KR102436129B1 - T 세포 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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마논 와이스
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메디진 이뮤노테라피스 게엠바하
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Abstract

본 발명은 생명 공학 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 항원-특이적인 T 세포 수용체 (TCRs)를 제공한다. 또한, 본 발명은 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 본 발명의 분자를 포함하는 숙주 세포 또한 제공된다. 더욱이, 본 발명은 특히 암의 진단 및 치료를 위한 수단 및 방법을 제공한다.

Description

T 세포 수용체 및 이의 용도
세포 매개된 면역계의 일부를 형성하는 T 림프구 (또는 T 세포)는 병원체 박멸에 중요한 역할을 한다. T 세포는 흉선에서 발생하고 그들의 표면에 T 세포 수용체 분자를 발현하여 유핵 세포 (항원 제시)에서 발현되는 주 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 제시된 펩타이드를 인식한다. 병원체의 항원, 즉 MHC 분자에 의해 제시된 외래 항원은 강력한 T 세포 반응을 유도할 것이나 자가-항원은 일반적으로 이러한 T 세포의 발생 동안 흉선에서 자가-항원 특이적인 T 세포의 부정적인 선택으로 인해 T 세포 반응으로 이어지지 않는다. 따라서, 면역계는 외래- 또는 자가-항원을 제시하는 유핵 세포를 구별할 수 있으며 강력한 사이토카인 방출 및 T 세포의 세포성 세포독성 메커니즘을 통해 감염된 세포를 특이적으로 표적화 및 근절시킬 수 있다.
면역계의 힘은 미래의 암 치료를 위한 유망한 도구로 인식되고 있다. 지난 10년 동안, 엑스 비보에서 (ex vivo) 확장된 공여자 (donor)에서 유래된 림프구의 투여를 포함하는 입양 세포 전달 (adaptive cell transfer, ACT)를 사용하여 T 세포의 독특한 특성들을 연구하기 시작하였다. ACT는 환자의 면역-능력이 필요하지 않기 때문에 암 치료에 대한 매력적인 개념이며, 전달된 림프구의 특이성은 전형적으로 돌연변이가 없어 면역원성이 낮으므로 자가 T 세포 반응을 효과적으로 유발하지 못하는 종양 항원을 표적으로 할 수 있다. ACT는 다양한 유형의 암에 대해 유망한 치료임이 입증되었지만 임상 치료시 그것의 광범위한 적용은 각 환자로부터 종양 특이적인 T 세포의 맞춤 격리 및 특성규명에 대한 필요성으로 인해 어려움을 겪었다 - 어렵고 시간소모적일 뿐만 아니라 종종 고-친화성 T 세포를 생성하지 못하는 과정이다 (Xue 등, Clin Exp Immunol. 2005 Feb; 139 (2):167-172, Schmitt et al., Hum Gene Ther.(11): 1240-1248).
종양 항원 특이적인 T-세포 수용체 (TCRs)의 프라이머리 T 세포로의 유전자 전달은 ACT의 현재 한계 중 일부를 극복할 수 있는데, 이는 면역억제 환자에서 조차 항원 특이성이 명시된 종양-반응성 T 림프구의 신속한 생성이 가능하기 때문이다. 그러나 종양 항원을 특이적으로 인식하고 인 비보 (in vivo)에서 원하는 항-종양 효과를 나타내는 TCR을 갖는 적당한 T 세포 클론의 동정은 여전히 진행중인 연구의 주제이다. 2012년 약 1,410만 건의 암이 전 세계적으로 발생하였으며 현재 암이 전 세계 모든 인간 사망자의 약 14.6%를 차지하고 있음을 고려할 때 새롭고 효율적인 치료 옵션이 절실히 요구된다.
본 발명의 목적은 전술한 필요성을 충족시키는 것이다.
본 발명은 항원 특이적인 T 세포 수용체뿐만 아니라 핵산, 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포; 및 이의 다양한 용도 및 적용을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 (i) CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T-세포 수용체 (TCR) 알파 사슬 가변 영역의 상보성 결정 영역 3 (CDR3); 및/또는 (ii) CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR3을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR)에 관한 것이다.
본원에 제공된 TCRs는 X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31)의 아미노산 서열 또는 이의 HLA-A*02 결합 형태 내에 포함된 에피토프, 바람직하게는 VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32)의 아미노산 서열 또는 이의 MHC-결합 형태 내에 포함된 에피토프에 결합할 수 있다. 전술한 아미노산 서열은 다수의 상이한 암에 의해 발현되는 것으로 생각되는 PRAME (흑색종에서 우선적으로 발현되는 항원)의 아미노산 위치 100 내지 108에 해당한다.
본 발명에 따른 TCRs은 예를 들어 (i) SEQ ID NO: 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역, 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 TCRs은 또한 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 사슬의 불변 영역을 포함할 수 있다.
특히, 본원에 제공된 TCRs은 (i) SEQ ID NO: 7, 9, 11 또는 13중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 7, 9, 11 또는 13과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬; 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 8, 10, 12 또는 14중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 8, 10, 12 또는 14와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 TCRs은 다양한 형태를 가질 수 있는데, 예를 들어, TCR은 천연 TCR, TCR 변이체, TCR 단편 또는 TCR 구조물일 수 있다. 서로 공유 결합된 TCR 알파 및 베타 사슬을 포함하는 헤테로다이머 및 다량체, 이외에도 하나 이상의 융합 성분을 포함하는 TCR 구조물이 구상된다. 유용한 TCR 구조물은 예를 들어 TCR 알파 사슬, TCR 베타 사슬 (둘 다 서로 공유 결합됨) 및 림프구 표면의 항원 또는 에피토프 (예를 들어, CD3, CD28, CD5, CD16 또는 CD56)에 대한 svFv와 같은 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 링커를 통해 TCR 사슬에 융합된다.
본 발명의 TCRs에 공유 결합될 수 있는 다른 유용한 모이어티는 다양한 표지를 포함한다. 본 발명의 TCRs은 또한 가용성 형태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 제공된 TCRs 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 제공하고, 상기 핵산은 예를 들어, SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 29 또는 30중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터가 추가로 제공된다. 예시적인 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 또는 감마-레트로바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명의 TCR, 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 본원에 제공된다. 유용한 숙주 세포는 세포 독성 T 림프구 (CTLs), CD8+T 세포, CD4+T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 감마/델타-T 세포와 같은 림프구를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 TCR의 수득 방법을 제공한다.
본 발명의 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 약학 또는 진단 조성물 또한 본원에 제공된다. 의약 또는 진단 제제로서 본 발명의 TCR, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약학 조성물의 용도, 및 특히 암의 검출, 진단, 예후예측, 예방 및/또는 치료 또한 구상된다. 암의 예방 또는 치료의 유용한 방식은 하기 단계를 포함한다: (a) 본원에 개시된 TCR, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약학 조성물 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및 (b) 전술한 하나 이상을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계. 본 발명은 또한 다음을 구상한다: (a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 림프구를 포함하는 단계; (b) 본원에 개시된 하나 이상의 TCR, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및/또는 약학 조성물을 제공하는 단계, 및 (c) 단계 (a)에서 수득된 림프구에 이를 도입하여 변형된 림프구를 수득하는 단계, (d) 단계 (c)의 변형된 림프구를 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하는 단계.
또한, 본 발명은 (a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 하나 이상의 세포를 포함하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 TCR, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포와 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하고, 복합체의 검출은 대상체에서 암의 존재를 표시하는 것인, 인 비트로에서 대상체의 암의 존재를 검출하는 인 비트로 방법에 관한 것이다.
도 1은 성숙한 수지상세포를 이용한 프라이밍 접근법의 도식적인 개요를 나타낸다. 자가의 건강한 공여자의 레파토리 내에서 PRAME 특이적인 CD8 T 세포를 드 노보 (de-novo) 유도하기 위해 PRAME-형질전환된 성숙한 수지상세포가 사용되었다.
도 2는 펩타이드-로딩된 T2 세포와 공배양된 PRAME100 -108-특이적인 T 세포 클론 T4.8-1-29의 멀티플렉스 사이토카인 분비 분석 (IFN-감마, IL-2, TNF-알파, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4, IL-1베타)을 나타낸다 (음성 대조군으로 PRAMEE100 -108 "VLD 펩타이드" 또는 PRAME300 -309 "ALY 펩타이드", n.d.=검출되지 않음). T4.8-1-29는 SEQ ID NO: 1에 도시된 이의 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR3을 갖거나 및/또는 SEQ ID NO: 2에 도시된 이의 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR3을 갖는 것을 특징으로 한다.
도 3은 HLA-A*02:01을 발현하는 다양한 인간 종양 세포주와 공배양된 PRAME100-108 특이적인 T 세포 클론 T4.8-1-29로부터 IFN-감마 방출을 나타내고, 여기서, 도 3의 설명표에 표시된 바와 같이, 종양 세포주의 일부는 PRAME (녹색 막대)를 발현한다. PRAME을 발현하지 않는 종양 세포주는 음성 대조군 (빨간색 막대)으로 사용된다. 양성 대조군: "VLD 펩타이드"가 로딩된 T2 세포 (검은색 막대), 자극이 없는 T 세포의 배경은 흰색 막대로 표시된다 ("n.d. = 검출안됨").
도 4는 적정량의 PRAME100 -108 펩타이드가 로딩된 T2 세포와 공배양된 PRAME100 -108-특이적인 T 세포 클론 T4.8-1-29의 IFN-감마 방출을 나타낸다. 점선은 시험된 T 세포 클론의 기능적 친화성에 대한 척도로서 최대량의 절반의 IFN-감마 분비를 유발하는 10-9 - 10-10 mol/L[M]의 펩타이드 농도를 표시한다.
도 5는 형질전환 TCR의 페어링 (pairing) 및 기능성을 증명하기 위해, PRAME100-108 (VLD) 펩타이드 로딩된 T2 세포 또는 무관한 펩타이드가 로딩된 T2 세포와의 공배양에서 PRAME100 -108-특이적인 TCR T4.8-1-29로 형질전환된 수혜자 CD8+ T 세포 (수혜자 T 세포 클론 + T4.8-1-29 ivtRNA)의 특이적인 IFN-감마 방출을 표준 ELISA에 의해 측정하였다.
도 6은 표준 ELISA에 의해 측정된 자가-펩타이드 (HLA-A*02:01 암호화된 분자에 결합하는 총 131개의 유비쿼터스 자가-펩타이드 중에서) 로딩된 T2 세포와의 공배양에서 PRAME100 -108-특이적인 TCR T4.8-1-29를 발현하도록 조작된 PRAME100 -108-특이적인 CD8+ 농축된 PBMC로부터 특이적인 IFN-감마 방출을 나타낸다.
도 7은 PRAME100 -108-특이적인 TCR T4.8-1-29를 발현하도록 조작된 CD8+ 농축된 PBMC에 의한 PRAME100 -108-펩타이드 ("VLD-펩타이드") 또는 무관한 펩타이드 SLLQHLIGL ("SLL-펩타이드") 중 어느 하나가 로딩된 T2 세포의 용해를 나타낸다.
도 8은 PRAME100 -108-특이적인 TCR T4.8-1-29를 발현하는 인간 PBMC에 의한 PRAME100-108-발현 표적 세포의 용해를 나타낸다. (A) HLA-A*02:01-형질전환되고, 내재적으로 PRAME 양성이며, 추가로 PRAME100 -108-펩타이드 ("VLD 펩타이드")가 로딩된 인간 K562 종양 세포의 용해를 나타낸다. (B) 음성 대조군으로서 HLA-A*02 음성이고, 내재적으로 PRAME 양성이며, 추가로 PRAME를 코딩하는 ivtRNA로 형질전환된 인간 K562 세포는 용해되지 않는다. (C)는 HLA-A*02-형질전환되고, 내재적으로 PRAME 양성이며, 추가로 PRAME를 코딩하는 ivtRNA로 형질전환된 인간 K562 세포의 용해를 나타낸다. (D)는 HLA-A*02-형질전환되고, 내재적으로 PRAME 양성인 인간 K562의 용해를 나타낸다.
도 9는 T 세포 수용체 알파 및 베타 사슬의 유용한 예시의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 11 및 12) 및 인간 PRAME의 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 33)을 나타낸다. 알파 및 베타 사슬에서, CDR1 및 CDR2 서열은 밑줄로 표시되고, CDR3 서열은 회색 및 볼드체로 표시되며, 가변 영역은 보통 글자체, 불변 영역은 이탤릭체이다.
도 10은 활성화-유도된 IFN-감마 방출에 의해 표시되고, 표준 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 TCR T4.8-1-29HLA-A*02를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC에 의한 상이한 HLA-A*02 및 PRAME 양성 종양 세포주의 인식을 나타낸다.
도 11은 건강한 공여자의 형질도입이 없는 PBMC 및 본원에 기술된 TCT T4.8-1-29 구조물을 포함하는 플라스미드가 형질도입된 건강한 공여자의 동일한 PBMC를 나타낸다.
도 12는 T 세포 클론 T4.8-1-29 (점으로 된 곡선) 또는 T4.8-1-29가 형질도입된 효과기 PBMC (실선으로 된 곡선) 중 어느 하나와 펩타이드 로딩된 T2 세포의 공배양 후 IFN-감마 분비의 검출에 의해 측정된 PRAME100 -108 (VLD)에 대한 기능적 T 세포 친화성을 나타낸다.
도 13은 T4.8-1-29 형질도입된 효과기 PBMC 및 형질도입되지 않은 대조군 PBMC의 항원 특이성의 분석을 나타낸다. 종양 세포주 OPM-2 및 U937 (HLA-A2 음성 및 PRAME 음성)은 변형되지 않거나, HLA-A2를 인코딩하는 ivtRNA로 형질전환되어 시험되었다.
도 14는 상이한 표적 세포주와 공배양된 T4.8-1-29 형질도입된 효과기 PBMC 및 형질도입되지 않은 대조군 PBMC의 항원 특이성의 분석을 나타낸다. 종양 세포주 K562 (HLA-A2 음성 및 PRAME 양성)뿐만 아니라 K562_A2 및 Mel 624.38 (HLA-A 양성 및 PRAME 양성) 및 647-V (HLA-A2 양성 및 PRAME 음성)도 시험되었다.
도 15는 세포의 살아있는 이미징이 가능한 현미경-기반 시스템인 IncuCyte ZOOM® - 생세포 분석 시스템을 사용한 종양 세포에 대한 T4.8-1-29-형질도입된 효과기의 세포독성 활성의 분석을 나타낸다.
도 16은 T4.8-1-29를 발현하는 PBMC의 안전성 프로파일의 분석을 나타낸다.
본 발명자들은 종양 관련 항원 (TAA) PRAME을 발현하는 세포를 특이적으로 인식; 및 사이토카인 생성 및 표적 세포의 세포 용해와 같은 유익한 효과기 기능을 나타내는 T 세포 클론을 동정하였다. 따라서, 상기 T 세포 클론 및 그들의 T 세포 수용체는 매우 특이적이고 효과적인 암 치료를 위한 유망한 도구이다. 동정된 PRAME 특이적인 TCRs은 따라서 암의 입양 T 세포 치료에 적합하다. 매우 특이적인 방식으로 PRAME에 결합할 수 있는 TCR의 동정은 엑스 비보 (ex vivo) T 세포를 "무장 (arming)"하고, 그들이 PRAME을 발현하는 암세포를 효과적으로 인식하고 특이적으로 제거할 수 있도록 공여자에게 그들을 재도입한다. 더욱이, 본원에 제공된 신규한 TCR의 항원 결합 영역은 직접 투여에 용이하게 이용 가능한 추가의 기능성 모이어티 (예컨대, 약물, 표지 또는 다른 면역 세포를 끌어당기는 추가 결합 도메인)를 포함하는 가용성 구조물을 설계하는데 사용될 수 있다.
가변 영역
CDR3 도메인
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 (i) CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T 세포 수용체 알파-사슬 CDR3, 및/또는 (ii) CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T-세포 수용체 베타-사슬 CDR3을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR)에 관한 것이다.
SEQ ID NO: 1과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR3 알파, 및/또는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR3 베타를 포함하는 TCR 서열 변이체가 본원에 추가로 구상된다; 단, TCR이 첨부된 실시예에서 평가된 TCR의 유리한 능력, 즉 본원에서 특정된 항원 표적에 결합할 수 있는 능력을 보유하여야 한다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 천연 TCR뿐만 아니라 TCR 변이체, 단편 및 구조물을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 선택적으로 추가의 도메인 및/또는 모이어티를 포함하여, TCR 알파 및 베타 사슬을 포함하는 헤테로다이머뿐만 아니라 다량체 및 단일 사슬 구조물을 포함한다.
이의 천연의 형태에서, TCR은 T 세포 표면의 몇몇 단백질의 복합체로 존재한다. T 세포 수용체는 독립적인 T 세포 수용체 알파 및 베타 (TCRα 및 TCRβ) 유전자로부터 생산되는 두 개의 (별도의) 단백질 사슬로 구성되며, 알파 (α-) 및 베타 (β-) 사슬로 불린다. TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 유사 (Ig) 가변 (V) 도메인/영역, 하나의 Ig 불변 유사 (C) 도메인/영역, 세포막에 사슬을 고정하는 트랜스멤브레인/세포막 스패닝 영역, 및 C-말단에서의 짧은 세포질 꼬리를 가지고 있다.
항원 특이성은 알파 및 베타 사슬의 가변 영역에 의해 부여된다. TCR 알파 사슬 및 베타 사슬의 두 가변 도메인은 골격 (FR) 영역으로 둘러싸인 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR1알파/베타, CDR2알파/베타 및 CDR3알파/베타)를 포함한다. CDR3은 항원 인식 및 특이성(즉, 특이 항원을 인식하고 상호작용하는 능력)의 주요 결정인자이나, CDR1 및 CDR2는 주로 항원 펩타이드를 제시하는 MHC 분자와 상호작용한다.
천연 TCRs은 항원 제시 세포의 표면에서 주 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합 ("제시/표시된")되는 항원 펩타이드를 인식한다. MHC 분자 상에 제시된 항원 펩타이드는 본원에서 "펩타이드:MHC 복합체"로도 지칭된다. MHC 분자의 두 가지 상이한 종류가 있다: MHC I 및 MHC II, 이들은 상이한 세포 구획으로부터 펩타이드를 제시한다. MHC 클래스 I 분자는 인체의 모든 유핵 세포의 표면에 발현되며, 세포 내 구획 유래의 펩타이드 또는 단백질 단편을 세포 독성 T 세포에 표시한다. 인간에서는, MHC를 사람 백혈구 항원 (human leukocyte antigen, HLA)이라고도 부른다. MHC 클래스 I에는 3가지 주요 유형이 있다: HLA-A, HLA-B 및 HLA-C. TCR이 이의 특이적인 펩타이드:MHC 복합체에 결합하면, T 세포가 활성화되어 생물학적 효과기 기능을 발휘한다.
본원에 제공된 TCRs은 유리하게도 PRAME, 특히 아래에 상세히 논의될 이의 MHC 결합 형태에서 PRAME100 -108을 (특이적으로) 인식할 수 있다. 항원 펩타이드는 그것이 MHC 분자 (수지상세포 또는 종양 세포와 같은 항원 제시 세포의 표면상에 존재할 수 있거나, 또는 예를 들어 비드 또는 플레이트에 코팅하여 고정될 수 있음)와 복합체를 형성할 때 이의 "MHC 결합 형태"로 존재한다고 일컫는다.
CDR1 및 CDR2 도메인
앞서 제시된 바와 같이, 본 발명의 TCRs는 특히 MHC 분자, 특히 MHC-I 분자, 및 특히 HLA-A, 바람직하게는 HLA-A*02 및 특히 대립유전자 HLA-A*02:01에 의해 인코딩된 HLA-A2 분자 상에 제시될 때 그들의 항원 표적 PRAME100 -108을 인식하는 것으로 구상된다 (T 세포 또는 TCR은 특정 MHC 분자에 "제한"된다고 일컫는다). 또한, 본 발명의 TCRs은 다른 HLA-A*02 대립유전자에 제시된 그들의 항원 표적을 인식하는 것도 생각할 수 있다. 이전에 언급했듯이, TCR 알파 및 베타 사슬의 CDR1 및 CDR2는 주로 MHC 인식에 관여하는 것으로 생각된다. HLA-A*02-제한된 항원 인식에 관여하는 것으로 알려진 CDR1 및 CDR2 서열의 제한된 "풀 (pool)"이 존재하며, 만약 TCR이 첨부된 실시예에서 평가된 TCR과 유사, 동일하거나 심지어 더 높은 정도로 이의 항원 표적, 바람직하게는 이의 HLA-A*02 결합 형태로 인식하는 이의 능력을 가지고 있다면, 본 발명의 CDR3 도메인은 원칙적으로 SEQ ID NO: 34-224에 나타낸 임의의 CDR1 및 CDR2 도메인과 병합될 수 있다. CDR1 및 CDR2 도메인의 유용한 예는 SEQ ID NO: 5에 나타낸 서열 VSGLRG를 포함하거나 이로 구성된 CDR1 알파, CDR2 알파는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 서열 LYSAGEE를 포함하거나 이로 구성된 CDR2 알파, SEQ ID NO: 6에 나타낸 서열 SGDLS를 포함하거나 이로 구성된 CDR1 베타, 및 SEQ ID NO: 4에 나타낸 서열 YYNGEE를 포함하거나 이로 구성된 CDR2 베타를 포함한다. 상기 CDR 서열은 또한 도 9에 도시된다.
전술한 바에 따르면, 본 발명은 특히 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 TCRs을 제공하며, 각각은 TCR의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (즉, 특히 CDR3 및 바람직하게는 CDR1 및/또는 CDR2)을 포함하는 인간 가변 영역을 포함한다. 특정 유리한 특성을 갖는 TCR (첨부된 실시예에 도시된)은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR1 (CDR1 알파), SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR2 (CDR2 알파), 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR3 (CDR3 알파)을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR1 (CDR1 베타), SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR2 (CDR2 베타), 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR3 (CDR3 베타)을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.
완전 가변 영역
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역을 포함하는 TCR을 제공한다. 상기 알파 및 베타 사슬 서열 또한 도 9에 도시된다 (일반 글자체).
SEQ ID NO: 15와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 알파 사슬 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TCR 베타 사슬 가변 영역을 포함하는 TCR 서열 변이체 또한 본원에 구상된다; 단, TCR이 첨부된 실시예에서 평가된 TCR의 유리한 능력, 즉, 본원에 특정된 항원 표적에 결합할 수 있는 능력을 보유하여야 한다.
불변 영역
TCR은 이의 알파 및/또는 베타 사슬에 불변 (C) 영역을 더 포함할 수 있다. 불변 영역은 인간 불변 영역이거나 다른 종으로부터 유래되어 "키메라" TCR을 생산할 수 있다. 예를 들어, 인간 알파 및/또는 베타 사슬은 TCR 알파 및 베타 사슬의 우선적 페어링 및 CD3 보조 수용체와의 보다 안정한 결합을 지원함으로써 인간 TCR의 표면 발현을 향상시키는 것으로 밝혀진 그들의 쥐 대응물 ("쥐화 (murinization)"로 대체될 수 있다. 알파 사슬의 적당한 불변 영역은 예를 들어 SEQ ID NO: 17 (인간), 19 (최소한의 쥐화) 및 21 (쥐)에서 선택될 수 있다. 베타 사슬의 적합한 불변 영역은 SEQ ID NO: 18 (인간), 20 (최소한의 쥐화) 및 22 (쥐)에서 선택될 수 있다. 본원에서 "TCR 서열 변이체" 섹션에서 추가로 설명된 바와 같이, 완전한 인간 불변 영역을 그들의 쥐 대응물로 대체하는 대신, 쥐의 불변 영역의 상응하는 아미노산에 대해 인간 불변 영역의 일부 아미노산만 교환하는 것도 가능하다 ("최소한의 쥐화").
알파 및 베타 사슬
본 발명의 TCRs의 유용한 예로는 SEQ ID NO: 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 알파 사슬 및 SEQ ID NO: 8, 10, 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 베타 사슬을 포함하는 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 특히 SEQ ID NO: 7에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 알파 사슬 및 SEQ ID NO: 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 베타 사슬을 포함하거나 이로 구성된 TCR; SEQ ID NO: 9에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 알파 사슬 및 SEQ ID NO: 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 베타 사슬을 포함하거나 이로 구성된 TCR; SEQ ID NO: 11에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 알파 사슬 및 SEQ ID NO: 12에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 베타 사슬을 포함하거나 이로 구성된 TCR (둘 다 또한 도 9에 도시됨); 및 SEQ ID NO: 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 알파 사슬 및 SEQ ID NO: 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 베타 사슬을 포함하거나 이로 구성된 TCR을 제공한다.
SEQ ID NO: 7, 9, 11 또는 13과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 알파 사슬 및/또는 SEQ ID NO: 8, 10, 12 또는 14와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR 서열 변이체 또한 본원에 구상된다; 단, TCR이 첨부된 실시예에서 평가된 TCR의 유리한 능력, 즉, 본원에 특정된 항원 표적에 결합할 수 있는 능력을 보유하여야 한다.
항원 표적
본원에 제공된 TCRs은 (인간) PRAME에 유리하게 결합할 수 있다. MAPE (Melanoma antigen preferentially expressed in tumors) 및 OIP4 (OPA-interacting protein 4)로도 지칭되는 PRAME(Melanoma antigen preferentially expressed in tumors, Uniprot Acc. No. P78395)은 미지의 기능을 갖는 암-고환 항원 (cancer-testis antigen, CTA)으로 보고되었다.
특히, 본 발명은 볼드체로 SEQ ID NO: 33에 나타낸 (도 9) PRAME 아미노산 서열의 아미노산 위치 100-108에 상응하는 아미노산 서열 내에 포함된 에피토프에 (특이적으로) 결합할 수 있는 TCRs을 제공한다. SEQ ID NO: 32에 나타낸 아미노산 서열로 구성된 PRAME 펩타이드는 또한 본원에서 PRAME100 -108 또는 "항원 표적" 또는 "VLD 펩타이드"로 지칭된다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 TCR-는 바람직하게는 MHC, 특히 HLA-A*02에 의해 결합될 때 PRAME100 -108을 인식할 것이다.
본 명세서에 따라 사용될 때 용어 "위치"는 본원에 나타낸 아미노산 서열 내의 아미노산 또는 본원에 기재된 핵산 서열 내의 뉴클레오티드의 위치 중 어느 하나의 위치를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "상응하는"은 또한 위치가 선행 뉴클레오티드/아미노산의 수에 의해서만 결정되는 것이 아니라 오히려 서열의 주변 부분과 관련하여 보이는 것을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 따른 주어진 아미노산 또는 뉴클레오티드의 위치는 서열의 다른 곳에서 아미노산 또는 뉴클레오티드의 결실 또는 부가로 인해 변할 수 있다. 따라서, 위치가 본 명세서에 따른 "상응하는 위치"로 언급될 때, 그것은 뉴클레오티드/아미노산이 특정 숫자의 관점에서 다를 수 있지만 여전히 유사한 이웃하는 뉴클레오티드/아미노산을 가질 수 있는 것으로 이해한다. 주어진 서열에서 아미노산 잔기 (또는 뉴클레오티드)가 "모체" 아미노산/뉴클레오티드 서열의 아미노산 서열의 특정 위치에 상응하는지를 결정하기 위해, 당업자는 당업계에 잘-알려진 수단 및 방법, 예를 들어, 수작업으로 또는 본원에 예시된 바와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정렬을 이용할 수 있다.
용어 "에피토프"는 일반적으로 결합 도메인이 인식하는 항원, 전형적으로 (폴리-) 펩타이드 상의 부위를 지칭한다. 이의 최광의 의미에서 용어 "결합 도메인"은 "항원 결합 부위"를 지칭하며, 즉 항원 표적의 특정 에피토프와 결합/상호작용하는 분자의 도메인을 특징으로 한다. 항원 표적은 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로 적어도 2개의 에피토프를 포함하고, 항원의 크기, 형태 및 유형에 따라 임의의 수의 에피토프를 포함할 수 있다. 용어 "에피토프"는 일반적으로 선형 에피토프 및 입체적 에피토프를 포함한다. 선형 에피토프는 아미노산 일차 서열에 포함된 연속적인 에피토프이며 전형적으로 적어도 2개 이상의 아미노산을 포함한다. 입체적 에피토프는 표적 항원, 특히 표적 (폴리-) 펩타이드의 폴딩에 의해 병치된 불연속적인 아미노산에 의해 형성된다.
본 발명과 관련하여, 용어 "결합 도메인"은 특히 TCR 알파 및/또는 베타 사슬의 가변 영역, 및 구체적으로 TCR의 CDR3 알파 및 CDR3 베타를 지칭한다.
본 발명자들은 본 발명의 TCRs에 의해 인식되는 최소 아미노산 서열이 아미노산 서열 X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31)에 상응하며, X는 임의의 아미노산으로부터 선택됨을 발견하였다. 구체적으로, 본 발명의 TCRs은 첨부된 실시예에 도시된 바와 같이, 아미노산 서열 VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32)을 포함하거나 이로 구성된 아미노산 서열을 (특이적으로) 인식하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 TCRs은 아미노산 서열 X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31)을 포함하거나 이로 구성되고, 바람직하게는 아미노산 서열 VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32)을 포함하거나 이로 구성된 아미노산 서열 또는 이의 MHC 결합 형태에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인식된 펩타이드는 SEQ ID NO: 31 및 특히 SEQ ID NO: 32에 나타낸 인식 모티프의 C-말단 및/또는 N-말단에 위치한 추가의 C 아미노산을 포함할 수 있는 것으로 구상된다. 구체적으로, 본원에 기술된 TCR은 전술한 아미노산 서열 내의 적어도 하나의 에피토프를 인식하는 것으로 구상된다. 모든 문법적 형식에서 용어 "결합하는" 및 "인식하는"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항원 표적은 특히 MHC 클래스 I 분자, 특히 HLA-A 분자 및 바람직하게는 HLA-A*02 분자, 특히 HLA-A*02:01 분자에 의해 결합될 때 본 발명의 TCR에 의해 인식되는 것으로 구상된다. 상기 MHC 분자, 특히 HLA-A 및 HLA-A*02 분자는 세포, 예를 들어 종양 세포의 표면 또는 (고상) 담체 상에 존재할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 TCRs은 그들의 항원 표적에 특이적으로 결합한다. "특이적(으로) 결합"이라는 용어는 일반적으로 TCR이 이의 항원 결합 부위를 통해 무작위의 무관한 비-표적 항원보다 이의 의도된 항원 표적에 더 쉽게 결합함을 나타낸다. 특히, 용어 "특이적으로 결합한다"는 이의 항원 표적에 대한 TCR의 결합 특이성이 비-표적 항원에 대한 이의 결합 특이성보다 적어도 약 5배, 바람직하게는 10배, 보다 바람직하게는 25배, 보다 더 바람직하게는 50배 및 가장 바람직하게는 100배 이상 더 클 수 있음을 나타낸다.
본원에 기술된 천연 TCR을 발현하는 효과기 숙주 세포는 그들의 항원 표적 (즉, 바람직하게는 항원 제시 세포에 의해 HLA-A*02 상에 제시된 PRAME100 - 108)에 결합하는 것으로 구상된다. 용어 "기능적 친화성"은 인 비트로에서 주어진 농도의 리간드에 반응하는 TCR 발현 세포 (특히, 본원에 기술된 천연 TCR을 발현하는 T-세포)의 능력을 지칭하며, TCR 발현 세포의 인 비보 효과기 능력과 상호 관련이 있다고 생각된다. 정의에 따르면, 높은 기능적 친화성을 갖는 TCR 발현 세포는 매우 낮은 항원 투여량에 대한 인 비트로 시험에서 반응하는 반면, 낮은 기능적 친화성의 그러한 세포는 고-친화성 TCR 발현 세포와 유사한 면역 반응을 일으키기 전에 더 많은 함량의 항원을 필요로 한다. 따라서, 기능적 친화성은 TCR 발현 세포의 활성화 역치의 정량적 결정 인자로 간주될 수 있다. 이러한 세포를 인 비트로에서 상이한 함량의 동족 항원에 노출함으로써 결정된다. 높은 기능적 친화성을 갖는 TCR 발현 세포는 낮은 항원 투여량에 반응한다. 예를 들어, TCR 발현 세포는956 g/mol의 분자량을 갖는 PRAME100 -108 펩타이드의 약 10-5 내지 약 10-11 M (즉, 약 0.05 ng/mL 내지 약 5 ng/mL, 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 또는 5 ng/mL)의 범위의 낮은 농도의 PRAME100 -108 펩타이드가 로딩된 항원-음성 HLA-A*02 발현 표적 세포와 공배양시 전형적으로 그것이 적어도 약 200 pg/mL 이상 (예를 들어, 200 pg/mL 이상, 300 pg/mL 이상, 400 pg/mL 이상, 500 pg/mL 이상, 600 pg/mL 이상, 700 pg/mL 이상, 1000 pg/mL 이상, 5,000 pg/mL 이상, 7,000 pg/mL 이상, 10,000 pg/mL, 또는 20,000 pg/mL 이상)의 인터페론 감마 (IFN-gamma)를 분비하는 경우 이의 항원 표적에 "높은" 기능적 친화성으로 결합하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명의 TCRs의 특이적인 결합을 결정하는 다른 방법으로 Gertner-Dardenne et al. J Immunol 188(9): 4701-4708에 의해 기술된 51Cr-방출 분석; Leisegang et al., Clin. Cancer Res 2010. 16: 2333-2343에 의해 기술된 CD107a/b 고정화; 및 Wilde et al., J Immunol 2012; 189:598-605에 의해 기술된 펩타이드-MHC 다량체 결합 분석이 포함된다.
변이체
전술한 바와 같이, 용어 "TCR"은 TCR 서열 변이체, 단편 및 구조물을 포함하는 TCR 변이체를 포함한다. 모든 TCR 변이체는 본 발명의 TCR의 기능적 변이체로 구상된다. 본원에 사용된 용어 "기능적 변이체"는 모체 TCR, 이의 가변 영역 또는 이의 항원-결합 영역과 실질적으로 또는 유의한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 TCR, 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭하며, 이의 생물학적 활성, 즉, 본 발명의 모체 TCR이 본원에 개시되고 첨부된 실시예에서 평가된 TCR와 유사하거나, 같거나 심지어 더 높은 정도의 항원 특이성을 갖는 항원 표적에 특이적으로 결합하는 이의 능력을 공유한다.
서열 변이체
용어 "TCR 변이체"는 본원에 개시된 TCRs의 "서열 변이체", 즉, 상기 기술된 본 발명의 TCR의 아미노산 서열 ("모체" TCR로도 지칭됨)을 실질적으로 포함하나 "모체" TCR 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형 (즉, 치환, 결실, 또는 삽입)을 포함하는 변이체를 포함한다. 단, 변이체는 바람직하게는 본 발명의 "모체" TCR의 항원 특이성을 보유한다. 본 발명의 TCR 서열 변이체는 전형적으로 "모체" TCR을 인코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 일반적으로, 전술한 아미노산 변형은 TCR의 가변 영역 또는 불변 영역에 도입되거나 존재할 수 있으며, 결합 강도 및 특이성, 번역후 프로세싱 (예를 들어, 글리코실화), 열역학적 안정성, 용해도, 표면 발현 또는 TCR 조립과 같은 특성들을 조절하는 역할을 할 수 있다.
전술한 바와 같이, 아미노산 변형은 예를 들어 모체 TCR의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 본 발명의 TCR의 예시적인 삽입 변이체는 상기 TCR 및 효소 또는 다른 기능성 폴리펩타이드의 융합 산물을 포함한다. 본 발명의 TCR의 예시적인 치환 변이체는 알파 및/또는 베타 사슬의 가변 영역 또는 CDRs, 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 치환을 포함하는 것들이다. 보존적 아미노산 치환이 본원에서 특히 구상된다. 보존적 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 특정의 물리적 및/또는 화학적 특성들을 갖는 하나의 아미노산이 동일한 화학적 또는 물리적 특성들을 갖는 다른 아미노산과 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 예를 들어, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친성 성질에서의 유사성에 기초하여 제조될 수 있는데, 다른 산성 아미노산 (예를 들어, Asp 또는 Glu)으로 치환된 산성 아미노산, 비극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (예를 들어, Ala, Gly, Val, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val 등)으로 치환된 비극성 측쇄를 갖는 아미노산, 다른 염기성 아미노산 (Lys, Arg 등)으로 치환된 염기성 아미노산, 극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산 (Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr 등)으로 치환된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 등에서 일어날 수 있다.
시스테인 변형
불변 영역에서의 이황화 결합의 부가는 TCR 알파 및 베타 사슬의 정확한 페어링을 촉진하는 것으로 보고되었다 (Kuball J et al., Blood. 2007 Mar 15; 109 (6) : 2331-8). 따라서, 불변 영역에서 하나 이상의 시스테인 결합의 부가 또한 본원에 구상된다.
쥐화 ( Murinization )
이전에 언급했듯이, TCRs의 쥐화 (즉, 그들의 쥐 대응물에 의한 알파 및 베타 사슬에서의 인간 불변 영역의 교환)는 숙주 세포에서 TCRs의 세포 표면 발현을 개선하기 위해 일반적으로 적용되는 기술이다. 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 쥐화된 TCRs은 CD3 보조-수용체와 훨씬 효과적으로 결합하고; 및/또는 우선적으로 서로 쌍을 이루며, 원하는 항원 특이성의 TCRs을 발현하기 위해 엑스 비보에서 조작된 인간 T 세포 상에 혼합된 TCRs을 형성하는 경향은 적지만 여전히 그들의 "오리지널" TCRs을 유지하고 발현하는 것으로 생각된다.
최근에 쥐화된 TCRs의 개선된 발현을 담당하는 9개의 아미노산이 확인되었고 (Sommermeyer and Uckert, J Immunol., 2010 Jun 1; 184 (11) : 6223-31), 그것은 그들의 쥐 대응물 잔기에 대해 TCRs 알파 및/또는 베타 사슬 불변 영역의 아미노산 잔기 중 하나 또는 모두를 치환하는 것으로 구상된다. 이 기술은 또한 "최소 쥐화"로 지칭되며, 세포 표면 발현을 향상시킴과 동시에 아미노산 서열에서 "외래" 아미노산 잔기의 수를 감소하여 면역원성의 위험을 줄이는 장점을 제공한다.
일반적으로, TCR 서열 변이체는 본원에 개시된 CDR1, CDR2, CDR3, 알파 사슬 가변 영역, 베타 사슬 가변 영역, 알파 사슬 및/또는 베타 사슬 중 적어도 하나를 포함하거나, 또는 본원에 개시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%의 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것으로 구상된다. 단, 상기 변이체는 첨부된 실시예에서 평가된 TCR과 비교하여 비교 가능한, 동일하거나 개선된 결합 특징들을 나타내야 한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 2개의 (뉴클레오티드 또는 아미노산) 서열이 정렬에서 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 정도를 나타내며, 종종 퍼센트로 표시된다. 바람직하게는, 동일성은 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 따라서, 정확하게 동일한 서열의 2개의 복제물은 100% 동일성을 갖지만, 덜 고도로 보존되고 결실, 부가 또는 대체를 갖는 서열들은 보다 낮은 정도의 동일성을 가질 수 있다. 당업자는 표준 파라미터를 이용한 서열 동일성을 결정하기 위해 예를 들어, Blast(Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), Blast2(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), Smith-Waterman(Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197) 및 ClustalW를 이용할 수 있다.
따라서, SEQ ID NOS: 1 또는 2의 아미노산 서열은 예를 들어 "대상 서열" 또는 "레퍼런스 서열"로서 제공하는 한편, 그와 상이한 CDR3의 아미노산 서열은 "퀴어리 서열"로 제공할 수 있다.
구조물 및 단편
본원에 사용된 용어 "TCR"은 TCR 구조물을 추가로 포함한다. 용어 "구조물"은 본 발명의 TCRs의 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하나 반드시 천연 TCR의 기본 구조 (즉, 가변 도메인이 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬에 결합되어 헤테로다이머를 형성)를 공유하는 것은 아니다. TCR 구조물 및 단편은 전형적으로 일상적인 유전 공학 방법에 의해 수득되며 종종 추가의 기능성 단백질 또는 폴리펩타이드 도메인을 포함하도록 인위적으로 구축된다. 전술한 바에 따르면, 본 발명의 TCR 구조물 및 단편은 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 적어도 하나의 CDR3 알파 및/또는 적어도 하나의 CDR3 베타를 포함하는 것으로 구상된다. 적어도 하나의 CDR1알파, CDR2알파, CDRI베타, CDR2베타, 알파 사슬 가변 영역, 베타 사슬 가변 영역, 알파 사슬 및/또는 베타 사슬, 또는 이들의 조합, 선택적으로, 본원에 예시된 추가의 단백질 도메인 또는 모이어티와 임의로 조합하여 포함하는 구조물 및 단편들이 본원에서 추가로 구상된다. 본원에 제공된 TCR 구조물 및 단편은 상기 기술되고 첨부된 실시예에서 평가된 본 발명의 TCRs과 동일한 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 구상된다.
다량체
용어 "TCR 구조물"은 적어도 하나의 TCR 알파 사슬 가변 영역 또는 TCR 알파-사슬 및 적어도 하나의 TCR 베타-사슬 가변 영역이 서로 공유 결합된 헤테로다이머 및 다량체를 포함한다. 이의 가장 간단한 형태에서, 본 발명에 따른 다가 TCR 구조물은 바람직하게는 링커 분자를 통해 서로 결합된 (예를 들어, 공유적으로 또는 달리 결합된) 2개 또는 3개 또는 4개 이상의 TCRs의 다량체를 포함한다.
적절한 링커 분자는 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 및 엑스트라비딘과 같은 다가 부착 분자들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 각각은 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 갖는다. 따라서, 비오틴화 된 TCRs은 다수의 TCR 결합 부위를 갖는 다량체로 형성될 수 있다. 다량체 내의 TCRs의 수는 다량체를 제조하는데 사용되는 링커 분자의 양 및 임의의 다른 비오틴화 된 분자의 존재 또는 부재와 연관하여 TCR의 양에 달려 있을 것이다. 예시적인 다량체는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체 또는 고차원 다량체 TCR 구조물이다. 본 발명의 다량체는 또한 표지 또는 약물 또는 (고상) 담체와 같은 추가의 기능성 실체를 포함할 수 있다.
용어 "TCR 구조물"은 또한 적절한 링커를 통해 구형체, 바람직하게는 균일 한 비드, 보다 바람직하게는 폴리스티렌 비드, 가장 바람직하게는 생체적합성 폴리스티렌 비드에 결합된 TCR 분자를 포함한다. 이러한 TCR 구조물은 또한 본 발명의 TCR 및 비드에 결합된 소정의 형광 염료를 갖는 비드로 이루어질 수 있다.
융합 단백질
용어 "TCR 구조물"은 또한 적어도 하나의 TCR 알파 사슬, TCR 알파 사슬 가변 영역 또는 CDR3알파 및/또는 적어도 하나의 TCR 베타 사슬, TCR 사슬 가변 영역 또는 CDR3베타; 및 추가로 하나 이상의 융합 성분(들)을 포함하는 융합 단백질 또는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 유용한 성분들은 Fc 수용체; Fc 도메인 (IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM으로부터 유래); 사이토카인 (IL-2 또는 IL-15와 같은); 독소; 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (항-CD3, 항-CD28, 항-CD5, 항-CD16 또는 항-CD56 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 같은); CD247 (CD3-제타), CD28, CD137, CD134 도메인; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
융합 성분으로 사용될 수 있는 예시적인 항체 단편은 (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 또는 "rIgG" ("절반 항체")와 같은 전장의 항체의 단편; scFv, di-scFv 또는 bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, 디아바디, 단일쇄 디아바디, 탠덤 디아바디 (Tandab's), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv, 미니바디, 트리아바디 또는 테트라바디와 같은 멀티바디와 같은 변형된 항체 단편; 및 나노바디와 같은 단일 도메인 항체 또는 VHH, VH 또는 VL일 수 있는 단지 하나의 가변 도메인을 포함하는 단일 가변 도메인 항체를 포함한다.
본 발명의 TCR 구조물은 하나 이상의 항체 또는 항체 단편에 융합되어 1가, 2가 및 다가 (polyvalent/multivalent) 구조물을 생산함으로써 단지 하나의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 특이적인 구조물뿐만 아니라 특정 항원 결합 부위를 통해 하나 이상, 예를 들어, 2개, 3개 이상의 표적 항원과 특이적으로 결합하는 이중 특이적 및 다중 특이적인 (polyspecific/multispecific) 구조물을 생산할 수 있다.
선택적으로, 링커는 본 발명의 TCR 구조물의 하나 이상의 도메인 또는 영역 사이, 즉, TCR 알파 사슬 CDR3, TCR 알파 사슬 가변 영역 및/또는 TCR 알파 사슬, TCR 베타 사슬 CDR3, TCR 베타 사슬 가변 영역 및/또는 TCR 베타 사슬 및/또는 본원에 기술된 하나 이상의 융합 성분(들) 사이에 도입될 수 있다. 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 특히 Chen et al. Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct 15; 65(10): 1357-1369에 의해 검토되었다. 일반적으로, 링커는 가요성의, 절단 가능한 단단한 링커를 포함하며, 구조물의 유형 및 의도된 사용/적용에 따라 선택될 것이다. 예를 들어, 치료적 적용을 위해, 부정적인 면역원성 반응의 위험을 감소시키면서 도메인들 사이의 어느 정도의 가요성 또는 상호작용을 보장하기 위해 비-면역원성의 가요성 링커가 종종 선호된다. 이러한 링커는 일반적으로 작고 비극성 (예를 들어, Gly) 또는 극성 (예를 들어, Ser 또는 Thr)의 아미노산으로 구성되며, 연속된 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 "GS" 링커를 포함한다. 또한, 본 발명의 TCR 구조물에서의 사용을 위해 의도된 가장 널리 사용되는 가요성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 225)의 서열을 갖는다. 다른 적당한 링커는 예를 들어 KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 226) 및 EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 227) 및 GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO: 228)을 포함한다.
본 발명에 따라 구상되는 특히 유용한 TCR 구조물은 본원에 정의된 적어도 하나의 TCR 알파 사슬, TCR 알파 사슬 가변 영역 또는 CDR3 알파, 본원에 정의된 적어도 하나의 TCR 베타 사슬, TCR 베타 사슬 가변 영역 또는 CDR3 베타를 포함하고, 선택적으로 서로 결합되고 선택적으로 링커를 통해 림프구의 표면상의 항원 또는 에피토프에 대한 적어도 하나의 항체 또는 항체 단편 (예컨대, 단일 사슬 항체 단편 (scFv))에 융합된 것들이다. 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)에 의해 인식되는 유용한 항원 표적은 CD3, CD28, CD5, CD16 및 CD56을 포함한다. 상기 구조물은 일반적으로 "TCR 부분" (즉, TCR 알파 및 베타 사슬 또는 이들의 가변 영역 또는 CDR3)이 본원에 정의된 항원 표적을 인식하는 이의 능력을 보유하고, "항체 부분"이 원하는 표면 항원 또는 에피토프에 결합함으로써 각각의 림프구를 표적 세포로 모집하고 표적화하는 한 임의의 구조를 가질 수 있다. 이러한 구조물은 항원 표적 (예를 들어, 종양 세포)을 나타내는 항원 제시 세포 및 림프구 (예컨대, 세포 독성 T 세포 또는 NK 세포)를 함께 결합시키는 "어댑터"로서 유리하게 작용할 수 있다. 그러한 융합 단백질의 예로 약 55 kD의 단일 펩타이드 사슬 상에 상이한 항체들의 2개의 단일-사슬 가변 단편들 (scFvs)로 구성된 이중-특이적인 T 세포 인게이저 (BiTE®)의 원리에 따라 조작된 구조물이다. 따라서, 본 발명의 TCR 구조물은 원하는 결합 특이성의 scFv (또는 다른 결합 도메인), 예를 들어, CD3 또는 CD56에 결합된 본원에 기술된 적어도 하나의 TCR 항원 결합 도메인 (예를 들어, 서로 융합된 TCR 가변 알파 및 가변 베타 사슬)을 포함할 수 있다. scFv (또는 다른 결합 도메인)은 NK 세포 활성화를 위해 예컨대 CD3 수용체 또는 CD56을 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 종양 세포에 특이적으로 발현되는 항원 표적을 통해 종양 세포에 결합한다. 또한, 본원에 기술된 적어도 하나의 TCR 항원 결합 도메인, scFv (또는 다른 결합 도메인) 및 예를 들어, 체내의 작용 부위 (예를 들어, Fc 도메인)로의 구조물의 표적화를 위한 추가 도메인을 포함하는 트리바디가 또한 본원에서 구상된다.
단리된 형태
본 발명의 TCR은 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 형태로 제공될 수 있다. 본원에 사용된 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한"은 TCRs이 이의 생산 환경의 성분으로부터 동정, 분리 및/또는 회수되어, "단리된" TCR이 이의 치료적 또는 진단적 용도를 방해할 수 있는 이의 생산 환경 유래의 다른 오염원 성분이 없거나 실질적으로 없음을 의미한다. 오염원 성분은 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 따라서, "단리된" TCRs은 이러한 오염원 성분을 제거하거나 실질적으로 제거하는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. 전술한 정의는 "단리된" 폴리뉴클레오티드/핵산에 준용하여 동등하게 적용할 수 있다.
가용성 형태
본 발명의 TCRs은 가용성 형태로 제공될 수 있다. 가용성 TCRs은 진단 도구 및 예를 들어 가용성 TCR에 의해 인식되는 항원 표적을 발현하는 암세포에 대해 치료제 또는 효과기 세포를 특이적으로 표적으로 하는 담체 또는 "어댑터"로서 유용하다. 가용성 TCRs (sTCRs)은 전형적으로 TCR 알파 및/또는 베타 사슬, 또는 이들의 가변 영역 또는 CDRs을 포함하고, 선택적으로 이황화 결합을 통해 안정화되거나, 예를 들어, 본 발명의 TCR 구조물과 관련하여 상기 기술된 적절한 링커 분자를 통해 공유 결합된 단편 또는 구조물일 것이다. 그들은 전형적으로 예를 들어 트랜스멤브레인 영역을 포함하지 않을 것이다. 일부 경우에서, 폴리펩타이드 서열의 아미노산 변형은 분자의 용해도 및/또는 특히 상기 언급된 특징들을 제공하지 않는 재조합 숙주에서 생산될 때 (원하는 경우) 알파 및 베타 사슬의 정확한 폴딩 및 페어링을 증가시키기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 생산 숙주 세포로서 대장균을 사용할 때, TCR 알파 및 베타 사슬의 폴딩 및 페어링은 전형적으로 인 비트로에서 수행된다. 따라서, 본 발명에 따른 TCRs은 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 부가적인 시스테인 잔기를 포함할 수 있다.
부가적인 시스테인 브릿지 외에, 다른 유용한 변형은 예를 들어 TCR 알파 및/또는 베타 사슬의 폴딩, 발현 및/또는 페어링을 증가하기 위해 예를 들어 루신 지퍼 및/또는 리보좀성 스킵핑 서열, 예를 들어 Walseng et al. (2015), PLoS ONE 10(4): e0119559에 기술된 피코르나 바이러스 유래의 서열 2A의 부가를 포함한다.
변형
본 발명의 TCRs은 하기에 기술된 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 하기 기술된 변형은 전형적으로 공유 변형일 수 있으며 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 어떤 경우에는, 상기 변형의 도입을 용이하게 하기 위해 TCRs 내의 아미노산 변형이 필요할 수 있다.
표지
본 발명의 TCRs, 특히 (가용성) TCRs은 표지될 수 있다. 유용한 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 선택적으로 다양한 길이의 링커를 통해 일상적인 방법을 사용하여 TCR 또는 TCR 변이체에 결합될 수 있다. "표지" 또는 "표지화 그룹"이란 용어는 검출 가능한 임의의 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 그들이 검출될 분석에 따라 다양한 분류에 속한다. 하기의 예시들은, 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종과 같은 방사성 또는 중동위원소일 수 있는 동위원소 표지 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I); 자성 표지 (예를 들어, 자성 입자); 산화 환원 활성 모이어티; 형광 그룹 (예를 들어, FITC, 로다민, 란탄 계열 인광체), 화학 발광 그룹 및 "저분자" 형광체 또는 단백질성 형광체 중 하나일 수 있는 형광체와 같은 광학 염료 (발색단, 인광체 및 형광체를 포함하나 이에 제한되지 않음); 효소 그룹 (예를 들어, 서양 고추냉이 페록시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼라인 포스파타아제, 비오틴화 그룹); 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프 (예를 들어, 루신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 표지화는 특히 TCRs, TCR 변이체 또는 특히 가용성 TCR 구조물 (본원에 기술된 적어도 하나의 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 사슬을 포함하는 것들과 같은)은 진단 용도로 사용되는 경우에 구상된다.
기능성 모이어티
본 발명의 TCRs, 특히 가용성 TCRs은 예를 들어, 면역원성을 감소하고, 유체역학적 크기 (용액 내 크기), 용해도 및/또는 안정성 (예를 들어, 단백질 분해에 대해 향상된 보호에 의해)을 증가하고 및/또는 혈청 반감기를 연장하기 위해 추가의 기능성 모이어티를 부착하여 변형될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 예시적인 기능성 모이어티는 인체의 다른 단백질에 결합하는 펩타이드 또는 단백질 도메인 (혈청 알부민, 면역글로불린 Fc 영역 또는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)와 같은), 다양한 길이의 폴리펩타이드 사슬 (예를 들어, XTEN 기술 또는 PASylation®), 이에 제한하지는 않으나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEGylation), 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시알킬렌과 같은 폴리올, 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜, 또는 하이드록시에틸 스타치(예를 들어, HESylation®) 또는 폴리시알산 (예를 들어, PolyXen® 기술)과 같은 탄수화물의 공중합체를 포함하는 비-단백질성 고분자를 포함한다.
다른 유용한 기능성 모이어티는 환자의 몸에서 본 발명의 TCR을 운반하는 효과기 숙주 세포를 차단하는데 사용될 수 있는 "자살" 또는 "안전 스위치"를 포함한다. 일례는 Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235에 의해 기술된 Caspase 9 (iCasp9) "안전 스위치"이다. 간단히 말해, 효과기 숙주 세포는 AP1903/CIP와 같은 저분자 이량체화 약물에 의존하여 이량체를 형성하는 (dimerization) 카스파제 9 도메인을 발현하도록 공지된 방법에 의해 변형되고, 변형된 효과기 세포에서 세포사멸이 신속하게 유도된다. 이 시스템은 예를 들어 EP 2173869(A2)에 기술되어 있다. 다른 "자살" "안전 스위치"에 대한 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (Herpes Simplex Virus thymidine kinase)(HSV-TK), CD20의 발현 및 이어서 항-CD20 항체 또는 myc 태그를 이용한 고갈이다 (Kieback et al, Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Jan 15;105(2):623-8).
글리코실화
변경된 글리코실화 패턴을 갖는 TCRs 또한 본원에 구상된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 아미노산 서열 (예를 들어, 하기 논의되는 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재) 및/또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 생물체에 달려 있다. 폴리펩타이드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합 중 하나이다. N-결합은 탄수화물 모이어티의 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 부착을 지칭한다. 결합 분자에의 N-결합 글리코실화 부위의 부가는 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)에서 선택된 하나 이상의 트리-펩타이드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. O-결합 글리코실화 부위는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의해 개시 서열로의 부가 또는 치환에 의해 도일될 수 있다.
TCRs의 글리코실화의 다른 수단은 단백질에 글리코시드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 사용된 커플링 방식에 따라 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실기, (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프하이드릴기, (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 것과 같은 유리 하이드록시기, (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다.
유사하게, 탈글리코실화 (즉, 결합 분자 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거)는 TCRs을 트리플루오로메탄설폰산에 노출함으로써 화학적으로, 또는 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 사용함으로써 효소적으로 달성될 수 있다.
약물 컨쥬게이트
또한, 본 발명의 TCRs, 특히 가용성 TCRs에 저분자화합물과 같은 약물을 첨가하는 것도 고려할 수 있다. 결합은 공유 결합이나 정전기력과 같은 비-공유 상호작용을 통해 이루어질 수 있다. 약물 컨쥬게이트를 형성하기 위해 당업계에 공지된 다양한 링커가 사용될 수 있다.
태그
본 발명의 TCRs, 특히 가용성 TCRs은 각각의 분자 (태그)의 동정, 추적, 정제 및/또는 단리를 돕는 부가 도메인을 도입하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 태그의 비제한적인 예는 Myc-태그, HAT-태그, HA-태그, TAP-태그, GST-태그, 키틴 결합 도메인 (CBD-태그), 말토오스 결합 단백질 (MBP-태그), Flag-태그, Strep-태그 및 이의 변이체들 (예를 들어, Strep II-태그), His-태그, CD20, Her2/neu 태그, myc-태그, FLAG-태그, T7-태그, HA (hemagglutinin)-태그 또는 GFP-태그로 알려진 펩타이드 모티프를 포함한다.
에피토프 태그는 본 발명의 TCR에 결합될 수 있는 유용한 태그의 예이다. 에피토프 태그는 특정 항체의 결합을 허용하는 아미노산의 짧은 연속이므로, 환자의 신체 또는 배양된 (숙주) 세포 내에서 가용성 TCRs 또는 숙주 세포의 결합 및 이동을 동정하고 추적할 수 있다. 에피토프 태그 및 그에 따른 태그화 된 TCR의 검출은 다수의 상이한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 그러한 기술의 예로는 면역조직화학법, 면역침전법, 플로우 사이토메트리, 면역형광현미경법, ELISA, 면역블로팅 ("웨스턴") 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 에피토프 태그는 예를 들어 6 내지 15의 아미노산, 특히 9 내지 11의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 TCR 내에 하나 이상의 에피토프 태그를 포함하는 것이 가능할 수 있다.
태그는 상기 태그에 특이적인 결합 분자 (항체들)의 존재에서 세포를 배양하여 본 발명의 TCR을 전달하는 숙주 세포의 자극 및 확장에 적용될 수 있다.
핵산
본 발명은 본원에 기술된 TCRs을 인코딩하는 핵산을 추가로 제공한다. 상세하게는, TCR 알파 또는 베타 사슬, TCR 알파 또는 베타 사슬 가변 영역, 및 TCR CDR3 알파 및 CDR3 베타, 뿐만 아니라 본 발명의 TCR 변이체, 구조물 및 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드의 서열, 예를 들어 하이브리드 분자를 포함하여 각각 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 형태의 선형 또는 원형, 또는 이의 혼합물로, 변형되거나 비변형된 RNA 또는 DNA를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산은 DNA (dsDNA, ssDNA, cDNA와 같은), RNA (dsRNA, ssRNA, mRNA, ivtRNA와 같은), 이들의 조합 또는 이들의 유도체 (PNA 같은)를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적인 결합 (예를 들어, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기, 예를 들어 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 비정상적인 염기를 함유할 수 있다. 본 발명의 결합 분자가 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있는 한, 화학적, 효소적 또는 대사적 변형을 포함하는 다른 변형들도 또한 고려될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같이 단리된 형태로 제공될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 전사 조절 요소 (프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호를 포함함), 리보좀 결합 부위, 인트론 등과 같은 조절 서열을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명은 SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30으로 구성된 군에서 선택된 레퍼런스 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 동일한 핵산을 포함하거나 이로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 기술된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 본원에 기술된 변경된 아미노산 잔기를 인코딩하는 부가적인 또는 변경된 뉴클레오티드 서열, 코딩된 TCR, 불변 영역 또는 다른 이종 폴리펩타이드의 직접 분비를 유도하는 신호 펩타이드를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 결합 분자의 융합 폴리펩타이드, 단편, 변이체 및 다른 유도체를 인코딩할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 함유한다. 또한, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에 제공되고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 TCR 알파 사슬 가변 영역을 인코딩하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 TCR 베타 사슬 가변 영역을 인코딩한다.
본 발명의 핵산 서열은 원하는 숙주 세포, 예를 들어 인간 림프구에서 최적 발현을 위해; 또는 본 발명의 가용성 TCRs의 발현을 위해 특히 구상되는 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화 (codon optimization)는 코돈에 의해 주어진 종의 고도로 발현된 유전자들에서 일반적으로 드물고, 교환되는 코돈과 같은 아미노산을 인코딩하는 그러한 코돈에 의해 그러한 종의 고도로 발현된 유전자들에서는 일반적으로 빈번한 목적 코돈의 서열 내 교환을 지칭한다. 따라서, 최적 코돈의 선택은 숙주 게놈의 코돈 이용 및 몇몇의 바람직한 및 바람직하지 않은 서열 모티프의 존재에 달려 있다.
벡터
본원에 기술된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 추가로 제공된다. "벡터"는 예를 들어 복제 및/또는 발현될 수 있는 숙주 세포 내로 (외래의) 유전 물질을 전달하는 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다.
용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스 벡터 (레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터 및 아데노바이러스 관련 벡터 (AAV) 포함), 파지, 파지미드, 코스미드 및 인공 염색체 (BAC 및 YAC 포함)를 포함하나, 이에 제한하지는 않는다. 벡터 그 자체는 일반적으로 뉴클레오티드 서열, 공통적으로 인서트 (트랜스진) 및 벡터의 "백본 (backbone)"으로 작용하는 더 큰 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 조작된 벡터는 전형적으로 숙주 세포에서 자기 복제를 위한 기점 (폴리뉴클레오티드의 안정한 발현이 요구되는 경우), 선별 마커 및 제한 효소 절단 부위 (예를 들어, 다중 클로닝 사이트, MCS)을 포함한다. 벡터는 프로모터, 유전자 마커, 리포터 유전자, 표적화 서열 및/또는 단백질 정제 태그를 추가로 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 다수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 많은 것은 상업적으로 이용 가능하다. 적합한 벡터의 예는 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)에서 제공되며, 이를 포함한다.
표적화 벡터
표적화 벡터는 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)에 기술된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법들에 의해 숙주 세포의 염색체에 폴리뉴클레오티드를 통합하는데 사용될 수 있다. 간단히 말해, 적당한 수단은 상동성 재조합 또는 통합 부위의 서열을 특이적으로 표적으로 하는 하이브리드 재조합효소의 사용을 포함한다. 표적화 벡터는 전형적으로 원형이고, 상동성 재조합에 사용하기 전에 선형화된다. 또는, 외래 폴리뉴클레오티드는 융합 PCR에 의해 결합된 DNA 단편 또는 합성적으로 구축된 DNA 단편일 수 있고, 그 이후에 숙주 세포로 재조합된다. 또한, 무작위 또는 비-표적화 된 통합을 초래하는 이종 재조합을 사용할 수도 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
발현 벡터
본 발명의 벡터는 또한 발현 벡터일 수 있다. "발현 벡터" 또는 "발현 구조물"은 적합한 숙주 세포에서 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 본 발명의 TCRs을 인코딩하는 것들의 전사 및 그들의 mRNA의 번역을 위해 사용될 수 있다. 이 과정은 또한 본원에서 본 발명의 TCRs의 "발현"으로 지칭된다.
복제 기점, 선별 마커 및 제한 효소 절단 부위 외에도, 발현 벡터는 전형적으로 발현될 이종 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 생물체 또는 숙주 세포에서 (이종) 폴리뉴클레오티드의 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭하며, 따라서 전사 및 번역 조절 서열을 포함한다. 전형적으로, 원핵생물에서 이종 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 필요한 조절 서열은 프로모터(들), 선택적으로 오퍼레이터 서열(들) 및 리보좀 결합 부위(들)을 포함한다. 진핵생물에서, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 인핸서 및 선택적으로 스플라이스 신호가 전형적으로 필요하다. 또한, 목적 폴리펩타이드의 배양 배지로의 분비를 위해 벡터 내로 특이적인 개시 및 분비 신호가 도입될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열, 특히 동일한 폴리뉴클레오티드 분자 상에 기능적 관계로 놓일 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터는 이 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있는 경우 이종 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 전형적으로 목적 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자의 업스트림에 위치하여 상기 유전자의 발현을 조절한다.
포유류 숙주 세포 발현을 위한 예시적인 조절 서열은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소들, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 (CMV) (CMV 프로모터/인핸서와 같은), 시미안 바이러스 40 (SV40) (SV40 프로모터/인핸서와 같은), 아데노바이러스 (예를 들어, adenovirus major late promoter (AdMLP)) 및 폴리오마에서 유래한 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 전술한 바와 같이, 발현 벡터는 또한 복제 기점 및 선별 마커를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 추가로 포함할 수 있다. 진핵생물의 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 적합한 선별 마커는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (hgprt) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (aprt) 유전자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 유전자는 dhfr (메토트렉세이트 내성), gpt (마이코페놀산 내성), neo (G-418 내성) 및 hygro (하이그로마이신 내성)를 포함한다. 발현 수준을 향상시키기 위해 벡터 증폭이 사용될 수 있다. 일반적으로, 선별 마커 유전자는 발현될 폴리뉴클레오티드 서열에 직접 연결되거나, 동시-형질전환에 의해 동일한 숙주 세포에 도입될 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명은 벡터에 삽입된 (즉, 포함된) 본원에 기술된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 TCR 또는 이의 알파 또는 베타 사슬, 또는 알파 또는 베타 가변 도메인, 또는 CDR3 알파 또는 CDR3 베타를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 (복제 가능한) 벡터를 제공한다.
당업자는 예를 들어, TCR 발현을 위한 숙주 세포에 기초하여 적당한 발현 벡터를 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 적당한 발현 벡터의 예는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 MP71 벡터 또는 레트로바이러스 SIN 벡터; 및 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 SIN 벡터이다. 본 발명의 TCRs을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 예를 들어 차후 이종 TCR을 발현하도록 구상된 림프구를 감염시킬 수 있다. 적당한 발현 벡터에 대한 다른 예는 Sleeping Beauty (SB) 트랜스포존 트랜스포사아제 DNA 플라스미드 시스템, SB DNA 플라스미드이다. 본 발명의 핵산 및/또는 특히 발현 구조물은 일시적인 RNA 형질감염에 의해 세포 내로 전달될 수 있다.
천연 TCR 발현을 위해 현재 사용되는 바이러스 벡터는 전형적으로 하나의 벡터에서 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 유전자를 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열 또는 돼지 테스코바이러스 (teschovirus)에서 유래한 2A 펩타이드 서열 중 하나와 연결하여 형질도입된 세포 내에서 바이러스 프로모터의 조절하에서 단일 메신저 RNA (mRNA) 분자를 발현시킨다.
숙주 세포
본 발명은 또한 본원에 기술된 TCR, 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
다양한 숙주 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 수혜자이거나 수혜자였을 수 있고, 및/또는 본 발명의 TCR을 발현 (및 선택적으로 분비)할 수 있는 세포를 포함한다. "세포"와 "세포 배양물"이라는 용어는 달리 명확하게 명시하지 않는 한 TCR의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어 "숙주 세포"는 또한 "숙주 세포주"를 포함한다.
일반적으로, 용어 "숙주 세포"는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하며, 박테리아, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 및 곤충 세포 및 포유류 세포, 예를 들어 쥐, 생쥐, 마카크 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기의 관점에서, 본 발명은 특히 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 예를 들어 본원에 기술된 TCR 또는 TCR 구조물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 당업계에 공지된 일상적인 방법, 예를 들어, 형질감염, 형질전환 등에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
"형질감염"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드 (벡터 포함)를 의도적으로 표적 세포에 도입하는 과정이다. 일례로, RNA 형질감염, 즉 숙주 세포 내로 RNA (in vitro transcribed RNA, ivtRNA와 같은)를 도입하는 과정이 있다. 이 용어는 진핵세포에서 비-바이러스 방법에 주로 사용된다. 용어 "형질도입"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 바이러스-매개 전달을 기술하는데 종종 사용된다. 동물세포의 형질감염은 전형적으로 물질의 섭취를 허용하기 위해 세포막에 일시적인 공극 또는 "구멍"을 여는 것을 포함한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트를 이용하여, 전기천공에 의해, 세포 압착에 의해 또는 리포좀을 생산하는 물질과 양이온성 지질의 혼합에 의해 수행할 수 있는데, 세포막과 융합하여 내부에 그들의 화물을 저장한다. 진핵 숙주 세포를 형질감염시키는 예시적인 기술은 지질 비히클을 매개로 한 흡수, 열 충격을 매개로 한 흡수, 칼슘 포스페이트를 매개로 한 형질감염 (칼슘 포스페이트/DNA 동시-침전), 미세주입 및 전기천공을 포함한다.
용어 "형질전환"은 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드 (벡터 포함)의 박테리아, 및 식물 세포를 포함하여 비-동물성 진핵 세포로의 비-바이러스 전달을 기술하는데 또한 사용된다. 따라서, 형질전환은 이의 주변으로부터 세포막(들)을 통한 직접적인 흡수 및 이어서 외인성 유전 물질 (핵산 분자)의 통합으로 인한 박테리아 또는 비-동물성 진핵 세포의 유전적 변경이다. 형질전환은 인공적인 수단에 의해 달성될 수 있다. 형질전환이 일어나기 위해서는, 세포 또는 박테리아가 기아 및 세포 밀도와 같은 환경 조건에 대해 시간 제한적인 반응으로써 일어날 수 있는 컨피턴스 상태에 있어야 한다. 원핵생물의 형질전환을 위해, 기술은 열 충격을 매개로 한 흡수, 손상되지 않은 세포와 박테리아 원형질체의 융합, 미세주입 및 전기천공을 포함할 수 있다. 식물 형질전환을 위한 기술은 예를 들어, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (A. tumefaciens)에 의한 아그로박테리움을 매개로 한 전달, 급속 추진된 텅스텐 또는 금 미세발포물, 전기천공, 미세주입 및 폴리에틸렌 글리콜을 매개로 한 흡수를 포함한다.
따라서, 상기의 관점에서, 본 발명은 본원에 기술된 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
본 발명의 TCRs의 발현을 위해, 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하고, 및/또는 원하는 대로 유전자 산물 (즉, RNA 및/또는 단백질)을 변형하고 프로세싱하는 숙주 세포가 선택될 수 있다. 유전자 산물의 그러한 변형 (예컨대, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 TCR의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 유전자 산물의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 산물을 올바르게 변형하고 프로세싱할 수 있다. 이를 위해, 일차 전사체의 적당한 프로세싱, 글리코실화 및 유전자 산물의 인산화를 위한 세포성 기구를 갖는 숙주 세포가 사용될 수 있다.
본원에서 (a) 본 발명의 TCRs를 특히 가용성 형태로 발현하고 수득하기 위한 숙주 세포 ("생산 숙주 세포") 및 (b) 본 발명의 TCR을 발현하고 효과기 기능을 갖는 숙주 세포 ("효과기 숙주 세포")를 제공하는 것이 구상된다. 이러한 "효과기 숙주 세포"는 치료학적 적용에 특히 유용하며, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 구상된다. 바람직한 "효과기 숙주 세포"는 세포독성 T 림프구 (CTL), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 감마/델타 T 세포와 같은 림프구를 포함한다.
"생산 숙주 세포"
세포
본 발명의 가용성 TCRs의 발현에 사용되는 "생산 숙주 세포"는 바람직하게는 다량의 재조합 단백질을 발현할 수 있다.
"생산 숙주 세포"로 사용될 수 있는 예시적인 포유류 숙주 세포는 DG44 및 DUXBI 1, NSO, COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체)와 같은 DHFR 마이너스 CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포), HEK293 (인간 신장) 및 SP2 (마우스 골수종) 세포를 포함한다. 다른 예시적인 숙주 세포주는 HELA (인간 자궁경부암), CVI (원숭이 신장 라인), VERY, BHK (아기 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610 (차이니즈 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 라인), P3x63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-IcIBPT (소 내피세포) 및 RAJI (인간 림프구)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스, ATCC (American Tissue Culture Collection) 또는 출판된 문헌으로부터 입수 가능하다.
박테리아, 효모, 곤충 또는 식물 세포와 같은 비-포유류 세포도 쉽게 입수할 수 있으며, 상기 기술된 "생산 숙주 세포"로 사용할 수도 있다. 예시적인 박테리아 숙주 세포는 대장균 (Escherichia coli), 살모넬라 (Salmonella)와 같은 장내세균과 (Enterobacteriaceae); 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실러스과 (Bacillaceae); 폐렴구균 (Pneumococcus); 연쇄상구균 (Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)를 포함한다. 다른 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 효모 세포를 포함한다. 곤충 세포는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
전술한 바에 따르면, 생각할 수 있는 발현 시스템 (즉, 상기 기술된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포)은 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코즈미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예를 들어, 대장균 (E. coli), 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis))와 같은 미생물; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예컨대, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피키아 (Pichia)); 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV, 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템을 포함한다. 포유류 세포의 게놈에서 유래한 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스에서 유래한 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 레이트 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, cytomegalovirus (CMV) major immediate-early promoter (MIEP) 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 탑재한 포유류 발현 시스템이 종종 바람직하다. 적당한 포유류 숙주 세포는 공지의 세포주 (예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)로부터 선택될 수 있으나, 세포독성 T 림프구 (CTLs), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 감마/델타-T-세포와 같은 림프구를 사용하는 것도 생각할 수 있다.
전술한 바에 따르면, 본 발명은 또한 (i) 숙주 세포 (즉, 생산 숙주 세포)를 TCR의 발현을 유발하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 (ii) 상기 TCR을 정제하는 단계를 포함하는 본원에 기술된 TCR의 생산 및 수득 방법을 제공한다.
배양
발현 벡터를 탑재한 숙주 세포는 본원에 제공된 TCRs, 특히 본원의 다른 곳에서 기술된 알파 사슬 및/또는 베타 사슬의 생산에 적합한 조건하에서 성장되고, 알파 및/또는 베타 사슬 단백질 합성에 대해 분석된다. 이중 사슬로 된 TCRs의 발현을 위해, 알파 및 베타 사슬 모두를 인코딩하는 벡터는 완전한 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 동시-발현될 수 있다.
정제
본 발명의 TCR이 일단 발현되면, 그것은 당업계에 공지된 임의의 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피), 친화성 크로마토그래피, 특히 프로테인 A, 프로테인 G 또는 렉틴 친화성 크로마토그래피, 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 당업자는 회수될 TCR의 개별 특징들에 기초하여 적합한 정제 방법을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
"효과기 숙주 세포"
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 벡터 또는 TCR을 포함하는 "효과기 숙주 세포"를 제공한다. 상기 효과기 숙주 세포는 일상적인 방법을 사용하여 본 발명의 TCR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 변형되고, 특히 세포 표면상에 본원에 기술된 TCR을 발현하도록 구상된다. 본 발명의 목적을 위해, "본 발명의 TCR을 발현하는 변형된 숙주 세포"는 일반적으로 예를 들어 첨부된 실시예에서 기술된 RNA 형질감염에 의해 본 발명에 따른 TCR을 발현하도록 처리되거나 변경된 (효과기 또는 생산) 숙주 세포를 지칭한다. 본원의 다른 곳에서 기술된 것들과 같이, 변형 또는 형질감염 또는 형질도입의 다른 방법들 또한 구상된다. 따라서, 용어 "변형된 숙주 세포"는 바람직하게는 본 발명의 TCR을 발현하는 "형질감염된", "형질도입된", 및 "유전자 변형된" 숙주 세포를 포함한다.
바람직하게는, 이러한 "(변형된) 효과기 숙주 세포" (특히 "(변형된) 효과기 림프구")는 이의 특이적인 항원 표적에의 TCR의 결합 시 세포내 신호 전달을 통해 효과기 기능을 매개할 수 있다. 이러한 효과기 기능은 예를 들어 퍼포린 (perforin) (표적 세포막에 구멍을 만듦)의 방출, 그랜자임 (granzymes) (세포사멸을 유발하는 세포 내에서 작용하는 프로테아제), Fas 리간드의 발현 (Fas-함유 표적 세포에서 세포사멸을 활성화시킴) 및 사이토카인, 바람직하게는 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α와 같은 Th1/Tc1 사이토카인의 방출을 포함한다. 따라서, 치료될 대상체에서 이의 항원 표적을 인식 및 결합할 수 있는 본 발명의 TCR을 발현하도록 조작된 효과기 숙주 세포는 상기 언급된 효과기 기능들을 수행하여 표적 (예를 들어, 암) 세포를 죽이는 것으로 구상된다. 표적 세포의 세포용해는 예를 들어, TCR-형질감염된 수혜자 T 세포와 공-배양 동안 형광 표지된 표적 세포의 소멸을 검출하는 CTL 형광 살상 분석 (CTL, USA)으로 평가될 수 있다.
상기의 관점에서, 효과기 숙주 세포는 바람직하게는 즉, 전형적으로 본원에 기술된 TCR 알파 및 베타 사슬; 및 신호 전달 서브 유닛 CD3 감마, 델타, 엡실론 및 제타 (CD3 복합체) 또한 포함하는 기능적 TCR을 발현한다. 더욱이, 보조-수용체 CD4 또는 CD8의 발현 또한 요구될 수 있다. 일반적으로, 항원 결합, 수용체 활성화 및 다운스트림 신호 전달 (예를 들어, Lck, FYN, CD45 및/또는 Zap70)과 관련된 필수 유전자가 탑재된 림프구, T 세포가 효과기 숙주 세포로 특히 적합하다. 그러나 CD3 신호 전달 서브 유닛 및/또는 전술한 다운스트림 신호 전달 분자가 없는 (즉, 본원에 기술된 항원 표적을 인식할 수 있으나, CD3 및/또는 전술한 다운스트림 신호전달 분자에 의해 매개되는 효과기 기능들이 없는) "결합 도메인"으로서 본 발명의 TCR을 발현하는 효과기 숙주 세포 또한 본원에 구상된다. 이러한 효과기 세포는 본원에 기술된 항원 표적을 인식할 수 있고, 선택적으로 CD3 신호 전달 및/또는 전술한 다운스트림 신호 전달 분자의 신호 전달과 연관이 없는 다른 기능들을 수행할 수 있는 것으로 구상된다. 예시들은 본 발명의 TCR을 발현하고, 예를 들어, 그들의 항원 표적의 인식 시 세포독성 과립을 방출할 수 있는 NK 또는 NKT 세포를 포함한다.
따라서, 세포독성 T 림프구 (CTL), CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, NK 세포, NKT 세포, 감마/델타-T 세포를 유용한 림프구 효과기 숙주 세포로 간주한다. 본 발명의 재조합 TCR을 발현하는 이러한 림프구는 본원에서 "변형된 효과기 림프구"로도 지칭된다. 그러나 당업자는 일반적으로 원하는 효과기 기능을 유도하는 TCR 신호 전달 경로의 임의의 성분이 당업계에 공지된 재조합 유전 공학 방법에 의해 적당한 숙주 세포 내로 도입될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
효과기 숙주 세포, 특히 T 세포와 같은 림프구는 본 발명의 TCR을 발현하기 위해 처리 및 형질전환 또는 형질도입될 대상체에서 수득된 자가 숙주 세포일 수 있다. 전형적으로, TCR의 재조합 발현은 첨부된 실시예에 기술된 바이러스 벡터를 사용하여 달성될 것이다. 환자로부터 세포를 수득하고 단리하는 기술은 당업계에 공지되어 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본원에 제공된 효과기 숙주 세포는 특히 치료적 적용을 위해 구상된다. 숙주 세포의 추가의 유전자 변형은 치료적 효능을 증가시키는데 바람직할 수 있다. 예를 들어, "효과기 숙주 세포"로서 자가 CD8+ T 세포를 사용하는 경우, 적당한 부가적인 변형은 내인성 TCR, CTLA-4 및/또는 PD-1 발현의 하향 조절; 및/또는 CD28, CD134, CD137과 같은 보조자극분자의 증폭을 포함한다. 전술한 유전적 변형을 달성하기 위한 수단 및 방법은 당업계에 기술되어있다.
숙주 세포의 표적화 된 게놈 조작을 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, siRNA를 이용한 유전자 넉다운 외에도, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALEN) 및 특히 Kim & Kim Nature Reviews Genetics 15, 321-334 (2014)에서 검토된 박테리아의 clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas (CRISPR-associated) system에서 유래한 RNA-guided engineered nucleases (RGENs)와 같은 소위 "프로그램 가능한 뉴클레아제"의 이용을 포함한다. 예를 들어, TALEN과 같은 프로그램 가능한 뉴클레아제를 사용하여 PD-1, CTLA-4 또는 내인성 TCR과 같은 "원치않는" 단백질을 코딩하는 DNA 영역을 잘라내어 그들의 발현을 줄일 수 있다. T 세포를 (효과기) 숙주 세포로 사용할 때, 내인성 TCR의 하향 조절은 내인성 및 외인성 TCR 알파/베타 사슬의 원치않는 "미스페어링"을 줄이는 장점을 갖는다.
약학/진단 조성물
본 발명은 또한 본원에 기술된 하나 이상의 활성제, TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포, 및 선택적으로 하나 이상의 약학적 부형제(들)을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 따라서, 약학 조성물 또는 의약의 제조를 위한 상기 TCR, 핵산, 벡터 및 숙주 세포의 사용 또한 본원에서 구상된다.
용어 "약학 조성물"은 특히 인간에게 투여하기에 적합한 조성물을 지칭한다. 그러나 비인간 동물에게 투여하기에 적합한 조성물 또한 일반적으로 그 용어에 포함된다.
약학 조성물 및 이의 성분 (즉, 활성제 및 선택적으로 부형제)은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능하다. 즉, 수혜자에게 임의의 바람직하지 않은 국소 또는 전신 효과를 일으키지 않으면서 원하는 치료 효과를 이끌어낼 수 있다. 본 발명의 약학적으로 허용 가능한 조성물은 예를 들면 무균 상태일 수 있다. 상세하게는, "약학적으로 허용 가능한"이란 용어는 동물, 보다 상세하게는, 인간에게 사용하기 위해 규제 기관 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 의해 승인됨을 의미할 수 있다.
전술한 활성제 (예를 들어, 숙주 세포 또는 TCR)는 바람직하게는 치료학적 유효량으로 약학 조성물 중에 존재한다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료 효과를 이끌어내는 활성제의 양을 의미한다. 치료 효능 및 독성은 세포 배양 또는 시험 동물에서, 예를 들어 ED50 (집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 투여량) 및 LD50 (집단의 50%에게 치사량)과 같은 표준 절차에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이며, 비율, ED50/LD50로 표현될 수 있다. 큰 치료 지표를 나타내는 약학 조성물이 바람직하다.
투여량
TCR 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포의 정확한 투여량은 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다. 적절한 투여량은 본 발명의 활성제의 충분한 양을 제공하고, 바람직하게는 치료학적으로 유효하며, 즉 원하는 치료 효과를 이끌어낸다.
당업계에 공지된 바와 같이, 치료 목적 (예를 들어, 관해 유지 대 질병의 급성 악화기), 투여의 경로, 시간 및 빈도, 투여 제형의 시간 및 빈도, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 질병 상태의 중증도, 약물 조합(들), 반응 민감도 및 치료에 대한 내성/반응에 대한 조정이 필요할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 가용성 TCRs에 대한 적절한 투여량 범위는 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터를 사용하여 결정될 수 있으며, ED50을 포함할 수 있다. 전형적으로, 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100000 마이크로그램, 약 2 g의 총 투여량까지 다양할 수 있다. 본 발명의 활성제의 예시적인 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg의 범위이다. 특정 투여량 및 전달 방법에 관한 지침이 문헌에 제공되어있다. 치료는 본 발명의 활성제의 치료학적으로 유효한 투여량의 단일 투여 또는 치료학적으로 유효한 투여량의 다중 투여를 요구할 수 있는 것으로 인식된다. 예를 들어, 일부 약학 조성물은 특정 조성물의 제형, 반감기 및 제거율에 따라 3 내지 4일마다, 매주, 또는 2주마다 한번, 또는 한달에 한번 투여될 것이다.
전술한 바와 같이, 약학 조성물은 선택적으로 하나 이상의 부형제 및/또는 추가의 활성제를 포함할 수 있다.
부형제
용어 "부형제"는 충전제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 흡수제, 접착방지제, 활택제, 보존제, 항산화제, 향료, 착색제, 감미료, 용매, 공용매, 완충제, 킬레이팅제, 점증제 (viscosity imparting agent), 계면활성제, 희석제, 습윤제, 담체, 희석제, 방부제, 유화제, 안정화제 및 등장화제 (tonicity modifier)를 포함한다. 본 발명의 원하는 약학 조성물을 제조하기 위한 적당한 부형제를 선택하는 것은 당업자의 지식 범위 내에 있다. 본 발명의 약학 조성물에서 사용하기 위한 예시적인 담체는 식염수, 완충된 염수, 덱스트로스 및 물을 포함한다. 전형적으로, 적절한 부형제의 선택은 특히 사용된 활성제, 치료될 질병, 및 약학 조성물의 원하는 제형에 달려 있을 것이다.
추가 활성제
본 발명은 또한 상기 특정된 하나 이상의 본 발명의 활성제 (예를 들어, 숙주 세포 또는 TCR 구조물) 및 치료될 질병의 치료 및/또는 예방에 적합한 하나 이상의 추가 활성제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 조합에 적합한 활성 성분의 바람직한 예는 시스-플라틴, 메이탄신 유도체, 라첼마이신, 칼리케아미신, 도세탁셀, 에토포사이드, 겜시타빈, 이포스파마이드, 이리노테칸, 멜팔란, 미톡산트론, 소르피머 소듐포토프린 II, 테모졸마이드, 토포테칸, 트리메트리에이트 글루쿠로네이트, 아우리스타틴 E 빈크리스틴 및 독소루비신과 같은 공지의 항암 약물; 및 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 엑소톡신 A, DNAase 및 RNAase과 같은 펩타이드 세포독소; 요오드 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90, 비스무트 210 및 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213과 같은 방사성 핵종; 전구약물, 예를 들어 항체 지향 효소 전구-약물; IL-2와 같은 면역-자극제, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등과 같은 케모카인, 항-CD3 항체 또는 이의 단편과 같은 항체 또는 이의 단편, 보체 활성제, 이종 단백질 도메인, 동종 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인 및 바이러스/박테리아 펩타이드를 포함한다.
투여
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에는 다양한 경로가 적용 가능하다. 전형적으로, 투여는 비경구적으로 달성될 것이다. 비경구 전달 방법은 국소, 동맥 내, 근육 내, 피하, 골수 내, 척수강 내, 심실 내, 정맥 내, 복강 내, 자궁 내, 질 내, 설하 또는 비강 내 투여를 포함한다.
제형화
본 발명의 약학 조성물은 특히 예를 들어, 고체, 액체, 기체 또는 동결 건조된 형태로 사용된 활성제 (예를 들어, 가용성 TCR)에 따라 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 특히 연고, 크림, 경피 패치, 젤, 분말, 정제, 용액, 에어로졸, 과립제, 환제, 현탁제, 유제, 캡슐, 시럽, 액체, 엘릭서, 추출물, 팅크 또는 유체 추출물 형태로 또는 원하는 투여 방법에 적합한 형태일 수 있다. 의약을 생산하기 위한 자체 공지된 공정은 Remington's Pharmaceutical Sciences의 22판(Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa., 2012)에 제시되어 있으며, 예를 들면 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 레비게이팅, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결 건조 공정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 숙주 세포 또는 가용성 TCR을 포함하는 약학 조성물은 전형적으로 액체 형태로 제공될 것이며, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 완충용액을 포함할 것이다.
본 발명의 약학 조성물을 제조한 후, 그들을 적절한 용기에 넣고 지시된 질병의 치료를 위해 표지할 수 있다. 그러한 표지화는 예를 들어 투여의 양, 빈도 및 방법이 포함된다.
치료
따라서, 전술한 관점에서 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기술된 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 제공한다.
TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포는 일반적으로 질병 또는 장애의 처리 검출, 진단, 예후예측, 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 이의 모든 문법적 형태의 용어 "치료"는 이를 필요로 하는 대상체의 치료 또는 예방적 치료를 포함한다. "치료 또는 예방적 치료"는 임상 및/또는 병리학적 징후의 완전한 예방을 목적으로 하는 예방적 치료, 또는 임상 및/또는 병리학적 징후의 개선 또는 완화를 목적으로 하는 치료적 치료를 포함한다. 따라서, 용어 "치료"는 또한 질병의 개선 또는 예방을 포함한다.
용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 치료가 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 지칭한다. 포유류 대상체는 일반적으로 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 기니아피그, 돼지, 토끼, 생쥐, 마우스, 말, 소, 암소 등을 포함한다. 그러나 본원에 제공된 TCR, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 약학 조성물은 특히 인간 대상체, 특히 HLA-A2-양성인 대상체의 치료를 위해 구상된다.
직접 투여
치료를 위해, 본 발명의 TCRs, 특히 가용성 TCRs, 핵산, 벡터 (예컨대, 바이러스 벡터) 또는 숙주 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암의 검출, 진단, 예후예측, 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 TCRs, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 제공한다. 상기 방법은 (a) 본 발명의 (i) TCR (ii), 핵산, (iii) 벡터, (iv) 숙주 세포 및/또는 (v) 약학 조성물 중 하나 이상을 제공하는 단계; 및 (b) (i) 내지 (v) 중 하나 이상을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 암 치료의 추가 단계, 예를 들어 방사선 조사, 또는 하나 이상의 항암제의 투여를 포함할 수 있다.
엑스 비보 ( ex vivo ) 치료
본 발명에 따른 치료는 또한 (a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 림프구를 포함하는 단계; (b) 본 발명의 TCR, 핵산, 벡터 숙주 세포 및/또는 약학 조성물의 하나 이상을 제공하는 단계; (c) 단계 (b)의 (i) 내지 (v) 중 하나 이상을 단계 (a)의 림프구에 도입하여 변형된 림프구를 얻는 단계; (d) 단계 (c)의 변형된 림프구를 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
단계 (a)에서 제공되는 림프구는 특히 전술한 바와 같이 "효과기 숙주 세포"로 구상되며 T 세포, NK 세포 및/또는 NKT 세포, 특히 CD8+T 세포로부터 유리하게 선택되고; 당업계에 공지된 일상적인 방법에 의해 대상체의 샘플, 특히 혈액 샘플로부터 이전 단계 (a')에서 수득될 수 있다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 TCR을 발현할 수 있고 본원에 기술된 원하는 생물학적 효과기 기능들을 발휘할 수 있는 다른 림프구를 사용하는 것도 고려할 수 있다. 더욱이, 상기 림프구는 전형적으로 대상체의 면역계와의 적합성을 위해 선택될 것이고, 즉 그들은 바람직하게는 면역원성 반응을 이끌어내지 않을 것이다. 예를 들어, "만능 수혜자 세포 (Universal Recipient Cells)", 즉 인 비트로에서 성장하고 확장될 수 있는 원하는 생물학적 효과기 기능들을 발휘하는 보편적으로 적합한 림프구를 사용하는 것이 고려될 수 있다. 따라서, 그러한 세포의 사용은 단계 (a)에서 대상체 자신의 림프구를 수득하고 제공할 필요성을 방지할 것이다.
상기 단계 (c)의 엑스 비보 도입은 본원에 기술된 핵산 또는 벡터를 전기천공을 통해 림프구 내로 도입하거나, 효과기 숙주 세포와 관련하여 이전에 기술된 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 림프구를 감염시켜 수행될 수 있다. 다른 고려할 수 있는 방법으로 리포좀과 같은 형질감염 시약 또는 일시적인 RNA 형질감염의 사용이 포함된다. 예를 들어, (레트로)-바이러스 벡터 또는 일시적인 RNA 형질감염에 의한 (프라이머리) T 세포로의 항원-특이적인 TCR 유전자의 전달은 차후에 공여자로 재-도입될 수 있는 종양-관련 항원-특이적인 T 세포를 위한 유망한 도구를 나타내며, 그들은 특이적으로 상기 항원을 발현하는 종양 세포를 표적으로 하고 파괴한다. 본 발명에서, 상기 종양-관련 항원은 PRAME100-108, 특히 이의 HLA-A*02 결합 형태이다.
상기의 관점에서, 본 발명의 또 다른 양태는 변형된 림프구를 생성하기 위한 본원의 다른 곳에서 기술된 TCR, 핵산 서열, 벡터 및/또는 숙주 세포의 용도이다. 예를 들어, 핵산 및 벡터를 림프구에 도입하기 위한 수단 및 방법은 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.
진단 조성물
본 발명은 또한 하나 이상의 진단제(들)로서 본원에 기술된 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함하는 진단 조성물을 제공한다. 전형적으로, 상기 진단제는 이의 항원 표적에 대한 이의 결합을 검출하기 위한 수단, 예를 들어, 본 발명의 TCR 구조물과 관련하여 기술된 표지를 포함할 것이다. 숙주 세포에 관해서는, 예를 들어, 항원 인식시 (세포독성 과립 대신에) 방출되는 염료 또는 조영제를 포함하는 변형된 숙주 세포를 사용하는 것을 고려할 수 있다.
용도
본 발명은 인 비보 또는 인 비트로에서 달성될 수 있는 대상체에서 암을 검출, 진단 및/또는 예후예측하기 위한 전술한 진단제의 용도를 구상한다.
따라서, 본 발명은 인 비보에서 대상체의 암을 검출, 진단 및/또는 예후예측하기 위한 진단 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 진단제로서, 본 발명의 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포를 포함한다. 상기 방법은 전형적으로 (a) 상기 진단제를 대상체에게 투여하는 단계 및 (b) 상기 진단제의 이의 항원 표적에 대한 결합을 검출하는 단계를 포함할 것이다.
또한, 본 발명은 인 비트로에서 암을 검출, 진단 및/또는 예후예측하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 (a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 하나 이상의 세포를 포함하는 단계; (b) 상기 샘플을 본 발명의 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암의 존재를 진단하는 방법을 제공한다. 상기 복합체는 진단제의 이의 항원 표적과의 결합에 대한 지표인 것으로 구상되고, 상기 항원 표적을 발현하는 (암) 세포의 존재에 대한 지표이다.
두 가지 방법 모두에서 진단제의 이의 항원 표적에 대한 결합은 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용함으로써 검출 가능하며, 특히 사용된 특정 진단제에 달려있을 것이다. 본 발명의 진단제에 결합될 수 있는 적합한 표지는 표지된 TCR 구조물에 관한 섹션에서 예시된다. 변형된 림프구 생성을 위한 용도.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 달리 명시하지 않는 한 복수의 레퍼런스를 포함하는 것으로 알아야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 시약"에 대한 레퍼런스는 이러한 상이한 시약들 중 하나 이상을 포함하고, "그 방법"에 대한 레퍼런스는 당업자에게 공지된 등가의 단계 및 방법에 대한 레퍼런스를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 일련의 요소들 전에 기재된 "적어도"라는 용어는 그 시리즈의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 일상적인 실험을 사용하여, 본원에 기술된 본 발명의 특정 구체예들에 대한 많은 균등물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어로 연결된 모든 요소 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 그러나 그것은 또한 구체적인 숫자를 포함하며, 예를 들어, "약 20"은 20을 포함한다.
용어 "이하" 또는 "더 큰"은 구체적인 숫자를 포함한다. 예를 들어, 20 이하는 더 작거나 같음을 의미한다. 유사하게, 더 많거나 더 크다는 각각 더 많거나 같고, 또는 더 크거나 같음을 의미한다.
본 명세서 및 이하의 청구 범위에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 하나의 정수 또는 단계, 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 용어 "함유하는(containing)" 또는 "비롯한(including)" 또는 때로는 본원에 사용될 때 용어 "갖는(having)"으로 치환될 수 있다.
본원에 사용될 때 "이로 구성된"은 청구항 요소에 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본원에 사용될 때, "필수적으로 구성된"은 청구항의 기본적이고 새로운 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계들을 제외하지 않는다.
본원의 각각의 예에서, "포함하는", 필수적으로 구성된" 및 "이로 구성된"과 같은 용어는 다른 두 용어 중 하나로 치환될 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 재료, 시약 및 물질 등에 한정되지 않고 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 특정 구체예들만 기술하기 위한 것이며, 청구 범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 인용된 모든 간행물 및 특허 (모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조자의 설명서, 소개서 등을 포함)는 위 또는 아래 상관없이, 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본원에 있는 어떤 것도 본 발명이 선 발명에 의해 그러한 발명의 개시를 앞서지 않는다는 인정으로 해석되어서는 안 된다. 참고 문헌에 수록된 내용이 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 명세서가 임의의 그러한 내용을 대신할 것이다.
본 발명 및 이의 이점에 대한 더 나은 이해는 다음의 실시예로부터 얻어질 것이며 단지 예시적인 목적으로 제공된다. 이 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 한정하려는 것은 아니다.
본 발명은 또한 다음의 항목들을 갖는다:
1. T-세포 수용체 (TCR)은,
(i) CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역의 CDR3, 또는
SEQ ID NO: 1과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는
(ii) CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR3, 또는
SEQ ID NO: 2와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
2. 항목 1에 따른 TCR에 있어서, 상기 TCR은 X1LX2GLDX3LL (SEQ ID NO: 31)의 아미노산 서열 또는 이의 MHC-결합 형태 내에 포함된 에피토프, 바람직하게는 VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32)의 아미노산 서열 또는 이의 MHC-결합 형태 내에 포함된 에피토프에 결합할 수 있다.
3. 항목 1 또는 항목 2 중 어느 한 항목에 따른 TCR은, (i) SEQ ID NO: 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역, 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역을 포함한다.
4. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은,
(i) TCR 알파 사슬 불변 영역, 및/또는
(ii) TCR 베타 사슬 불변 영역을 더 포함한다.
5. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은,
(i) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 13으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 7, 11, 9 또는 13과 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬; 및/또는
(ii) SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 8, 10, 12 또는 14와 적어도 80%의 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬을 포함한다.
6. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR에 있어서, 상기 TCR은 천연 TCR, TCR 변이체, TCR 단편 또는 TCR 구조물로부터 선택된다.
7. 항목 6의 TCR 구조물은, 서로 공유 결합되어 TCR 헤테로다이머 또는 다량체를 형성하는 적어도 하나의 TCR 알파 사슬(들) 및 적어도 하나의 TCR 베타 사슬(들)을 포함한다.
8. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은, Fc 수용체; IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 Fc 도메인; IL-2 또는 IL-15를 포함하는 사이토카인; 독소; 항-CD3, 항-CD28, 항-CD5, 항-CD16 또는 항-CD56 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CD247 (CD3-제타), CD28, CD137, CD134 도메인 또는 이들의 조합으로부터 선택적으로 선택되는 하나 이상의 융합 성분(들)을 더 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 링커를 더 포함한다.
9. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은,
(i) 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 정의된 적어도 하나의 TCR 알파-사슬; 및
(ii) 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 정의된 적어도 하나의 TCR 베타-사슬
(iii) 림프구 표면의 항원 또는 에피토프에 대한 항체 또는 단일사슬 항체 단편 (scFv)을 포함하고,
TCR 알파-사슬(들) 및 TCR 베타-사슬(들)은 서로 결합되고 선택적으로 링커를 통해 상기 항체 또는 scFv에 융합된다.
10. 항목 9에 따른 TCR에 있어서, 상기 항원은 CD3, CD28, CD5, CD16 또는 CD56으로부터 선택된다.
11. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은, 적어도 하나의 표지를 더 포함한다.
12. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR은, 가용성이다.
13. 상기 항목들 중 어느 한 항목에 따른 TCR을 인코딩하는 핵산.
14. 항목 13에 따른 핵산은, SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 핵산 서열을 포함한다.
15. 항목 13 또는 14 중 어느 한 항목에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
16. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR, 항목 12 또는 13에 따른 핵산 서열 또는 항목 14에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
17. 항목 16에 따른 숙주 세포는, 세포 독성 T 림프구 (CTL), CD8+T 세포, CD4+T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포, 감마/델타-T 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 림프구로부터 선택된다.
18. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR을 수득하는 방법은,
(i) 상기 TCR의 발현을 유발하는 조건하에서 항목 17에 따른 숙주 세포를 인큐베이션 하는 단계
(ii) 상기 TCR을 정제하는 단계를 포함한다.
19. 다음의 하나 이상을 포함하는 약학 또는 진단 조성물:
(i) 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR;
(ii) 항목 13 내지 14 중 어느 한 항목에 따른 핵산;
(iii) 항목 15에 따른 벡터; 및/또는
(iv) 항목 16 또는 17 중 어느 한 항목에 따른 숙주 세포,
및 선택적으로, 약학적 부형제(들).
20. 의약으로 사용하기 위한 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR, 항목 13 또는 14에 따른 핵산, 항목 15에 따른 벡터 및/또는 항목 16 또는 17에 따른 숙주 세포.
21. 암의 검출, 진단, 예후예측, 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR, 항목 13 또는 14에 따른 핵산, 항목 15에 따른 벡터 및/또는 항목 16 또는 17에 따른 숙주 세포.
22. 항목 21의 사용을 위한 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포에 있어서, 암의 예방 및/또는 치료는
(a) 다음 중 하나 이상을 제공하는 단계,
(i) 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR;
(ii) 항목 13 또는 14 중 어느 한 항목에 따른 핵산
(iii) 항목 15에 따른 벡터; 및/또는
(iv) 항목 16 또는 17 중 어느 한 항목에 따른 숙주 세포,
(v) 항목 19에 따른 약학 조성물; 및
(b) (i) 내지 (v) 중 적어도 하나를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
23. 항목 21의 사용을 위한 TCR, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포에 있어서, 암의 예방 및/또는 치료는
(a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 림프구를 포함하는 단계;
(b) 다음 중 하나 이상을 제공하는 단계,
(i) 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR;
(ii) 항목 13 또는 14 중 어느 한 항목에 따른 핵산
(iii) 항목 15에 따른 벡터; 및/또는
(iv) 항목 16 또는 17 중 어느 한 항목에 따른 숙주 세포;
(v) 항목 19에 따른 약학 조성물;
(c) 단계 (a)의 림프구에 단계 (b)의 (i) 내지 (v) 중 하나 이상을 도입하여 변형된 림프구를 수득하는 단계,
(d) 단계 (c)의 변형된 림프구를 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
24. 인 비트로에서 대상체의 암의 존재를 검출하는 방법은,
(a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 하나 이상의 세포를 포함하는 단계;
(b) 상기 샘플을 다음과 접촉하여 복합체를 형성하는 단계,
(i) 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR;
(ii) 항목 13 또는 14 중 어느 한 항목에 따른 핵산;
(iii) 항목 15에 따른 벡터; 및/또는
(iv) 항목 16 또는 17 중 어느 한 항목에 따른 숙주 세포,
(v) 항목 19에 따른 약학 조성물; 및
(c) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 복합체의 검출은 대상체에서 암의 존재를 표시하는 것이다.
25. 변형된 림프구를 생성하기 위한 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목에 따른 TCR, 항목 13 또는 14에 따른 핵산, 및/또는 항목 15에 따른 벡터의 용도.
실시예
약어 및 동의어
(m)DC (성숙한) 수지상세포
ivtRNA 인 비트로 전사된 RNA
APC 항원-제시 세포
(X)pos 또는 (X)+ X를 발현하는
VLD 또는 VLD 펩타이드 PRAME100 -108
E:T 비율 표적 세포에 대한 효과기 세포의 비율
SLL 또는 SLL 펩타이드 무관한 펩타이드, SLLQHLIGL(SEQ ID NO: 229)
ALY 또는 ALY 펩타이드 무관한 펩타이드, ALYVDSLFFL(SEQ ID NO: 230)
ELA 또는 ELA 펩타이드 무관한 펩타이드, ELAGIGILTV(SEQ ID NO: 231)
[M] 몰 농도[mol/L]
PBMC 말초혈액 단핵세포, 즉, 말초혈액 내 유핵 세포; T 세포와 같은 PBL (말초혈액 림프구)을 포함한다.
실시예 1: PRAME -특이적인 T 세포 클론의 단리
본 발명자들은 임의의 바람직한 MHC 제한 및 항원 특이성의 T 세포 클론을 단리하기 위해 인 비트로 프라이밍 접근법을 사용하였다. 프라이밍 시스템은 항원-제시 세포로 성숙한 수지상세포 (mDC)를, 반응 세포로 자가 CD8+T-농축된 T 세포를 사용한다. SEQ ID NO: 33에 언급된 전장의 인간 PRAME 아미노산 서열을 인코딩하는 인 비트로 전사된 RNA (ivtRNA)를 특이 항원의 공급원으로 제공한다. mDCs로의 전기천공 후, ivtRNA는 전장의 단백질로 번역되고, 이어서 프로세싱되어 mDCs의 MHC 분자에 의해 펩타이드로서 제시된다. 같은 공여자에서 유래한 ivtRNA-형질감염된 mDCs와 T 세포의 인 비트로 공배양은 상응하는 TCRs의 공급원으로 제공하는 항원-특이적인 T 세포의 드 노보 유도를 야기한다. 항원-특이적인 T 세포는 다양한 방법에 의해 농축될 수 있고 제한 희석 (limiting dilution) 또는 FACS-기반 단일 세포 플레이팅에 의해 클로닝된다.
실시예 1.1: 성숙한 수지상세포를 이용한 프라이밍 접근법
고-친화성 TCR을 이용한 T 세포의 DC 프라이밍은 하기 프로토콜에 따라 자가 MHC 분자에 의한 펩타이드 제시를 사용하여 달성되었다(도 1):
● HLA-A*02:01/PRAME 프라이밍
● DC를 위한 적당한 성숙화 칵테일을 사용하여 8일간 mDC를 생산
● APC 로딩: ivtRNA
● HLA-A*02:01 PRAME100 -108 다량체에 의한 농축
● FACS 기술을 사용한 단일 세포 소팅
실시예 2: 기능/특이성 분석
원하는 PAME 에피토프 (PRAME100 - 108)를 인식하는 후보 T 세포 클론 (T 세포 클론 T4.8-1-29)의 동정 후, 기능 및 특이성에 관한 완전한 특성규명이 수행되었다. 분석은 다양한 인간 종양 세포주와의 공배양에서 단리된 T 세포 클론 (T 세포 클론 T4.8-1-29)의 사이토카인 분비 패턴, 다양한 표적 세포를 특이적으로 인식하는 클론의 능력, 클론의 기능적 친화성 및 T2 및 종양 세포에 대한 세포독성을 포함한다.
실시예 2.1: 오리지널 T 세포 클론 T4.8-1-29의 분석
실시예 2.1.1: 폴리 -사이토카인 분석
실험 레이아웃: 펩타이드 - 로딩된 T2 세포에 의한 자극
사이토카인 방출은 하기 프로토콜에 따라 측정하였다:
● Multiplex® 사이토카인 분석을 수행하여 IFN-감마, IL-2, TNF-알파, IL-5, IL-10, IL-6, IL12p70, IL-4 및 IL-1베타를 검출
● 자극 세포: PRAME100 -108 펩타이드("VLD 펩타이드") 또는 무관한 PRAME300 -309, 즉 ALYVDSLFFL 펩타이드 ("ALY 펩타이드", SEQ ID NO: 230)의 포화 양(10-5 M)이 로딩된 T2 세포 (HLA-A*02pos)
● 관련이 있거나 또는 무관한 펩타이드-로딩된 T2 세포와 T 세포의 공배양물의 상등액을 24시간 후에 수확하고, 이어서 Multiplex® 사이토카인 분석을 사용하여 측정하였다.
결과
● 후보 클론은 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파 (Th1/Tc1 사이토카인)를 백그라운드 수준 이상으로 분비하였다. 사이토카인 발현 양상은 좋은 항암 효과기 기능과 관련이 있는 Th1 표현형을 반영한다 (도 2).
● IL-5 및 IL-13 (Th2/Tc2 사이토카인) 분비는 검출되지 않았다 (n.d.).
실시예 2.2: 종양 세포의 인식
실험 레이아웃: 종양 세포주에 의한 자극
● IFN-감마 ELISA를 사용하여 사람 종양 세포주 패널 (PRAME 발현 상태는 NanoString nCounter® 분석에 의해 검출됨)로 자극 후 사이토카인 분비를 평가하였다.
● T 세포 클론 T4.8-1-29와 K562-A2, Mel-624.38, Colo-678, 647-V 및 SuDHL-6 (모두 HLA-A*02pos)의 24시간까지의 공배양 후 상등액을 수확하였다. 특정 IFN-감마 분비는 표준 ELISA를 사용하여 평가하였다.
● 표적 세포:
°K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
°Mel-624.38 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
°Colo-678 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
°647-V (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
°SuDHL-6 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)
결과
● T 세포 클론 T4.8-1-29는 PRAMEpos, HLA-A*02pos 종양 세포주 K562-A2 및 Mel-624.38 (양성 대조군: 펩타이드-펄스된 T2 세포)와의 공배양에서 높은 IFN-감마 분비를 나타냈다.
● T 세포 클론 T4.8 (음성 대조군; n.d., 검출되지 않음)에 의해 인식되는 PRAMEneg, HLA-A*02pos 종양 세포주는 없었다.
● HLA-A*02 및 PRAME를 발현하는 종양 세포주만 항원-특이성을 나타내면서 자기-제한된 T 세포 클론 T4.8-1-29에 의해 인식되었다 (도 3).
실시예 2.3: 기능적 친화성
실험 레이아웃: 펩타이드 - 펄스된 T2 세포로 자극
● PRAME100 -108 (VLD) 펩타이드 인식에 대한 기능적 T 세포 친화성은 클론 T4.8-1-29와 펩타이드-로딩된 T2 세포의 공배양 후 IFN-감마 분비를 검출하여 측정하였다.
● 표적 세포: 적정량의 외인성 PRAME100 -108 (VLD) 펩타이드 (10-5 M 내지 10-12 M)가 로딩된 T2 세포 (HLA-A*02pos, PRAMEneg).
● 효과기 대 표적의 비율=1:1
● 상대적인 IFN-감마 방출은 최대 방출의 퍼센트로 표시된다. 기능적 친화성을 정의하는 최대 절반의 IFN-감마 분비는 대시 선 (dashed line)으로 표시하였다.
● 배양 상등액은 ~ 24시간 공배양 후 수확하고 표준 ELISA로 평가하였다.
결과
● 클론 T4.8-1-29은 약 1×10-9 내지 1×10- 10 mol/L[M]의 PRAME100 -108 펩타이드 농도에서 최대 절반의 IFN-감마 분비를 보였으며 (2회 독립 실험의 평균), 이는 바이러스-특이적인 T 세포의 생리적 범위 내에 있고, 효과적인 항-종양 효능을 위한 바람직한 기능적 친화성을 나타내는 것으로 보고된다 (Aleksic, M et al. Eur. J. Immunol.;42 (12):3174-3179).
● → TCR T4.8-1-29: ~1×10- 9 mol/L[M] (도 4)
실시예 2.3: 트랜스제닉 T 세포 수용체의 분석: TCR T4.8-1-29
PRAME100 -108-특이적인 T 세포 클론 T4.8-1-29를 동정하면, 다음 단계는 상응하는 TCR 사슬을 코딩하는 DNA 서열 정보의 분리, 적당한 수혜자 T 세포로의 복제된 TCR의 전달 및 TCR-조작된 T 세포의 후속적인 기능 분석을 포함한다.
실시예 2.3.1: T 세포 수용체 서열 분석
오리지널 클론 T4.8-1-29 TCR 알파 및 베타 사슬의 DNA 서열은 차세대 시퀀싱 (NGS-TCRseq)에 의해 사내에서 분석하였다. 상응하는 TCR 알파 및 베타 DNA 서열을 DNA 유전자 합성 (GeneArt, Regensburg)에 의해 재구성하고, 안정한 형질도입을 위해 레트로바이러스 벡터뿐만 아니라 ivtRNA 생산을 위한 pGEM 벡터 백본으로 클로닝 하였다.
실시예 2.3.2: 트랜스제닉 TCR의 기능 검증
T 세포 클론 T4.8-1-29의 TCR 서열의 수혜자 세포로의 전달
오리지널 T 세포 클론 T4.8-1-29의 TCR DNA 서열은 전기천공에 의해 수혜자 효과기 세포의 일시적인 형질감염을 위해 완전한 T4.8-1-29 TCR 서열을 인코딩하는 RNA로 인 비트로 전사되거나, 또는 T 세포 T4.8-1-29 서열 전체를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터 구조물을 사용하여 효과기 세포의 안정한 형질도입을 위해 또한 사용된다.
실험 레이아웃: 펩타이드 - 펄스된 T2 세포에 의한 자극
● PRAME100 -108 (VLD) 펩타이드-펄스된 T 세포와의 공배양에서 TCR T4.8-1-29로 형질감염된 수혜자 T 세포 (CD8pos 수혜자 T 세포 클론 + T4.8-1-29/ivtRNA)의 특정 IFN-감마 분비는 표준 ELISA를 사용하여 측정하였다.
● 표적 세포: 10-5M VLD (관련이 있는) 또는 "ELA 펩타이드" (무관한) 펩타이드 (ELAGIGILTV, MelanA, SEQ ID NO: 231)가 펄스된 T2 세포 (HLA-A*02pos, PRAMEneg).
결과
● TCR T4.8-1-29로 형질감염된 수혜자 T 세포는 관련 펩타이드가 로딩된 T2 세포를 잘 인식하지만 T2 세포에 무관한 펩타이드가 로딩될 때는 인식하지 못하였다.
● T4.8-1-29 TCR 알파 및 베타 사슬 DNA 서열이 올바르게 재구성되었고, 트랜스진으로서 좋은 기능을 보였다 (도 5).
실시예 2.4: 자가- 펩타이드 인식 분석
실험 레이아웃: 펩타이드 로딩된 T2 세포와의 공배양 시 TCR T4.8-1-29를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC의 INF-감마 분비
10-5M의 PRAME100 -108 VLD 펩타이드 또는 HLA-A*02로부터 용출된 유비쿼터스 자가-펩타이드 (131개의 자가-펩타이드)가 로딩된 T2 표적 세포 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)와 공배양된 클론 T4.8-1-29의 T 세포 수용체를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC의 INF-감마 분비는 ELISA-분석을 사용하여 결정되었다.
결과
● 클론 T4.8-129의 T 세포 수용체를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC는 유비쿼터스 자가-펩타이드 (양성 대조군: PRAME100 -108 로딩된 T2 세포)가 로딩된 T2 세포 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)와 공배양되는 경우 IFN-감마를 분비하지 않아 TCR 4.8-1-29의 높은 특이성을 반영한다 (도 6).
실시예 2.5: 세포독성 분석
실험 레이아웃: 펩타이드 - 펄스된 T2 세포의 용해
● PRAME100 -108 (VLD) 펩타이드-펄스된 T2 세포의 용해는 TVA™ 형광 살상 분석 (CTL, Cellular Technology Limited, USA)을 사용하여 T4.8-1-29 TCR을 발현하는 CD8 농축된 PBMC와의 공배양 동안 형광 표지된 표적 세포의 소멸을 결정하여 측정하였다.
● 표적 세포: 10-5M PRAME100 -108 VLD (관련이 있는) 또는 SLL(SLLQHLIGL (SEQ ID NO: 229), PRAME, 무관한) 펩타이드가 펄스된 T2 세포 (HLA-A*02pos, PRAMEneg)를 TCR T4.8-1-29를 발현하는 PBMC와 E:T 비율별로 공배양하였다.
결과
● T4.8-1-29를 발현하는 PBMC는 낮은 E:T 비율에서도 관련이 있는 (VLD) 펩타이드가 로딩된 T2 세포의 효율적인 용해를 보여준다.
● 무관한 SLL 펩타이드 (PRAME)가 로딩된 T2 세포는 어느 E:T 비율에서도 용해되지 않았다 (음성 대조군) (도 7).
실험 레이아웃: 종양 세포의 용해
● 종양 세포에 대한 세포독성 활성은 TVA™ 형광 살상 분석 (CTL, Cellular Technology Limited, USA)을 사용하여 T 세포 클론 T4.8-1-29의 트랜스제닉 TCR을 발현하는 PBMC와의 공배양 동안 형광 표지된 표적 세포의 소실을 검출하여 분석하였다.
표적 세포: 인간 종양 세포주 K562를 실험에 사용하였다. K562 세포는 인간 HLA-A*02:01을 코딩하는 ivtRNA 및/또는 인간 PRAME를 코딩하는 ivtRNA를 사용하여 형질감염되었다. 인간 K562는 내인성 PRAME 발현을 나타낸다 (Nanonstring에 의해 측정되고 문헌에 보고됨). 또한, PRAME 발현은 인간 PRAME을 코딩하는 ivtRNA로 K562 세포의 형질감염에 의해, 또는 PRAME100 -108 VLD 펩타이드의 외인성 로딩에 의해 증가되었다.
°HLA-A*02:01을 코딩하는 ivtRNA로 형질감염되고, PRAME100 -108(VLD) 펩타이드가 로딩된 K562: K562-(PRAME + /A2 - )+A2- ivt RNA+VLD peptide (도 8A)
°PRAME를 코딩하는 ivtRNA가 형질도입된 K562: K562-( PRAME + /A2 - )+ PRAME - ivt RNA (도 8B)
°PRAME를 코딩하는 ivtRNA 및 HLA-A*02를 코딩하는 ivtRNA가 형질감염된 K562: K562-(PRAME + /A2 - )+A2- ivt RNA (도 8C)
°HLA-A*02 ivtRNA를 코딩하는 ivtRNA로 형질감염된 K562: K562-(PRAME + /A2 - )+A2- ivt RNA + PRAME ivt RNA (도 8D)
● 종양 세포는 TCR T4.8-1-29를 발현하는 PBMC와 E:T의 비율별로 공배양되었다.
결과
HLA-A*02:01을 발현하는 K562 세포의 VLD 펩타이드 로딩뿐만 아니라 PRAME ivtRNA로의 형질감염은 트랜스제닉 TCR T4.8-1-29를 발현하는 PBMC에 의한 특이적인 용해를 증가시켰다 (도 8A-D).
실시예 2.5: TCR T4.8-1-29를 발현하는 CD8 + 농축된 PBMC에 의한 종양 세포의 인식
실험 레이아웃: 종양 세포주에 의한 자극
● IFN-감마 ELISA를 사용하여 사람 종양 세포주 패널 (PRAME 발현 상태는 NanoString nCounter® 분석에 의해 검출됨)로 자극 후 사이토카인 분비를 평가하였다.
● T 세포 수용체 T4.8-1-29를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC와 K562-B35, K562-A2, Mel-624.38, Colo-678 및 SKMEL23을 24시간까지 공배양 후 상등액을 수확하였다. 특정 IFN-감마 분비는 표준 ELISA를 사용하여 평가하였다.
● 표적 세포:
° K562-B35 (HLA-A*02neg, PRAMEpos)
° K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
° VLD 펩타이드가 로딩된 K562-A2 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
° Mel-624.38 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
° SkMEL23 (HLA-A*02pos, PRAMEpos)
결과
● T 세포 수용체 T4.8-1-29를 발현하는 CD8+ 농축된 PBMC는 PRAMEpos, HLA-A*02pos 종양 세포주 K562-A2, VLD 펩타이드가 추가로 로딩된 K562-A2과의 공배양에서 높은 IFN-감마 분비를 보였다. PRAMEpos, HLA-A*02pos Mel-624.38 및 SkMEL23과의 공배양 시에는 중간의 INF-감마 분비를 보였다.
● HLA-B*35 발현을 갖는 PRAMEpos K562는 INF-감마 분비를 유도하지 않아 TCR T4.8-1-29의 HLA-A*02 제한을 확인하였다 (도 10).
실시예 2.6: TCR T4.8-1-29의 PBMC로의 형질도입
● 건강한 공여자의 CD8 농축된 PBMC에 TCR T4.8-1-29 구조물을 함유하는 플라스미드를 형질도입시켰다. TCR-전달-효율을 분석하기 위해, 형질도입되지 않은 PBMC 및 TCR T4.8-1-29-형질도입된 PBMC의 표면 염색 후 FACS 분석을 수행하였다. 세포를 CD8 및 TCR-β-사슬의 TCRs 가변 영역 (TRBV9)에 특이적인 항체들로 염색하였다. 대조군 효과기 세포 집단에서는 내재적으로 TRBV9를 발현하는 T 세포가 8% 존재하고, 형질도입 후에 T 세포의 60%가 TRBV9를 발현하였다. 이는 50% 이상의 형질도입 효율을 나타낸다 (도 11).
실시예 2.7: T 세포 클론 T4.8-1-29 및 TCR T4.8-1-29가 형질도입된 PBMC에 의한 PRAME 100-108 (VLD) 펩타이드에 대한 기능적 T 세포 친화성
● PRAME100 -108 (VLD) 펩타이드 인식에 대한 기능적 T 세포 친화성은 T 세포 클론 T4.8-1-29 (실선) 또는 T4.8-1-29가 형질도입된 효과기 PBMC (점선) 중 어느 것과 펩타이드-로딩된 T2 세포의 공배양 후 IFN-감마 분비를 검출하여 측정되었다. T2 세포에 적정된 양의 10-5M 내지 10-12M의 농도 범위의 펩타이드를 로딩하였다. 공배양물-상등액을 공배양 후 24시간 이내에 수확하여 표준 ELISA에 의해 평가하고, 상대적인 IFN-감마 방출은 최대 방출의 퍼센트로 나타낸다. 기능적 친화성을 명시하는 최대 절반의 IFN-감마-분비 (EC50)는 대시 선으로 표시한다. 오리지널 T 세포 클론 및 트랜스제닉 TCR의 기능적 친화성은 매우 유사하다 (도 12).
실시예 2.8: 상이한 표적 세포 ( OPM -2 및 U937)를 사용하여 TCR T4.8-1-29가 형질도입된 PBMC 및 형질도입되지 않은 대조군 PBMC의 항원 특이성의 분석
● 항원 특이성을 분석하기 위해, T4.8-1-29이 형질도입된 효과기 PBMC 및 형질도입되지 않은 대조군 PBMC를 상이한 표적 세포와 공배양하였다. 종양 세포주 OPM-2 및 U937 (HLA-A2 음성 및 PRAME-음성)는 변형되지 않거나, 또는 HLA-A2를 인코딩하는 ivtRNA로 형질감염시켜 시험하였다. 이외에도, 세포는 또한 HLA-A2 및 PRAME, 또는 HLA-2 및 무관한 항원을 인코딩하는 ivtRNA의 조합으로 형질감염시킨 후 시험하였다. 대조군으로, 효과기는 또한 PRAMEVLD 펩타이드 (10-5M) 또는 무관한 PRAMESLL 펩타이드 (10-5M)가 로딩된 T2 세포와 공배양되었다. 공배양 24시간 후, 상등액을 수확하고, 분비된 IFN-감마의 양을 표준 ELISA에 의해 측정하였다. VLD-로딩된 T2 세포와의 공배양에서 TCR-형질도입된 PBMC에 대해 고 함량의 IFN-감마가 측정되었다. 또한, HLA-A2 및 항원 PRAME로 형질감염된 종양 세포주 둘 다 TCR-형질도입된 PBMC에 의해 IFN-감마 분비를 유도하였다. 따라서, 항원 PRAME과의 조합으로 필요로 하는 MHC-제한-요소인 HLA-A2를 발현하는 종양 세포만이 인식되어 T4.8-1-29를 발현하는 PBMC의 활성화를 유도하였다 (도 13).
실시예 2.9: 상이한 표적 세포 (K562, K562_A2 및 Mel 624.38)를 사용하여 TCR T4.8-1- 29이 형질도입된 PBMC 및 형질도입되지 않은 대조군 PBMC의 항원 특이성 분석
● 항원 특이성을 분석하기 위해, T4.8-1-29이 형질도입된 효과기 PBMC와 형질도입되지 않은 대조군 PBMC를 상이한 표적 세포와 공배양하였다. K562_A2 및 Mel624.38 (HLA-A-양성 및 PRAME-양성) 및 647-V (HLA-A2 양성 및 PRAME-음성) 뿐만 아니라 종양 세포주 K562 (HLA-A2 음성 및 PRAME-양성)를 시험하였다. 대조군으로, 효과기는 또한 PRAMEVLD 펩타이드 (10-5M) 또는 무관한 PRAMESLL 펩타이드 (10-5M)가 로딩된 T2 세포와 공배양되었다. 공배양 24시간 후, 상등액을 수확하고, 분비된 IFN-감마의 양을 표준 ELISA에 의해 측정하였다. VLD-로딩된 T2 세포와의 공배양에서 TCR-형질도입된 PBMC에 대해 고 함량의 IFN-감마가 측정되었다.
측정된 IFN-감마-값은 VLD-펩타이드가 로딩된 T2 세포 및 종양 세포주 K562_A2 및 Mel624.38에 의한 TCR T4.8-1-29가 형질도입된 PBMC의 활성화를 나타냈다. 따라서, HLA-A2-양성, 내인성 PRAME를 발현하는 종양 세포주만이 형질도입된 PBMC에 의해 인식되지만, HLA-A2 또는 항원 중 어느 것이 없는 경우 활성화를 방지하였다 (도 14).
실시예 2.10: 종양 세포에 대한 T4.8-1- 29이 형질도입된 효과기의 세포독성 활성 분석
● 종양 세포에 대한 T4.8-1-29가 형질도입된 효과기의 세포독성 활성은 세포의 살아있는 이미징이 가능한 현미경-기반 시스템인 IncuCyte ZOOM®-생세포 분석 시스템 (Essenbiosciences)을 사용하여 분석되었다.
TCR T4.8-1-29-형질도입된 및 형질도입되지 않은 효과기 PBMC를 HLA-A2-양성, PRAME-양성 흑색종 세포주 Mel624.38과 공배양하였다. 흑색종 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 60% 미만의 컨플루언시에 도달하면 효과기 세포를 첨가하였다. 세포 죽음을 시각화하기 위해 빨간색 아넥신 V 염료도 추가되었으며 이미지는 매일 4일 동안 촬영되었다. 형질도입되지 않은 효과기와의 공배양에서 흑색종 세포주 Mel624.38은 시간이 지나면서 확장되고, 죽은 세포는 드물게 관찰됐지만 (상단 줄), TCR이 형질도입된 효과기는 종양 세포의 성장을 방지하고 높은 수의 죽어가는 세포를 갖는 세포 클러스터의 형성을 유도하였다. 이는 T4.8-1-29를 발현하는 효과기 세포가 PRAME를 발현하는 종양 세포를 효율적으로 용해하고 며칠 동안 종양 세포의 성장을 방지할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2.11: T4.8-1-29를 발현하는 PBMC의 안전성 프로파일의 분석
● T4.8-1-29를 발현하는 PBMC의 안전성 프로파일을 분석하기 위해, 건강한 인간 조직의 인식은 배제해야 한다. 따라서, 두 개의 상이한 공여자로부터 유래한 T4.8-1-29가 형질도입된 PBMC를 HLA-A2 양성 공여자의 건강한 조직으로부터 유래 한 세포와 공배양하였다. 예로서, 형질도입되지 않은 PBMC뿐만 아니라 형질도입된 PBMC 또한 인간 신장 모세혈관 상피 세포 (HRCEpC)와 공배양하였다. 대조군으로, HRCEp 세포에 추가적으로 VLD 펩타이드 (10-5M)를 로딩하였다. 공배양 24시간 후, 상등액을 수확하여 IFN-감마의 분비된 양을 표준 ELISA에 의해 측정하였다. TCR이 형질도입된 PBMC만 펩타이드 로딩된 표적 세포와 공배양 시 활성화되었으나, 비변형된 HRCEp 세포의 인식은 없었다.
SEQUENCE LISTING <110> Medigene Immunotherapies GmbH <120> T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF <130> MED15669PCT <160> 231 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_Feature <223> CDR3 alpha <400> 1 Cys Ala Val His Ser Thr Ala Gln Ala Gly Thr Ala Leu Ile Phe 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_feature <223> CDR3 beta <400> 2 Cys Ala Ser Ser Thr His Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_feature <223> CDR2 alpha <400> 3 Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_feature <223> CDR2 beta <400> 4 Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_feature <223> CDR1 alpha <400> 5 Val Ser Gly Leu Arg Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_feature <223> CDR1 beta <400> 6 Ser Gly Asp Leu Ser 1 5 <210> 7 <211> 274 <212> PRT 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Met Asn His Glu Tyr 1 5 <210> 127 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Asp His Glu Asn 1 5 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ser Gln Val Thr Met 1 5 <210> 129 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Gly Thr Ser Asn Pro Asn 1 5 <210> 130 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Asn Ala Leu Asp Gly Leu 1 5 <210> 131 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Asn Val Leu Asp Gly Leu 1 5 <210> 132 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Gly Ser Lys Pro 1 <210> 133 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val 1 5 <210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Gly Tyr Lys Thr Lys 1 5 <210> 135 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 135 Ile Phe Ser Asn Met Asp Met 1 5 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ile Arg Glu Asn Glu Lys Glu 1 5 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Met Tyr Ser Ala Gly Tyr Glu 1 5 <210> 138 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Tyr Phe Ser Gly Asp Pro Leu Val 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val 1 5 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Tyr Phe Ser Gly Asp Thr Leu Val 1 5 <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Tyr Thr Ser Ala Ala Thr Leu Val 1 5 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Tyr Leu Ser Gly Ser Thr Leu Val 1 5 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Ala Met Lys Ala Asn Asp Lys 1 5 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Ala Thr Lys Ala Asp Asp Lys 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Met Thr Phe Ser Glu Asn Thr 1 5 <210> 146 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ile Gln Ser Ser Gln Lys Glu 1 5 <210> 147 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Val Tyr Ser Ser Gly Asn 1 5 <210> 148 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Ile Tyr Ser Asn Gly Asp 1 5 <210> 149 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Thr Tyr Ser Ser Gly Asn 1 5 <210> 150 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu 1 5 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ile Arg Ser Asn Met Asp Lys 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn 1 5 <210> 153 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 His Ile Ser Arg 1 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu 1 5 <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Ser Ser Glu Asn Gln Glu 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn 1 5 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Leu Tyr Ser Ala Gly Glu Glu 1 5 <210> 158 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu 1 5 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Ile Pro Ser Gly Thr 1 5 <210> 160 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 160 Ile Arg Pro Asp Val Ser Glu 1 5 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu 1 5 <210> 162 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Leu Val Lys Ser Gly Glu Val 1 5 <210> 163 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Gly Leu Lys Asn Asn 1 5 <210> 164 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 164 Gly Leu Thr Ser Asn 1 5 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Val Val Thr Gly Gly Glu Val 1 5 <210> 166 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys 1 5 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Leu Leu Lys Gly Gly Glu Gln 1 5 <210> 168 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Leu Gln Lys Gly Gly Glu Glu 1 5 <210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu 1 5 <210> 170 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Leu Thr Ser Ser Gly Ile Glu 1 5 <210> 171 <211> 8 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 171 Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn 1 5 <210> 172 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Gln Glu Ala Tyr Lys Gln Gln Asn 1 5 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Leu Leu Ser Asn Gly Ala Val 1 5 <210> 174 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Glu Thr Met Glu 1 <210> 175 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Leu Ser Ser Gly Lys 1 5 <210> 176 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Phe Tyr Asn Asn Glu Ile 1 5 <210> 177 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Tyr Asn Asn Lys Glu Leu 1 5 <210> 178 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu 1 5 <210> 179 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Tyr Asn Phe Lys Glu Gln 1 5 <210> 180 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 180 Tyr Ser Leu Glu Glu Arg 1 5 <210> 181 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Tyr Phe Ser Glu Thr Gln 1 5 <210> 182 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu 1 5 <210> 183 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu 1 5 <210> 184 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 185 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Tyr Asp Glu Gly Glu Glu 1 5 <210> 186 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Ser Ala Ser Glu Gly Thr 1 5 <210> 187 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Ser Val Gly Glu Gly Thr 1 5 <210> 188 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Ser Val Gly Glu Gly Thr 1 5 <210> 189 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Ser Asn Thr Ala Gly Thr 1 5 <210> 190 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Ser Val Gly Ala Gly Ile 1 5 <210> 191 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Ser Val Gly Ala Gly Ile 1 5 <210> 192 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Ser Ala Ala Ala Gly Thr 1 5 <210> 193 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Ser Val Ala Ala Gly Ile 1 5 <210> 194 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Phe Gln Gly Asn Ser Ala 1 5 <210> 195 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Phe Gln Gly Thr Gly Ala 1 5 <210> 196 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Ser Gln Ser Asp Ala Gln 1 5 <210> 197 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Phe Asn Tyr Glu Ala Gln 1 5 <210> 198 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Phe Asn Tyr Glu Ala Gln 1 5 <210> 199 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 199 Phe Gln Asn Glu Ala Gln 1 5 <210> 200 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Phe Gln Asn Glu Ala Gln 1 5 <210> 201 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu 1 5 <210> 202 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Ser Tyr Gly Val Gln Asp 1 5 <210> 203 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Ser Ala Ala Ala Asp Ile 1 5 <210> 204 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Ser Tyr Gly Val Lys Asp 1 5 <210> 205 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Phe Gln Asp Glu Ser Val 1 5 <210> 206 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Phe Gln Asn Asn Gly Val 1 5 <210> 207 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Tyr Glu Asn Glu Glu Ala 1 5 <210> 208 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Phe Cys Ser Trp Thr Leu 1 5 <210> 209 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Phe Arg Ser Ser Ile 1 5 <210> 210 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Phe Asn Asn Asn Val Pro 1 5 <210> 211 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Phe Asn Asn Asn Val Pro 1 5 <210> 212 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Phe Arg Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 213 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 213 Phe Tyr Glu Lys Met Gln 1 5 <210> 214 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Phe Val Lys Glu Ser Lys 1 5 <210> 215 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Phe Val Lys Glu Ser Lys 1 5 <210> 216 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Phe Gln Asn Glu Asn Val 1 5 <210> 217 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Leu Gln Lys Glu Asn Ile 1 5 <210> 218 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Ser Gln Ile Val Asn Asp 1 5 <210> 219 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala 1 5 <210> 220 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Ser Phe Asp Val Lys Asp 1 5 <210> 221 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Ser Tyr Gly Val Asn Ser 1 5 <210> 222 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Ser Met Asn Val Glu Val 1 5 <210> 223 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Ser Tyr Asp Val Lys Met 1 5 <210> 224 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Ser Val Gly Ile Gly 1 5 <210> 225 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 225 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 226 <211> 18 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 226 Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser 1 5 10 15 Leu Asp <210> 227 <211> 14 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 227 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr 1 5 10 <210> 228 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <220> <223> linker <400> 228 Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe 1 5 10 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> SLL peptide <400> 229 Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu 1 5 <210> 230 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> ALY peptide <400> 230 Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 10 <210> 231 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> ELA peptide <400> 231 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10

Claims (24)

  1. (i) VSGLRG (SEQ ID NO: 5)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T-세포 수용체 알파 사슬 가변 영역의 CDR1 및 SGDLS (SEQ ID NO: 6)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR1;
    (ii) LYSAGEE (SEQ ID NO: 3)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T-세포 수용체 알파 사슬 가변 영역의 CDR2 및 YYNGEE (SEQ ID NO: 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR2; 및
    (iii) CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 T-세포 수용체 알파 사슬 가변 영역의 CDR3 및 CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO: 2)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역의 CDR3를 포함하는 T-세포 수용체 (TCR).
  2. 제1항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 15에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬 가변 영역, 및/또는
    (ii) SEQ ID NO: 16에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬 가변 영역을 포함하는 TCR.
  3. 제1항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 13으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 알파 사슬; 및/또는
    (ii) SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 14로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR.
  4. 제1항에 있어서,
    (i) TCR 알파 사슬 불변 영역, 및/또는
    (ii) TCR 베타 사슬 불변 영역을 더 포함하는 TCR.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TCR은 천연 TCR, TCR 변이체, TCR 단편 또는 TCR 구조물로부터 선택되는 TCR.
  6. 제5항에 있어서,
    서로 공유 결합되어 TCR 헤테로다이머 또는 다량체를 형성하는 적어도 하나의 TCR 알파-사슬(들) 및 적어도 하나의 TCR 베타-사슬(들)을 포함하는 TCR 구조물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 수용체; IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM을 포함하는 Fc 도메인; IL-2 또는 IL-15를 포함하는 사이토카인; 독소; 항-CD3, 항-CD28, 항-CD5, 항-CD16 또는 항-CD56 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CD247 (CD3-제타), CD28, CD137, CD134 도메인 또는 이들의 조합으로부터 선택적으로 선택되는 하나 이상의 융합 성분(들)을 더 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 링커를 더 포함하는 TCR.
  8. 제1항에 있어서,
    (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 TCR 알파-사슬;
    (ii) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 적어도 하나의 TCR 베타-사슬; 및
    (iii) 림프구 표면의 항원 또는 에피토프에 대한 항체 또는 단일사슬 항체 단편 (scFv)을 포함하고,
    TCR 알파-사슬(들) 및 TCR 베타-사슬(들)은 서로 결합되고 선택적으로 링커를 통해 상기 항체 또는 scFv에 융합되는 TCR.
  9. 제1항에 따른 TCR을 인코딩하는 핵산.
  10. 제9항에 있어서,
    SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30의 핵산 서열을 포함하는 핵산.
  11. 제9항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  13. (i) TCR의 발현을 유발하는 조건하에서 제12항에 따른 단리된 숙주 세포를 인큐베이션 하는 단계; 및
    (ii) 상기 TCR을 정제하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 TCR의 수득 방법.
  14. (i) 제1항에 따른 TCR;
    (ii) 제9항에 따른 핵산;
    (iii) 제11항에 따른 벡터; 및/또는
    (iv) 제12항에 따른 단리된 숙주 세포,
    및 선택적으로, 약학적 부형제(들)을 하나 이상 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. (i) 제1항에 따른 TCR;
    (ii) 제9항에 따른 핵산;
    (iii) 제11항에 따른 벡터; 및/또는
    (iv) 제12항에 따른 단리된 숙주 세포,
    및 선택적으로, 약학적 부형제(들)을 포함하는 암의 검출 또는 진단용 물질.
  16. (i) 제1항에 따른 TCR;
    (ii) 제9항에 따른 핵산;
    (iii) 제11항에 따른 벡터; 및/또는
    (iv) 제12항에 따른 단리된 숙주 세포,
    및 선택적으로, 약학적 부형제(들)을 포함하는 암의 예후 예측용 조성물.
  17. (a) 대상체의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 하나 이상의 세포를 포함하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 제15항에 따른 하나 이상의 물질과 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하며,
    복합체의 검출은 대상체에서 암의 존재를 표시하는 것인 인 비트로에서 대상체의 암의 존재를 검출하는 방법.
  18. 림프구를 하기와 접촉시키는 단계를 포함하는 변형된 림프구를 생성하는 방법:
    (i) 제1항에 따른 TCR;
    (ii) 제9항에 따른 핵산; 또는
    (iii) 제11항에 따른 벡터.
  19. 삭제
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