ES2949342T3 - Receptores de células T y usos de los mismos - Google Patents

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Christian Ellinger
Carina Wehner
Manon Weis
Susanne Wilde
Dolores Schendel
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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología. Específicamente, la invención proporciona receptores de células T (TCR) específicos de antígeno. Además, la invención abarca polinucleótidos que codifican los mismos y vectores que comprenden dichos polinucleótidos. También se proporcionan células huésped que comprenden las moléculas de la invención. Además, la invención proporciona medios y métodos para el diagnóstico y la terapia, en particular del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de células T y usos de los mismos
Antecedentes
Los linfocitos T (o células T) que forman parte del sistema inmunitario celular desempeñan un papel principal en la erradicación de patógenos. Las células T se desarrollan en el timo y expresan moléculas receptoras de células T en su superficie que permite el reconocimiento de péptidos presentados en moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se expresan en las células nucleadas (presentación de antígenos). Los antígenos de patógenos, es decir, antígenos exógenos presentados por moléculas de MHC provocarán una respuesta de células T poderosa, mientras los antígenos propios habitualmente no producen una respuesta de células T debido a la selección negativa de células T específicas de antígenos propios en el timo durante el desarrollo de tales células T El sistema inmunitario puede así discriminar entre células nucleadas que presentan antígenos exógenos o antígenos propios y específicamente dirigirse a y erradicar las células infectadas a través de mecanismos de liberación de citoquinas potentes y citotoxicidad celular de las células T
La potencia del sistema inmunitario se ha reconocido como una herramienta prometedora para futuras terapias contra el cáncer. En la última década, la investigación ha empezado a explotar las propiedades únicas de las células T usando transferencia de células adoptiva (ACT), que implica la administración de linfocitos derivados de un donante, expandidos ex vivo. La ACT es un concepto atractivo para el tratamiento de cáncer porque no requiere inmunocompetencia de los pacientes, y la especificidad de los linfocitos transferidos se puede dirigir contra antígenos tumorales no mutados y por tanto poco inmunogénicos que típicamente no pueden desencadenar de forma eficaz respuestas de células T autólogas. Aunque se ha mostrado que la ACT es un tratamiento prometedor para varios tipos de cáncer, su aplicación amplia como tratamiento clínico ha estado obstaculizado por la necesidad de aislamiento personalizado y caracterización de células T específicas de tumor de cada paciente -un proceso que puede ser no solo difícil y largo, sino también con frecuencia falla en producir células T de alta avidez (Xue et al. Clin Exp Immunol. Feb 2005; 139(2): 167-172; Schmitt et al., Hum Gene Ther. Nov 2009; 20(11): 1240-1248. El documento WO01/52614 y Kessler et al. 2001, J. Exp. Med., Volume 193, Número 1, 73-88 describen la identificación de cuatro epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) presentados en HLA-A*0201 en el antígeno tumoral PRAME por análisis de digestión mediada por proteasoma y la lisis de líneas celulares de melanoma, carcinoma de células renales, carcinoma de pulmón, y carcinoma mamario que expresan PRAME y HLA-A*0201 por clones de CTL inducidos contra los cuatro epítopos de PRAME identificados.
La transferencia genética de receptores de células T específicos de antígenos tumorales (TCR) en células T primarias puede superar algunas de las limitaciones actuales de la ACT, ya que permite la generación rápida de linfocitos T reactivos con tumor con especificidad de antígeno definida incluso en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, la identificación de clones de células T adecuados que portan TCR que reconocen específicamente antígenos tumorales y muestran los efectos antitumorales deseados in vivo todavía es el tema de investigación en marcha. Considerando que en 2012 se produjeron aproximadamente 14,1 millones de nuevos casos de cáncer globalmente y que el cáncer actualmente es la causa de aproximadamente el 14,6% de todas las muestras humanas mundiales, se necesitan urgentemente opciones de tratamiento novedosas y eficaces. Es el objeto de la presente invención cumplir con las necesidades expuestas anteriormente.
Compendio
La presente invención proporciona receptores de células T específicos de PRAME, así como ácidos nucleicos, vectores, células huésped que comprenden los mismos; métodos de obtener dichos receptores de células T, composiciones farmacéuticas o diagnósticas que comprenden dichos receptores de células T, ácidos nucleicos, vectores y/o células huésped, y métodos para detectar la presencia de un cáncer en un sujeto como se define en las reivindicaciones.
En un primer aspecto, la invención se refiere a un receptor de células T (TCR) específico de PRAME que comprende una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR, que comprende:
(i) una región variable de la cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y
(ii) una región variable de la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16,
dicho TCR es capaz de unirse al epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos de VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) o su forma unida a MHC.
Los TCR proporcionados en el presente documento son capaces de unirse a un epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos de VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) o su forma unida a MHC. La secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente corresponde a las posiciones de aminoácidos 100 a 108 de PRAME (antígeno preferentemente expresado en melanoma) que se piensa es expresado por una multitud de diferentes cánceres.
Los TCR, según la invención comprenden (i) una región variable de la cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y (ii) una región variable de la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16 como se define en las reivindicaciones. En particular, se prevé que los TCR de la presente invención comprendan (iii) una región variable de la cadena alfa de TCR que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y (iv) una región variable de la cadena beta de TCR que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16. Los TCR de la invención comprenden una región constante en la cadena alfa de TCR y beta de TCR.
En particular, los TCR proporcionados en el presente documento pueden comprender (i) una cadena alfa de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 7, 9, 11 o 13; y (ii) una cadena beta de TCR que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 8, 10, 12 o 14.
Los TCR pueden tener una variedad de formas, por ejemplo, el TCR puede ser un TCR nativo, una variante de TCR, un fragmento de TCR, o una construcción de TCR. Heterodímeros y multímeros que comprenden cadenas alfa y beta de TCR covalentemente unidas entre sí se prevén en el presente documento, así como construcciones de TCR que comprenden uno o más componentes de fusión. Por tanto, el TCR de la invención puede ser un TCR nativo, o una construcción de TCR, que preferiblemente comprende al menos una cadena(s) alfa de TCR y al menos una cadena(s) beta de TCR covalentemente unidas entre sí para formar heterodímeros o multímeros de TCR. Se prevé particularmente que el TCR de la invención además comprenda uno o más componente(s) de fusión opcionalmente seleccionados de receptores de Fc; dominios Fc, incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM; citoquinas, incluyendo IL-2 o IL-15; toxinas, anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, incluyendo anticuerpos anti-CD3, anti-CD28, anti-CD5, anti-CD16 o anti-CD56 o fragmentos de unión a antígenos de los mismos; dominio CD247 (CD3-zeta), CD28, CD137, CD134, o combinaciones de los mismos, opcionalmente que además comprende al menos un enlazador. Una construcción de TCR útil comprende por ejemplo (i) al menos una cadena alfa de TCR del TCR de la invención, (ii) al menos una cadena beta de TCR del t Cr de la invención, (iii) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que se dirige contra un antígeno o epítopo en la superficie de linfocitos; en donde la(s) cadena(s) alfa del TCR y la(s) cadena(s) beta del TCR están unidas entre sí y fusionadas, opcionalmente a través de un enlazador, a dicho anticuerpo o scFv, en donde dicho antígeno preferiblemente se selecciona de CD3, CD28, CD5, CD16 o CD56.
Otras fracciones útiles que pueden estar covalentemente unidas a los TCR inventivos comprenden varios marcadores. Los TCR de la invención también se pueden proporcionar en forma soluble.
Además, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica cualquiera de los TCR de la invención, dicho ácido nucleico, por ejemplo, comprende o consiste en la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.
Se proporciona además en el presente documento un vector que comprende el ácido nucleico según la invención. Los vectores ejemplares incluyen vectores víricos, por ejemplo, vectores lentíviricos o gamma-retrovíricos.
También se proporcionan en el presente documento células huésped que comprenden el TCR, el ácido nucleico, o el vector de la invención. Las células huésped útiles incluyen linfocitos tal como linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD8+, células T CD4+, células citolíticas naturales (NK), células T citolíticas naturales (NKT), células T gamma/delta.
Además, la invención proporciona un método para obtener el TCR de la invención, que comprende
(i) incubar una célula huésped según las reivindicaciones 9 o 10 en condiciones que producen expresión de dicho TCR;
(ii) purificar dicho TCR.
También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende el TCR, el ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped de la invención, y, opcionalmente, excipiente(s) farmacéutico(s). También se prevé el TCR, ácido nucleico, vector y/o célula huésped inventivos para uso en un método de detección, diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de cáncer. Una manera útil de prevenir o tratar cáncer incluye las siguientes etapas: (a) proporcionar uno o más del TCR, ácido nucleico, vector, célula huésped y/o composición farmacéutica divulgados en el presente documento; y (b) administrar uno o más de los anteriormente mencionados a un sujeto en necesidad de ello. También se divulga lo siguiente: (a) proporcionar una muestra de un sujeto, dicha muestra comprende linfocitos; (b) proporcionar uno o más del TCR, ácido nucleico, vector, célula huésped y/o composición farmacéutica divulgados en el presente documento, y (c) introducir el mismo en los linfocitos obtenidos en la etapa (a) y, mediante ello, obtener linfocitos modificados, (d) administrar los linfocitos modificados de la etapa (c) a un sujeto o paciente en necesidad de ello.
La invención se refiere además a un método in vitro de detectar la presencia de un cáncer en un sujeto in vitro, que comprende: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto y que comprende una o más células con (i) el TCR de la invención, (ii) el ácido nucleico de la invención, y/o (iii) la composición farmacéutica de la invención, formando de esta manera un complejo, y (b) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia del cáncer en el sujeto.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra una perspectiva general esquemática del enfoque de sensibilización usando células dendríticas maduras. Se usaron células dendríticas maduras transfectadas con PRAME para inducir de novo células T CD8 específicas de PRAME en el repertorio del donante sano autólogo.
La figura 2 muestra el análisis de secreción de citoquinas multiplex (IFN-gamma, IL-2, TNF-alfa, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4, IL-1beta) del clon de células T específico de PRAME100-108 T4.8-1-29 cocultivado con células T2 cargadas con péptido (PRAME100-108 “péptido VLD” o PRAME300-309 “péptido ALY” como control negativo, n.d. = no detectado). T4.8-1-29 se caracteriza por tener una CDR3 de su región variable de la cadena alfa de TCR como se muestra en SEQ ID NO: 1 y/o por tener una CDR3 de su región variable de la cadena beta de TCR como se muestra en SEQ ID NO: 2.
La figura 3 muestra la liberación de IFN-gamma del clon de células T específico de PRAME100-108 T4.8-1-29 cocultivado con varias líneas celulares tumorales humanas que expresan HLA-A*02:01, en donde, como se indica en la leyenda de la figura 3, algunas de las líneas celulares tumorales expresan PRAME (barras verdes). Las líneas celulares tumorales que no expresan PRAME sirven como control negativo (barras rojas). Control positivo: células T2 cargadas con “péptido VLD” (barra negra), el fondo de las células T sin estimulación se indica por barras blancas (“n.d. = no detectado”).
La figura 4 muestra la liberación de IFN-gamma del clon de células T específico de PRAME100-108 T4.8-1-29 cocultivado con células T2 cargadas con cantidades tituladas de péptido PRAME100-108. La línea discontinua indica la concentración de péptido que produce secreción de IFN-gamma semimáxima entre 10"9-1ü"10 mol/l [M] como una medida para la avidez funcional del clon de células T ensayado.
Figura 5. Para demostrar el emparejamiento y funcionalidad del TCR transgénico, la liberación específica de IFN-gamma de células T CD8+ receptoras transfectadas con el TCR específico de PRAME100-108 T4.8-1-29 (clon de células T receptor ARNitv T4.8-1-29) en cocultivo con células T2 cargadas con el péptido PRAME100-108 (VLD) o células T2 cargadas con péptido irrelevante se midió por ELISA estándar.
La figura 6 muestra la liberación de IFN-gamma específica de CMSP enriquecidas en CD8+ específicas para PRAME100-108 manipuladas para expresar el TCR específico de PRAME100-108 T4.8-1-29 en cocultivo con células T2 cargadas con péptidos propios (en total 131 péptidos propios ubicuos que se unen a moléculas codificadas por HLA-A*02:01) medido usando ELISA estándar.
La figura 7 muestra la lisis de células T2 cargadas con péptido PRAME100-108 (“péptido VLD”) o péptido irrelevante SLLQHLIGL (“péptido SLL”) por CMSP enriquecidas en CD8+ manipuladas para expresar el TCR específico de PRAME100-108 T4.8-1-29.
La figura 8 muestra la lisis de células diana que expresan PRAME100-108 por CMSP humanas que expresan el TCR específico de PRAME100-108 T4.8-1-29. (A) lisis de células tumorales K562 humanas positivas para PRAME endógenamente, transfectadas con HLA-A*02:01, además cargadas con péptido PRAME100-108 (“péptido VLD”). (B) las células K562 humanas negativas para HLA-A*02, positivas para PRAME endógenamente, además transfectadas con ARNitv que codifica PRAME como control negativo no se lisan. (C) muestra la lisis de células K562 humanas positivas para PRAME endógenamente, transfectadas con HLA-A*02 además transfectadas con ARNitv que codifica PRAME. (D) muestra la lisis de células K562 humanas positivas para PRAME endógenamente, transfectadas con HLA-A*02.
La figura 9 muestra las secuencias de aminoácidos de un ejemplo útil de una cadena alfa y beta de receptor de células T (SEQ ID NO 11 y 12) y las secuencias de aminoácidos de PRAME humano (SEQ ID No . 33). En la cadena alfa y beta, las secuencias CDR1 y CDR2 están subrayadas, las secuencias CDR3 están en gris y negrita, las regiones variables en tipografía regular, la región constante en cursiva.
La figura 10 muestra el reconocimiento de diferentes líneas celulares tumorales positivas para HLA-A*02 y PRAME por CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan el TCR T4.8.1-29HLA-A*02 como se indica por la liberación de IFN-gamma inducida por activación y medida por ELISA estándar.
La figura 11 muestra CMSP no transducidas de un donante sano y las mismas CMSP del donante sano transducidas con un plásmido que contiene la construcción de TCT T4.8.1-29 descrita en el presente documento.
La figura 12 muestra la avidez de células T funcionales por el péptido PRAME100-108 (VLD) medido por detección de secreción de IFN-gamma después de cocultivar el clon de células T T4.8-1-29 (curva discontinua) o CMSP efectoras transducidas con T4.8-1-29 (curva continua) con células T2 cargadas con péptido.
La figura 13 muestra el análisis de especificidad de antígeno de CMSP efectoras transducidas con T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir. Las líneas celulares tumorales OPM-2 y U937 (negativas para HLA-A2 y positivas para PRAME) se ensayaron sin modificar, o transfectadas con ARNifv que codifica HLA-A2.
La figura 14 muestra el análisis de especificidad de antígeno, CMSP efectoras transducidas con T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir se cocultivaron con diferentes líneas celulares diana. Las líneas celulares tumorales K562 (negativa para HLA-A2 y positiva para PRAME) se ensayaron, así como K562_A2 y Mel 624.38 (positiva para HLA-A y positiva para PRAME) y 647-V (positiva para HLA-A2 y negativa para PRAME).
La figura 15 muestra el análisis de actividad citotóxica de efectores transducidos con T4.8-1-29 contra células tumorales usando IncuCyte ZOOM®-Sistema de análisis de células vivas (Essenbiosciences), un sistema basado en microscopio que permite la imagenología en directo de células.
La figura 16 muestra el análisis del perfil de seguridad de CMSP que expresan T4.8-1-29.
Descripción detallada
Los presentes inventores han identificado clones de células T que son capaces de reconocer específicamente células que expresan el antígeno asociado a tumores (TAA) PRAME; y que muestran funciones efectoras ventajosas tal como producción de citoquinas y citólisis de células diana. Dichos clones de células T y sus receptores de células T son, por tanto, herramientas prometedoras para tratamiento de cáncer muy específico y eficaz. Los TCR específicos de PRAME identificados son, por tanto, adecuados para terapia de células T adoptiva de cáncer. La identificación de un TCR que es capaz de unirse a PRAME de una manera muy específica permite así “armar” células T ex vivo y reintroducirlas en el donante donde pueden reconocer de forma eficaz y eliminar específicamente células cancerosas que expresan PRAME. Además, las regiones de unión a antígeno del TCR novedoso proporcionado en el presente documento se puede usar para diseñar construcciones solubles que comprenden fracciones funcionales adicionales (tal como fármacos, marcadores o dominios de unión adicionales que atraen otras células inmunitarias) que están fácilmente disponibles para administración directa.
Región variable
Dominios CDR3
La presente divulgación se refiere a un receptor de células T (TCR) que comprende (i) una CDR3 de la cadena alfa de receptor de células T que comprende o consiste en la secuencia de CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1) y/o (ii) una CDR3 de la cadena beta de receptor de células T que comprende o consiste en la secuencia de CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO. 2)
Se describen además en el presente documento variantes de secuencia de TCR que comprenden una CDR3 alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 1 y/o CDR3beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 2; siempre que el t Cr retenga las capacidades ventajosas del TCR evaluado en los ejemplos adjuntos, es decir, sea capaz de unirse a la diana antigénica especificada en el presente documento.
El término “receptor de células T” o “TCR” como se usa en el presente documento incluye TCR nativos, así como variantes, fragmentos y construcciones de TCR. El término, por tanto, incluye heterodímeros que comprenden cadenas alfa y beta de TCR, así como multímeros y construcciones de monocatenarias; que opcionalmente comprenden dominios y/o fracciones adicionales.
En su forma nativa, el TCR existe como un complejo de varias proteínas en la superficie de células T. El receptor de células T está compuesto de dos cadenas proteicas (separadas), que se producen de los genes independientes alfa y beta del receptor de células T (TCR a y t Cr p) y se llaman cadenas alfa (a) y beta (p). Cada cadena del TCR posee un dominio/región variable (V) de tipo inmunoglobulina (Ig) N-terminal, un dominio/región de tipo Ig constante (C), una región transmembrana/que atraviesa la membrana celular que ancla la cadena en la membrana plasmática, y una corta cola citoplásmica en el extremo C-terminal.
La especificidad de antígeno está conferida por las regiones variables de la cadena alfa y beta. Ambos dominios variables de la cadena alfa y cadena beta del TCR comprenden tres regiones hipervariables o determinantes de complementariedad (CDR1alfa/beta, CDR2alfa/beta y CDR3alfa/beta) rodeadas por regiones marco (FR). CDR3 es el principal determinante de reconocimiento de antígeno y especificidad (es decir, la capacidad de reconocer e interaccionar con un antígeno específico), mientras CDR1 y CDR2 principalmente interaccionan con la molécula de MHC que presenta el péptido antigénico.
Los TCR nativos reconocen péptidos antigénicos unidos a (“presentados/mostrados en”) moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en la superficie de una célula presentadora de antígenos. Un péptido antigénico presentado en una molécula de MHC también se denomina un “complejo péptido:MHC” en el presente documento. Hay dos clases diferentes de moléculas de MHC: MHC I y m Hc II, que presentan péptidos de diferentes compartimentos celulares. Las moléculas de MHC de clase I se expresan en la superficie de todas las células nucleadas en todo el cuerpo humano y presentan péptidos o fragmentos de proteínas de compartimentos intracelulares a células T citotóxicas. En seres humanos, el MHC también se llama el antígeno de leucocitos humano (HLA). Hay tres tipos principales de MHC de clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C. Una vez un TCR se une a su complejo péptido:MHC específico, la célula T se activa y ejerce funciones efectoras biológicas.
Los TCR proporcionados en el presente documento son ventajosamente capaces de reconocer (específicamente) PRAME, en particular PRAME100-108 en su forma unida a MHC como se discutirá posteriormente en detalle. Se dice que un péptido antigénico está presente en su “forma unida a MHC” cuando forma un complejo con una molécula de MHC (que puede estar presente en la superficie de una célula presentadora de antígenos tal como una célula dendrítica o una célula tumoral, o puede estar inmovilizada, por ejemplo, recubriendo una perla o placa).
Dominios CDR1 y CDR2
Como se ha expuesto previamente, se prevé particularmente que los TCR de la invención reconozcan su diana antigénica PRAME100-108 cuando está presentada en una molécula de MHC, específicamente una molécula de MHC-I, y en particular HLA-A, preferiblemente HLA-A*02 y específicamente moléculas HLA-A2 codificadas por el alelo HLA-A*20:01 (se dice que la célula T o TCR está “restringido” a una molécula de MHC particular). También es concebible que los TCR de la invención reconozcan su diana antigénica presentada en otros alelos de HLA-A*02. Como se ha indicado previamente, se piensa que CDR1 y CDR2 de las cadenas alfa y beta del TCR están principalmente implicadas en el reconocimiento de MHC. Hay un “conjunto” limitado de secuencias CDR1 y CDR2 que se sabe están implicadas en el reconocimiento de antígeno restringido a HLA-A*02. Está entre la presente divulgación que los dominios CDR3 descritos en el presente documento pueden en principio combinarse con cualquiera de los dominio CDR1 y CDR2 representados en SEQ ID NO: 34-224, siempre que el TCR retenga su capacidad de reconocer su diana antigénica, preferiblemente su forma unida a HLA-A*02, a un nivel similar, igual o incluso mayor que el TCR evaluado en los ejemplos adjuntos. Los ejemplos útiles de dominios CDR1 y CDR2 incluyen el CDR1 alfa que comprende o consiste en la secuencia VSGLRG como se representa en la SEQ ID NO: 5, el CDR2 alfa que comprende o consiste en la secuencia LYSAGEE como se representa en la SEQ ID NO: 3, el CDR1 beta que comprende o consiste en la secuencia SGDLS como se representa en la SEQ ID NO: 6, y el CDR2 beta que comprende o consiste en la secuencia YYNGEE como se representa en la SEQ ID NO: 4. Dichas secuencias de CDR también se muestran en la figura 9.
Según lo anterior, la presente invención, entre otros, proporciona TCR que comprenden dos cadenas polipeptídicas, es decir una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR, cada una de las cuales comprende una región variable humana que comprende al menos una región determinante de complementariedad (es decir, CDR3, y una CDR1, y CDR2) de un TCR como se define en las reivindicaciones. Un TCR con propiedades ventajosas particulares (como se muestra en los ejemplos adjuntos) comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR1 alfa), una CDR2 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR2 alfa), y una CDR3 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (CDR3 alfa), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 beta), una CDR2 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR2 beta), y una CDR3 que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (CDR3 beta).
Regiones variables completas
La presente invención proporciona un TCR que comprende una región variable de la cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 15 y una región variable de la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 16 como se define en las reivindicaciones. Específicamente, la invención se refiere a un receptor de células T (TCR) específico de PRAME, que comprende una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR, que comprende:
(i) una región variable de la cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y
(ii) una región variable de la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16,
dicho TCR es capaz de unirse al epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos de VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) o su forma unida a MHC.
Dichas secuencias de la cadena alfa y beta también se muestran en la figura 9 (tipografía normal).
Las variantes de secuencia de TCR comprenden regiones variables de la cadena alfa que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 15 y/o una región variable de la cadena beta que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 16 también se divulgan en el presente documento; siempre que el TCR retenga las capacidades ventajosas del TCR evaluado en los ejemplos adjuntos, es decir, sea capaz de unirse a la diana antigénica especificada en el presente documento.
Región constante
El TCR de la invención comprende una región constante (C) en su cadena alfa y beta. La región constante puede ser una región constante humana o derivada de otra especie, produciendo un TCR “quimérico”. Por ejemplo, se pueden sustituir cadenas alfa y/o beta humanas por sus homólogas murinas (“murinización”) que se ha encontrado que aumenta la expresión en superficie de los TCR humanos apoyando el emparejamiento preferente de las cadenas alfa y beta de TCR, y una asociación más estable con el correceptor CD3. Las regiones constantes adecuadas de la cadena alfa se pueden, por ejemplo, seleccionar de SEQ ID NO: 17 (humana), 19 (murinizada mínima) y 21 (murina). Las regiones constantes adecuadas de la cadena beta se pueden seleccionar de SEQ ID NO: 18 (humana), 20 (murinizada mínima) y 22 (murina). En lugar de sustituir regiones constantes humanas completas por sus homólogas murinas, también es posible intercambiar solo algunos aminoácidos en las regiones constantes humanas por los correspondientes aminoácidos de la región constante murina (“murinización mínima”), como se explica adicionalmente en la sección “variantes de secuencia de TCR” en el presente documento.
Cadenas alfa y beta
Los ejemplos útiles de los TCR de la invención incluyen los que comprenden una cadena alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 7, 9, 11 o 13 y una cadena beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 8, 10, 12 o 14. La presente invención, por tanto, proporciona, entre otros, un TCR que comprende o consiste en una cadena alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 7 y una cadena beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 8; un TCR que comprende o consiste en una cadena alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 9 y una cadena beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 10; un TCR que comprende o consiste en una cadena alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 11 y una cadena beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 12 (ambos también mostrados en la figura 9); y un TCR que comprende o consiste en una cadena alfa que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 13 y una cadena beta que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID: 14.
Las variantes de secuencia de TCR que comprenden cadenas alfa que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 7, 9, 11 o 13 y/o una cadena beta de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad, más preferiblemente al menos el 85% de identidad, más preferiblemente el 90% o 95% a SEQ ID NO: 8, 10, 12 o 14 también se divulgan en el presente documento; siempre que el TCR retenga las capacidades ventajosas del TCR evaluado en los ejemplos adjuntos, es decir, sea capaz de unirse a la diana antigénica especificada en el presente documento.
Dianas antigénicas
Los TCR proporcionados en el presente documento son ventajosamente capaces de unirse a PRAME (humano) como se define en las reivindicaciones. PRAME (antígeno de melanoma preferentemente expresado en tumores, No. de acceso de Uniprot P78395), también denominado MAPE (antígeno de melanoma preferentemente expresado en tumores) y OIP4 (proteína 4 que interacciona con OPA), se ha descrito un antígeno de testículo en cáncer (CTA) con función desconocida.
En particular, la presente invención proporciona TCR que son capaces de (específicamente) unirse a un epítopo comprendido en una secuencia de aminoácidos que corresponde a las posiciones de aminoácidos 100-108 de la secuencia de aminoácidos de PRAME representada en SEQ ID NO: 33 (Figura 9) en negrita. El péptido de PRAME que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 32 también se denomina PRAME100-108 o la “diana antigénica” o “péptido VLD” en el presente documento. Como se expone en otro sitio en el presente documento, el TCR de la invención preferiblemente reconocerá PRAME100-108 cuando está unido a MHC, en particular HLA-A*02.
El término “posición” cuando se usa según la divulgación significa la posición de un aminoácido en una secuencia de aminoácidos representada en el presente documento o la posición de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico representada en el presente documento. El término “correspondiente” como se usa en el presente documento también incluye que una posición no solo está determinada por el número de los nucleótidos/aminoácidos precedentes, sino más bien se debe ver en el contexto de la porción circunyacente de la secuencia. Según esto, la posición de un aminoácido o nucleótido determinado según la divulgación puede variar debido a deleción o adición de aminoácidos o nucleótidos en otro lugar en la secuencia. Por tanto, cuando se hace referencia a una posición como una “posición correspondiente” según la divulgación se entiende que los nucleótidos/aminoácidos puede diferenciarse en térmicos del número especificado, pero pueden tener todavía nucleótidos/aminoácidos próximos similares. Con el fin de determinar si un residuo de aminoácidos (o nucleótido) en una secuencia determinada corresponde a una cierta posición en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos/nucleótidos “parental”, el experto en la materia puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos de secuencia, bien manualmente o usando programas informáticos tal como se ejemplifica en el presente documento.
El término “epítopo” en general se refiere a un sitio en un antígeno, típicamente un (poli-) péptido, que reconoce un dominio de unión. El término “dominio de unión” en su sentido más amplio se refiere a un “sitio de unión a antígeno”, es decir, caracteriza un dominio de una molécula que se une/interacciona con un epítopo específico en una diana antigénica. Una diana antigénica puede comprender un único epítopo, pero típicamente comprende al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos dependiendo del tamaño, conformación, y tipo de antígeno. El término “epítopo” en general abarca epítopos lineales y epítopos conformacionales. Los epítopos lineales son epítopos contiguos comprendidos en la secuencia primaria de aminoácidos y típicamente incluyen al menos 2 aminoácidos o más. Los epítopos conformacionales están formados por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento del antígeno diana, y en particular (poli-) péptido diana.
En el contexto de la presente invención el término “dominio de unión” en particular se refiere a la región variable de la cadena alfa y/o beta del TCR y específicamente la CDR3alfa y CDR3beta del TCR.
Los presentes inventores han encontrado que la secuencia de aminoácidos mínima reconocida por los TCR descritos en el presente documento corresponde a la secuencia de aminoácidos X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO. 31), seleccionándose X de cualquier aminoácido. Específicamente, se ha mostrado que los TCR reconocen (específicamente) la secuencia de aminoácidos que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32), como se muestra en los ejemplos adjuntos. Los TCR de la invención son por tanto capaces de unirse al epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos de VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) o su forma unida a MHC. Está dentro de la presente divulgación que el péptido reconocido pueda comprender C aminoácidos adicionales localizados C- y/o N-terminal del motivo de reconocimiento representado en SEQ ID NO: 31 y en particular SEQ ID NO: 32. Específicamente, el TCR descrito en el presente documento reconoce al menos un epítopo en las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas. Los términos “unirse a” y “reconocer” en todas las formas gramaticales se usan de forma intercambiable en el presente documento. Se prevé particularmente que la diana antigénica sea reconocida por el TCR inventivo cuando está unida a una molécula de MHC de clase I, específicamente una molécula HLA-A, y preferiblemente una molécula HLA-A*02, en particular una molécula HLA-A*02:01. Dicha molécula de MHC, en particular molécula HLA-A y HLA-A*02, puede estar presente en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, o en un soporte (sólido).
Preferiblemente, los TCR inventivos se unen específicamente a su diana antigénica. El término “se une especifica(mente)” en general indica que un TCR se une a través de su sitio de unión a antígeno más fácilmente a su diana antigénica pretendida que a un antígeno no diana aleatorio, sin relacionar. Particularmente el término “se une específicamente” indica que la especificidad de unión del TCR será al menos aproximadamente 5 veces, preferiblemente 10 veces, más preferiblemente 25 veces, incluso más preferiblemente 50 veces, y lo más preferiblemente 100 veces o más, mayor para su diana antigénica que su especificidad de unión para un antígeno no diana.
Las células huésped efectoras que expresan un TCR nativo como se describe en el presente documento se prevé que se unan a su diana antigénica (es decir, preferiblemente PRAME100-108 presentado en HLA-A*02 por células presentadoras de antígeno) con una alta avidez funcional. El término “avidez funcional” se refiere a la capacidad de células que expresan TCR (en particular células T que expresan TCR nativos como se describe en el presente documento) para responder in vitro a una concentración determinada de un ligando y se piensa que se correlaciona con la capacidad efectora in vivo de células que expresan TCR. Por definición, las células que expresan TCR con alta avidez funcional responden en ensayos in vitro a dosis de antígeno muy bajas, mientras tales células de menor avidez funcional requieren cantidades mayores de antígeno antes de que monten una respuesta inmunitaria similar a la de células que expresan TCR de alta avidez. Por tanto, la avidez funcional se puede considerar como un determinante cuantitativo del umbral de activación de una célula que expresa TCR. Se determina exponiendo tales células in vitro a diferentes cantidades de antígeno afín. Las células que expresan TCR con alta avidez funcional responden a bajas dosis de antígeno. Por ejemplo, una célula que expresa TCR típicamente se considerará que se une con “alta” avidez funcional a su diana antigénica si secreta al menos aproximadamente 200 μg/ml o más (por ejemplo, 200 μg/ml o más, 300 μg/ml o más, 400 μg/ml o más, 500 μg/ml o más, 600 μg/ml o más, 700 μg/ml o más, 1000 μg/ml o más, 5.000 μg/ml o más, 7.000 μg/ml o más, 10.000 μg/ml o más, o 20.000 μg/ml o más) de interferón gamma (IFN-gamma) tras cocultivo con células diana que expresan HLA-A*02 negativas para antígeno cargadas con cuna baja concentración del péptido PRAME100-108 que varía desde aproximadamente 10-5 hasta aproximadamente 10-11 M (es decir, de aproximadamente 0,05 ng/ml hasta aproximadamente 5 ng/ml, 0,05 ng/ml, 0,1 ng/ml. 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, o 5 ng/ml) con un peso molecular del péptido PRAME100-108 de 956 g/mol.
Otros métodos para determinar la unión específica a los TCR inventivos incluyen el ensayo de liberación de 51Cr descrito por Gertner-Dardenne et al. J Immunol 188(9): 4701-4708, movilización de CD107a/b descrita por Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16: 2333-2343 y análisis de unión de multímeros péptido:MHC descritos por Wilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605.
Variantes
Como se ha indicado previamente, el término “TCR” abarca variantes de TCR, que incluyen variantes de secuencia de TCR, fragmentos y construcciones. Todas las variantes de TCR divulgadas en el presente documento son variantes funcionales del TCR descrito en el presente documento. El término “variante funcional” como se usa en el presente documento se refiere a un TCR, polipéptido, o proteína que tiene identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa a un TCR parental, sus regiones variables o sus regiones de unión a antígeno y comparte su actividad biológica, es decir, su capacidad de unirse específicamente a la diana antigénica para la que el TCR parental de la invención tiene especificidad antigénica a un nivel similar, igual o incluso mayor que el TCR divulgado en el presente documento y evaluado en los ejemplos adjuntos.
Variantes de secuencia
El término “variantes de TCR” incluye “variantes de secuencia” de los TCR divulgados en el presente documento, es decir, variantes que sustancialmente comprenden la secuencia de aminoácidos del TCR inventivo como se ha descrito anteriormente (también denominado el TCR “parental”), pero que contienen al menos una modificación de aminoácido (es decir, una sustitución, deleción, o inserción) en comparación con la secuencia de aminoácidos del TCR “parental”, siempre que la variante preferiblemente retenga la especificidad antigénica del TCR “de patente” inventivo. Las variantes de secuencia de TCR divulgadas en el presente documento típicamente se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en los ácidos nucleicos que codifican el TCR “parental”, o por síntesis de péptidos. En general, las modificaciones de aminoácidos anteriormente mencionadas, se pueden introducir en, o estar presentes en, la región variable o la región constante del TCR, y pueden servir para modular propiedades como potencia y especificidad de unión, procesamiento postraduccional (por ejemplo, glucosilación), estabilidad termodinámica, solubilidad, expresión en superficie o ensamblaje de TCR.
Como se ha expresado anteriormente, las modificaciones de aminoácidos incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos en las secuencias de aminoácidos del TCR parental. Las variantes de inserción ejemplares de un TCR de la invención incluyen productos de fusión de dicho TCR y una enzima u otro polipéptido funcional. Las variantes de sustitución ejemplares de un TCR descrito en el presente documento son las que incluyen sustituciones de aminoácidos en las regiones variables o CDR de la cadena alfa y/o beta, la región marco o la región constante. Las variantes de sustitución de un TCR de la invención son las que incluyen sustituciones de aminoácidos en la región constante. En el presente documento se prevén particularmente sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se conocen en la técnica, e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades físicas y/o químicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido conservadora puede ser en un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, He, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con cadena lateral polar (Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc. que se puede hacer, por ejemplo, en base a similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados.
Modificación de cisteína
Se ha descrito la adición de un enlace disulfuro en la región constante potencia el emparejamiento correcto de las cadenas alfa y beta de TCR (Kuball J et al. Blood. 15 Mar 2007; 109(6):2331-8). Por tanto, la adición de uno o más enlaces de cisteína en la región constante también se prevé en el presente documento.
Murinización
Como se ha indicado previamente, la murinización de los TCR (es decir, intercambio de regiones constantes humanas en la cadena alfa y beta por sus homólogas murinas) es una técnica que se aplica comúnmente con el fin de mejorar la expresión en la superficie celular de los TCR en células huésped. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría específica, se piensa que los TCR murinizados se asocian de forma más eficaz con los correceptores CD3; y/o que preferentemente se emparejan entre sí y son menos propensos a formar TCR mixtos en células T humanas manipuladas ex vivo para expresar los TCR de especificidad antigénica deseada, pero aún retienen y expresan sus TCR “originales”.
Recientemente se han identificado nueve aminoácidos responsables para la expresión mejorada de TCR murinizados (Sommermeyer y Uckert, J Immunol. 1 Jun 2010; 184(11):6223-31) y se prevé sustituir uno o todos los residuos de aminoácidos en la región constante de la cadena alfa y/o beta de TCR por sus residuos homólogos murinos. Esta técnica también se denomina “murinización mínima”, y ofrece la ventaja de aumentar la expresión en la superficie celular mientras, al mismo tiempo, reduce el número de residuos de aminoácidos “exógenos” en la secuencia de aminoácidos y, por tanto, el riesgo de inmunogenicidad.
En general, las variantes de secuencia de TCR divulgadas en el presente documento comprenden al menos una de las CDR1, CDR2, CDR3, regiones variables de la cadena alfa, regiones variables de la cadena beta, cadenas alfa y/o cadenas beta como se divulga en el presente documento, o comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o idéntica a las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, siempre que dichas variantes muestren características de unión comprables, iguales o mejoradas en comparación con el TCR evaluado en los ejemplos adjuntos. Las variantes de secuencia de TCR de la invención comprenden al menos una de la cadena alfa y la cadena beta definidas en las reivindicaciones.
Como se usa en el presente documento el término “identidad de secuencia” indica el nivel al que dos secuencias (de nucleótidos o aminoácidos) tienen residuos idénticos en las mismas posiciones en un alineamiento, y con frecuencia se expresa como un porcentaje. Preferiblemente, la identidad se determina sobre la longitud entera de las secuencias que se comparan. Por tanto, dos copias de exactamente la misma secuencia tienen el 100% de identidad, pero secuencias que están menos conservadas y tienen deleciones, adiciones o sustituciones, pueden tener un menor grado de identidad. Los expertos en la materia reconocerán que están disponibles varios algoritmos para determinar la identidad de secuencia usando parámetros estándar, por ejemplo, Blast (Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402), Blast2 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Smith-Waterman (Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) y ClustalW.
Según esto, las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 2 pueden, por ejemplo, servir como “secuencia sujeto” o “secuencia de referencia”, mientras las secuencias de aminoácidos de una CDR3 diferente de las mismas puede servir como una “secuencia problema”.
Construcciones y fragmentos
El término “TCR” como se usa en el presente documento además comprende construcciones de TCR. El término “construcción” cuando se usa en el contexto de la presente divulgación incluye proteínas o polipéptidos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno de los TCR inventivos, pero no comparten necesariamente la estructura básica de un TCR nativo (es decir, dominios variables incorporados en una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR formando un heterodímero). Las construcciones y fragmentos de TCR típicamente se obtienen por métodos de rutina de ingeniería genética y con frecuencia se construyen artificialmente para comprender dominios de proteína o polipéptido funcionales adicionales. Según lo anterior, se prevé que las construcciones y fragmentos de TCR descritos en el presente documento comprendan al menos una CDR3alfa y/o al menos una CDR3beta como se divulga en otra parte en el presente documento. Se describen además en el presente documento construcciones y fragmentos que comprenden al menos una CDR1alfa, CDR2alfa, CDR1beta, CDR2beta, región variable de la cadena alfa, región variable de la cadena beta, cadena alfa y/o cadena beta, o combinaciones de las mismas, opcionalmente en combinación con dominios o fracciones de proteína adicionales como se ejemplifica en el presente documento. La presente invención prevé además construcciones de TCR que comprenden al menos una cadena alfa y una cadena beta como se define en las reivindicaciones, opcionalmente en combinación con dominios o fracciones proteicas adicionales como se ejemplifica en el presente documento. Las construcciones y fragmentos de TCR son capaces de unirse específicamente a la misma diana antigénica que los TCR inventivos descritos anteriormente y evaluados en los ejemplos adjuntos.
Multímeros
El término “construcción de TCR” cuando se usa en el contexto de la presente invención también abarca heterodímeros y multímeros en los que al menos una región variable de cadena alfa de TCR o cadena alfa de TCR y al menos una región variable de cadena beta de TCR están covalentemente unidas entre sí. En su forma más sencilla una construcción de TCR multivalente según la invención comprende un multímero de dos o tres o cuatro o más TCR de la invención asociados (por ejemplo, unidos covalentemente o de otra manera) entre sí, preferiblemente a través de una molécula enlazadora.
Las moléculas enlazadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, moléculas de unión multivalentes, tal como avidina, estreptavidina, neutravidina y extravidina, cada una de las cuales tiene cuatro sitios de unión para biotina. Por tanto, los TCR biotinilados se pueden formar en multímeros que tienen una pluralidad de sitios de unión de TCR. El número de los TCR en el multímero dependerá de la cantidad de TCR en relación a la cantidad de molécula enlazadora usada para hacer los multímeros, y también de la presencia o ausencia de cualquier otra molécula biotinilada. Los multímeros ejemplares son construcciones de TCR diméricas, triméricas, tetraméricas o pentamétricas o multímeros de orden superior. Los multímeros de la invención también pueden comprender entidades funcionales adicionales tal como marcadores o fármacos o soportes (sólidos).
El término “construcción de TCR” también abarca moléculas de TCR que están unidas a través de un enlazador adecuado a un cuerpo esférico, preferiblemente una perla uniforme, más preferiblemente una perla de poliestireno, lo más preferiblemente una perla de poliestireno biocompatible. Tales construcciones de TCR también pueden estar compuestas de un TCR inventivo y una perla que tiene un colorante fluorescente predefinido incorporado en la perla.
Proteínas de fusión
El término “construcción de TCR” también se refiere a proteínas o polipéptidos de fusión que comprenden al menos una cadena alfa de TCR, región variable de la cadena alfa de TCR o CDR3alfa y/o al menos una cadena beta de TCR, región variable de la cadena beta de TCR o CDR3beta; y además uno o más componente(s) de fusión. Los componentes útiles incluyen receptores de Fc; dominios Fc (derivados de IgA, IgD, IgG, IgE e IgM); citoquinas (tal como IL-2 o IL-15); toxinas; anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos (tal como anticuerpos anti-CD3, anti-CD28, anti-CD5, anti-CD16 o anti-CD56 o fragmentos de unión a antígenos de los mismos); dominios CD247 (CD3-zeta), CD28, CD137, CD134; o cualquier combinación de los mismos.
Los fragmentos de anticuerpo ejemplares que se pueden usar como componentes de fusión incluyen fragmentos de anticuerpos de longitud completa tal como (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, o “r IgG” (“medio anticuerpo”); fragmentos de anticuerpos modificados tal como scFv, di-scFv o bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-cremallera, scFab, Fab2, Fab3, diacuerpos, diacuerpos monocatenarios, diacuerpos en tándem (Tandab), di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, minicuerpos, multicuepros tal como triacuerpos o tetracuerpos, y anticuerpos de dominio único tal como nanocuerpos o anticuerpos de dominio variable único que comprenden solo un dominio variable, que puede ser VhH, Vh o Vl.
Las construcciones de TCR de la invención se pueden fusionar a uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, produciendo construcciones monovalentes, bivalentes y polivalentes/multivalentes y por tanto construcciones monoespecíficas, que específicamente se unen a solo un antígeno diana, así como construcciones biespecíficas y poliespecíficas/multiespecíficas, que específicamente se unen a más de un antígeno diana, por ejemplo, dos, tres o más, mediante distintos sitios de unión a antígeno.
Opcionalmente, se puede introducir un enlazador entre el uno o más dominios o regiones de la construcción de TCR de la invención, es decir, entre la CDR3 de la cadena alfa de TCR, región variable de la cadena alfa de TCR, y/o una cadena alfa de TCR, la CDR3 de la cadena beta de TCR, región variable de la cadena beta de TCR, y/o una cadena beta de TCR, y/o el uno o más componente(s) de fusión descritos en el presente documento. Los enlazadores se conocen en la técnica y se han revisado, en otros, por Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 15 Oct 2013; 65(10): 1357­ 1369. En general, los enlazadores incluyen enlazadores flexibles, cortables y rígidos y se seleccionarán dependiendo del tipo de construcción y uso/aplicación pretendida. Por ejemplo, para aplicación terapéutica, con frecuencia se prefieren enlazadores no inmunógenos, flexibles con el fin de asegurar cierto grado de flexibilidad o interacción entre los dominios mientras se reduce el riesgo de reacciones inmunógenas adversas. Tales enlazadores en general están compuestos de aminoácidos pequeños, no polares (por ejemplo, Gly) o polares (por ejemplo, Ser o Thr) e incluyen enlazadores "GS" que consisten en tramos de residuos de Gly y Ser. Un ejemplo del enlazador flexible más ampliamente usado que también se pretende para uso en la construcción de TCR de la presente invención tiene la secuencia de (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 225) Otros enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 226) y EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 227) y GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 228).
Las construcciones de TCR particularmente útiles previstas según la invención son las que comprenden al menos una cadena alfa de TCR como se define en las reivindicaciones, al menos una cadena beta de TCR como se define en las reivindicaciones, opcionalmente unidas entre sí y fusionadas, opcionalmente a través de un enlazador, a al menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv)) dirigido contra un antígeno o epítopo en la superficie de linfocitos. Las dianas antigénicas útiles reconocidas por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, scFv) incluyen CD3, CD28, CD5, CD16 y CD56. Dicha construcción en general puede tener cualquier estructura siempre que la “porción TCR” (es decir, cadena alfa y beta de TCR o regiones variables o CDR3 de las mismas) retenga su capacidad de reconocer la diana antigénica definida en el presente documento, y la “porción de anticuerpo” se una al antígeno o epítopo de superficie deseado, de esta manera reclutando y dirigiendo el linfocito respectivo a la célula diana. Tales construcciones pueden servir ventajosamente como “adaptadores” que unen una célula presentadora de antígeno que muestra la diana antigénica (tal como una célula tumoral) y un linfocito (tal como una célula T citotóxica o célula NK). Un ejemplo de una proteína de fusión descrita en el presente documento es una construcción manipulada según el principio de un acoplador de células T biespecífico (BiTE®) que consiste en dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) de diferentes anticuerpos, en una única cadena peptídica de aproximadamente 55 kilodalton (kD). Según esto, una construcción TCR descrita en el presente documento puede comprender al menos un dominio de unión a antígeno de TCR como se describe en el presente documento (por ejemplo, una cadena alfa variable y beta variable de TCR fusionadas entre sí) unido a un scFv (u otro dominio de unión) de la especificidad de unión deseada, por ejemplo, CD3 o CD56. El scFv (u otro dominio de unión) se une a células T tal como a través del receptor de CD3 o CD56 para activación de células NK, y el otro a una célula tumoral a través de una diana antigénica específicamente expresada en la célula tumoral. También se describen en el presente documento triacuerpos que comprenden al menos un dominio de unión a antígeno de TCR como se describe en el presente documento, un scFv (u otro dominio de unión) y un dominio adicional, por ejemplo, para dirigir la construcción a un sitio de acción en el cuerpo (por ejemplo, un dominio Fc).
Forma aislada
Los TCR de la invención se pueden proporcionar en forma “aislada” o “sustancialmente pura”. “Aislada” o “sustancialmente pura” cuando se usan en el presente documento significa que los TCR se han identificado separados y/o recuperados de un componente de su medio de producción, de modo que el TCR “aislado” está libre o sustancialmente libre de otros componentes contaminantes de su medio de producción que podrían interferir con su uso terapéutico o diagnóstico. Los componentes contaminantes pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteinaceos o no proteinaceos. Los TCR “aislados” se prepararán, por tanto, mediante al menos una etapa de purificación que elimina o sustancialmente elimina estos componentes contaminantes. La definición anteriormente mencionada es igualmente aplicable a polinucleótidos/ácidos nucleicos “aislados”, mutatis mutandis.
Formas solubles
Los TCR de la invención se pueden proporcionar en forma soluble. Los TCR solubles son útiles como herramientas diagnósticas, y soportes o “adaptadores” que específicamente dirigen agentes terapéuticos o células efectoras a, por ejemplo, una célula cancerosa que expresa la diana antigénica reconocida por el TCR soluble. Los TCR solubles (sTCR) descritos en el presente documento típicamente serán fragmentos o construcciones que comprenden las cadenas alfa y/o beta de TCR, o regiones variables o CDR de las mismas y opcionalmente estabilizadas a través de enlaces disulfuro o unidas covalentemente a través de una molécula enlazadora adecuada, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente en el contexto de las construcciones de TCR de la divulgación. Los t Cr solubles (sTCR) de la invención típicamente serán construcciones que comprenden cadenas alfa y beta de TCR, y opcionalmente estabilizados a través de enlaces disulfuro o unidas covalentemente a través de una molécula enlazadora adecuada, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente en el contexto de las construcciones de TCR de la invención. Típicamente no comprenderán, por ejemplo, una región transmembrana. En algunas circunstancias se pueden introducir modificaciones de aminoácidos en la secuencia polipeptídica con el fin de aumentar la solubilidad de las moléculas y/o corregir el plegamiento y emparejamiento de las cadenas alfa y beta (si se desea), en particular cuando se producen en un huésped recombinante que no proporciona las características anteriormente mencionadas. Por ejemplo, cando se usa E. coli como células huésped de producción, el plegamiento y emparejamiento de las cadenas alfa y beta de TCR típicamente se logra in vitro. Los TCR según la invención pueden, por tanto, por ejemplo, comprender residuos de cisteína adicionales, como se describe en otro sitio en el presente documento.
Además de puentes de cisteína adicionales, otras modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, la adición de cremalleras de leucina y/o secuencias de salto de ribosoma, por ejemplo, la secuencia 2A de picornavirus como se describe en Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): e0119559 para aumentar el plegamiento, la expresión y/o el emparejamiento de las cadenas alfa y/o beta de TCR.
Modificaciones
Los TCR de la invención pueden además comprender una o más modificaciones como se describe a continuación. Las modificaciones descritas a continuación típicamente serán modificaciones covalentes y se pueden lograr usando métodos estándar conocidos en la técnica. En algunas circunstancias, se pueden requerir modificaciones de aminoácidos en los TCR con el fin de facilitar la introducción de dichas modificaciones.
Marcadores
Los TCR, en particular los TCR (solubles), de la invención se pueden marcar. Los marcadores útiles se conocen en la técnica y se pueden acoplar al TCR o variante de TCR usando métodos rutinarios, opcionalmente a través de enlazadores de varias longitudes. El término “marcador” o “grupo marcador” se refiere a cualquier marcador detectable. En general, los marcadores están en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que se van a detectar -los siguientes ejemplos incluyen, pero no están limitados a: marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radioactivos o pesados, tales como radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I); marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas); fracciones redox activas; colorantes ópticos (incluyendo, pero no limitados a, cromóforos, fósforos y fluoróforos) tal como grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos), grupos quimioluminiscentes, y fluoróforos que pueden ser o bien fluoróforos de “molécula pequeña” o fluoróforos proteinaceos; grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano, pgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina; grupos biotinilados; o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina; sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo, etc.). El marcaje se prevé particularmente cuando los TCR, las variantes de TCR o especialmente construcciones de TCR solubles (tal como los que comprenden al menos una cadena alfa de TCR y/o cadena beta de TCR según se describe en el presente documento) se pretenden para uso diagnóstico.
Fracciones funcionales
Los TCR, en particular los TCR solubles, de la invención se pueden modificar uniendo fracciones funcionales adicionales, por ejemplo, para reducir la inmunogenicidad, aumentar el tamaño hidrodinámico (tamaño en solución) solubilidad y/o estabilidad (por ejemplo, por protección aumentada a degradación proteolítica) y/o extender la semivida en suero.
Las fracciones funcionales ejemplares para uso según la invención incluyen péptidos o dominios de proteínas que se unen a otras proteínas en el cuerpo humano (tal como seroalbúmina, la región Fc de la inmunoglobulina o el receptor de Fc neonatal (FcRn), cadenas polipeptídicas de longitud variable (por ejemplo, tecnología XTEN o PASylation®), polímeros no proteinaceos, incluyendo, pero no limitados a, varios polioles tal como polietilenglicol (PEGilación), polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, o de hidratos de carbono, tal como hidroxietil almidón (por ejemplo, HESylation®) o ácido polisiálico (por ejemplo, tecnología PolyXen®).
Otras fracciones funcionales útiles incluyen “ interruptores suicidas” o “de seguridad” que se pueden usar para desconectar las células huésped efectoras que portan un TCR inventivo en el cuerpo de un paciente. Un ejemplo es el “interruptor de seguridad” de caspasa 9 inducible (iCasp9) descrito por Gargett y Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235. Brevemente, las células huésped efectoras se modifican por métodos bien conocidos para expresar un dominio de caspasa 9 cuya dimerización depende de un fármaco dimerizador de molécula pequeña tal como AP1903/CIP, y produce la rápida inducción de apoptosis en las células efectoras modificadas. El sistema, por ejemplo, se describe en el documento EP2173869 (A2). Los ejemplos de otros “interruptores suicidas” o “de seguridad” se conocen en la técnica, por ejemplo, la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), la expresión de CD20 y posterior reducción usando un anticuerpo anti-CD20 o etiquetas myc (Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 15 Ene 2008;105(2):623-8).
Glucosilación
También se prevén en el presente documento los TCR con un patrón de glucosilación alterado. Como se sabe en la técnica, los patrones de glucosilación pueden depender de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glucosilación particulares, discutidos posteriormente) y/o la célula huésped u organismos en que se produce la proteína. La glucosilación de polipéptidos típicamente es N-glucosilación u O-glucosilación. N-glucosilación se refiere a la unión de la fracción glucídica a la cadena lateral de un residuo de asparragina. La adición de sitios de N-glucosilación a la molécula de unión se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más secuencias de tripéptido seleccionadas de asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina (donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Los sitios de O-glucosilación se pueden introducir por la adición de o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida.
Otro medio de glucosilación de los TCR es por acopamiento químico o enzimático de glucósidos a la proteína. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tal como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libre tal como los de serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tal como los de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina.
Similarmente, se puede lograr la desglucosilación (es decir, eliminación de fracciones glucídicas presentes en la molécula de unión) químicamente, por ejemplo, exponiendo los TCR a ácido trifluorometanosulfónico, o enzimáticamente empleando endo- y exo-glucosidasas.
Conjugados a fármacos
También es concebible añadir un fármaco tal como un compuesto de molécula pequeña a los TCR, en particular los TCR solubles, de la invención. La unión se puede lograr a través de enlaces covalentes, o interacciones no covalentes tal como mediante fuerzas electrostáticas. Se pueden emplear varios enlazadores, conocidos en la técnica, con el fin de formar los conjugados con fármacos.
Etiquetas
Los TCR, en particular los TCR solubles, de la invención se pueden modificar para introducir dominios adicionales que ayudan en la identificación, seguimiento, purificación y/o aislamiento de las moléculas respectivas (etiquetas). Los ejemplos no limitantes de tales etiquetas comprenden motivos peptídicos conocidos tal como etiqueta Myc, etiqueta HAT, etiqueta HA, etiqueta TAP, etiqueta GST, dominio de unión a quitina (etiqueta CBD), proteína de unión a maltosa (etiqueta MBP), etiqueta Flag, etiqueta Strep y variantes de las mismas (por ejemplo, etiqueta Strep II), etiqueta His, etiquetas Her2/neu, etiqueta myc, etiqueta FLAG, etiqueta T7, etiqueta hA (hemaglutinina), o etiquetas GFP Las etiquetas de epítopo son ejemplos útiles de etiquetas que se pueden incorporar al TCR de la invención. Las etiquetas de epítopo son tramos cortos de aminoácidos que permiten la unión de un anticuerpo específico y por tanto permiten la identificación y el seguimiento de la unión y el movimiento de los TCR solubles o células huésped en el cuerpo del paciente o células (huésped) cultivadas. La detección de la etiqueta de epítopo, y, por tanto, el TCR etiquetado, se puede lograr usando un número de diferentes técnicas. Los ejemplos de tales técnicas incluyen: inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia (“Western”), y cromatografía de afinidad. Las etiquetas de epítopo pueden, por ejemplo, tener una longitud de 6 a 15 aminoácidos, en particular de 9 a 11 aminoácidos. También es posible incluir más de una etiqueta de epítopo en el TCR de la invención.
Las etiquetas se pueden además emplear para la estimulación y expansión de células huésped que portan un TCR inventivo cultivando las células en presencia de moléculas de unión (anticuerpos) específicas para dicha etiqueta. Ácido nucleico
La presente invención además proporciona ácidos nucleicos que codifican los TCR de la invención. También se describen en el presente documento polinucleótidos que codifican cadenas alfa o beta de TCR, regiones variables de cadenas alfa o beta de TCR, y CDR3alfa y CDR3beta de TCR, así como variantes, construcciones y fragmentos de TCR de la invención.
El término “polinucleótido” o “ácido nucleico” como se usa en el presente documento comprende una secuencia de polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, por ejemplo, ARN o ADN modificado o sin modificar, cada uno en forma monocatenaria y/o bicatenaria lineal o circular, o mezclas de las mismas, incluyendo moléculas híbridas. Los ácidos nucleicos según esta invención comprenden por tanto ADN (tal como ADNbc, ADNmc, ADNc), ARN (tal como ARNbc, ARNmc, ARNm, ARNivt), combinaciones de los mismos o derivados (tal como APN) de los mismos.
Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como el encontrado en ácidos peptidonucleicos (APN)). Los polinucleótidos de la invención también pueden contener una o más bases modificadas, tal como, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tal como inosina. Otras modificaciones, incluyendo modificaciones químicas, enzimáticas o metabólicas, también son concebibles, siempre que una molécula de unión de la invención se pueda expresar del polinucleótido. El polinucleótido se puede proporcionar en forma aislada como se define en otro lugar en el presente documento. Un polinucleótido puede incluir secuencias reguladoras tal como elementos de control de la transcripción (incluyendo promotores, potenciadores, operadores, represores, y señales de terminación de la transcripción), sitio de unión al ribosoma, intrones, o similares.
También se describe en el presente documento un polinucleótido que comprende o consiste en un ácido nucleico que es al menos aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o el 100% idéntico a una secuencia polinucleotídica de referencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30.
Los polinucleótidos descritos anteriormente pueden o no comprender secuencias de nucleótidos adicionales o alteradas que codifican, por ejemplo, residuos de aminoácidos alterados, un péptido señal para dirigir la secreción del TCR codificado, regiones constantes u otros polipéptidos heterólogos como se describe en el presente documento. Tales polinucleótidos pueden por tanto codificar polipéptidos de fusión, fragmentos, variantes y otros derivados de las moléculas de unión descritas en el presente documento.
Además, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas o diagnósticas que comprenden uno o más de los polinucleótidos de la invención. También se describen en el presente documento composiciones que comprenden un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en donde dicho primer polinucleótido codifica una región variable de la cadena alfa de t Cr como se describe en el presente documento y en donde dicho segundo polinucleótido codifica una región variable de la cadena beta de TCR como se describe en el presente documento.
Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden optimizar para codón para la expresión óptima en la célula huésped deseada, por ejemplo, un linfocito humano; o para expresión en células bacterianas, de levadura o insecto que se prevén particularmente para la expresión de los TCR solubles de la invención. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que en general son raros en genes muy expresados de una especie determinada por codones que en general son frecuentes en genes muy expresados de tal especie, tales codones codifican los mismos aminoácidos que los codones que se intercambian. La selección de codones óptimos depende por tanto del uso de codones del genoma huésped y la presencia de varios motivos de secuencia deseables e indeseables.
Vector
En presente documento se proporciona además un vector, que comprende uno o más de los polinucleótidos como se describen en el presente documento. Un “vector” es una molécula de ácido nucleico usada como un vehículo para transferir material genético (exógeno) a una célula huésped donde se puede, por ejemplo, replicar y/o expresar.
El término “vector” abarca, sin limitación plásmidos, vectores víricos (incluyendo vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, vectores de virus vaccinia, vectores de virus del polioma, y vectores de virus adenoasociados (AAV)), fagos, fagémidos cósmidos y cromosomas artificiales (incluyendo BAC y YAC). El vector mismo en general es una secuencia de nucleótidos, comúnmente una secuencia de ADN que comprende un inserto (transgén) y una secuencia más larga que sirve como el “esqueleto” del vector. Los vectores manipulados típicamente comprenden un origen para la replicación autónoma en la célula huésped (si se desea expresión estable del polinucleótido), marcadores de selección, y sitios de corte de enzimas de restricción (por ejemplo, un sitio múltiple de clonación, MCS). El vector puede además comprender promotores, marcadores genéticos, genes indicadores, secuencias de direccionamiento, y/o etiquetas de purificación de proteínas. Como saben los expertos en la materia, un gran número de vectores adecuados son conocidos para los expertos en la materia y muchos están comercialmente disponibles. Se proporcionan ejemplos de vectores adecuados en J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a editaron), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2012) e incluyen
Vectores de direccionamiento
Los vectores de direccionamiento se pueden usar para integrar un polinucleótido en el cromosoma de la célula huésped por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe por J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a editaron), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2012). Brevemente, los medios adecuados incluyen recombinación homóloga o uso de una recombinasa híbrida que específicamente se dirige a secuencias en los sitios de integración. Los vectores de direccionamiento típicamente son circulares y se linealizan antes de usarse para la recombinación homóloga. Como una alternativa, los polinucleótidos exógenos pueden ser fragmentos de ADN unidos por PCR de fusión o fragmentos de ADN sintéticamente construido que después se recombinan en la célula huésped. También es posible usar recombinación heteróloga que produce integración aleatoria no dirigida.
La presente invención también proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención.
Vectores de expresión
El vector de la presente invención también puede ser un vector de expresión. Los “vectores de expresión” o “construcciones de expresión” se pueden usar para la transcripción de secuencias de polinucleótidos heterólogos, por ejemplo, los que codifican los TCR de la invención, y la traducción de su ARNm en una célula huésped adecuada. Este proceso también se denomina “expresión” de los TCR de la invención en el presente documento.
Además de un origen de replicación, marcadores de selección, y sitios de corte de enzimas de restricción, los vectores de expresión típicamente incluyen una o más secuencias reguladoras operativamente unidas al polinucleótido heterólogo que se va a expresar.
El término “secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico necesaria para la expresión de una secuencia codificante operativamente unida de un polinucleótido (heterólogo) en un organismo huésped o célula huésped particular y por tanto incluye secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales. Típicamente, las secuencias reguladoras requeridas para la expresión de secuencias de polinucleótidos heterólogos en procariotas incluyen un promotor(es), opcionalmente secuencia(s) operadora(s), y sitio(s) de unión al ribosoma. En eucariotas, típicamente se requieren promotores, señales de poliadenilación, potenciadores y opcionalmente señales de ayuste. Además, también se pueden introducir señales de iniciación y secretoras específicas en el vector con el fin de permitir la secreción del polipéptido de interés en el medio de cultivo.
Un ácido nucleico está “operativamente unido” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico, en particular en la misma molécula de polinucleótido. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido con una secuencia codificante de un gen heterólogo cuando es capaz de llevar a cabo la expresión de esa secuencia codificante. El promotor típicamente se coloca antes del gen que codifica el polipéptido de interés y regula la expresión de dicho gen.
Las secuencias reguladoras ejemplares para expresión en células huésped de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tal como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como se expresado antes, los vectores de expresión también pueden incluir orígenes de replicación y marcadores seleccionables.
Como se ha mencionado anteriormente, los vectores de la invención pueden además comprender uno o más marcadores de selección. Los marcadores de selección adecuados para uso con células huésped eucariotas incluyen, sin limitación, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (tk), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (hgfrt), y adenina fosforribosiltransferasa (aprt). Otros genes incluyen dhfr (resistencia metotrexato), gpt (resistencia a ácido micofenólico) neo (resistencia a G-418) e higro (resistencia a higromicina). Se puede usar la amplificación del vector para aumentar los niveles de expresión. En general, el gen marcador de selección puede estar o bien directamente unido a las secuencias de polinucleótido que se van a expresar, o introducido en la misma célula huésped por cotransformación.
En vista de lo anterior, la presente invención por tanto proporciona además una o más de las secuencias de nucleótidos de la invención insertadas en (es decir, comprendidas por) un vector. Específicamente, la invención proporciona vectores (replicables) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR de la invención. También se divulgan vectores (replicables) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa o beta del TCR de la invención, o un dominio variable alfa o beta, o una CDR3 alfa o CDR3beta operativamente unida a un promotor.
El experto en la materia será capaz fácilmente de seleccionar un vector de expresión adecuado basado en, por ejemplo, la célula huésped pretendida para la expresión del TCR. Los ejemplos de vectores de expresión adecuados son vectores víricos, tal como vectores retrovíricos, por ejemplo, vectores MP71 o vectores SIN retrovíricos; y vectores lentivíricos o vectores SIN lentivíricos. Los vectores víricos que comprenden los polinucleótidos que codifican los TCR de la invención, por ejemplo, son capaces de infectar linfocitos, que se prevén que posteriormente expresen el TCR heterólogo. Otro ejemplo de un vector de expresión adecuado es el sistema de plásmido de ADN con transposasa de transposón Sleeping Beauty (SB), plásmido de ADN SB. Los ácidos nucleicos y/o en particular las construcciones de expresión de la invención también se pueden transferir a las células por una transfección de ARN transitoria.
Los vectores víricos actualmente usados para expresión de TCR nativo típicamente unen los genes de la cadena alfa de TCR y beta de TCR en un vector con o bien secuencia de sitio de entrada interna al ribosoma (IRES) o la secuencia del péptido 2A derivada de un tsechovirus porcino, que produce la expresión de una única molécula de ARN mensajero (ARNm) bajo el control del promotor vírico en las células transducidas.
Célula huésped
La presente invención además proporciona una célula huésped que comprende el TCR, el ácido nucleico o el vector de la invención.
Se puede usar una variedad de células huésped según la invención. Como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” abarca células que pueden ser o ha(n) sido receptora(s) de polinucleótidos o vectores descritos en el presente documento y/o expresan (y opcionalmente secretan) el TCR de la presente invención. Los términos “célula” y “cultivo celular” se usan de forma intercambiable para indicar la fuente de un TCR a menos que claramente se especifique otra cosa. El término “célula huésped” también incluye “líneas celulares huésped”.
En general, el término “célula huésped” incluye células procariotas o eucariotas, y también incluye sin limitación bacterias, células de levadura, células fúngicas, células vegetales, y células animales tal como células de insecto y células de mamífero, por ejemplo, células murinas, de rata, macaco o humanas.
En vista de lo anterior, la invención por tanto proporciona, entre otros, células huésped que comprenden un polinucleótido o un vector, por ejemplo, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR o construcción de t Cr de la invención.
Los polinucleótidos y/o vectores de la invención se pueden introducir en las células huésped usando métodos rutinarios conocidos en la técnica, por ejemplo, por transfección, transformación, o similares.
“Transfección” es el proceso de introducir deliberadamente moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) en células diana. Un ejemplo es la transfección de ARN, es decir, el proceso de introducir ARN (tal como ARN transcrito in vitro, ARNivt) en una célula huésped. El término se usa principalmente para métodos no víricos en células eucariotas. El término “transducción” con frecuencia se usa para describir transferencia mediada por virus de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos. La transfección de células animales típicamente implica abrir poros o “agujeros” transitorios en la membrana celular, para permitir la absorción del material. La transfección se puede llevar a cabo usando fosfato de calcio, por electroporación, aplastando células o mezclando un lípido catiónico con el material para producir liposomas, que se fusionan con la membrana celular y depositan su carga dentro. Las técnicas ejemplares para transfectar células huésped eucariotas incluyen absorción mediada por vesículas lipídicas, absorción mediada por choque término, transfección mediada por fosfato de calcio (coprecipitación de fosfato de calcio/ADN), microinyección y electroporación.
El término “transformación” se usa para describir la transferencia no vírica de moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos (incluyendo vectores) a bacterias, y también a células eucariotas no animales, incluyendo células vegetales. La transformación por tanto es la alteración genética de un célula bacteriana o eucariota no animal resultante de la absorción directa a través de la(s) membrana(s) celular(es) de sus alrededores y posterior incorporación de material genético exógeno (moléculas de ácido nucleico). La transformación se puede efectuar por medios artificiales. Para que se produzca la transformación, las células o bacterias deben estar en un estado de competencia, que se podría producir como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones medioambientales tal como ayuno y densidad celular. Para la transformación procariota, las técnicas pueden incluir absorción mediada por choque térmico, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, microinyección y electroporación. Las técnicas para la transformación vegetal incluyen transferencia mediada por Agrobacterium, tal como A. tumefaciens, microproyevtiles de tungsteno u oro rápidamente propulsados, electroporación, microinyección y absorción mediada por polietilenglicol.
En vista de lo anterior, la presente invención por tanto proporciona además células huésped que comprenden al menos una secuencia de polinucleótido y/o vector de la invención.
Para la expresión de los TCR de la invención, se puede elegir una célula huésped que module la expresión de las secuencias de polinucleótidos insertadas, y/o modifique y procese el producto génico (es decir, ARN y/o proteína) según se desee. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, corte) de productos génicos puede ser importante para la función del TCR. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de productos génicos. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para asegurar la modificación y procesamientos correctos del producto. Para este fin, se pueden usar células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, glucosilación, y fosforilación del producto génico.
Se prevé en el presente documento proporcionar (a) células huésped para expresar y obtener los TCR de la invención, en particular en forma soluble (“células huésped de producción”) y (b) células huésped que expresan un TCR de la invención y que tienen función efectora (“células huésped efectoras”). Tales “células huésped efectoras” son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas y se prevén para la administración a un sujeto en necesidad de ello. Las “células huésped efectoras” preferidas incluyen linfocitos tal como linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD8+, células T CD4+, células citolíticas naturales (NK), células T citolíticas naturales (NKT), células T gamma/delta.
“Células huésped de producción”
Células
Las “células huésped de producción” usadas para la expresión de los TCR solubles de la invención son preferiblemente capaces de expresar altas cantidades de proteína recombinante.
Las células huésped de mamífero ejemplares que se pueden usar como “células huésped de producción” incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) incluyendo células CHO DHFR menos tal como DG44 y DUXBI 1, NSO, COS (un derivado de CVI con antígeno T de SV40), HEK293 (riñón humano), y SP2 (mieloma de ratón). Otras líneas celulares huésped ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, HELA (carcinoma cervical humano), CVI (línea de riñón de mono), Ve RY, BHK (riñón de hámster recién nacido), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblastos de hámster chino) BALBC/3T3 (fibroblastos de ratón), HAK (línea de riñón de hámster), P3x63-Ag3.653 (mieloma de ratón), BFA-IcIBPT (células endoteliales bovinas), y RAJI (linfocito humano). Las líneas celulares huésped típicamente están disponibles de servicios comerciales, la Colección Americana de Cultivos de Tejido (ATCC) o de bibliografía publicada.
Las células no de mamífero tal como células bacterianas, de levadura, insecto o vegetales también están fácilmente disponibles y también se pueden usar como “células huésped de producción” como se describe anteriormente. Las células huésped bacterianas ejemplares incluyen enterobacterias, tal como Escherichia coli, Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, y Haemophilus influenza. Otras células huésped incluyen células de levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae, y Pichia pastoris. Las células de insecto incluyen, sin limitación, células de Spodoptera frugiperda.
Según lo anterior, los sistemas de expresión concebibles (es decir, células huésped que comprenden un vector de expresión como se ha descrito anteriormente) incluye microorganismos tal como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti). Los sistemas de expresión de mamífero que tienen construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5K del virus vaccinia, el promotor inmediato-temprano principal (MIEP) del citomegalovirus (CMV)) con frecuencia son preferidos. Las células huésped de mamífero adecuadas se pueden seleccionar de líneas celulares conocidas (por ejemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3), sin embargo, también es concebible usar linfocitos tal como linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD8+, células T CD4+, células citolíticas naturales (NK), células T citolíticas naturales (NKT), células T gamma/delta.
Según lo anterior, la presente invención también proporciona un método para obtener un TCR de la invención que comprende las etapas de (i) incubar una célula huésped de la invención (es decir, una célula huésped de producción) en condiciones que producen expresión de dicho TCR y (ii) purificar dicho TCR.
Cultivo
Las células huésped que tienen el vector de expresión se hacen crecer en condiciones apropiadas para la producción de los TCR de la invención, en particular cadenas alfa y cadenas beta como se describe en otro sitio en el presente documento, y se ensayan para la síntesis de proteína de la cadena alfa y beta. Se divulga además que, para la expresión de los TCR de doble cadena, los vectores que codifican tanto la cadena alfa como la beta se pueden coexpresar en la célula huésped para expresión de la molécula entera.
Purificación
Una vez un TCR de la invención se ha expresado, se puede purificar por cualquier método de purificación conocido en la técnica, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita), cromatografía de afinidad, particularmente cromatografía de afinidad con proteína A, proteína G o lectina, cromatografía en columna de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, cromatografía de interacción hidrofóbica, o por cualquier otra técnica estándar de purificación de proteínas. El experto en la materia será capaz fácilmente de seleccionar un método de purificación adecuado basado en las características individuales del TCR que se va a recuperar.
“Células huésped efectoras”
Como se ha mencionado antes, la presente invención también proporciona “células huésped efectoras” que comprenden una secuencia de nucleótidos, vector o TCR de la invención. Dichas células huésped efectoras se modifican usando métodos rutinarios para comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica el TCR de la invención, y se prevé que expresen el TCR de la invención, en particular en la superficie celular. Para los fines de la presente invención, “células huésped modificadas que expresan un TCR de la invención” en general se refiere a células huésped (efectoras o de producción) tratadas o alteradas para expresar un TCR según la presente invención, por ejemplo, por transfección de ARN como se describe en los ejemplos adjuntos. También se prevén otros métodos de modificación o transfección o transducción, tal como los descritos en otro lugar en el presente documento. El término “célula huésped modificada” por tanto incluye células huésped “transfectadas”, “transducidas”, y “genéticamente manipuladas” que preferiblemente expresan el TCR de la presente invención.
Preferiblemente tales “células huésped efectoras (modificadas)” (en particular “linfocitos efectores (modificados)”) son capaces de mediar funciones efectoras mediante transducción de señales intracelulares tras la unión del TCR a su diana antigénica específica. Tales funciones efectoras incluyen, por ejemplo, la liberación de perforina (que crea agujeros en la membrana celular diana), granzimas (que son proteasas que actúan intracelularmente para desencadenar apoptosis), la expresión del ligando de Fas (que activa apoptosis en una célula diana que porta Fas) y la liberación de citoquinas, preferiblemente citoquinas Th1/Tc1 tal como iFN-y, IL-2 y TNF-a. Por tanto, se prevé una célula huésped efectora manipulada para expresar el TCR de la invención que es capaz de reconocer y unirse a su diana antigénica en el sujeto que se va a tratar para llevar a cabo las funciones efectoras anteriormente mencionadas, destruyendo de esta manera las células diana (por ejemplo, cancerosas). La citólisis de las células diana se puede evaluar, por ejemplo, con el ensayo de destrucción fluorescente de CTL (CTL, EE UU) que detecta la desaparición de células diana marcadas con fluorescencia durante el cocultivo con células T receptoras transfectadas con TCR.
En vista de lo anterior, las células huésped efectoras preferiblemente expresan un TCR funcional, es decir, que comprende una cadena alfa y beta de TCR según la invención; y también las subunidades de transducción de señales CD3 gamma, delta, épsilon y zeta (complejo CD3). Además, también se puede desear la expresión de correceptores CD4 o CD8. En general, los linfocitos que tienen los genes requeridos implicados en la unión a antígeno, activación de receptor, y señalización posterior (por ejemplo, Lck, FYN, CD45, y/o Zap70), células T son particularmente adecuadas como células huésped efectoras. Sin embargo, las células huésped efectoras que expresan el TCR de la invención como un “dominio de unión” sin la subunidad de transducción de señales CD3 y/o las moléculas de señalización posteriores mencionadas anteriormente (es decir, que son capaces de reconocer la diana antigénica descrita en el presente documento, pero sin efectuar funciones mediadas por CD3 y/o las moléculas de señalización posteriores mencionadas anteriormente) también se prevén en el presente documento. Se prevé que tales células efectoras sean capaces de reconocer la diana antigénica descrita en el presente documento, y opcionalmente de efectuar otras funciones no asociadas con la señalización de CD3 y/o señalización de moléculas de señalización posteriores mencionadas anteriormente. Los ejemplos incluyen células NK o NKT que expresan el TCR inventivo y que son capaces de, por ejemplo, liberar gránulos citotóxicos tras el reconocimiento de su diana antigénica.
Por tanto, los linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD8+, células T CD4+, células citolíticas naturales (NK), células T citolíticas naturales (NKT), células T gamma/delta se consideran células huésped efectoras linfocíticas útiles. Tales linfocitos que expresan el TCR recombinante de la invención también se denominan “linfocitos efectores modificados” en el presente documento. El experto en la materia, sin embargo, reconocerá fácilmente que en general cualquier componente de la ruta de señalización de TCR que lleve a la función efectora deseada se puede introducir en una célula huésped adecuada por métodos de ingeniería genética recombinante conocidos en la técnica.
Las células huésped efectoras en particular linfocitos tal como células T pueden ser células huésped autólogas que se obtienen del sujeto que se va a tratar y se transforman o transducen para expresar el TCR de la invención. Típicamente, la expresión recombinante del TCR se logrará usando un vector vírico como se describe en los ejemplos adjuntos. Los métodos para obtener y aislar las células del paciente se conocen en la técnica.
Como se ha mencionado antes, las células huésped efectoras proporcionadas en el presente documento se prevén particularmente para aplicaciones terapéuticas. Pueden ser deseables modificaciones genéticas adicionales de las células huésped con el fin de aumentar la eficacia terapéutica. Por ejemplo, cuando se usan células T CD8+ autólogas como “células huésped efectoras” las modificaciones adicionales adecuadas incluyen disminución de la expresión de TCR, CTLA-4 y/o PD-1 endógenos; y/o amplificación de moléculas coestimuladoras tal como CD28, CD134, CD137. Los medios y métodos para lograr las modificaciones genéticas anteriormente mencionadas se han descrito en la técnica.
Los métodos para la manipulación del genoma dirigida de células huésped se conocen en la técnica e incluyen, además de atenuación génica con ARNip, el uso de las llamadas “nucleasas programables” tal como nucleasas con dedo de cinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activadoras de la transcripción (TALEN) y nucleasas manipuladas guiadas por ARN (RGEN) derivadas del sistema de repetición palindrómica corta espaciadas regularmente agrupadas bacterianas (CRISPR)-Cas (asociado a CRISPR), como se revisa, entre otros en Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334 (2014). Por ejemplo, las nucleasas programables tal como las TALEN se pueden emplear para cortar las regiones de ADN que codifican proteínas “ indeseadas”, tal como PD-1, CTLA-4 o un TCR endógeno, y reduciendo de esta manera su expresión. Cuando se usan célula T como células huésped (efectoras), la disminución del TCR endógeno tiene el beneficio de reducir “mal emparejamiento” indeseado de las cadenas alfa/beta de TCR endógenas y exógenas.
Composición farmacéutica/diagnóstica
La presente invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los agentes activos inventivos anteriormente mencionados, en particular el TCR, el ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped de la invención, y, opcionalmente, uno o más excipiente(s) farmacéutico(s). El uso de dicho TCR, ácido nucleico, vector y célula huésped para la fabricación de una composición farmacéutica o medicamento también se describe en el presente documento.
El término “composición farmacéutica” en particular se refiere a una composición adecuada para administrar a un ser humano. Sin embargo, las composiciones adecuadas para la administración a animales no humanos en general también están abarcadas por el término.
La composición farmacéutica y sus componentes (es decir, agentes activos y opcionalmente excipientes) son preferiblemente farmacéuticamente aceptables, es decir, capaces de provocar el efecto terapéutico deseado sin producir ningún efecto local o sistémico indeseable en el receptor. Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la invención pueden, por ejemplo, ser estériles. Específicamente, el término “farmacéuticamente aceptable” puede significar aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más en particular en seres humanos.
El agente activo descrito en lo anterior (por ejemplo, la célula huésped o el TCR) preferiblemente está presente en la composición farmacéutica en una cantidad terapéuticamente eficaz. Mediante “cantidad terapéuticamente eficaz” se quiere decir una cantidad del agente activo que provoca el efecto terapéutico deseado. La eficacia terapéutica y toxicidad se pueden determinar por procedimientos estándar, por ejemplo, en cultivo celular o en animales de prueba, por ejemplo, la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). La proporción de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción, DE50/DL50. Las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos son preferidas.
Dosis
La dosis exacta del TCR, polinucleótido, vector o célula huésped la determinará un experto en la materia usando técnicas conocidas. Las dosis adecuadas proporcionan cantidades suficientes del agente activo de la invención y preferiblemente son terapéuticamente eficaces, es decir, provocan el efecto terapéutico deseado.
Como se sabe en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para el propósito del tratamiento (por ejemplo, mantenimiento de remisión frente a brote agudo de la enfermedad), ruta, tiempo t frecuencia de administración, tiempo y frecuencia de formulación de administración, edad, peso corporal, salud general sexo, dieta, gravedad del estado de enfermedad, combinación(es) de fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Los intervalos de dosis adecuados, por ejemplo, para los TCR solubles como se describen en el presente documento, se pueden determinar usando datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios con animales y pueden incluir la DE50. Típicamente, las cantidades de dosis pueden variar desde 0,1 a 100000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 2 g, dependiendo de la ruta de administración. Las dosis ejemplares del agente activo de la invención están en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, o desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg. Se proporciona orientación respecto a dosis particulares y métodos de administración en la bibliografía. Se reconoce que el tratamiento puede requerir una única administración de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz del agente activo de la invención. Por ejemplo, algunas composiciones farmacéuticas se podrían administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, o una vez en un mes dependiendo de la formulación, semivida y velocidad de depuración de la composición particular.
Como se ha expuesto previamente, la composición farmacéutica puede opcionalmente comprender uno o más excipientes y/o agentes activos adicionales.
Excipientes
El término “excipiente” incluye rellenos, aglutinantes, disgregantes, recubrimientos, sorbentes, antiadherentes, deslizantes, conservantes, antioxidantes, saborizantes, agentes colorantes, edulcorantes, solventes, cosolventes, agentes tamponantes, agentes quelantes, agentes que imparten viscosidad, agentes tensioactivos, diluyentes, humectantes, soportes, diluyentes, conservantes, emulsionantes, estabilizantes y modificadores de tonicidad. Está dentro del conocimiento del experto en la materia seleccionar los excipientes adecuados para preparar la composición farmacéutica deseada de la invención. Los soportes ejemplares para uso en la composición farmacéutica de la invención incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Típicamente, la elección de los excipientes adecuados dependerá, entre otros, del agente activo usado, la enfermedad que se va a tratar, y la formulación deseada de la composición farmacéutica.
Agentes activos adicionales
La presente invención además proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes activos inventivos especificados anteriormente (por ejemplo, una célula huésped o una construcción de TCR), y uno o más agentes activos adicionales que son adecuados para el tratamiento y/o profilaxis de la enfermedad que se va a tratar. Los ejemplos preferidos de ingredientes activos adecuados para combinaciones incluyen fármacos anticáncer conocidos tal como cisplatino, derivados de maitansina, raquelmicina, caliqueamicina, docetaxel, etopósido, gemcitabina, ifosfamida, irinotecano, melfalán, mitoxantrona, sorfimer sodiofotofrina II, temozolmida, topotecano, trimetreato glucuronato, auristatina E vincristina y doxorrubicina; y citotoxinas peptídicas tal como ricina, toxina de la difteria, exotoxina A bacteriana de pseudomonas, DNAasa y RNAasa; radio-núclidos tal como yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astato 213; profármacos tal como profármacos de enzima dirigidos por anticuerpo; inmunoestimulantes, tal como IL-2, quimioquinas tal como IL-8, factor de plaquetas 4, proteína estimuladora del crecimiento de melanoma, etc., anticuerpos o fragmentos de los mismos tal como anticuerpos anti-CD3 o fragmentos de los mismos, activadores del complemento, dominios de proteínas xenogénicas, dominios de proteínas alogénicas, dominios de proteínas víricas/bacterianas y péptidos víricos/bacterianos.
Administración
Una variedad de rutas es aplicable para la administración de la composición farmacéutica según la presente invención. Típicamente, la administración se logrará por vía parenteral. Los métodos de administración parenteral incluyen administración tópica, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intrauterina, intravaginal, sublingual o intranasal.
Formulación
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en varias formas, dependiendo, entre otros, del agente activo usado (por ejemplo, TCR soluble), por ejemplo, en forma sólida, líquida, gaseosa o liofilizada y pueden estar, entre otros, en la forma de una pomada, una crema, parches transdérmicos, un gel, polvo, un comprimido, solución, un aerosol, gránulos, píldoras, suspensiones, emulsiones, cápsulas, jarabes, líquidos, elíxires, extractos, tinturas o extractos fluidos o en una forma que es particularmente adecuada para el método deseado de administración. Los procesos conocidos por sí para producir medicamentos se indican en la 22a edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012) y pueden incluir, por ejemplo, procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grajeas, pulido, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas que comprenden, por ejemplo, células huésped o TCR soluble como se ha descrito en el presente documento típicamente se proporcionarán en una forma líquida, y preferiblemente comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable.
Después de haber preparado las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden colocar en un envase apropiado y etiquetar para el tratamiento de una afección indicada. Tal etiquetado incluiría, por ejemplo, cantidad, frecuencia y método de administración.
Tratamiento
En vista de lo anterior la presente divulgación también se refiere a un TCR, ácido nucleico, vector y/o célula huésped como se describe en el presente documento para su uso como un medicamento.
El TCR, ácido nucleico, vector y/o célula huésped en general se pueden emplear para detección de tratamiento, diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades o trastornos. El término “tratamiento” en todas sus formas gramaticales incluye el tratamiento terapéutico o profiláctico de un sujeto en necesidad de ello. Un “tratamiento terapéutico o profiláctico” comprende tratamientos profilácticos dirigidos a la prevención completa de manifestaciones clínicas y/o patológicas o el tratamiento terapéutico dirigido a la mejora o remisión de manifestaciones clínicas y/o patológicas. El término “tratamiento” por tanto también incluye la mejora o prevención de enfermedades.
Los términos “sujeto” o “ individuo” o “animal” o “paciente” se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el que se desea la terapia. Los sujetos mamíferos en general incluyen seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, y similares. Sin embargo, se entenderá fácilmente que los TCR, ácidos nucleicos, vectores, células huésped y composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se prevén especialmente para el tratamiento de sujetos humanos, en particular los que son positivos para HLA-A2.
Administración directa
Para terapia, los TCR -en particular los TCR solubles de la invención-, ácidos nucleicos, vectores (tal como vectores víricos) o células huésped de la invención se pueden administrar directamente al sujeto en necesidad de ello, Por tanto, la presente invención proporciona los TCR, ácido nucleico, vector y/o células huésped de la invención para uso en un método de detección, diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de cáncer. Dicho método puede comprender las etapas de (a) proporcionar uno o más de (i) un TCR, (ii) un ácido nucleico, (iii) un vector, (iv) una célula huésped, y/o (v) una composición farmacéutica de la presente invención; y (b) administrar uno o más de (i)-(v) al sujeto en necesidad de ello. Opcionalmente, el método puede comprender una etapa adicional de terapia contra cáncer, por ejemplo, radiación, o administración de uno o más agentes anticáncer.
Tratamiento ex vivo
El tratamiento según la presente divulgación también puede comprender las etapas de (a) proporcionar una muestra de un sujeto, dicha muestra comprende linfocitos; (b) proporcionar uno o más del TCR, ácido nucleico, vector, células huésped y/o composición farmacéutica de la invención (c) introducir uno o más de (i) a (v) de la etapa (b) en los linfocitos de la etapa (a) y, mediante ello, obtener linfocitos modificados, (d) administrar los linfocitos modificados de la etapa (c) al sujeto o paciente en necesidad de ello.
Se prevé particularmente que los linfocitos proporcionados en la etapa (a) sean “células huésped efectoras” como se ha descrito en lo anterior y se seleccionan ventajosamente de células T, células NK y/o células NKT, especialmente células T CD8+; y se pueden obtener en una etapa previa (a') de una muestra -en particular una muestra de sangredel sujeto por métodos rutinarios conocidos en la técnica. Sin embargo, también es concebible usar otros linfocitos que sean preferiblemente capaces de expresar el TCR de la presente invención y ejercer las funciones efectoras biológicas deseadas como se describe en el presente documento. Además, dichos linfocitos típicamente se seleccionarán para compatibilidad con el sistema inmunitario del sujeto, es decir, preferiblemente no provocarán una respuesta inmunogénica. Por ejemplo, es concebible usar una “célula receptora universal”, es decir, linfocitos universalmente compatibles que ejercen las funciones efectoras biológicas deseadas que se pueden hacer crecer y expandir in vitro. El uso de tales células, por tanto, obviará la necesidad para obtener y proporcionar los propios linfocitos del sujeto en la etapa (a).
La introducción ex vivo de la etapa (c) se puede llevar a cabo introduciendo un ácido nucleico o vector descrito en el presente documento a través de electroporación en los linfocitos, o infectando los linfocitos con un vector vírico, tal como un vector lentivírico o retrovírico descrito previamente en el contexto de la célula huésped efectora. Otros métodos concebibles incluyen el uso de reactivos de transfección, tal como liposomas, o transfección de ARN transitoria. La transferencia de genes de TCR específicos de antígeno en células T (primarias) mediante, por ejemplo, vectores (retro)víricos o transfección de ARN transitoria representa una herramienta prometedora para generar células T específicas de antígenos asociados a tumor que posteriormente pueden reintroducirse en el donante, donde específicamente se dirigen a y destruyen células tumorales que expresan dicho antígeno. En la presente invención, dicho antígeno asociado a tumor es PRAME100-108, en particular en su forma unida a HLA-A*02.
En vista de lo anterior, un aspecto adicional de la presente divulgación es por tanto el uso de un TCR, una secuencia de ácido nucleico, un vector y/o una célula huésped como se ha descrito en otro lugar en el presente documento para generar linfocitos modificados. Los medios y métodos para introducir, por ejemplo, un ácido nucleico y un vector en los linfocitos se han descrito en otro lugar en el presente documento.
Composición diagnóstica
La presente invención también proporciona una composición diagnóstica que comprende uno o más de los agente(s) diagnóstico(s) inventivo(s) anteriormente mencionados, en particular, el TCR, ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped de la invención. Típicamente, dicho agente diagnóstico comprenderá medios para detectar su unión a su diana antigénica, por ejemplo, un marcador como se ha descrito en el contexto de las construcciones de TCR de la invención. Con respecto a la célula huésped, por ejemplo, es concebible usar células huésped modificadas que comprenden un colorante o un agente de contraste que se libera (en lugar de gránulos citotóxicos) tras el reconocimiento del antígeno.
Uso
La presente divulgación también se refiere al uso de los agentes diagnósticos descritos en lo anterior para detectar, diagnosticar y/o pronosticar cáncer en un sujeto que se puede lograr in vivo o in vitro.
Por tanto, la presente divulgación proporciona una composición diagnóstica para uso en detectar, diagnosticar y/o pronosticar cáncer en un sujeto in vivo, dicha composición comprende, como un agente diagnóstico, el TCR, el ácido nucleico, el vector y/o la célula huésped de la invención. El método típicamente comprenderá (a) administrar dicho agente diagnóstico al sujeto y (b) detectar unión de dicho agente diagnóstico a su diana antigénica.
Además, la invención proporciona un método de detectar cáncer en un sujeto in vitro, que comprende: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto y que comprende una o más células con (i) el TCR de la invención, (ii) la célula huésped de la invención y/o (iii) la composición farmacéutica de la invención; formando mediante ello un complejo, y (b) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia del cáncer en el sujeto. En concordancia, la presente divulgación también proporciona un método de detectar la presencia de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de (a) proporcionar una muestra de un sujeto, dicha muestra comprende una o más células; (b) poner en contacto dicha muestra con el TCR, ácido nucleico, vector y/o célula huésped de la invención; formando mediante ello un complejo, y (c) detectar el complejo. Se prevé que dicho complejo sea indicativo para la unión del agente diagnóstico a su diana antigénica y es de la presencia de una célula (cancerosa) que expresa dicha diana antigénica.
En ambos métodos la unión del agente diagnóstico a su diana antigénica es detectable usando métodos rutinarios conocidos en la técnica y dependerá, entre otros, del agente diagnóstico específico usado. Los marcadores adecuados que se puede acoplar al agente diagnóstico de la invención se ejemplifican en la sección que se refiere a las construcciones de TCR marcadas. El uso para generar linfocitos modificados
* * * * *
Se debe indicar que como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la”, incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente indique otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a “un reactivo” incluye uno o más de tales diferentes reactivos y la referencia a “el método” incluye referencia a etapas y métodos equivalentes que conocen los expertos en la materia que se podrían modificar o sustituir por los métodos descritos en el presente documento.
A menos que se indique otra cosa, el término “al menos” que precede a una serie de elementos se debe entender que se refiere a cada elemento en la serie. Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la invención descritas en el presente documento. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por la presente invención.
El término “y/o” donde quiera que se use en el presente documento incluye el significado de “y”, “o” y “todos o cualquier otra combinación de elementos unidos por dicho término”.
El término “alrededor de” o “aproximadamente” como se usa en el presente documento significa dentro del 20%, preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo determinado. Sin embargo, también incluye el número concreto, por ejemplo, “aproximadamente 20” incluye 20.
El término “menor que” o “mayor que” incluye el número concreto. Por ejemplo, menor que 20 significa menor que o igual a. Similarmente, más que o mayor que significa más que o igual a, o mayor que o igual a, respectivamente.
A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprender” y variaciones tal como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas manifestado, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupos de números enteros o etapas. Cuando se usa en el presente documento el término “comprender” se puede sustituir con el término “contener” o “ incluir” o algunas veces cuando se usa en el presente documento con el término “tener”.
Cuando se usa en el presente documento “consistir en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en el elemento de reivindicación. Cuando se usa en el presente documento “consistir esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de la reivindicación.
En cada caso en el presente documento cualquiera de los términos “comprender”, “consistir esencialmente en” y “consistir en” se pueden sustituir con cualquiera de los otros dos términos.
Se debe entender que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, material, reactivos y sustancias, etc., particulares descritos en el presente documento y como tal puede variar. La terminología usada en el presente documento es para el fin de describir formas de realización particulares solo, y no se pretende que limite el ámbito de la presente invención, que se define solamente por las reivindicaciones.
Se obtendrá un mejor entendimiento de la presente invención y de sus ventajas del siguiente ejemplo, ofrecido para fines ilustrativos solo. No se pretende que el ejemplo limite el ámbito de la presente invención en modo alguno.
Ejemplos
Abreviaturas y sinónimos
CD(m) célula dendrítica (madura)
ARNivt ARN transcrito in vitro
CPA célula presentadora de antígeno
(X)pos o (X)+ que expresa X
VLD o péptido VLD PRAME100-108
Proporción E:T Proporción de células efectoras a células diana
SLL o péptido SLL Péptido, irrelevante, SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229)
ALY o péptido ALY Péptido, irrelevante, ALYVDSLFFL (SEQ ID NO: 230)
ELA o péptido ELA Péptido, irrelevante, ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 231)
[M] Concentración molar [mol/l]
CMSP Célula mononuclear de sangre periférica, es decir, células nucleadas en la sangre periférica;
comprende LSP (linfocitos de sangre periférica) tal como células T
Ejemplo 1: Aislamiento de clon de células T específico de PRAME
Los presentes inventores usaron un enfoque de sensibilización in vitro para aislar clones de células T de cualquier restricción de MHC deseada y especificidad de antígeno. El sistema de sensibilización usa células dendríticas maduras (CDm) como células presentadoras de antígeno y células T enriquecidas en CD8+ autólogas como células respondedoras. El ARN transcrito in vitro (ARNivt) que codifica la secuencia de aminoácidos de PRAME humano de longitud completa como se referencia en SEQ ID NO: 33 sirve como la fuente de antígeno específico. Después de electroporación en las CDm el ARNivt se traduce a la proteína de longitud completa, que posteriormente se procesa y presenta como péptidos por las moléculas de MHC de las CDm. Los cocultivos in vitro de células T con las CDm transfectadas con el ARNivt del mismo donante produjeron la inducción de novo de células T específicas de antígeno que sirven como la fuente de los correspondientes TCR. Las células T específicas de antígeno se pueden enriquecer mediante una variedad de métodos y se clonan por dilución limitante o siembra de célula única basada en FACS.
Ejemplo 1.1: Enfoque de sensibilización usando células dendríticas maduras
La sensibilización con CD de células T con TCR de alta afinidad se logró usando presentación de péptidos por moléculas de MHC autólogas según el siguiente protocolo (Figura 1):
Sensibilización con HLA-A*02:01/PRAME
CDm de 8 días producidas usando mezclas de maduración adecuadas para CD
Carga de CPA: ARNivt
Enriquecimiento a través de multímeros HLA-A*02:01 PRAME100-108
Separación de células únicas usando tecnología FACS
Ejemplo 2: Análisis de función/especificidad
Después de la identificación de un clon de células T candidato (clon de células T T4.8-1-29) que reconoce el epítopo PRAME deseado (PRAME100-108), se realizó la caracterización completa respecto a función y especificidad. Los análisis incluyeron el patrón de secreción de citoquinas del clon de células T aislado (clon de células T T4.8-1-29) en cocultivo con varias líneas celulares tumorales humanas, la capacidad del clon para reconocer específicamente varias células diana, la avidez funcional del clon y la toxicidad hacia células T2 y tumorales.
Ejemplo 2.1: Análisis del clon de células T original T4.8-1-29
Ejemplo 2.1.1: Análisis de policitoquinas
Diseño experimental: Estimulación por células T2 cargadas con péptido
La liberación de citoquinas se midió según el siguiente protocolo:
• Se realizó análisis de citoquinas Multiplex®, detectando IFN-gamma, IL-2, TNF-alfa, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4 e IL-1beta
• Células estimuladoras: células T2 (HLA-A*02pos) cargadas con cantidades saturantes (10-5 M) de péptido PRAME100-108 (“péptido VLD”) o péptido PRAME300-309 irrelevante, es decir, ALYVDSLFFL (“péptido AlY”, SEQ ID NO: 230)
• Se recogieron sobrenadantes de cocultivos de células T, con células T2 cargadas con péptido relevante o irrelevante, después de 24 h y posteriormente se midieron usando el análisis de citoquinas Multiplex®.
Resultados
• El clon candidato secretó IFN-gamma, IL-2 y TNF-alfa (citoquinas Th1/Tc1) por encima de los niveles de fondo.
El patrón de expresión de citoquinas refleja un fenotipo Th1 que está relacionado con buena función efectora antitumoral (Figura 2).
• La secreción de IL-5 e IL-13 (citoquinas Th2/Tc2) no se detectó (n.d.)
Ejemplo 2.2: Reconocimiento de células tumorales
Diseño experimental: Estimulación por líneas celulares tumorales
• Se usó ELISA de IFN-gamma para evaluar la secreción de citoquinas después de la estimulación con un panel de líneas celulares tumorales humanas (el estado de la expresión de PRAME se detectó usando análisis NanoString nCounter®).
• Se recogieron sobrenadantes después de hasta 24 h de cocultivo del clon de células T T4.8-1-29 con K562-A2, Mel-624.38, Colo-678, 647-V y SuDHL-6 (todas HLA-A*02pos). La secreción de IFN-gamma específica se evaluó usando ELISA estándar.
• Células diana:
o K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
o Mel-624.38 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
o Colo-678 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
o 647-V (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
o SuDHL-6 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
Resultados
• El clon de células T T4.8-1-29 mostró alta secreción de IFN-gamma en cocultivo con las líneas celulares tumorales PRAMEpos, HLA-A*02pos K562-A2 y Mel-624.38 (control positivo: células T2 pulsadas con péptido).
• Ninguna línea celular tumoral PRAMEneg, HLA-A*02pos fue reconocida por el clon de células T T4.8 (controles negativos; n.d., no detectado).
• Solo las líneas celulares tumorales que expresan HLA-A*02 y PRAME fueron reconocidas por el clon de células T T4.8-1-29 autorrestringido, lo que indica especificidad de antígeno (Figura 3).
Ejemplo 2.3: Avidez funcional
Diseño experimental: Estimulación por células T2 pulsadas con péptido
• La avidez funcional de células T para el reconocimiento del péptido PRAME100-108 (VLD) se midió por detección de secreción de IFN-gamma después del cocultivo del clon T4.8-1-29 con células T2 cargadas con péptido. • Células diana: células T2 (HLA-A*02pos, PRAMEneg) cargadas con cantidades tituladas de péptido PRAME100-108 (VLD) exógeno (de 10'5 M a 10'12 M).
• Proporción efector a diana (E:T) de 1:1.
• La liberación de IFN-gamma relativa se muestra en porcentaje de la liberación máxima. La secreción de IFN-gamma semimáxima que define la avidez funcional se indica por líneas discontinuas.
• Se recogieron sobrenadantes de cultivo después de ~24h de cocultivo y se evaluaron por ELISA estándar. Resultados
• El clon T4.8-1-29 mostró secreción de IFN-gamma semimáxima a concentración entre concentración de aproximadamente 1x10'9 y 1x1ü'10 mol/l [M] de péptido PRAME100-108 (media de dos experimentos independientes), que está en el intervalo fisiológico de células T específicas de virus y se describe que representa la avidez funcional deseada para eficacia antitumoral eficaz (Aleksic, M et al. Eur. J. Immunol.,42 (12):3174-3179).
• → TCR T4.8-1-29: ~1x10-9 mol/l [M] (Figura 4).
Ejemplo 2.3: Análisis de receptor T transgénico: TCR T4.8-1-29
Habiendo identificado el clon de células T específico de PRAME100'108 T4.8-1-29, las siguientes etapas implicaban el aislamiento de la información de secuencia de ADN que codifica las correspondientes cadenas de TCR, transferencia del TCR clonado a células T receptoras adecuadas y posterior análisis funcional de las células T manipuladas con TCR.
Ejemplo 2.3.1: Análisis de la secuencia del receptor de células T
Las secuencias de ADN de las cadenas alfa y beta del TCR del clon original T4.8-1-29 se analizaron internamente por secuenciación de nueva generación (NGS-TCRseq). Las secuencias de ADN de alfa y beta de TCR correspondientes se reconstruyeron por síntesis de genes de ADN (GeneArt, Regensburg) y se clonaron en esqueletos de vectores pGEM para producción de ARNitv, así como vectores retrovíricos para transducción estable.
Ejemplo 2.3.2: Validación funcional del TCR transgénico
Transferencia de la secuencia de TCR del clon de células T T4.8-1-29 a células receptoras
Las secuencias de ADN del TCR del clon original de células T T4.8-1-29 o bien se transcribieron in vitro a ARN que codifica las secuencias de TCR de T4.8-1-29 completas para transfección transitoria de células efectoras receptoras por electroporación, o se usaron para transducción estable de células efectoras usando construcciones de vectores retrovíricos, que también codifican la secuencia de TCR T4.8-1-29 completa.
Diseño experimental: Estimulación por células T2 pulsadas con péptido
• La secreción de IFN-gamma específica de células T receptoras transfectadas con TCR T4.8-1-29 (clon de células T receptoras CD8pos ARNitv de T4.8-1-29) en cocultivo con células T2 pulsadas con el péptido PRAME100-108 (VLD) se midió usando ELISA estándar.
• Células diana: células T2 (HLA-A*02pos, PRAMEneg) pulsadas con péptido VLD (relevante) o “péptido ELA” (irrelevante) (ELAGIGILTV, MelanA, SEQ ID NO: 231) 10'5 M.
Resultados
• Las células T receptoras transfectadas con TCR T4.8-1-29 mostraron buen reconocimiento de células T2 cargadas con el péptido relevante, pero no reconocimiento cuando las células T2 estaban cargadas con el péptido irrelevante.
• Las secuencias de ADN de las cadenas alfa y beta de TCR T4.8-1-29 se reconstruyeron correctamente y mostraron buena función como transgenes (Figura 5).
Ejemplo 2.4: Análisis de reconocimiento de péptidos propios
Diseño experimental: Secreción de INF-gamma de CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan TCR T4.8-1-29 en cocultivo con células T2 cargadas con péptido
La secreción de INF-gamma de CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan el receptor de células T del clon T4.8-1-29 cocultivadas con las células diana T2 (HLA-A*02pos, PRAMEneg) cargadas con péptido PRAME100-108 VLD o péptidos propios ubicuos eluidos de HLA-A*02 (131 péptidos propios) 10'5 M se determinó usando un ensayo ELISA.
Resultados
• Las CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan el receptor de células T del clon T4.8-1-29 no mostraron secreción de INF-gamma si se cocultivaban con células T2 (HLA-A*02pos, PRAMEneg) cargadas con péptidos propios ubicuos (control positivo: células T2 cargadas con PRAME100-108) reflejando alta especificidad de TCR T4.8-1-29 (Figura 6).
Ejemplo 2.5: Análisis de citotoxicidad
Diseño experimental: Lisis de células T2 pulsadas con péptido
• La lisis de células T2 pulsadas con péptido PRAME100-108 (VLD) se midió usando el ensayo de destrucción fluorescente TVA™ (CTL, Cellular Technology Limited, EE UU) que determina la desaparición de células diana marcadas con fluorescencia durante el cocultivo con CMSP enriquecidas en CD8 que expresan el TCR de T4.8-1-29.
• Células diana: células T2 (HLA-A*02pos, PRAMEneg) pulsadas con péptido PRAME100-108 VLD (relevante) o SLL (SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229), PRAME, irrelevante) 10-5 M cocultivadas con CMSP que expresan TCR T4.8-1-29 en proporciones E:T escalonadas.
Resultados
• Las CMSP que expresan T4.8-1-29 muestran lisis eficaz de células T2 cargas con péptido relevante (VDL) incluso a bajas proporciones E:T
• Las células T2 cargadas con el péptido SLL irrelevante (PRAME) no se lisaron (control negativo) a ninguna proporción E:T (Figura 7).
Diseño experimental: Lisis de células tumorales
• La actividad citotóxica contra células tumorales se analizó usando el ensayo de destrucción fluorescente TVA™ (CTL, Cellular Technology Limited, EE UU) que detecta la desaparición de células diana marcadas con fluorescencia durante el cocultivo con CMSP que expresan el TCR transgénico del clon de células T T4.8-1-29.
• Células diana: La línea celular tumoral humana K562 se usó para los experimentos. Las células K562 se transfectaron usando el ARN/fv que codifica HLA-A*02:01 humana y/o ARNitv que codifica PRAME humano. K562 humana muestra expresión de PRAME endógena (determinado por Nanostring y descrito en la bibliografía). Además, la expresión de PRAME se aumentó por transfección de las células K562 con ARN/fv que codifica PRAME humano o por carga exógena de péptido PRAME100-108 VLD.
o K562 transfectadas con ARN/fv que codifica HLA-A*02:01 y cargadas con péptido PRAME100-108 (VLD): K562-(PRAME+/A2")+ARN/vt de A2+péptido VLD (Figura 8A)
o K562 transducidas con ARN/fv que codifica PRAME: K562-(PRAME+/A2-)+ARN/tvde PRAME (Figura 8B) o K562 transfectadas con ARN/fv que codifica PRAME y ARN/fv que codifica HLA-A*02: K562-(PRAME+/A2-)+ARN/tv de A2 (Figura 8C)
o K562 transfectadas con ARN/fv que codifica HLA-A*02: K562- (PRAME+/A2")+ARN/tv de A2 ARNitv de PRAME (Figura 8D)
• Las células tumorales se cocultivaron con CMSP que expresan TCR T4.8-1-29 en proporciones E:T escalonadas.
Resultados
• La transfección con el ARN/fv de PRAME, así como la carga de péptido VLD de células K562 que expresan HLA-A*02:01 aumentó la lisis específica por CMSP que expresan el TCR transgénico T4.8-1-29 (Figura 8A-D).
Ejemplo 2.5: Reconocimiento de células tumorales por CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan TCR T4.8-1-29
Diseño experimental: Estimulación por líneas celulares tumorales
• Se usó ELISA de IFN-gamma para evaluar la secreción de citoquinas después de la estimulación con un panel de líneas celulares tumorales humanas (el estado de la expresión de PRAME se detectó por análisis de NanoString nCounter®).
• Los sobrenadantes se recogieron después de hasta 24 h de cocultivo de CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan el receptor de células T T4.8-1-29 con K562-B35, K562-A2, Mel-624.38, Colo-678 y SKMEL23. La secreción de IFN-gamma específica se evaluó usando ELISA estándar.
• Células diana:
o K562-B35 (HLA-A*02neg, PRAMEpos)
o K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
o K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos) cargadas con péptido VLD
o Mel-624.38 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
o SkMEL23 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
Resultados
• Las CMSP enriquecidas en CD8+ que expresan el receptor de células T T4.8-1-29 mostraron alta secreción de IFN-gamma en cocultivo con las líneas celulares tumorales PRAMEpos, HLA-A*02pos K562-A2, K562-A2 además cargada con péptido VLD, secreción intermedia de IFN-gamma tras cocultivo con PRAMEpos, HLA-A*02pos Mel-624.38 y SkMEL23.
• K562 PRAMEpos con expresión de HLA-B*35 no indujo la secreción de IFN-gamma confirmando la restricción a HLA-A*02 de TCR T4.8-1-29 (Figura 10).
Ejemplo 2.6: Transducción de CMSP con TCR T4.8-1-29
• Se transdujeron CMSP enriquecidas en CD8 de un donante sano con un plásmido que contenía la construcción de TCR T4.8-1-29. Para analizar la eficacia de transducción de TCR, se realizó análisis de FACS después de la tinción de superficie de CMSP sin transducir y transducidas con TCR T4.8-1-29. Las células se tiñeron con anticuerpos específicos para CD8 y la región variable de los TCR de la cadena p de TCR (TRBV9). En la población celular efectora control, hay presente un 8% de células T que expresan TRBV9 endógenamente, mientras que después de la transducción el 60% de las células T expresaba TRBV9. Esto indica una eficacia de transducción de más del 50% (Figura 11).
Ejemplo 2.7: Avidez funcional de células T por péptido PRAME100-108 (VLD) por el clon de células T T4.8-1-29 y CMSP transducidas con TCR T4.8-1-29
• La avidez funcional para el reconocimiento del péptido PRAME100-108 (VLD) se midió por detección de la secreción de IFN-gamma después de cocultivar el clon de células T T4.8-1-29 (curva continua) o CMSP efectoras transducidas con T4.8-1-29 (curva de puntos) con células T2 cargadas con péptido. Las células T2 se cargaron con cantidades tituladas de péptido, que variaban de una concentración de 10'5 M hasta 10'12 M. Los sobrenadantes del cocultivo se recogieron después de ~24 h de cocultivo y se evaluaron por ELISA estándar, la liberación de IFN-gamma relativa se muestra en porcentaje de la liberación máxima. La secreción semimáxima de IFN-gamma (CE50) que define la avidez funcional se indica por la línea discontinua. La avidez funcional del clon de células T original y el t Cr transgénico son muy similares (Figura 12).
Ejemplo 2.8: Análisis de especificidad de antígeno de CMSP transducidas con TCR T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir con diferentes células diana (OPM-2 y U397)
• Para analizar la especificidad de antígeno, CMSP efectoras transducidas con TCR T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir se cocultivaron con diferentes células diana. Las líneas celulares tumorales OPM-2 y u 937 (negativas para HLA-A2 y negativas para PRAME) se ensayaron o bien sin modificar o transfectadas con el a Rn /ív que codifica HLA-A2. Además, las células también se ensayaron después de transfección con una combinación de ARN/ív que codifica HLA-A2 y PRAME, o HLA-A2 y un antígeno irrelevante. Como control, los efectores también se cultivaron con células T2 cargada scon el péptido PrAMEvld (10‘5 M) o el péptido PRAMEsll irrelevante (10‘5 M). Después de 24 h de cocultivo, los sobrenadantes se recogieron y las cantidades secretadas de IFN-gamma se midieron por ELISA estándar. Se midieron altas cantidades de IFN-gamma para las CMSP transducidas con TCR con las células T2 cargadas con VLD. También ambas líneas celulares tumorales transfectadas con HLA-A2 y el antígeno PRAME indujeron secreción de IFN-gamma por las CMSP transducidas con TCR. Así solo las células tumorales que expresan HLA-A2 como el elemento de restricción del MHC de necesidad, en combinación con el antígeno PRAME fueron reconocidas y produjeron una activación de las CMSP que expresan T4.8-1-29 (Figura 13).
Ejemplo 2.9: Análisis de especificidad de antígeno de CMSP transducidas con TCR T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir con diferentes células diana (K562, K562_A2 y Mel 624.38).
• Para analizar la especificidad de antígeno, CMSP efectoras transducidas con TCR T4.8-1-29 y CMSP control sin transducir se cocultivaron con diferentes células diana. Las líneas celulares tumorales K562 (negativa para HLA-A2 y positiva para PRAME), se ensayaron, así como K562_A2 y Mel 624.38 (positiva para HLA-A2 y positiva para PRAME) y 647-V (positiva para HLA-A2 y negativa para PRAME). Como control, los efectores también se cultivaron con células T2 cargadas con el péptido PRAMEvld (10‘5 M) o el péptido PRAMEsll irrelevante (10‘5 M). Después de 24 h de cocultivo, los sobrenadantes se recogieron y las cantidades secretadas de IFN-gamma se midieron por ELISA estándar. Se midieron altas cantidades de IFN-gamma para las CMSP transducidas con TCR con las células T2 cargadas con VLD.
Los valores de IFN-gamma medidos indicaban la activación de CMSP transducidas con TCR T4.8-1-29 por células T2 cargadas con el péptido VLD y las líneas celulares tumorales K562_A2 y Mel 624.38. Así solo las líneas celulares tumorales positivas para HLA-A2 que expresan PRAME endógenamente fueron reconocidas por la CMSP transducidas, mientras que la ausencia de HLA-A2 o el antígeno previnieron la activación (Figura 14).
Ejemplo 2.10: Análisis de actividad citotóxica de efectores transducidos con T4.8-1-29 contra células tumorales

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de células T (TCR) específico de PRAME que comprende una cadena alfa de TCR y una cadena beta de TCR, que comprende:
(i) una región variable de la cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y
(ii) una región variable de la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16,
dicho TCR es capaz de unirse al epítopo comprendido en la secuencia de aminoácidos VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32) o su forma unida a MHC.
2. El TCR según la reivindicación 1, que comprende
(i) una cadena alfa de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 13;
y
(ii) una cadena beta de TCR que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, o SEQ ID NO: 14.
3. El TCR según la reivindicación 1, que comprende
(i) una región variable de la cadena alfa de TCR que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 15, y
(ii) una región variable de la cadena beta de TCR que consiste en la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 16.
4. El TCR según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, dicho TCR se selecciona de un TCR nativo, o una construcción de TCR, que preferiblemente comprende al menos una cadena(s) alfa de TCR y al menos una cadena(s) beta de TCR unidas covalentemente entre sí para formar heterodímeros o multímeros de TCR.
5. El TCR según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende uno o más componente(s) de fusión opcionalmente seleccionados de receptores de Fc; dominios Fc, incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM; citoquinas, incluyendo IL-2 o IL-15; toxinas; anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, incluyendo anticuerpos anti-CD3, anti-CD28, anti-CD25, anti-CD16 o anti-CD56 o fragmentos de unión a antígenos de los mismos; dominio CD247 (CD3-zeta), CD28, CD137, CD134, o combinaciones de los mismos, opcionalmente que además comprende al menos un enlazador.
6. El TCR según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende
(i) al menos una cadena alfa de TCR como se define en la reivindicación 1; y
(ii) al menos una cadena beta de TCR como se define en la reivindicación 1;
(iii) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que está dirigido contra un antígeno o epítopo en la superficie de linfocitos;
en donde la(s) cadena(s) alfa de TCR y la(s) cadena(s) beta de TCR están unidas entre sí y fusionadas, opcionalmente a través de un enlazador, a dicho anticuerpo o scFv, en donde dicho antígeno preferiblemente se selecciona de CD3, CD28, CD5, CD16 o CD56.
7. Un ácido nucleico que codifica el TCR según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende preferiblemente la secuencia de ácido nucleico de Se Q ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30.
8. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7.
9. Una célula huésped que comprende el TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 7 o el vector según la reivindicación 8.
10. La célula huésped según la reivindicación 9 que se selecciona de linfocitos incluyendo, pero no limitado a linfocitos T citotóxicos (CTL), células T CD8+, células T CD4+, células citolíticas naturales (NK), células T citolíticas naturales (NKT), células T gamma/delta.
11. Un método para obtener un TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende
(i) incubar una célula huésped según las reivindicaciones 9 o 10 en condiciones que producen la expresión de dicho TCR;
(ii) purificar dicho TCR.
12. Una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende uno o más de:
(i) el TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
(ii) el ácido nucleico según cualquiera de la reivindicación 7;
(iii) el vector según la reivindicación 8; y/o
(iv) la célula huésped según las reivindicaciones 9 o 10;
y, opcionalmente, excipiente(s) farmacéutico(s).
13. El TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el ácido nucleico según la reivindicación 7, el vector según la reivindicación 8 y/o la célula huésped según la reivindicación 9 o 10 para uso en un método de detección, diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de cáncer.
14. Un método de detectar la presencia de un cáncer en un sujeto in vitro, que comprende:
(a) poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto y que comprende una o más células con
(i) el TCR según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
(ii) la célula huésped según las reivindicaciones 9 o 10; y/o
(iii) la composición farmacéutica según la reivindicación 12;
formando mediante ello un complejo, y
(b) detectar el complejo,
en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia del cáncer en el sujeto.
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102016123847B3 (de) * 2016-12-08 2018-04-05 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie
KR102375218B1 (ko) 2016-12-08 2022-03-17 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 T 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법
EP3595708A4 (en) * 2017-03-15 2020-12-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGHLY POTENTIAL MAGE-A1 SPECIFIC TCRS AND USES
US11236145B2 (en) 2017-03-23 2022-02-01 Immatics Biotechnologies Gmbh T cell receptors and immune therapy using the same against PRAME positive cancers
DE102017106305A1 (de) 2017-03-23 2018-09-27 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapien gegen prame-positive Krebsarten
CR20200014A (es) 2017-07-14 2020-06-11 Immatics Biotechnologies Gmbh Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada
RU2694412C9 (ru) * 2017-12-25 2019-09-18 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела и способы их применения
WO2019139972A1 (en) * 2018-01-09 2019-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors for immunotherapy
CN110272482B (zh) * 2018-03-14 2022-08-19 中国科学院广州生物医药与健康研究院 识别prame抗原短肽的t细胞受体
CN110818802B (zh) * 2018-08-08 2022-02-08 华夏英泰（北京）生物技术有限公司 一种嵌合t细胞受体star及其应用
RU2711871C1 (ru) * 2018-12-25 2020-01-23 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV-9 Т-клеточного рецептора человека, и способы их применения
MX2021012207A (es) 2019-04-05 2021-12-10 Rootpath Genomics Inc Composiciones y métodos para ensamblaje de genes del receptor de linfocitos t.
BR112022009707A2 (pt) * 2019-11-18 2022-08-09 BioNTech SE Receptores de tcr prame e usos dos mesmos
CN110964122B (zh) * 2019-12-24 2022-04-15 南京北恒生物科技有限公司 T细胞受体融合蛋白及其用途
CN111690051B (zh) * 2020-06-28 2021-08-17 英威福赛生物技术有限公司 靶向ny-eso-1(157-165)表位的特异性t细胞受体及抗肿瘤应用
CN116457371A (zh) * 2020-10-07 2023-07-18 多安生物治疗有限公司 T细胞受体、包含t细胞受体的免疫细胞及其使用方法
US20220372165A1 (en) 2021-05-05 2022-11-24 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding prame
KR20240005865A (ko) * 2021-05-07 2024-01-12 메디진 이뮤노테라피스 게엠바하 Prame 특이적 t 세포 수용체 및 키메라 공동 자극 수용체의 조합
EP4419548A2 (en) * 2021-10-18 2024-08-28 Board of Regents, The University of Texas System Peptides and engineered t cell receptors targeting ndc80 antigen and methods of use
WO2023175069A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Medigene Immunotherapies Gmbh Tcr constant region pairing library for pramevld tcrs
WO2023174398A1 (en) * 2022-03-17 2023-09-21 Rootpath , Inc. Synthetic tumor-infiltrating lymphocytes (tils)
WO2024092265A2 (en) * 2022-10-28 2024-05-02 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptors targeting ewsr1-wt1 fusion protein and uses thereof
WO2024123975A2 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Board Of Regents, The University Of Texas System A t cell receptor recognizing an unmutated foxm1 epitope presented on hla-a*02:01
WO2024163292A1 (en) * 2023-01-30 2024-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System T-cell receptors targeting her2 and methods of use thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1118860A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-25 Rijksuniversiteit te Leiden Methods for selecting and producing T cell peptide epitopes and vaccines incorporating said selected epitopes
RU2005131852A (ru) * 2003-03-14 2006-04-20 Уайт (Us) Антитела против человеческого рецептора il-21 и их применение
EP2006376A1 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Fusion protein comprising a caspase domain and a nuclear hormone receptor binding domain and methods and uses thereof
WO2009026116A2 (en) 2007-08-16 2009-02-26 Genizon Biosciences, Inc. Genemap of the human genes associated with longevity
WO2013002086A1 (ja) 2011-06-28 2013-01-03 株式会社癌免疫研究所 ペプチド癌抗原特異的ｔ細胞のレセプター遺伝子

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