CN111690051B - 靶向ny-eso-1(157-165)表位的特异性t细胞受体及抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种靶向NY‑ESO‑1(157‑165)表位的特异性T细胞受体及抗肿瘤应用，该T细胞受体由α、β两条肽链组成，还提供其抗原结合片段，以及编码它的核酸，包含该核酸的载体，包含该载体的宿主细胞；还提供一种制备NY‑ESO‑1特异性T细胞受体或其抗原结合片段的方法。该特异性T细胞受体及其抗原结合片段能够作为免疫效应活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果。

Description

靶向NY-ESO-1(157-165)表位的特异性T细胞受体及抗肿瘤 应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种能够特异性识别NY-ESO-1(157-165)表位(SLLMWITQC，HLA-A^*0201)的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段。

背景技术

2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。

在20世纪80年代早期，Allison及其他研究者确定了在T细胞表面负责识别抗原的αβT细胞受体(TCR)的基因结构。80年代后期，Boone、Rosenberg、Old等人分别研究发现，不同肿瘤病人体内均存在一些肿瘤特异性抗原，能够被T细胞所识别并特异性杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗的希望重新燃起，大量研究致力于肿瘤治疗性疫苗的研究和开发。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。

近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。

过继性T细胞疗法(Adoptive cell therapy，ACT)是一种高度个性化的癌症治疗方法，它可以通过重建癌症患者体内缺失或较弱的免疫系统，以达到抗肿瘤的效果。ACT疗法是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。寻找仅表达在癌症组织上而非正常必需组织上的抗原成为ACT疗法的限制因素。目前，ACT疗法可以包括T细胞受体工程化细胞(TCR-T)治疗技术和嵌合抗原受体工程化T细胞(CAR-T)治疗技术来实现。通过这些方法，ACT对多种癌症，例如黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、胆总管癌和成神经细胞瘤都有很好的疗效。

TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR是由α、β两条肽链组成，属于免疫球蛋白超家族，抗原特异性存在于V区(CDR1、CDR2、CDR3)，CDR3直接决定了TCR的抗原结合特异性。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR。经过基因改造过TCR的T细胞，对肿瘤细胞表面上的抗原分子进行特异性识别，进而针对肿瘤细胞产生免疫反应。

TCR-T细胞免疫治疗是近年发展起来的细胞治疗新技术，是典型的“精准医疗”治疗技术。目前该技术已在骨髓瘤、黑色素瘤、食管癌、肝癌等治疗中表现出积极的治疗前景。TCR-T细胞免疫治疗最早在20世纪末应用于HIV的治疗中，近年来的研究发现基于MART-1、MAGE-A4、NY-ESO-1、WT-1等肿瘤抗原特异性TCR工程化改造的自体免疫细胞治疗黑色素瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、滑膜细胞肉瘤等表现出了良好的开发前景。特别是2015年报道的NYESO-1特异性TCR工程化细胞免疫治疗20例多发性骨髓瘤的临床I/II期报道，80％的病例在接受了TCR-T治疗后表现出积极的临床治疗效果。当前，TCR-T细胞免疫治疗技术已经成为国际肿瘤及传染病治疗研究的热点领域，一些技术和产品已经进入临床前或临床研究阶段。

当前，CAR-T在急/慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤等疾病的治疗中也实现了重大突破，大大提高了患者生存率及生存质量。然而，由于有限的特异性靶点使得CAR-T细胞治疗在实体瘤治疗研究中前景并不明朗。而研究表明，T细胞表面受体(TCR)则是机体识别内源性肿瘤抗原的主要分子，基于TCR的细胞免疫治疗对于突破实体瘤及重大传染病的临床治疗具有广阔前景。

NY-ESO-1(New York Esophageal Squamous Cell Carcinoma 1，纽约食管鳞状细胞癌)是含有180个氨基酸的肿瘤相关抗原，NY-ESO-1具有较强的免疫原性，能够诱导机体产生体液免疫反应和细胞免疫反应。NY-ESO-1在多种肿瘤中都能够特异性表达，其中在超过60％的骨髓瘤病例中都有表达，而在约50％的NY-ESO-1阳性的病例中能够检测到NY-ESO-1特异性抗体。目前研究发现，NY-ESO-1含有多种不同HLA限制性T细胞表位，包括HLA-A02、-A24、-B07、-B18及-C03等限制性的CTL表位，以及DR4限制性的CD4+T细胞表位，其中人白细胞抗原A2型(HLA-A2)限制性表位，NY-ESO-1(157-165)，是一个免疫优势表位，其多肽序列为SLLMWITQC，该短肽可与HLA-A2形成复合物，并一起呈递到细胞表面。针对NY-ESO-1(157-165)的TCR-T目前已经在多种肿瘤的免疫治疗中开展了广泛研究和应用，具有显著的临床治疗效果。Paul F.Robbins等在滑膜肉瘤及黑色素瘤中应用NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗，观察到在6例滑膜肉瘤病例中有4例得到客观缓解，在11例黑色素瘤中有5例得到客观缓解(Paul F.Robbins et al.Journal of Clinical Oncology.2011)。Aaron PRapoport等在多发性骨髓瘤中的研究发现应用NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗，在20例病例中有16例都能产生积极的临床响应(Aaron P Rapoport et al.NatureMedicine.2015)。因此，NY-ESO-1可能对多种肿瘤具有显著的临床治疗效果。

发明内容

本发明的第一方面提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，该TCR或其抗原结合片段能够与NY-ESO-1(157-165)表位和HLA-A2复合物结合，并且该TCR包含α链可变区和β链可变区，其中该TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区(CDR)和β链互补决定区(CDR)：

包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列或其修饰的α链互补决定区(CDR)1；

包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或其修饰的α链互补决定区(CDR)2；

包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或其修饰的α链互补决定区(CDR)3；

包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其修饰的β链互补决定区(CDR)1；

包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列或其修饰的β链互补决定区(CDR)2；和

包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其修饰的β链互补决定区(CDR)3。

该NY-ESO-1特异性TCR或其抗原结合片段能够特异性结合SLLMWITQC-HLA-A*0201分子。

本发明的第二方面提供一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，该TCR或其抗原结合片段能够与NY-ESO-1(157-165)表位和HLA-A2复合物结合，并且该TCR包含α链可变区和β链可变区，其中该TCR或其抗原结合片段包含：

与具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的α链可变区，和

与SEQ ID NO:2的序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的β链可变区。

在具体的实施方式中，上述本发明的TCR包含序列为SEQ ID NO:1的α链可变区和序列为SEQ ID NO:2的β链可变区。

在优选的实施方式中，上述本发明的TCR或其抗原结合片段中，TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR。

本发明的第三方面提供一种多核苷酸，其编码上述本发明的TCR或其抗原结合片段。

本发明的第四方面提供一种表达载体，其包含上述本发明的多核苷酸。

本发明的第五方面提供一种宿主细胞，其包含上述本发明的表达载体。

本发明的第六方面提供一种制备上述本发明的TCR或其抗原结合片段的方法，该方法包括：

1)培养上述本发明的宿主细胞；

2)从该宿主细胞或其培养基中回收上述本发明的TCR或其抗原结合片段。

本发明的第七方面提供一种药物组合物，其包含上述本发明的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

本发明的第八方面提供上述本发明的TCR或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IL-2水平的药物中的用途。

本发明的第九方面提供上述本发明的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗多发性骨髓瘤及软组织肉瘤、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌等的抗肿瘤药物中的用途，优选地，该软组织肉瘤为滑膜肉瘤。

本发明提供的NY-ESO-1特异性TCR或其片段能够特异性识别人HLA-A2呈递的来源于肿瘤相关抗原NY-ESO-1的SLLMWITQC表位多肽，进而结合NY-ESO-1分子，能够作为免疫效应活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果并能够产生一系列生物学效应。这些生物学效应包括，例如：能够提高肿瘤病例肿瘤特异性T细胞分泌IL-2及IFN-γ的水平，特别是能够抑制小鼠体内肿瘤生长。

附图说明

图1.NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2蛋白纯化和SDS-PAGE鉴定。

图2.生物素化NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2蛋白纯化及生物素化效率鉴定。

图3.NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2四聚体特异性T细胞单细胞分选。

图4.YW-TCR-1 TCR特异性结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2验证。

图5.YW-TCR-1 TCR蛋白分子筛层析纯化和SDS-PAGE鉴定。在图中，DTT为二硫苏糖醇，强还原剂，加入后能打开TCRα链和β链间二硫键，在SDS-PAGE中显示两个条带，表明TCR蛋白是由α链和β链形成的异源二聚体。

图6.YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2孵育形成复合物的分子筛层析和SDS-PAGE鉴定。在图中，DTT为二硫苏糖醇，强还原剂，加入后能打开TCR α链和β链间二硫键，在SDS-PAGE中显示两个条带，表明TCR蛋白是由α链和β链形成的异源二聚体。

图7.BIAcore试验检测YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2亲和力。

图8.YW-TCR-1 TCR与靶细胞孵育后细胞因子分泌水平检测。

具体实施方式

NY-ESO-1是一种重要的肿瘤睾丸(cancer-testis antigen，CT)抗原，在人体内有强烈的自发性免疫原性，包括在细胞和体液免疫系统中的综合反应。NY-ESO-1是在X染色体上(Xq28)一个多基因家族中的一员。它在常见的肿瘤中，例如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌以及它们的子集中，表达量很高(RNA水平20％-80％)。以NY-ESO-1作为抗原的抗体，可以和CD8⁺CTL(cytotoxic lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)反应。NY-ESO-1多肽中的157–165片段可以被HLA-A2限制性T细胞识别。有研究表明，TCR转化的CD4 T细胞，与被NY-ESO-1多肽刺激的T2细胞一起培养，可以产生IFN-γ、GM-CSF、IL-4和IL-10，证明了独立于CD8，HLA-A2特异性TCR的激活。经过基因工程化改造的T淋巴细胞(TCR-T)，能够特异性表达NY-ESO-1特异性TCR，这些TCR-T细胞可以有效的识别并杀死HLA-A2和NY-ESO-1阳性肿瘤细胞系，进而抑制肿瘤生长达到肿瘤治疗的效果。

本发明是基于上述的原理作出的，本发明中的NY-ESO-1特异性TCR或其抗原结合片段通过与NY-ESO-1来源的SLLMWITQC多肽和HLA-A2的复合物分子特异性结合，从而刺激T细胞活化，诱导T细胞分泌IFN-γ及IL-2等细胞因子，进而杀伤表达NY-ESO-1和HLA-A2的肿瘤细胞。

在本发明中，表述“NY-ESO-1特异性TCR”或“鼠源NY-ESO-1特异性TCR”为针对NY-ESO-1中HLA-A2限制性的CTL表位多肽(其序列为SLLMWITQC)的鼠源TCR，在具体的实施方式中为YW-TCR-1TCR。

本申请包括与NY-ESO-1来源的第157-165位SLLMWITQC多肽与HLA-A2的复合物分子特异性结合的TCR或衍生物，也包括与原来的TCR显示实质上相同的抗原特异性的TCR片段。“TCR的片段”或“抗原结合片段”是指TCR的抗原结合片段及TCR类似物，其通常包括至少部分母体TCR的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。TCR的片段保留母体TCR的至少某些结合特异性。

当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如SLLMWITQC多肽与HLA-A2复合物分子的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。

本发明还提供含有本发明NY-ESO-1特异性TCR或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使NY-ESO-1特异性TCR或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的药物组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。

本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的TCR。

本发明通过具体实施方式和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料。

实施例1.NY-ESO-1(157-165)多肽/HLA-A2四聚体制备及抗原特异性T细胞分选和TCR基因克隆

本实施例通过制备NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2四聚体，通过其与CD3、CD8抗体一起对免疫后小鼠脾细胞进行染色，分选小鼠脾细胞中NY-ESO-1(157-165)特异性T细胞，以备后续筛选TCR。

1.NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2四聚体的制备

(1)NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物复性和纯化

将β2m(β2-微球蛋白，HLA-A2的轻链基因)(Uniprot:P61769)和HLA-A2重链基因(Uniprot:P01892)按照原核密码子进行优化，并在重链基因的C端加入表达生物素特异性结合多肽的序列(Biotin-tag)，分别合成DNA序列，并分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中Nde I酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I将合成的β2m和HLA-A2重链基因的DNA序列分别克隆入表达载体pET21 a(Invitrogen公司)，建立β2m和HLA-A2重链蛋白的原核重组表达质粒。

将表达质粒转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞(购自天恩泽生物)，加入IPTG进行诱导表达，获得包涵体状态的β2m和HLA-A2重链的包涵体蛋白。

将2mlβ2m包涵体(30mg/ml)缓慢滴加到含5mg NY-ESO-1(157-165)多肽(中科亚光公司合成)的1L复性液(20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA 2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中，8小时后按照β2m：HLA-A2重链＝1:1的摩尔比将HLA-A2的重链包涵体缓慢滴加到上述复性液中，复性8小时以上。

使用超滤杯使复性后样品通过10kDa滤膜以浓缩样品，并通过浓缩换液为20mMTris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；两次换液：将样品浓缩至约20ml后，加入至200ml含20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；之后浓缩至约20ml后再次加入20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液至100ml，并最终浓缩至约10-20ml体积。将样品取出后4℃12000rpm离心10min，将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5-1ml，过superdex200分子筛(购自GE Healthcare)进行NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物纯化，根据280nm光吸收值收集NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白峰(峰值约在15.8mL)。将经过分子筛纯化后的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白样品收集于超滤浓缩管中，浓缩至约300μl，之后4℃下离心去除沉淀，得到NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白样品(图1)。

(2)生物素化反应

将步骤(1)得到的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白样品，配制500μl生物素化反应体系：

生物素化反应体系(AVIDITY公司)：总计500μl

NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白样品，加入Buffer A(N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液)50μl，Buffer B(ATP，生物素)50μl，200μM生物素，Bir-A酶(3mg/ml)20μl，用20mMTris-Cl，50mM NaCl，pH8.0补足到500μl。配完后混匀，置冰上，于4℃冷库孵育过夜。

将上述生物素化反应体系样品过Superdex200分子筛，进行生物素化后的复合物纯化，以去除多余的生物素，得到生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物。

生物素化效率检测：

将上述生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物浓缩到约500μl，取样进行shift试验验证生物素化效果。

一般设一个样品及两个对照：

A.生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物样品8μl+分子筛缓冲液2μl；

B.生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物样品8μl+链霉亲和素2μl(20mg/ml)；

C.链霉亲和素2μl+分子筛缓冲液8μl。

将上述三支样品置冰上孵育30min后进行SDS-PAGE鉴定。

结果判断：

生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物能够与链霉亲和素结合成为大分子，从而使得其在SDS-PAGE中的条带滞后，通过比较(A-B)/A的比值可以判断生物素化的效果。

(3)NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体的制备

将生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物分子浓缩，按照链霉亲和素-PE：NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物＝1:5的摩尔比将生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物分子加入链霉亲和素-PE进行四聚化，最后置4℃孵育过夜，得到NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体备用(图2)。

2.NY-ESO-1(157-165)多肽免疫HLA-A2转基因小鼠

通过用NY-ESO-1(157-165)多肽(SLLMWITQC)免疫HLA-A2转基因小鼠(Jackson实验室)，使小鼠体内产生NY-ESO-1特异性T细胞，以便获得NY-ESO-1(157-165)特异性TCR。取合成的NY-ESO-1(157-165)多肽50μg溶于100μL PBS，并与等体积的弗氏完全佐剂混合并进行乳化。将乳化的多肽和弗氏完全佐剂混合液采用背部皮下多点注射方法，进行HLA-A2转基因小鼠免疫。一周后，利用同样方法取NY-ESO-1(157-165)多肽50μg溶于100μL PBS，并与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，并进行HLA-A2转基因小鼠免疫。一周以后处死小鼠，取脾脏，并研磨获得小鼠脾细胞。

3.NY-ESO-1(157-165)特异性T细胞分选及单细胞TCR基因扩增及测序

经PBS清洗重悬步骤2中经过NY-ESO-1(157-165)多肽免疫后获得的小鼠脾细胞，并离心；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，离心；将步骤1获得的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体、PerCP-Cy5-CD8(购自BD)和FITC-CD3荧光抗体(购自BD)与小鼠脾细胞在25℃条件下共同孵育20分钟；用含0.5％BSA的PBS洗三次，离心；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞。之后进行流式细胞技术单细胞分选。选取淋巴细胞亚群，选择CD3+CD8+T细胞，分选NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体阳性的CD8+T细胞(图3)，将单个阳性细胞分选至含有细胞裂解液(购自天根生物)和RNA酶抑制剂(购自康为世纪生物)的96孔板中。之后对每个孔内的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体阳性T细胞提取总RNA，进行5’RACE TCR基因扩增。

5’RACE分为三个步骤：基因的反转录(RT-PCR)、第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增。

(1)RT-PCR：即以上述提取的RNA为模板合成第一条cDNA链。下游引物是TCR基因恒定区特异性引物GSP1(购自Takara公司)，上游引物为3’末端带有寡聚鸟嘌呤脱氧核糖核酸(Oligo dG)的靶开关引物(target-switching primer)(购自Takara公司)。反转录到达mRNA的5’末端时，碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的鸟嘌呤(G)时会连续在合成的cDNA末端加上一定数量的胞嘧啶脱氧核糖核酸(dC)，上游引物的Oligo dG与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以上游引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端。通过RT-PCR能够将T细胞内转录的TCR RNA反转录为cDNA，得到TCR的cDNA，并通过两轮巢式PCR进行TCR的α链或β链可变区基因的扩增。

将扩增之后的含有TCR α链和β链可变区基因的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在500bp位置可分别获得TCR α链或β链可变区目的基因。将目的条带进行回收，并用T4连接酶将目的基因片段连接到T载体(pMD18T，Takara)。之后将连接产物转化DH5α细胞(购自天根生物)，并进行单克隆基因测序，得到编码的氨基酸序列。

本研究选取其中高频率出现的α链和β链组合为新的TCR，命名为YW-TCR-1 TCR(序列如下)，并进一步对其进行了结合及功能验证。

SEQ ID NO:1：YW-TCR-1 TCRα链可变区

AQKVTQTQTSISVMEKTTVTMDCVYETQDSSYFLFWYKQTASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMSYASSGSWQLIFGSGTQLTVMP

SEQ ID NO:2：YW-TCR-1 TCRβ链可变区

GGIITQTPKFLIGQEGQKLTLKCQQNFNHDTMYWYRQDSGKGLRLIYYSITENDLQKGDLSEGYDASREKKSSFSLTVTSAQKNEMAVFLCASSIVFQDTQYFGPGTRLLVL

SEQ ID NO:3：YW-TCR-1 TCRα链CDR1：TQDSSYF

SEQ ID NO:4：YW-TCR-1 TCRα链CDR2：QDSYKKEN

SEQ ID NO:5：YW-TCR-1 TCR α链CDR3：AMSYASSGSWQLIFG

SEQ ID NO:6：YW-TCR-1 TCRβ链CDR1：FNHDT

SEQ ID NO:7：YW-TCR-1 TCRβ链CDR2：SITEND

SEQ ID NO:8：YW-TCR-1 TCRβ链CDR3：ASSIVFQDTQY

SEQ ID NO:9:YW-TCR-1 TCRα链全长

MLILSLLGAAFGSICFATSMAQKVTQTQTSISVMEKTTVTMDCVYETQDSSYFLFWYKQTASGEIVFLIRQDSYKKENATVGHYSLNFQKPKSSIGLIITATQIEDSAVYFCAMSYASSGSWQLIFGSGTQLTVMPIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO:10:YW-TCR-1 TCR β链全长

MNKWVFCWVTLCLLTVETTHGDGGIITQTPKFLIGQEGQKLTLKCQQNFNHDTMYWYRQDSGKGLRLIYYSITENDLQKGDLSEGYDASREKKSSFSLTVTSAQKNEMAVFLCASSIVFQDTQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

实施例2.NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2四聚体与表达YW-TCR-1TCR的细胞结合实验

为进一步确认所筛选的YW-TCR-1 TCR能够特异性识别NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2，本实施例将YW-TCR-1 TCR的α链和β链可变区(V区)(即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)基因与人TCR的α链和β链恒定区(C区)基因(泓讯生物公司合成)组成YW-TCR-1 TCR(即SEQ IDNO:9+SEQ ID NO:10)基因连接到pCDH-GFP慢病毒表达质粒(System Biosciences：货号：CD527A-1)，构建嵌合YW-TCR-1 TCR表达载体(YW-TCR-1-pCDH)。将YW-TCR-1-pCDH质粒与表达CD3和CD8的CD3-CD8-pCDH质粒共转染HEK-293T细胞(购自ATCC)。转染24小时后，将细胞离心；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，离心；将NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体、PerCP-Cy5-CD8和FITC-CD3与共转染得到的HEK-293T细胞共同孵育；用含0.5％BSA的PBS洗三次，离心；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞。之后进行流式细胞技术单细胞分选(图4A)。本实施例以目前正在开展临床研究的HLA-A02限制性NY-ESO-1(157-165)特异性1G4 TCR为阳性对照。

结果表明，转染了1G4 TCR和YW-TCR-1 TCR的293T细胞均能够检测到GFP的表达，GFP阳性细胞分别约占总细胞数的18.8％和27.7％。而NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体对共转染的HEK-293T细胞染色分析结果表明，转染1G4 TCR的293T细胞中能够结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体的细胞约占GFP阳性细胞的比例为9.7％/(9.7％+20.8％)，而转染YW-TCR-1 TCR的293T细胞中能够结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2-PE四聚体的细胞约占GFP阳性细胞的比例为35.6％/(35.6％+2.57％)，表明YW-TCR-1 TCR比1G4TCR结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2结合效率更高(图4B)。

实施例3.YW-TCR-1 TCR蛋白制备及其与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2亲和力测定

研究者进一步对YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2在蛋白水平结合的亲和力进行了测定。

1.YW-TCR-1 TCR蛋白制备

将YW-TCR-1 TCR α链和β链的胞外区基因按照原核密码子进行优化，分别合成YW-TCR-1 TCR α链和β链的胞外区的DNA序列，并分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中Nde I酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I将合成的YW-TCR-1 TCRα链和β链的胞外区的DNA序列分别克隆入表达载体pET21 a(Invitrogen公司)，建立YW-TCR-1 TCRα链和β链的胞外区蛋白的原核重组表达质粒。

将表达质粒转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达，获得包涵体状态的YW-TCR-1 TCR α链和β链的胞外区蛋白。将6ml YW-TCR-1 TCRα链和β链的胞外区的包涵体按照2:1的质量比滴在1L配好的复性液(5M脲，20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中，分两次滴加，每次滴加3mL，两次滴加之间间隔最少8h，然后用浓缩杯浓缩后分别置4L去离子水和4L 10mM Tris，pH 8.0的透析液中各透析24h。之后用20mM Tris-HCL，150mM NaCL，pH 8.0的缓冲液换液，浓缩后用Superdex200pg分子筛(GE Healthcare)纯化，得到YW-TCR-1 TCR蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白(图5)。

2.YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白分子筛层析结合分析

将上述制备的YW-TCR-1 TCR蛋白(2mg/ml)与实施例1中制备的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白(2mg/ml)按照1:2的摩尔比混合，并置冰上孵育1h，之后离心取上清上样至superdex200 pg分子筛层析柱进行检测。结果表明，共同孵育后YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2能够形成稳定的复合物，在分子筛层析在13ml位置出现洗脱峰，SDS-PAGE鉴定结果表明，YW-TCR-1 TCR的α和β链及NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的轻重链条带均能够在复合物洗脱峰中检出(图6)。因此，YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2在蛋白水平能够形成稳定的复合物。

3.表面等离子共振技术检测亲和力

为了准确测定YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白的结合特性和亲和力，本实施例进一步通过表面等离子共振技术(SPR)对YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白进行检测。

将上述制备的YW-TCR-1 TCR蛋白以及实施例1中制备的生物素化的NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物换液至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl，150mM Na-Cl，0.005％Tween-20，pH 7.4)。将NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白稀释到20μg/ml固定到SA芯片(GE Health)上，之后将梯度稀释的YW-TCR-1 TCR蛋白(0μM,0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM)分别流过SA芯片各通道，利用BIA评价软件分析结合动力学参数，并计算亲和力常数。同时，梯度稀释的1G4 TCR蛋白(0μM、0.74μM、1.46μM、2.93μM、5.8μM、11.75μM、23.5μM、47μM)分别流过SA芯片各通道，作为阳性对照。

通过对YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2复合物蛋白亲和力的检测，结果表明，YW-TCR-1 TCR与1G4 TCR结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的结合和解离速率类似，都是快结合快解离的模式，YW-TCR-1 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2结合亲和力(KD)为12.2×10^-6M，而1G4 TCR与NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2结合亲和力(KD)为10×10^-6M，两者间无显著差异。因此，从SPR结果可以看出，YW-TCR-1 TCR与1G4 TCR结合NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的亲和力相当，均为～10^-6M数量级的亲和力(如图7)。

实施例4.YW-TCR-1 TCR与表达NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的靶细胞作用

本实施例将YW-TCR-1 TCR基因导入Jurkat T细胞系(购自上海细胞库)，作为效应细胞；将NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2导入K562细胞(购自上海细胞库)，作为靶细胞。通过检测效应细胞和靶细胞作用后IL-2的水平，对YW-TCR-1 TCR与表达NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的靶细胞的作用进行评价。

1.YW-TCR-1 TCR慢病毒制备及Jurkat T细胞感染

将实施例2中的YW-TCR-1 TCR表达质粒(YW-TCR-1-pCDH)与慢病毒包装质粒PLP1、PLP2和VSVG(购自Addgene公司)按照PLP1:PLP2:VSVG:YW-TCR-1-pCDH＝1:1:1:1的比例混合，并稀释到DMEM培养基(1.25ml)中。将聚醚酰亚胺(PEI，1μg/μl)加入到DMEM(1.25ml)中。将PEI/DMEM溶液全部加入到已经配好的DNA溶液中，室温孵育15分钟后加入293T细胞(上海细胞库)中并混匀。6小时后，小心吸出培养液，加入25ml新的培养液继续培养。64小时后，收集含有病毒的上清液，即为YW-TCR-1 TCR慢病毒上清。

将YW-TCR-1 TCR慢病毒按照1:1体积比加入到Jurkat T细胞中，混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。24小时后，换成完全培养基继续培养。病毒感染72小时后，收集细胞用PBS清洗两次，得到效应细胞备用。

2.NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2靶细胞制备

按照真核细胞表达密码子优化NY-ESO-1(157-165)多肽及HLA-A2重链和β2m的基因(HLA-A2)，合成DNA，并分别引入酶切位点Eco RI和Bam HI，其中Eco RI酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Bam HI位于序列的3’端。利用酶切位点Eco RI和Bam HI将合成的HLA-A2 DNA序列克隆入表达载体pCDH(Addgene公司)，建立NY-ESO-1(157-165)-HLA-A2的真核重组表达质粒。之后将HLA-A2表达质粒通过DNA电转仪转入K562细胞，48小时后收集细胞用PBS清洗两次，得到靶细胞备用。

3.表达YW-TCR-1 TCR的效应细胞与表达NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2的靶细胞相互作用检测

将上述表达YW-TCR-1 TCR的Jurkat T细胞(已培养至7天)进行培养，在检测与靶细胞作用的当天或者第二天阳性率检测，确认TCR的表达。

分别将上述NY-ESO-1(157-165)-HLA-A2靶细胞的细胞悬液吸至15ml或50ml离心管中(如有需要可用2ml PBS冲洗培养瓶2-3次，以减少细胞在计数中的损耗)，室温200-250g离心10分钟。用移液枪小心吸除上清液，加1ml 1640完全培养基重悬细胞进行细胞计数。将准备好的细胞悬液铺至96孔板内，每孔100μl细胞悬液(2×10⁵个细胞)，每孔做三个重复，其中PMA/伊屋诺霉素(IONO)组按照每250μl细胞培养基中加入1μl PMA/伊屋诺霉素混合液(250×)提前稀释成工作液，并作为阳性刺激对照。未感染YW-TCR-1 TCR慢病毒的Jurkat T细胞平行加入，作为阴性对照，而只有靶细胞而未加入任何效应细胞的孔作为空白对照。将靶细胞与效应细胞混合，在37℃下培养20h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清加入包被有抗IL-2抗体的ELISA检测板(BD公司)，检测上清中的IL-2水平。

结果表明，表达YW-TCR-1 TCR的Jurkat T细胞与表达NY-ESO-1(157-165)-HLA-A2的靶细胞孵育后能够产生较高水平的IL-2(500pg/ml)，而未转入YW-TCR-1 TCR的Jurkat T细胞与靶细胞孵育后IL-2水平与不加效应细胞的对照无显著差异(图8)。因此，YW-TCR-1TCR能够特异性识别表达NY-ESO-1(157-165)-HLA-A2的靶细胞，并特异性分泌细胞因子IL-2，具有潜在的靶细胞杀伤活性和肿瘤治疗价值。

序列表

<110> 英威福赛生物技术有限公司

<120> 靶向NY-ESO-1（157-165）表位的特异性T细胞受体及抗肿瘤应用

<130> 192117

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

Ala Gln Lys Val Thr Gln Thr Gln Thr Ser Ile Ser Val Met Glu Lys

1 5 10 15

Thr Thr Val Thr Met Asp Cys Val Tyr Glu Thr Gln Asp Ser Ser Tyr

20 25 30

Phe Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Thr Ala Ser Gly Glu Ile Val Phe Leu

35 40 45

Ile Arg Gln Asp Ser Tyr Lys Lys Glu Asn Ala Thr Val Gly His Tyr

50 55 60

Ser Leu Asn Phe Gln Lys Pro Lys Ser Ser Ile Gly Leu Ile Ile Thr

65 70 75 80

Ala Thr Gln Ile Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Met Ser Tyr

85 90 95

Ala Ser Ser Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu

100 105 110

Thr Val Met Pro

115

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Gly Gly Ile Ile Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Ile Gly Gln Glu Gly

1 5 10 15

Gln Lys Leu Thr Leu Lys Cys Gln Gln Asn Phe Asn His Asp Thr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Ser Gly Lys Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr

35 40 45

Ser Ile Thr Glu Asn Asp Leu Gln Lys Gly Asp Leu Ser Glu Gly Tyr

50 55 60

Asp Ala Ser Arg Glu Lys Lys Ser Ser Phe Ser Leu Thr Val Thr Ser

65 70 75 80

Ala Gln Lys Asn Glu Met Ala Val Phe Leu Cys Ala Ser Ser Ile Val

85 90 95

Phe Gln Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Thr Gln Asp Ser Ser Tyr Phe

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Gln Asp Ser Tyr Lys Lys Glu Asn

1 5

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 5

Ala Met Ser Tyr Ala Ser Ser Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 6

Phe Asn His Asp Thr

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 7

Ser Ile Thr Glu Asn Asp

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Cabassous unicinctus

<400> 8

Ala Ser Ser Ile Val Phe Gln Asp Thr Gln Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Met Leu Ile Leu Ser Leu Leu Gly Ala Ala Phe Gly Ser Ile Cys Phe

1 5 10 15

Ala Thr Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Thr Gln Thr Ser Ile Ser

20 25 30

Val Met Glu Lys Thr Thr Val Thr Met Asp Cys Val Tyr Glu Thr Gln

35 40 45

Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Thr Ala Ser Gly Glu

50 55 60

Ile Val Phe Leu Ile Arg Gln Asp Ser Tyr Lys Lys Glu Asn Ala Thr

65 70 75 80

Val Gly His Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Pro Lys Ser Ser Ile Gly

85 90 95

Leu Ile Ile Thr Ala Thr Gln Ile Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

100 105 110

Ala Met Ser Tyr Ala Ser Ser Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe Gly Ser

115 120 125

Gly Thr Gln Leu Thr Val Met Pro Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val

130 135 140

Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe

145 150 155 160

Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp

165 170 175

Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe

180 185 190

Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys

195 200 205

Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro

210 215 220

Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu

225 230 235 240

Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg

245 250 255

Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg

260 265 270

Leu Trp Ser Ser

275

<210> 10

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Met Asn Lys Trp Val Phe Cys Trp Val Thr Leu Cys Leu Leu Thr Val

1 5 10 15

Glu Thr Thr His Gly Asp Gly Gly Ile Ile Thr Gln Thr Pro Lys Phe

20 25 30

Leu Ile Gly Gln Glu Gly Gln Lys Leu Thr Leu Lys Cys Gln Gln Asn

35 40 45

Phe Asn His Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Ser Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Ile Thr Glu Asn Asp Leu Gln Lys Gly

65 70 75 80

Asp Leu Ser Glu Gly Tyr Asp Ala Ser Arg Glu Lys Lys Ser Ser Phe

85 90 95

Ser Leu Thr Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Glu Met Ala Val Phe Leu

100 105 110

Cys Ala Ser Ser Ile Val Phe Gln Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly

115 120 125

Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu

130 135 140

Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys

145 150 155 160

Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu

165 170 175

Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr

180 185 190

Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr

195 200 205

Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro

210 215 220

Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn

225 230 235 240

Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser

245 250 255

Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr

260 265 270

Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly

275 280 285

Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala

290 295 300

Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

Claims (9)

1.一种T细胞受体（TCR）或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与NY-ESO-1（157-165）表位和HLA-A2复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，所述TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区CDR 和β链互补决定区CDR ：

氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的α链互补决定区CDR 1；

氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的α链互补决定区CDR 2；

氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示的α链互补决定区CDR 3；

氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示的β链互补决定区CDR 1；

氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示的β链互补决定区CDR 2；和

氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示的β链互补决定区CDR 3。

2.一种T细胞受体（TCR）或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与NY-ESO-1（157-165）表位和HLA-A2复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，所述TCR或其抗原结合片段包含：

氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的α链可变区，和

氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的β链可变区。

3.根据权利要求1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR。

4.一种多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。

5.一种表达载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种制备权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：

1）培养权利要求6所述的宿主细胞；

2）从所述宿主细胞或其培养基中回收权利要求1-3中任一项所述TCR或其抗原结合片段。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。

9.权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌、滑膜肉瘤的抗肿瘤药物中的用途。

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