 142, 143, 144 y 145. Un ácido nucleico puede codificar solamente la región variable de la cadena ligera o pesada, o puede también codificar una región constante de la cadena pesada o ligera del anticuerpo ligado operativamente a la correspondiente región variable. En una modalidad, la región variable de cadena ligera (VL) se une a una región constante elegida entre una región constante kappa o lambda. La región constante de la cadena ligera puede también ser de tipo lambda o kappa humano. En otra modalidad, la región variable de la cadena pesada (VH) se une a una región constante de la cadena pesada de un isotipo del anticuerpo seleccionado entre las IgG (por ejemplo, Igd, IgG2, IgG3, lgG4) , IgM, IgAi, IgA2, IgD e IgE. La región constante de la cadena pesada puede ser un isotipo de una IgG (por ejemplo una IgG2) . Las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención, aunque se encuentren en la secuencia nativa (de ADNc o ADN genómico o mezclas de los mismos) excepto por sitios de restricción modificadas y similares, pueden ser mutadas de acuerdo con técnicas estándar para proporcionar secuencias de genes. Para las secuencias de codificación, estas mutaciones pueden afectar las secuencias de aminoácidos como se desee. En particular, se contemplan las secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas o que derivan de secuencias y, D, J nativas, constantes, de cambios y otras secuencias descritas en la presente (donde "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada con respecto a otra secuencia) . En una modalidad, el ácido nucleico difiere (por ejemplo, difiere por sustitución, inserción o eliminación) de la secuencia proporcionada (por ejemplo, de la siguiente manera: por al menos uno pero menor de 10, 20, 30 ó 40 nucleótidos; por al menos uno pero menor de 1%, 5%, 10% ó 20% de los nucleótidos en el ácido nucleico de interés) . Si fuera necesario para este análisis, las secuencias deberán alinearse para lograr una homología máxima. Se consideran diferentes las secuencias suprimidas o insertadas "por bucles" o por faltas de coincidencia. La diferencia puede estar en uno o más de los nucleótidos que codifican uno o más residuos no esenciales, o la diferencia puede ser una o más sustituciones conservadoras. La descripción también proporciona construcciones de ácidos nucleicos en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión, que comprenden por lo menos uno de los ácidos nucleicos como se describen en la presente.

La descripción proporciona también una célula hospedera que comprende por lo menos una de las construcciones de ácido nucleico descritas en la presenté. Se proporcionan también los métodos para obtener la(s) proteína(s) codificadas por el/los ácido (s) nucleico (s) que comprenden la secuencia descrita en la presente en adelante. El método comprende cultivar células hospederas bajo condiciones apropiadas para que ellas expresen la proteína codificada por el ácido nucleico. Luego de la expresión y producción, se puede aislar y/o purificar el dominio VH o VL, o un miembro de unión específico, usando cualquier técnica conveniente, después se usará como es apropiado. Los fragmentos de unión al antígeno, los dominios VH y/o VL y las moléculas de ácido nucleico codificadores y los vectores, pueden ser aislados y/o purificados a partir de su entorno natural, hasta obtener una forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso del ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácidos nucleicos o genes de otro origen más allá de la secuencia que codifica el polipéptido con la función requerida. Los sistemas para donar y expresar los polipéptidos en una variedad de células hospederas son conocidos en la técnica. Las células apropiadas para producir anticuerpos se describen en, por ejemplo, Fernandez y colaboradores (1999) Gene Expression Systems, Academic Press, editores. Brevemente, las células hospederas apropiadas incluyen células de mamífero, células de insectos, células vegetales, células fúngicas o células procarióticas, por ejemplo de E. cali. Las células de mamífero que están disponibles en la técnica para expresión de polipéptidos heterólogos incluyen líneas de células linfocíticas (por ejemplo NSO) , células HEK293, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células COS, células HeLa, células del riñon de hámster recién nacido, oocitos y células de animales transgénicos , por ejemplo, célula epitelial mamaria. En una modalidad, los anticuerpos MUF y Müll se expresan en células HEK293 o CHO. En otras modalidades, los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención se ubican bajo el control de un promotor específico de tejidos (por ejemplo, un promotor específico de glándula mamaria) y los anticuerpos se producen en animales transgénicos. Por ejemplo, los anticuerpos se secretan en la leche de animales transgénicos, como por ejemplo una vaca, cerdo, caballo, oveja, cabra o roedor transgénicos. Se pueden seleccionar o construir vectores adecuados para que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras apropiadas, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras , genes marcadores y otras secuencias . Los vectores pueden contener también una estructura principal de un plásmido o viral . Para más detalles, ver Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) . Muchas de las técnicas establecidas que emplean vectores, incluyendo la manipulación, preparación, mutagénesis, secuenciación y transfeccion de ADN, se describen en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel y colaboradores, eds, John Wiley & Sons (1992) . Un aspecto más de la descripción proporciona un método de introducción de ácidos nucleicos en una célula hospedera. Para células eucarióticas , las técnicas de transfeccion apropiadas pueden incluir transfeccion con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, mediada por liposomas y transduccion usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia y baculovirus . Para células bacterianas, las técnicas apropiadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfeccion usando bacteriófagos. Después de introducir el ADN se puede aplicar un método de selección (por ejemplo, resistencia a fármacos) para seleccionar las células que contienen al ácido nucleico.

Depósitos biológicos Las células CHO transformadas con vectores que contienen cadenas pesadas y ligeras de MUF y células CHO transformadas con vectores que contienen cadenas pesadas y ligeras de MUll, fueron depositadas el 5 de marzo de 2003, en la American Tissue Culture Collection (ATCC) bajo los respectivos Números de Designación de Depósito PTA-5031 y PTA-5030. La dirección del depósito es 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110, USA. Usos de Anticuerpos Anti-IL-21R Los anticuerpos anti-IL-21R que actúan como antagonistas del IL-21R se pueden usar para regular por lo menos una o más respuestas inmunes reguladas por IL-21R seleccionadas entre proliferación celular, secreción de citoquinas, secreción de quemoquinas y actividad citolítica de células T, células B, células NK, macrófagos o células sinoviales. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención se pueden usar para inhibir la actividad (por ejemplo, proliferación, diferenciación y/o supervivencia) de una célula inmune o hematopoyética (por ejemplo, una célula del linaje mieloide, linfoide o eritroide, o células precursoras de las mismas) y así se pueden usar en el tratamiento de una variedad de trastornos inmunes e hiperproliferativos . Los ejemplos, sin limitaciones, de trastornos inmunes pueden incluir rechazo de transplantes, enfermedad de injerto contra huésped, alergias (por ejemplo, alergia atípica) y enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes pueden incluir diabetes mellitus, trastornos artríticos (que incluyen artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática y espondilitis anquilosante) , espondiloartropatía, esclerosis múltiple espondiloartropatía, esclerosis múltiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritematosa sistémica, lupus eritematosa cutáneo, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atípica y dermatitis eczematosa) , psoriasis, síndrome de Sjogren, IBD (incluyendo la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) , asma (incluyendo asma intrínseco y asma alérgico) , esclerodermia y vasculitis . La esclerosis múltiple es una enfermedad del sistema nervioso central que se caracteriza por la inflamación y pérdida de las vainas mielínicas - la materia grasa que aisla los nervios y que es necesaria para una función nerviosa apropiada. La inflamación que resulta de una respuesta inmune dependiente de IL-21 puede ser tratada con los anticuerpos y composiciones de esta invención. En el modelo de encefalitis autoinmune experimental (EAE por sus siglas en inglés) de ratón para esclerosis múltiple (Tuohy y colaboradores (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130), Sobel y colaboradores (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401) y Traugott (Cell Immnunol. (1989) 119: 114-129), el tratamiento de ratones con inyecciones de U11 antes (y continuamente) hasta la inducción de EAE demora profundamente el comienzo de la enfermedad. Los anticuerpos de esta invención se pueden utilizar asimismo para tratar la esclerosis múltiple en seres humanos . La artritis es una enfermedad caracterizada por la inflamación de los miembros. La artritis reumática (AR) es la más frecuente entre las artritis, e incluye la inflamación de los tejidos conectivos y la membrana sinovial, una membrana que reviste las articulaciones . La membrana sinovial inflamada a menudo infiltra la articulación y daña el cartílago y hueso de la misma. Los estudios muestran que el tratamiento de las células sinoviales y macrófagos con IL-21 induce la secreción de las citoquinas y quemoquinas asociadas con la inflamación por parte de estas células . En el modelo de ratón de artritis inducida con colágeno (AIC) para la artritis reumatoide (Courtenay y colaboradores (Nature (1980) 283: 666-628) y William y colaboradores (Immunol. (1995) 84: 433-439)), el tratamiento subsiguiente (y continuo) de los ratones con IL-21 hasta la inducción de (AIC) exacerba la enfermedad. La secreción incrementada de las citoquinas y quemoquinas inflamatorias, y más importante, un mayor grado de enfermedad como resultado de respuestas inmunes dependientes de IL-21 pueden ser tratadas con los anticuerpos de esta invención. Similarmente , los anticuerpos y composiciones de esta invención se pueden usar para tratar RA u otras enfermedades artríticas en seres humanos. El rechazo de transplantes es un fenómeno inmunológico en el cual los tejidos de un donante son específicamente "atacados" por células inmunes del huésped. Las principales células que "atacan" son células T, donde los receptores de células T reconocen las moléculas MHC del donante como "extrañas" . Este reconocimiento activa la célula T, que prolifera y secreta una variedad de proteínas de tipo citoquinas y citolíticas que por último destruyen el transplante. Las células T en la reacción de linfocitos mixtos (RML) , un ensayo in vi ro de rechazo de transplantes, proliferan más rápidamente cuando está suplementado con IL-21. Los modelos de RML y de transplante se han descrito en Current Protocols in Immunology, Segunda Edición, Coligan y colaboradores, eds, John Wiley & Sons, 1994; Kasaian y colaboradores (Immunity (2002) 16: 559-569); Fulmer y colaboradores (Am J. Anat. (1963) 113: 273-285), y Lenschow y colaboradores (Science (1992) 257: 789-792). Los anticuerpos y composiciones de esta invención se pueden usar para reducir la RML y tratar el rechazo de transplantes y otras enfermedades relacionadas (por ejemplo, síndrome de injerto contra huésped) en seres humanos y que dependen de IL-21. El lupus eritematoso sistémíco (SLE por sus siglas en inglés) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la presencia de anticuerpos, incluyendo anticuerpos contra ADN, antígenos nucleares y ribonucleoproteinas . Estos anticuerpos están asociados con el daño en tejidos y órganos. La causa de SLE no se conoce, pero la aparición de anticuerpos sugiere una inhibición inadecuada de células T o B autorreactivas . Los anticuerpos y composiciones de esta invención se pueden usar para inhibir las actividades mediadas por IL-21 y las células T y B autorreactivas, y para tratar el SLE y enfermedades relacionadas en ratones NZB X NZW (el modelo de ratón para SLE) (Immunologic Defects in Laboratory Animáis, Gershwin y colaboradores, eds, Plenum Press, 1981) o en humanos . Los anticuerpos de esta invención también se pueden utilizar para tratar trastornos hiperproliferativos asociados con actividad aberrante de células que responden IL-21 y IL-21R. Los ejemplos de tales células incluyen células neoplásicas de origen hematopoyético, por ejemplo, células que provienen de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o células precursoras de las mismas. Los ejemplos de estos trastornos neoplásicos incluyen distintos tipos de cáncer leucémicos y tumores en la sangre, médula ósea (por ejemplo, mieloma) y tejido linfático (por ejemplo, linfornas) . En determinadas modalidades, la presente invención se dirige al tratamiento de distintos tipos de cáncer leucémico que incluyen, pero sin limitarse a, leucemia promieloide aguda (APML) , leucemia mielogénica aguda (AML) y leucemia mielogénica crónica (CML) (revisada en Vaickus, L. (1991) Crit. Rev. in Oncol . /Hemotol . 11:267-97) . Los ejemplos de formas malignas linfoides que pueden ser tratadas por métodos de la invención incluyen, pero sin limitarse a, leucemia linfoblástica aguda (ALL, que incluye ALL del linaje B y ALL del linaje T) , leucemia linfocítica crónica (LLC) , leucemia prolinfocítica (PLL) , leucemia de células vellosas (HCL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) . Otras formas de linfomas malignos que pueden ser tratadas en la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, linfoma no Hodgkin, linfomas de células T periféricas, leucemia/linforna de células T de adultos (ATL) , linfomas de célula T cutáneas (CTCL) , leucemia linfocítica granular mayor (LGF) , linfoma de Hodgkin y variantes de las mismas . Terapia Combinada En una modalidad, se administra una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo anti-IL-21R y por lo menos un agente terapéutico en una terapia combinada. La terapia es útil para tratar afecciones o trastornos patológicos, como por ejemplo trastornos inmunes e inflamatorios. El término "en combinación" significa en este contexto que la composición de anticuerpos y del agente terapéutico se administran sustancialmente de una forma contemporánea, simultánea o bien consecutiva. Si se administra de forma consecutiva, al comenzar la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos puede todavía ser detectable en concentraciones eficaces en el momento del tratamiento. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir por lo menos un anticuerpo anti IL-21R coformulado y/o coadministrado con por lo menos un agente terapéutico adicional. Los agentes adicionales pueden incluir por lo menos un inhibidor de citoquinas, inhibidor del factor de crecimiento, inmunosupresor, agente antiinflamatorio, inhibidor metabólico, inhibidor enzimático, agente citotóxico y agente citostático, como se describirán con mayor detalle a continuación. Las terapias combinadas pueden emplear ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así los posibles efectos tóxicos o complicaciones asociadas con las distintas monoterapias . Más aún, los agentes terapéuticos descritos en la presente actúan sobre vías que difieren de la vía de IL-21/IL-21R y por consiguiente se espera que mejoren y/o permitan obtener un efecto sinérgico con los efectos de los anticuerpos anti-IL-21R. Los agentes terapéuticos usados en combinación con los anticuerpos anti-IL-21R pueden ser aquellos agentes que interfieren en diferentes etapas en la posterior respuesta inflamatoria y autoinmune. En una modalidad, se puede coformular y/o coadministrar por lo menos un anticuerpo anti-IL-21R, descrito en la presente, con por lo menos un antagonista de citoquinas y/o un factor de crecimiento. Los antagonistas pueden incluir receptores solubles, inhibidores de péptidos, pequeñas moléculas, fusiones de ligandos, anticuerpos (que unen citoquinas o factores de crecimiento o sus receptores u otras moléculas de la superficie celular) y "citoquinas antiinflamatorias" y agonistas de las mismas. Los ejemplos no limitantes de los agentes que se pueden usar en combinación con los anticuerpos anti-IL-2IR aquí descritos, incluyen, pero no se limitan a, antagonistas de por lo menos una interleuquina (IL) , (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 e IL-22) ; citoquinas (por ejemplo, TNFct, LT, EMAP-II y GM-CSF) ; y factores de crecimiento (por ejemplo, FGF y PDGF) . Los agentes también pueden incluir, pero sin limitarse a, antagonistas de por lo menos un receptor de una interleuquina, citoquina y factor de crecimiento. Los anticuerpos anti-IL-21R también se pueden combinar con inhibidores (por ejemplo, anticuerpos) de moléculas de la superficie celular como por ejemplo CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69 , CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, o sus ligandos (por ejemplo, CD154 (gp39, CD40L) ) , o LFA-1/ICA -l y VLA-4/VC2¾M-l (Yusuf-Makagiansar y colaboradores (2002) Med Res Rev 22 (2) : 146-67) ) . Los antagonistas que se pueden usar en combinación con anticuerpos anti-IL-21R descritos en la presente pueden incluir antagonistas de IL-1, IL-12, TNFa, IL-15, IL-17, IL-18, IL-22 y sus receptores. Los ejemplos de tales agentes incluyen antagonistas de IL-12 (como por ejemplo anticuerpos que se unen a IL-12 (ver, por ejemplo, el documento WO 00/56772, Genetics Institute/BASF) ) ; inhibidores de los receptores de IL-12 (como por ejemplo, anticuerpos del receptor IL-12) ; y el receptor soluble IL-12 y sus fragmentos. Los ejemplos de los antagonistas IL-15 incluyen anticuerpos contra IL-15 o su receptor, fragmentos solubles del receptor IL-15 y proteínas de unión de IL-15. Los ejemplos de antagonistas de IL-18 incluyen anticuerpos contra IL-18, fragmentos solubles del receptor de IL-18 y proteínas de unión de IL-18 (IL-18BP, Mallet y colaboradores (2991) Circ. Res. 28). Los ejemplos de antagonistas de IL-1 incluyen inhibidores de la enzima convertidora de interleuquina-1 (ECI) , (como por ejemplo, Vx740) , antagonistas de IL-1 (por ejemplo, IL-1RA (ANIKINRA, AMGEN) ) , sIL-lRII (Immunex) y anticuerpos anti receptor-IL-1. Los ejemplos de antagonistas de TNF incluyen anticuerpos contra TNF (por ejemplo, TNFa humano), como por ejemplo D2E7 (anticuerpo anti-TNFa humano, documento U.S. 5, 258, 562, Humira™, BASF); anticuerpo CDP-571/CDP- 870/BAY-10-3356 anti-TNFa humanizado, Celltech/Pharmacia) ; cA2 (anticuerpo quimérico anti-TNFa, Remicade™, Centocor) ; y fragmentos de anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, CPD870) . Otros ejemplos incluyen fragmentos y derivados de receptores solubles de TNF (por ejemplo, p55 o p75 humanos) , tal como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión de IgG-receptor de TNF de 55 kD, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF- gG de 75 kD, Enbrel™, Immunex, ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295 J. Invest. Med. (1996) Vql . 44, 235A) . Otros ejemplos incluyen antagonistas enzimáticos (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNFoc (TACE) , tal como un derivado del ácido alfa-sulfonil hidroxámico (documento O 01/55112) o inhibidor de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005 ó -022)) y TNF-bp/s-TNFR (proteína de unión a TNF soluble, ver, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284; y Am. J. Physiol. Heart Circ . Physiol. (1995) Vol. 268, páginas 37-42) . Los antagonistas de TNF pueden ser fragmentos y derivados del receptor soluble de TNF (por ejemplo, p55 o p75 humanos) , tal como 75 kdTNFR-IgG; e inhibidores de la enzima convertidora de TNFoc (TACE) . En otras modalidades, los anticuerpos anti-IL-21R que se describen aquí se pueden administrar en combinación con al menos uno de los siguientes: antagonistas de IL-13, tal como receptores solubles de IL-13 y/o anticuerpos anti-IL-13; y antagonistas de IL-2, tal como proteínas de fusión de IL-2 (por ejemplo, DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2, Seragen, ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223) y anticuerpos anti-IL-2R (por ejemplo, anti-Tac (anticuerpo humanizado, Protein Design Labs, ver Gancer Res. 1990 Mar 1 ; 50 (5) : 1495-502) ) . Otra combinación incluye anticuerpos anti-IL-21R en combinación con inhibidores no supresores anti-CD4, tal como IDEC-CE9. l/SB 21039S (anticuerpo anti-CD4, IDEC/SmithKline) . Aún otras combinaciones incluyen anticuerpos anti-IL-21R con antagonistas de la vía coestimuladora CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2) (tal como anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagónicos) ; ligandos de la glicoproteína P-selectina (PSGL) ; y citoquinas antiinflamatorias y agonistas de las mismas (por ejemplo, anticuerpos) . Las citoquinas antiinflamatorias pueden incluir IL-4 (DNAX/Schering) ; IL-10 (SCH 52000, IL-10 recombinante, DNAX/Schering); IL-13; y TGF. En otras modalidades, se puede coformular y/o coadministrar al menos un anticuerpo anti-IL-21R con al menos un fármaco antiinflamatorio, inmunosupresor, un inhibidor metabólico e inhibidor enzimático. Los ejemplos no limitantes de los fármacos o inhibidores que se pueden usar en combinación con antagonistas de IL-21 que se describen aquí, incluyen, a modo de ejemplo, al menos uno entre: un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAID, por sus siglas en inglés) (tal como ibuprofeno, Tenidap (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S280)), Naproxeno (ver por ejemplo, Neuro epod (1996) Vol. 7, páginas 1209-1213) , Meloxicam, Piroxicam, Diclofenac, e Indometacina) ; Sulfasalazina (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 . (suplemento), S281) ; corticosteroide (tal como prednisoíona) ; fármacos antiinflamatorios supresores de citoquinas (CSAID) ; y un inhibidor de la biosíntesis de los nucleótidos (tal como un inhibidor de la biosíntesis de las purinas (por ejemplo, un antagonista de folato tal como metotrexato) y un inhibidor de la biosíntesis de la pirimidina (por ejemplo, un inhibidor de dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH) tal como leflunomida (ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S131 Inflammation Research (1996) Vol. 45, páginas 103-107)). Los agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con antagonistas de IL-21/IL-21R incluyen inhibidores de NSAID, CSAID, DHODH (tal como leflunomida) y antagonistas de folato (tal como metotrexato) . Ejemplos de inhibidores adicionales incluyen al menos uno de: corticosteroides (por vía oral, inhalados e inyección local) ; inmunosupresores (tal como ciclosporina y tacrolimus (FK-506) ) ; un inhibidor de mTOR (tal como sirolimus (rapamicina) o un derivado de rapamicina (por ejemplo, un derivado éster de rapamicina tal como CCI-779 (Elit. L. (2002) Current Opinión Investig. Drugs 3(8): 1249- 53; Huang, S. y colaboradores (2002) Current Opinión Investig. Drugs 3 (2) : 295-304) ) ) ; un agente que interfiera con el señalamiento de la citoquinas proinflamatorias , tal como TNFcc e IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o un inhibidor de la MAP quinasa) ; un inhibidor de COX2 (por ejemplo, celecoxib y variantes del mismo (MK-966) , ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81) ; un inhibidor de fosfodiesterasa (tal como R973401, ver por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282) ) ; un inhibidor de fosfolipasa (por ejemplo, un inhibidor de la fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) , tal como análogos de trifluorometilcetona (documento U.S. 6,350,892)); un inhibidor del factor de crecimiento de células del endotelio vascular (VEGF) ; un inhibidor del receptor de VEGF; y un inhibidor de la angiogénesis . Los agente terapéuticos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos anti-IL-21R incluyen inmunosupresores (tal como ciclosporina y tacrolimus (FK-506)); e inhibidores de mTOR (tal como sirolimus (rapamicina) o derivados de rapamicina (por ejemplo, derivados éster de rapamicina tal como CCI-779) ) ; inhibidores de C0X2 (tal como celecoxib y variantes de los mismos) ; e inhibidores de fosfolipasa (tal como inhibidores de la fosfolipasa 2 citosólica (cPLA2) (por ejemplo, análogos de trifluorometilcetona) ) .

Los ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden coadministrar y/o coformular con al menos un anticuerpo anti-IL-21R, incluyen, sin limitaciones, al menos uno de: antagonistas de TNF (tal como anticuerpos anti-TNF) ; fragmentos solubles de receptores de TNF (por ejemplo, p55 y p75 humanos) y derivados de los mismos (tal como p55 kdTNFR-igG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 55 kD, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel™) ) antagonistas enzimáticos de TNF (tal como inhibidores TACE) ; antagonistas de IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-22; agentes supresores de células T y células B (tal como anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22) ; rrihi idores de moléculas pequeñas (tal como metotrexato y leflunomida) ; sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (tal como CCI-779) ; inhibidores de Cox-2 y cPIA2; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2 y NF B; RAGE y RAGE soluble; inhibidores de P-selectina y PSGL-1 (tal cerno anticuerpos contra inhibidores de moléculas pequeñas) ; y agonistas del receptor beta de estrógeno (ERB) y antagonistas de ERB-NFkb. Los agentes terapéuticos que pueden ser coadministrados y/o coformulados con al menos un anticuerpo anti-IL-21R incluyen al menos uno de : un fragmento soluble de un receptor de TNF (por ejemplo, p55 o p75 humanos) tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel™) ; metotrexato; leflunomida; y sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (tal como CCI-779) .

Los anticuerpos anti-IL-21R descritos aquí se pueden usar en combinación con otros agentes terapéuticos para tratar los trastornos inmunes específicos que se describirán con mayor detalle más adelante. Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar trastornos artríticos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis inflamatoria, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis y artritis psoriática) , con los cuales es posible combinar un anticuerpo anti-IL-21R incluyen al menos uno de los siguientes: antagonistas de TNF (tal como anticuerpos anti-TNF) ; fragmentos solubles de receptores de TNF (por ejemplo, p55 y p75 humanos) y derivados de los mismos (tal como p55 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 55 kD, Lenercept™) y 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel™) antagonistas enzimáticos de TNF (tal como inhibidores TACE); antagonistas de IL-12, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-22; agentes que suprimen células T y células B (tal como anticuerpos anti-CD4 o anti-CD22) ; inhibidores de moléculas pequeñas (tal como metotrexato y leflunomida) ; sirolimus (rapamicina) y análogos de los mismos (por ejemplo, CCI-779) ; inhibidores de Cox-2 y CPLA2; NSAID; inhibidores de p38, TPL-2, Mk-2 y NFKB; RAGE O RAGE soluble; inhibidores de P-selectina o PSGL-1 (tal como inhibidores y anticuerpos contra moléculas pequeñas) ; - agonistas del receptor beta de estrógenos (ERB) y antagonistas de ERB-NFKB. LOS agentes terapéuticos que se pueden coadministrar y/o coformular con al menos un antagonista de IL-21/IL-21R incluyen al menos uno de: un fragmento soluble de un receptor de TNF (por ejemplo, p55 o p75 humanos) tal como 75 kdTNFR-IgG (proteína de fusión del receptor de TNF-IgG de 75 kD, Enbrel™) ; metotrexato; leflunomida; y sirolimus (rapamicina) o un análogo del mismo (por ejemplo, CCI-779) . Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar la esclerosis múltiple con los cuales se puede combinar el anticuerpo anti-IL-21R incluyen interferón-ß (por ejemplo, ???ß-la e ???ß-lb) , copaxona, corticosteroides , inhibidores de IL-1, inhibidores de TNF, anticuerpos contra el ligando de CD40, anticuerpos contra CD80 y antagonistas de IL-12. Los ej emplos no limitantes de agentes para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de Crohn con los cuales se puede combinar un anticuerpo anti-IL-21R incluyen budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina; sulfasalazina; aminosalicilatos ; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol ; inhibidores de lipoxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-1; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; antagonistas de T F que se describen en la presente; IL-4, IL-10, IL-13, y/o TGFP O agonistas de los mismos (por ejemplo, anticuerpos agonistas) ,· IL-ll; profármacos de prednisolona conjugados con glucurónido o dextrano, dexametasona o budesonida; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor 1 del complemento soluble (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas del factor de activación de plaquetas (PAF) ; ciprofloxacina; y lignocaina. En otras modalidades, el anticuerpo anti-IL-21R se puede usar en combinación con al menos un anticuerpo dirigido contra otros blancos involucrados en la regulación de respuestas inmunes, por ejemplo, rechazo de transplantes o enfermedad de injerto contra huésped. Los ejemplos no limitantes de agentes para tratar las respuestas inmunes con los cuales se puede combinar un antagonista de IL-21/IL-21R de la invención incluyen los siguientes : anticuerpos contra moléculas de la superficie celular, incluyendo pero sin limitarse a, CD25 (receptor a de L-2) , CDlla (LFA-1) , CD54 (ICAM-1) , CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) , CD86 (B7-2) o combinaciones de los mismos. En otra modalidad, el anticuerpo anti-IL-21R se usa en combinación con al menos un agente inmunosupresor general, tal como ciclosporina A o FK506.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona por consiguiente con kits para llevar a cabo la administración combinada de anticuerpos anti-IL-21R con otros agentes terapéuticos. En una modalidad, el kit comprende al menos un anticuerpo anti-IL-2lR formulado en un vehículo farmacéutico y al menos un agente terapéutico, formulado según corresponda en una o más preparaciones farmacéuticas separadas . Usos de diagnóstico Los anticuerpos acordes con esta invención también se pueden usar para detectar la presencia de IL-21R en muestras biológicas. La correlación de la presencia o nivel de estas proteínas con una afección clínica, le permite al experto en la técnica diagnosticar la afección clínica asociada. Por ejemplo, las células T estimuladas incrementan la expresión de IL-21R y una concentración inusualmente alta de células T que expresan IL-21R en las articulaciones es indicativa de inflamación de las articulaciones y una posible artritis . Las afecciones clínicas ilustrativas que pueden ser diagnosticadas con los anticuerpos de esta invención incluyen esclerosis múltiple, artritis reumatoide y rechazo de transplantes . Los métodos de detección basados en anticuerpos son bien conocidos en la técnica e incluyen ELISA, radioinmunoensayos , inmunotransferencías, transferencias Western, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y otras técnicas relacionadas . Los anticuerpos se pueden proporcionar en un kit de diagnóstico que ha incorporado al menos uno de estos procedimientos para detectar IL-21R. El kit puede contener otros componentes, envases, instrucciones u otro material para ayudar en la detección de la proteína y el uso del kit . Los anticuerpos pueden ser modificados con marcadores detectables, incluyendo grupos de ligandos (por ejemplo, biotina) , fluoróforos y cromóforos, radioisótopos, reactivos ricos en electrones o enzimas. Las enzimas son detectadas por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano picante se detecta por su capacidad para convertir la tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros miembros de unión adecuados incluyen biotina y avidina, IgG y proteína A, y otros pares de receptor-ligando conocidos en la técnica. Los anticuerpos también se pueden ligar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otros) con al menos una entidad molecular adicional, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o multiespecífico) , toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros. Otros cambios y posibilidades serán evidentes para el experto en la técnica y se consideran equivalentes dentro del alcance de esta invención.

Composiciones farmacéuticas y métodos de administración Determinadas modalidades de la invención incluyen composiciones que comprenden los anticuerpos descritos . Las composiciones pueden ser adecuadas para su uso farmacéutico y administración a pacientes. Las composiciones comprenden un anticuerpo de la presente invención y un excipiente farmacéutico. Tal como se utiliza en la presente, un "excipiente farmacéutico" incluye solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y que demoran la absorción, etc . , que son compatibles con una administración farmacéutica. El uso de estos agentes como sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionan funciones terapéuticas suplementarias, adicionales o mejoradas. Las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir en un recipiente, envase o aplicador junto con las instrucciones de administración. La composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con la ruta de administración pretendida. Los métodos para realizar esta administración son conocidos por los expertos en la técnica. También es posible crear composiciones que pueden ser administradas por vía tópica u oral, o que pueden tener la capacidad de atravesar las membranas mucosas. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, . intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, subcutánea o transdérmica. Las soluciones o suspensiones utilizadas para una aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente al menos uno de los siguientes componentes : un diluyente estéril, tal como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol u otro solvente sintético; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tal como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminatetracético (EDTA) ; soluciones amortiguadoras tal como acetato, citrato, o fosfato,- y agentes de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases . Las preparaciones se pueden incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis. Las soluciones o suspensiones usadas para una administración intravenosa incluyen un vehículo, tal como salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF. Parsippany, NJ) , etanol o poliol . En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para facilitar su uso con jeringas. A menudo se puede lograr una fluidez apropiada usando lecitina o agentes tensioactivos . La composición también debe ser estable bajos las condiciones de elaboración y almacenamiento. La prevención de microorganismos se puede lograr con agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. En muchos casos, se pueden incluir agentes isotónicos (azúcar) , polialcoholes (manitol y sorbitol) o cloruro de sodio en la composición. Es posible lograr una absorción prolongada de la composición con la adición de un agente que demore la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o vehículo comestible. La composición se puede incluir en gelatina o comprimir en tabletas . Para una administración oral, los anticuerpos se pueden incluir en excipientes y se pueden introducir en tabletas, comprimidos o cápsulas. Se pueden incluir agentes aglutinantes o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles en la composición. Las tabletas, comprimidos y cápsulas pueden contener (1) un aglutinante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; (2) un excipiente, tal como almidón o lactosa, (3) un agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; (4) un lubricante, tal como estearato de magnesio; (5) un agente deslizante, tal como dióxido de silicona coloidal; o (6) un agente edulcorante o un agente saborizante. Las composiciones también pueden ser administradas por la ruta transmucosa o transdérmica. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una porción Fe pueden cruzar las membranas de la mucosa en intestino, boca o pulmones (a través de los receptores Fe) . La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de grageas, atomizadores nasales, inhaladores o supositorios. La administración transdérmica también se puede lograr con el uso de una composición que contiene ungüentos, pomadas, geles o cremas conocidos en la técnica. Para una administración transmucosa o transdérmica, se usan penetradores apropiados para la barrera a permearse. Para una administración por inhalación, los anticuerpos se administran en un aerosol desde un contenedor o aplicador presurizado, que contiene un propelente (por ejemplo, líquido o gaseoso) o un nebulizador. En determinadas modalidades, los anticuerpos de esta invención se preparan con vehículos para proteger a los anticuerpos contra una eliminación rápida del cuerpo. Frecuentemente se usan polímeros biodegradables (por ejemplo, vinilacetato de etileno, polianhídridos , ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico) . Los métodos de preparación de las formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden utilizar también suspensiones liposómicas como vehículos aceptables para uso farmacéutico. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con métodos establecidos conocidos en la técnica (Patente Norteamericana No. 4,522,811).

Los anticuerpos o las composiciones de anticuerpo de la invención se administran en las cantidades aceptables para uso terapéutico descritas. Las cantidades eficaces para uso terapéutico pueden variar con la edad, condición, sexo y severidad de la afección clínica del sujeto. La dosificación apropiada será determinada por el médico basado en las indicaciones clínicas. Los anticuerpos o las composiciones se pueden administrar como una dosis en bolo para maximizar los niveles en circulación de los anticuerpos por el mayor tiempo posible. También se puede usar una infusión continua después de la dosis en bolo. Tal como se utiliza en la presente, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Los sujetos pueden incluir un paciente humano que padece un trastorno caracterizado por células que expresan IL-21R, por ejemplo, una célula cancerosa o una célula inmune. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, tal como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Los ejemplos de intervalos de dosificación que se pueden administrar a un sujeto se pueden seleccionar entre: 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 1 mg/kg, 10 µg/kg a 100 µg/kg, 100 µg a 1 mg/kg, 500 µ /kg a 1 mg/kg.

Puede ser ventajoso formular composiciones en una forma de una dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la misma. Una forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para el paciente. Cada unidad de dosificación contiene una cantidad predeterminada de anticuerpo calculado para producir un efecto terapéutico asociado con el vehículo. La unidad de dosificación depende de las características de los anticuerpos y del efecto terapéutico particular que se desea lograr . La toxicidad y eficacia terapéutica de la composición pueden ser determinadas utilizando procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal del 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) . La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos constituye el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LDSo/ED50. Los anticuerpos que presentan índices terapéuticos altos pueden ser. menos tóxicos y/o más eficaces desde un punto de vista terapéutico. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo de células y de los estudios con animales se pueden utilizar para formular el intervalo de dosificación en humanos. La dosificación de estos compuestos puede estar dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo circulantes en la sangre, que incluye una ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la composición de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración elegida. Para cualquier anticuerpo usado en la presente invención, es posible estimar inicialmente la dosis eficaz para uso terapéutico usando ensayos de cultivo de células . Se puede formular una dosis en los modelos de animales para obtener el intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración de anticuerpo que permite lograr una inhibición medio máxima de los síntomas) . Los efectos de cualquier dosificación particular pueden ser monitoreados con un bioensayo adecuado. Los ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en transcripción, ensayos de unión con IL-21R/IL-21 y otros ensayos inmunológicos . Los siguientes ejemplos no limitan en modo alguno el alcance de la invención. El experto en la técnica comprenderá que se pueden realizar numerosas modificaciones y variaciones sin alterar el espíritu o alcance de la presente invención. Las modificaciones y variaciones están comprendidas dentro del alcance de la invención. Los contenidos completos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas en toda esta solicitud se incorporan en este documento a modo de referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1: Selección de scFv anti-IL-21 de MÜF y MUII Se utilizó la biblioteca de ScFv de fagémidos, que es una versión ampliada de la biblioteca 1.38xl010 descrita por Vaughan y otros ((1996) Nature Biotech. , 14: 309-314), para seleccionar los anticuerpos específicos de IL-21R humanas . Se recubrieron pozos de placas para microtitulación con una proteína de fusión soluble IL-21R o una proteína de fusión control (5-20 µg/ml en solución amortiguadora salina de fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) ) y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Los pozos se lavaron con PBS, luego se bloquearon durante una hora a 37 °C en MPBS (3% de leche en polvo en PBS) . Los fagos purificados (1012unidades de transducción) , bloqueados durante 1 hora en MPBS se agregaron a los pozos recubiertos con las proteínas de fusión de control y se incubaron durante 1 hora. Los fagos no unidos fueron transferidos después a los pozos con proteínas de fusión IL-21R y se incubaron durante una hora. Los pozos se lavaron 5 veces con PBST (Tween 20 0.1% v/v en PBS), luego 5 veces con PBS . Se eluyó el fago unido y se usó para infectar la cepa TG1 de E coli en fase de crecimiento exponencial. Las células infectadas se cultivaron en un caldo 2TY por 1 hora a 37°C, luego se esparcieron en placas 2TYAG y se incubaron durante toda la noche a 30°C. Al día siguiente, las colonias fueron transferidas a 10 mi de caldo 2TY con glicerol 15% y se almacenaron a una temperatura de —70°C. Más adelante, se descongelaron las colonias de esta primera ronda de selección y luego fueron superxnfectadas con un fago auxiliar para rescatar (generar) fagos que expresan scFv de anticuerpos para una segunda ronda de selección. Ejemplo 2: Selección de los scFv R18 y 19F5 anti-IL-21R Se aisló el scFv anti-IL21R (R18) usando proteína de fusión humana IL-21R biotinilada (bio.hlL21R) (Wyeth, Giralda Farms, NJ) 200 nM en solución. El fago scFv purificado (1012 tu) fue bloqueado con MPBS y la proteína de fusión de control 125 µg/ml, según como se describe en el Ejemplo 1 anterior. Se agregó la proteína de fusión IL21R biotinilada al fago bloqueado hasta una concentración final de 200 nM y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Este fago/antígeno se agregó a 75 µ? de esferas magnéticas de estreptavidina Dynal M280 (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY) que habían sido bloqueadas durante 90 minutos a temperatura ambiente en 1 mi de MPBS 3%. La mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las esferas fueron capturadas utilizando un soporte magnético y se lavó 5 veces en 1 mi de PBST seguido de tres lavados en PBS . Los fagos unidos se diluyeron con 500 µ? de tripsina 10 µg/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 0.2 , pH 7.0 y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. El fago diluido se utilizó para infectar 10 mi de células TG-1 de E. coli en fase de crecimiento exponencial como se describió previamente. Los clones ScFv se aislaron después de tres rondas de selección. La producción de ScFv fue inducida por adición de IPTG 1 m a los cultivos que crecían exponencialmente y se incubó todo durante toda la noche a 30°C. Se seleccionaron los extractos crudos periplasmáticos que contenían scFv (Griffiths et al. (1993) EMBO J. , 12: 725-734) por su capacidad para inhibir la unión de la proteína de fusión humana IL-21R con la proteína IL21-FLAG humana marcada. Brevemente, el anti-cuerpo anti-FLAG se inmovilizó sobre plástico y se utilizó para capturar la proteína FLAG IL-21 humana marcada. La unión de la proteína de fusión IL-21R humana se detectó con un anticuerpo marcado con Europio contra la proteína de fusión IL-21R, y se detectó la fluorescencia de resolución temporal con el kit del reactivo DELFIA (PerkinElmer, Boston, MA) . El clon scFv R18 purificado exhibió un valor de IC50 de 770 nM por inhibición de la unión de la proteína de fusión IL-21R con la proteína marcada IL-21-FLAG. El clon 19F5 anti-IL21R se aisló con el método de selección como el utilizado para R18, excepto que se utilizó proteína de fusión humana IL-21R 50 nM en la tercera ronda de selección. Ejemplo 3: Selección de los scFv 18A5 y 18G4 anti-IL-21R Los scFv 18A5 y 18G4, anti-IL2IR fueron aislados por selección con lineas de células que expresaban IL-21R y proteínas de fusión IL-21R en solución. Las células transíectadas hBaf3Mu-l ( yeth, Giralda Farms, NJ) que expresan el IL-21 R humano sobre la superficie celular se cultivaron utilizando métodos de cultivo tisular estándar. El fago scFv purificado (1012 tu) se bloqueó con IxlO8 células Baf3 no transfectadas durante una hora a temperatura ambiente en MPBS. El fago bloqueado se agregó a IxlO7 células hBaf3Mu-l, que se habían preincubado en MPBS durante 1 hora. Esto fue seguido por la incubación durante una hora a temperatura ambiente con mezcla. Las células hBaf3Mu-l se lavaron después 6 veces en PBST. El fago unido específicamente se eluyó de las células usando tripsina 10 µg/ml en solución amortiguadora de fosfato de sodio 0.2 M, pH 7.0, y se incubó a 37°C durante 30 minutos con agitación. El sobrenadante con el fago eluído se usó para infectar células TG-1 de E. coli como se describió previamente. Los fagos que expresan ScFv para la segunda ronda de selección se produjeron como se describió previamente. El fago se bloqueó con MPBS y proteína de fusión control 125 µg/ml. La selección se llevó a cabo en solución con la proteína de fusión IL-21R biotinilada humana (Wyeth) utilizando el método de selección descrito para R18, excepto que las esferas se lavaron 5 veces en 1 mi de MPBS / Tween 20 0.1% (v/v) seguido de tres lavados en PBS. Las partículas de fagos que expresaban el anticuerpo ScFv fueron sometidas a otra selección usando un método de selección que empleaba células hBaf3Mu-l, como se describió previamente . Ejemplo 4: Selección del scFv CP5G2 anti-IL-21R El clon CP5G2 se aisló por selección con IL-21R murino marcado con hexahistidxna y una marca de afinidad Flag (hIL21R.His.Flag) (Wyeth, Giralda Farms, NJ) . El fago scFv purificado (1012 tu) fue bloqueado con MPBS más 30 µ? de esferas de agarosa anti-Flag durante 1 hora a temperatura ambiente. Se agregó hIL-21R.His . Flag, a una concentración final de MPBS de 25 nM, al fago bloqueado y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de biblioteca/antígeno se agregó luego a 100 µ? de esferas de agarosa anti-Flag que se habían bloqueado en MPBS durante 2 horas a temperatura ambiente, lavado 3 veces en PBS e incubado durante otros 30 minutos con mezclado. Las esferas se lavaron 4 veces con PBST, seguido de 4 veces con PBS y el fago se eluyó de las esferas con tripsina 0.5 µg/ml en Tris 50 mM, pH 8.0, CaCl2 1 mM, como se describió previamente.

Las esferas se recolectaron usando centrifugación. El fago eluído se usó para infectar 10 mi de células TG-1 de E. coli, como se describió previamente. Se llevó a cabo una segunda ronda de selección soluble, también como se describió previamente. Las colonias se distribuyeron en placas de 96 pozos que contenían 100 µ? de 2TYAG. Los extractos periplasmáticos crudos que contenían el scFv se obtuvieron como se describió previamente, excepto que la solución amortiguadora que se usó fue sacarosa 20% (p/v) , Tris-HCI 50 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM. Los extractos crudos que contenían scFv fueron examinados por su capacidad para inhibir la unión de IL-21 biotinilada de murino 16 ng/ml (bio.mlL21) a la proteína IL-21R de murino inmovilizada sobre plástico en una placa para microtitulación de 96 pozos de ensayo. La unión de la bio.mlL2l se detectó con estreptavidina marcada con Europio y TRF se detectó usando el kit del reactivo DELFIA (PerkinElmer, Boston, MA) . El scFv CP5G2 purificado exhibió un valor de IC50 de 590 nM en el ensayo anterior de inhibición de la unión de IL-21 a IL-21R. Ejemplo 5: Identificación de fagos con clones de scFv's de ÜF y MU11 Para establecer la especificidad de los scFv' s por IL-21R, se llevó a cabo un ELISA en fagos contra la proteína de fusión IL-21R. Se transfirieron colonias individuales de células TG1 de la segunda selección a pozos de microtitulación que contenían 100 µ? de medio 2TYAG. Se agregó el fago auxiliar M13K07 (10 mol) al cultivo de TG1 en crecimiento exponencial y las muestras fueron incubadas por una hora a 37°C. Las placas se centrifugaron y se retiró el sobrenadante, luego se suspendieron las pelotillas remanentes en 100 µ? de 2TYAG y se incubaron durante toda la noche a 30°C con agitación. Al día siguiente, las placas fueron centrifugadas y el sobrenadante de fagos fue transferido a nuevas pozos de placas para microtitulación. El fago fue bloqueado en MPBS antes del ELISA. Los pozos de las placas para microtitulación fueron recubiertas con proteína de fusión IL-21R o proteína de fusión de control (0.5-2.5 µg/ml) y luego se incubaron durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente, se retiró la solución de proteínas de fusión y los pozos se bloquearon por una hora en MPBS. Los pozos se lavaron con PBS, luego se agregaron 50 µ? de fago bloqueado. Las placas se incubaron durante una hora; luego se lavaron 3 veces con PBST y tres veces con PBS. Se agregó un conjugado de anti-M13-HRP (Pharmacia, Peapack, NJ) a los pozos, y las muestras fueron incubadas durante una hora. Los pozos se lavaron 3 veces con PBST y tres veces con PBS. Se agregó TMB a los pozos, y las muestras fueron incubadas hasta que se desarrolló color. La reacción se detuvo con 25 µ? de H2SO¾ 0.5 M. La señal, de color se midió por lectura de la. absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas para microtitulación. Dos clones de fagos mostraron una unión específica de la proteína de fusión IL-21R y no de la proteína de fusión control, y en esta solicitud, estos clones se conocen como clones de fagos MUF y clones de fagos MUll. Se esparcieron colonias individuales TG-1 que contenían los clones de fagos MUF y MUll sobre placas 2TYAG y se incubaron durante toda la noche a 30°C. Las regiones VH y VL del fago fueron amplificadas por PCR utilizando oligos específicos del vector pCANTAB6 y secuenciadas . Las búsquedas en bases de datos revelan que la región VL del clon del fago MUF se había originado de la cadena lambda y la región VL del clon del fago MUll se había originado de la cadena kappa. Ejemplo 6: Conversión de scFv a IgG Se amplificaron las regiones VH y VL de los clones de fagos MUF y MUll por PCR utilizando cebadores específicos del clon. Los productos de la PCR fueron digeridos con enzimas de restricción y subclonados en vectores apropiados (véase el Ejemplo 2) que contenían el dominio constante de la cadena pesada de la IgGi humana (Takahashi et al. (1982) Cell 29, 671) o el dominio constante de la cadena liviana lambda humano o el dominio constante de cadena liviana kappa humano (Hieter et al. (1982) Nature 294:536) . Las cuatro construcciones codifican polipéptidos denominados en esta solicitud como cadena pesada MUF, cadena liviana MUF, cadena pesada MU11 y cadena liviana MU11. Se prepararon vectores que contenían la cadena pesada MUF, la cadena liviana MUF, la cadena pesada MU11 y la cadena liviana MU11, se secuenciaron y se utilizaron para transfectar células HEK293 o CHO utilizando técnicas estándares . Las células que expresan las cadenas pesadas y livianas MUF produjeron anticuerpos MUF denominados "MUF" en esta solicitud y las células que expresan las cadenas pesadas y livianas MU11 produjeron anticuerpos MU11, denominados "MUll" en esta solicitud. Se purificaron los anticuerpos secretados utilizando proteina A Sepharose (Pharmacia) , luego se dializaron con PBS . Se determinó la especificidad de unión de los anticuerpos de la siguiente manera: se recubrieron placas para ELISA durante la noche con la proteína de fusión IL-21R 2.5 µg/ml. Las placas se lavaron con PBSB (PBS + albúmina de suero bovino 1%) , luego se incubaron con concentraciones variables de MUF o MU11 durante dos horas a 25°C. Las placas se lavaron, luego se agregó una cantidad saturante de anticuerpo antihumano de cabra con HRP conjugado. Las placas se incubaron durante una hora a 25°C, luego se lavaron con PBSB y finalmente se revelaron utilizando TMB. Un ejemplo de los resultados obtenidos con el ELISA se muestra en la Figura 1A.

La especificidad de unión de los anticuerpos fue confirmada además por coloración de la superficie celular. Las células TF-1 transducidas con IL-21R humana fueron sometidas a pruebas de unión con MUF o MU11 (1 mg/ml) purificado o biotinilado. Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos, se lavaron con PBSB, luego se suspendieron en una solución que contenía el anticuerpo anti-humano IgG conjugado con PE o avidina conjugada con PE. Las células se incubaron sobre hielo durante 30 minutos, se lavaron, luego se analizaron con un FACScan. Los resultados se muestran en la Figura 13. De manera similar se marcaron células B de ratón purificadas con MUF, y los resultados se muestran en la Figura 1C. Ejemplo 7: MUF Bloquea la unión de 1L-21 a IL-21R Se llevaron a cabo ensayos de inhibición para evaluar la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de IL-21 a IL-21R. El ELISA se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 3 con las siguientes modificaciones. Luego de la incubación con MUF o MU11 durante 2 horas a 25 °C se agregó IL-21 conjugada con biotina (1 µ?/ml) , y las muestras se incubaron por una hora a 25°C. Después del lavado, se agregó una cantidad saturante de avidina-HRP y las muestras se incubaron durante hora más a 25 °C. Los pozos se lavaron con PBSB y las muestras se revelaron utilizando TMB. Los resultados se muestran en la Figura 2. Bajo estas condiciones, MUF bloqueó la unión de IL-21 a IL-21R, en tanto MU11 no lo hizo. Estos datos sugieren que MUF y Müll reconocen diferentes epítopes de IL-21R. Ejemplo 8: MÜF y Müll reducen las respuestas de las células T Se llevaron a cabo ensayos de proliferación para evaluar la capacidad de los anticuerpos para bloquear la proliferación de células T mediada por IL-21. Se estimularon células T CD4+ humanas (5 x 104 células/pozo) con PHA (fitohemaglutinina) e IL-21 humana. Se agregó IL-21 en un medio de cultivo de células COS (COS CM) a diferentes muestras a concentraciones variables. En las muestras indicadas, se agregó MUF, MU11 o isotipos de IgGi control humanos. Después de 72 horas, se agregó 3H-timidina y se midió la proliferación celular por la radioactividad incorporada utilizando un contador de centelleo liquido LKB 1205. Como se muestra en la Figura 3A, la IL-21 incrementó la proliferación de células T estimuladas con PHA. La adición de MUF, bloqueó la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación en un intervalo que varia entre aproximadamente 1:500 y 1:10,000. El bloqueo de MUF se contrarrestó con dosis altas de IL-21. La adición de MU11 o isotipo de anticuerpo control no afectó significativamente la proliferación aumentada por IL-21 de células T humanas.

En la Figura 3B, se estimuló una línea de células T CD4+ específica de PLP de ratón con el péptido PLP (1 y células de bazo de ratón SJL. La IL-21 en medio de cultivo de células COS (COS IL-21) fue titulada como se muestra sobre el eje X. "Cos falso" es un medio de cultivo COS sin IL-21. En las muestras indicadas, se agregó MU11 (1 µg ml) . Después de 72 horas, se agregó 3H-timidina y se midió la proliferación por la radioactividad incorporada. Como se muestra en la Figura 3B, la IL-21 incrementó la proliferación de células T de ratón estimuladas . La adición de MU11 bloqueó la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de células T CD4+ de ratón. Estos datos sugieren que MU11 actúa como un inhibidor no competitivo: bloquea la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación aún cuando no bloquea la unión de IL-21 al receptor . En la Figura 3C, se estimularon células T CD8+ de ratón purificadas con esferas de tosilo (Dynal, Great Neck, Y) recubiertos con anticuerpo anti-CD3. Se tituló IL-21 en medio de cultivo de células COS (COS s/n) como se indica en el eje X. La muestra indicada como "sin anticuerpo" se utilizó como un control. En las muestras indicadas, se agregó U11 a la concentración indicada. Después de 72 horas, se agregó 3H-timidina y se midió la proliferación por la radioactividad incorporada. Como se muestra en la Figura 3C, la adición de MUll bloqueó, en una forma dependiente de la dosis, la capacidad de IL-21 para incrementar la proliferación de células T CD8+. Ejemplo 9: Inhibición de la proliferación de células por scFv e IgGs Los anticuerpos de la invención fueron examinados en un ensayo basado en células por su antagonismo contra IL-21R. En un experimento de este tipo, se aislaron numerosos clones de fagos scFv como se explicó en los Ejemplos 1-3, que luego fueron evaluados en un ensayo basado en células por su potencia para inhibir la proliferación celular debido al bloqueo de la unión de IL-21 a IL-21 . Se utilizó una suspensión de células hBaf3Mu-l que expresaban IL21R humano en un ensayo de este tipo. Las células hBaf3Mu-l (Wyeth) se lavaron para eliminar todo rastro de IL-3 murina del medio de crecimiento y luego se incubaron durante 2 horas en medio de crecimiento RPMI Glutamax con suero fetal bovino 10% sin IL-3 a 37°C en un incubador con C02 5%. Se agregaron aproximadamente entre 10,000 y 20,000 células Baf3Mu-l a cada pozo de la placa de cultivo de 96 pozos y luego se incubaron con scFv o IgG durante 30 minutos a 37°C. A continuación, se agregó IL-21 (Wyeth, Giralda Farms , NJ) a una concentración de 5 ng/ml y los pozos se incubaron durante 24 horas . Las células recibieron después pulsos con 3H timidina 0.1 mCi/pozo toda la noche a 37°C y luego se cosecharon para medir la incorporación de timidina como una indicación de la proliferación de células. En un protocolo alternativo, se agregó IL-21 a la concentración de 0.3 ng/ml y las células fueron incubadas durante 48 horas. Las células se calentaron hasta alcanzar temperatura ambiente y se agregó cellTiter-Glo (Promega, I) 15 ml/pozo. Después de mezclar y sobre un periodo de incubación de 10 minutos, se midió la luminiscencia sobre un contador Wallac MicroBeta 1450 TriLux (PerkinElme , Boston, MA) como una indicación de la proliferación o viabilidad celular. Se puede determinar el valor de IC50 (es decir, la concentración de anticuerpo necesaria para un 50% de competencia) para cada scFv graficando una medida de la proliferación celular, por ejemplo, la incorporación de timidina, contra la concentración log de IL-21. Típicamente, cuanto más baja sea IC50, mejor será la afinidad que tiene un anticuerpo por IL-21R. En un experimento, ilustrado en la FIG. 4, UF inhibió la respuesta celular a IL-21 con una CI50 de 268 nM como scFv y de 3nM como IgG. Posteriormente, se comparó el valor de la CIS0 de otros clones de scFv con los de MUF, como se resume en la siguiente Tabla 4.

Tabla 4: Valores de CI50 de diversos scFv Ejemplo 10: Adaptación de MUF a la "linea germinal" Se utilizaron los datos de la secuencia de los clones scFv para identificar aquella secuencia más próxima a la "linea germinal" correspondiente a la cadena liviana y pesada del clon MUF utilizando VBASE. Las mutaciones se realizaron utilizando las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio estándar con cebadores mutagénicos apropiados. La mutación de las secuencias scFv se confirmó por análisis de la secuencia. Las secuencias del dominio scFv y VH y VL adaptadas a la linea germinal para MUF se muestran en las SEQ ID NO: 85, 83 y 84, respectivamente. La secuencia del scFv MUF adaptada a la linea germinal se evaluó luego por su capacidad para bloquear la proliferación de lineas de células hBaf3Mu-l inducidas con IL-21 en el ensayo descrito aquí. No existe una diferencia significativa en la potencia de MUF adaptada a la línea germinal para bloquear la proliferación de células Baf3Mu-l cuando se efectuó una comparación con scFv MUF no adaptado a la línea germinal. Ejemplo 11: Ensayo de competencia por el epítope Los clones scFv 18A5, 19F5 y 18G4 fueron examinados además en un ensayo de competencia por el epítope con el objeto de determinar si se unen al mismo epítope o a un epítope diferente que MUF. Los extractos que contienen ScFv se prepararon como se describió previamente para los distintos clones . La solución amortiguadora final utilizada era MOPS 50 mM, pH 7.4, EDTA 0.5 mM, sorbitol 0.5 M. Los extractos periplasmáticos crudos que contenían scFv fueron seleccionados por su capacidad para inhibir la unión de la proteína de fusión humana IL-21R biotinilada (bio.hIL21R) con la proteína MuF IgG inmovilizada sobre plástico en un ensayo con placas para microtitulación de 96 pozos. La unión de bio.hIL21R se detectó con estreptavidina marcada con Europio y se detectó TRF utilizando el kit del reactivo DELFIA (PerkinElmer) . Los clones positivos se utilizaron en el ensayo de competencia por el epítope que se describe en la presente . Los valores de CI50 obtenidos para los diversos clones en el ensayo de competencia por el epítope están resumidos en la Tabla 5.

Tabla 5: Ensayo de competencia por el epitope Ejemplo 12 : Tratamiento de la artritis Se utilizó IL-21 para estudiar sus efectos sobre células de la membrana sinovial, la membrana que une las articulaciones. Se aislaron sinoviocitos tipo fibroblastos humanos (HFLS, por sus siglas en inglés) (Cell Applications (San Diego, CA) ) de los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide sometidos a cirugía de las articulaciones. Las células HFLS se cultivaron con IL-21 humano durante 48 horas y luego se retiraron los sobrenadantes y evaluados por ELISA con las quimioquinas MCP-1 (proteína de quimioatracción de monocitos o CCLll) , GRO (oncogen regulado por el crecimiento o ligando 1 CXC) , 1-309 (CCLl) , TARC (quimioquina regulada por activación y por el timo), Eotaxina, MDC (quimioquina derivada de macrófagos o CCL22) , LYMPH (linfotactina o XCL1) , SDF-1B (factor IB derivado del estroma o ligando 12 CXC) , IP-10 (ligando 10 CXC) , I-TAC (quimioquina que atrae células T o ligando 11 CXC) , MG (monoquina inducida por interferón o ligando 9 CXC) , MP3B (proteína inhibidora de macrófagos) y las citoquinas IF -OÍ, TNF-a, IL-6 e IL-8. Estas quimioquinas y citoquinas son conocidas en la técnica por promover la inflamación a través de diversas de actividades, y las concentraciones incrementadas en las articulaciones provocadas por IL-21 exacerban la inflamación y RA. Tal como se muestra en las Figuras 5A-5D, la IL-21 incrementó repetidamente la secreción por HFLS de las quimioquinas MCP-1, GRO, 1-309, TARC, Eotaxina, MDC, LYMPH, SDF-1B, IP-10, I-TAC, MG, MP3B y las citoquinas IFN-a, TNF-a, IL-6 e IL-8. La IL-21 se utilizó para regular la progresión clínica de CIA (artritis inducida por colágeno) . La CIA es el modelo estándar en rata y ratón para estudiar la artritis reumatoide, véase, por ejemplo, Holmdahl et al., (2002) Ageing Res. Rev., 1:135. El día 0, los ratones recibieron inyecciones con 100 µg de colágeno tipo II en adyuvante completo de Freund y el día 21, los ratones recibieron tratamiento con 100 µg de colágeno tipo II en adyuvante incompleto de Freund. El día 21, los ratones recibieron asimismo inyecciones con 1 µg de IL-21 y cada día los ratones eran examinados por la presencia de la enfermedad. Los signos clínicos fueron clasificados como sigue: 0 = sin hinchazón, 1 = 1 a 2 dedos hinchados o tobillo hinchado, 2 = más de dos dígitos hinchados o hinchazón leve en la pata, 3 = gran hinchazón en la pata, y 4 = anquilosis de la pata. Como , se muestra en la Figura 5E, los ratones que recibieron inyecciones con PBS luego de las inyecciones de colágeno desarrollaron progresivamente la enfermedad. Los ratones inyectados con IL-21 luego de las inyecciones de colágeno desarrollaron la enfermedad más severamente. Debido a que el tratamiento con IL- 21 exacerba específicamente la CIA, se espera que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprima o demore la CIA. Así, debido a que el modelo predice eficacia en el tratamiento de RA, se espera asimismo que el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprima o demore la RA en humanos. Ejemplo 13: Tratamiento de rechazo de transplantes El rechazo de un transplante es el fenómeno inmunológico en el cual los tej idos de un donante son específicamente "atacados" por las células inmunes del huésped. Un ensayo para estudiar el rechazo a transplantes in vitro es la reacción mixta de linfocitos (MLR, por sus siglas en inglés) . En el ensayo MLR, las células 'donantes" y "huésped" se mezclan in vitro, y las células hospederas se activan y proliferan. Entre el día 3 y 5, se agregó 3H- timidina y se mide la proliferación por la radioactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido.

En la Figura 6, se suspendieron células de bazo de ratones C57BLJ6J (500,000) y células de bazo de ratones BDF1 irradiados (500,000) en 200 µ? de medio de cultivo en pozos de una placa para microtitulación. En tres pozos por duplicado se agregaron suplementos de diferentes cantidades de IL-21 de ratón. El día 4, se agregó 3H-timidina y el día 5 se midió la radioactividad incorporada utilizando un contador de centelleo líquido LKB 1205. Las muestras "0" y "falso" indican cultivos sin IL-21. En ausencia de IL21, células C57BL/6J proliferaron moderadamente (~6000 rads) . En presencia de IL-21, las células C57BL/6J proliferaron más fuertemente (~28, 000-38, 000 rads). El tratamiento con IL-21 aumenta la proliferación de células C57BL/6J (las células "huésped" o células alorreactivas) , lo cual sugiere que IL-21 interviene en la MLR. Por ello, cabe esperar que la adición o el tratamiento con anticuerpos anti-IL-21R suprima o demore la MLR y el rechazo a transplantes y enfermedades relacionadas (por ejemplo, la enfermedad de injerto contra huésped) . La especificación se comprenderá más exhaustivamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la misma, la totalidad de las cuales se incorpora a modo de referencia en la presente. Las modalidades de la especificación ilustran las modalidades de la invención y no se deben considerar como una limitación del alcance de la invención. Los expertos en la materia reconocen que la invención reivindicada comprende muchas otras modalidades y que se pretende que la especificación y los ejemplos solamente se consideren a manera de ejemplo, siendo que el verdadero espíritu y alcance de la invención estarán indicados por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Anticuerpo aislado, caracterizado porgue comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 19, 20, 21, 47, 48, 49, 65, 66, 67, 83, 84, 85, 101, 102, 103, 119, 120, 121, 137, 138 y 139, donde el anticuerpo se une selectivamente a un receptor de IL-21.

2. Anticuerpo aislado, caracterizado porque es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95% idéntica a una de las secuencias de nucleótidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 28, 29, 30, 56, 57, 58, 74, 75, 76, 92, 93, 94, 110, 111, 112, 128, 129, 130, 146, 147 y 148, donde el anticuerpo se une selectivamente al receptor de IL-21.

3. Anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende un dominio VH que presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 19, 47, 65, 83, 101, 119 y 137, y un dominio VL que presenta una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 2, 20, 48, 66, 84, 102, 120 y 138, donde el anticuerpo se une selectivamente al receptor de IL-21.

4. Anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende un dominio VH que comprende una o más CDRs seleccionadas entre las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 22, 23, 24; 50, 51, 52, 68, 69, 70, 86, 87, 88, 104, 105, 106, 122, 123, 124, 140, 141, 142 y sustituciones de aminoácidos conservativos del mismo, donde el anticuerpo se une selectivamente al receptor de IL-21.

5. Anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende un dominio VL que presenta una o más CDRs seleccionadas entre las SEQ ID NO: 7,8, 9, 25, 26, 27, 53, 54, 55, 71, 72, 73, 89, 90, 91, 107, 108, 109, 125, 126, 127, 143, 144, 145 y sustituciones de aminoácidos conservadoras del mismo, donde el anticuerpo se une selectivamente al receptor de IL-21.

6. Anticuerpo aislado, caracterizado porque compite con un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 19, 20, 21, 47, 48, 49, 65, 66, 67, 83, 84, 85, 101, 102, 103, 119, 120, 121, 137, 138 y 139, para la unión a un receptor de IL-21.

7. Anticuerpo aislado, caracterizado porque se une al mismo epítope sobre un receptor de IL-21 que un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 19, 20, 21, 47, 48, 49, 65, 66, 67, 83, 84, 85, 101, 102, 103, 119, 120, 121, 137, 138 y 139.

8. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 6 7, caracterizado porque el anticuerpo se une selectivamente a una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95% idéntica a la secuencia que comprende al menos 100 aminoácidos contiguos indicados en la SEQ ID NO: 43.

9. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7, caracterizado porque el anticuerpo se une selectivamente al deminio extracelular del receptor humano de IL-21.

10. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unión de IL-21 al receptor IL-21.

11. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7, caracterizado porque el anticuerpo es humano.

12. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 Ó 7, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo IgGi.

13. Anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo es IgOa o Ig¾.

14. Anticuerpo aislado, caracterizado porque es expresado por una célula hospedera que presenta una Designación de Deposito ATCC No. PTA5030 o PTA-5031.

15. Composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7.

16. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7.

17. Vector de expresión, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16.

18. Célula hospedera, caracterizada porque es transformada con el vector de conformidad con la reivindicación 17.

19. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula hospedera es una bacteria, una célula de mamíferos, una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de insecto.

20. Célula hospedera, caracterizada porque su Numero de Designación de Depósito en ATCC es PTA-5030 o PTA-5031.

21. Método para producir un anticuerpo que se une a un receptor de IL21, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20 bajo condiciones que permitan expresar el anticuerpo y aislar el mismo del cultivo celular.

22. Método para generar un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno que se une selectivamente a un receptor de IL-21, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable que incluye un CDR 1, 2 ó 3 que puede ser reemplazado o que no contiene una región codificadora de CDR1, 2 ó 3; (b) combinar el repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una de las secuencias de aminoácidos sustancialmente como la descrita en las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 68, 69 , 70, 71, 72, 73, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 140, 141, 142, 143, 144 Ó 145, de modo tal que el ácido nucleico donante se inserta en la región CDR1, 2 ó 3 en el repertorio, con lo cual se obtiene un repertorio de productos de ácidos nucleicos que codifican un dominio variable; (c) expresar los ácidos nucleicos del repertorio de productos; (d) seleccionar un fragmento de unión al antígeno específico para el receptor IL-21; y (e) recuperar el fragmento de unión al antígeno o el ácido nucleico que codifica el fragmento de unión al antígeno .

23. Anticuerpo, caracterizado porgue es producido por el método de conformidad con la reivindicación 22.

24. Método de la reivindicación 22, caracterizado porque además comprende la etapa de adaptación a la línea germinal .

25. Método para regular una respuesta inmune, caracterizado porque comprende poner una célula en contacto con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 23, con lo cual se regula la respuesta inmune.

26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la célula es un leucocito o una célula sinovial.

27. Método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el leucocito es una célula T, una célula B, una célula NK o un macrófago.

28. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la respuesta inmune comprende proliferación celular, actividad citolítica, secreción de citoquina o secreción de quimioquina.

29. Método de tratamiento o prevención de un trastorno inmune asociado a células en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7 ó 23, en una cantidad suficiente para inhibir o reducir la actividad de células inmunes en el sujeto, con lo cual se trata o previene el trastorno.

30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el trastorno inmune asociado a células se selecciona entre esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritomatoso sistémico, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriática, espondilitis anquilosante, rechazo a transplantes, enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y enfermedad de Crohn.

31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el trastorno inmune asociado a células se selecciona entre artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn y psoriasis.

32. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque además comprende administrar al sujeto otro agente terapéutico seleccionado entre un inhibidor de citoquina, un inhibidor del factor de crecimiento, un inmunodepresor, un agente anti-inflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor de enzimas, un agente citotóxico y un agente citostático.

33. Método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente terapéutico se selecciona entre un antagonista de TNF, un antagonista de IL-12, un antagonista de IL-15, un antagonista de IL-17, un antagonista de IL-18, un antagonista de IL-22, un agente supresor de células T, un agente supresor de células B, metotrexato, leflunomida, rapamicina o un análogo del mismo, un inhibidor de Cox-2, un inhibidor de cPLA2, un NSAID y un inhibidor de p38.

34. Método de tratamiento o prevención de un trastorno hiperproliferativo en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 23, en una cantidad suficiente para inhibir o reducir la hiperproliferación de IL-21 y/o de las células que responden al receptor de IL-21 en el sujeto y permitir que el anticuerpo trate o prevenga el trastorno.

35. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

36. Método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el sujeto es un ser humano.

37. Método de conformidad con la reivindicación 29, 30 ó 33, caracterizado porque el anticuerpo se administra en un intervalo seleccionado entre 1 µg/kg a 20 mg/kg, 1 µg/kg a 10 mg/kg, 1 g/kg a 1 mg/kg, 10 g/kg a 1 mg/kg, 10 g/kg a 100 µg/kg, 100 µg/kg a 1 mg/kg y 500 µg/kg a 1 mg/kg.

38. Kit de diagnóstico, caracterizado porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación