JP2023509590A

JP2023509590A - 工学的修飾ｔ細胞、その調製および応用

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Publication number: JP2023509590A
Application number: JP2022538051A
Authority: JP
Inventors: 李俊; ▲張▼▲鵬▼潮
Original assignee: Fundamenta Therapeutics Inc
Current assignee: Fundamenta Therapeutics Inc
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2023-03-09
Also published as: US20230059596A1; CN113005088A; WO2021121383A1; KR20220124189A; CA3165426A1; AU2020404324A1; EP4079841A1; CN113005088B

Abstract

本発明は、工学的修飾Ｔ細胞を提供し、当該細胞は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現をダウンレギュレートするポリペプチドの導入によって、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現を低下した；当該工学的修飾Ｔ細胞は、治療目的、例えば癌症の治療に用いられてもよい。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞免疫療法の分野に属し、特に、工学的修飾Ｔ細胞、その調製および応用に関する。

腫瘍治療法の発展に伴い、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ、ＣＡＲ－Ｔ）免疫療法は、注目を集めている治療アプローチになった。ＣＡＲ－Ｔ細胞に発現されたＣＡＲは、通常に、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含む。通常、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者自身のＴ細胞からＣＡＲ遺伝子でトランスフェクトし、増幅し、当該患者の体に注入し戻す。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ、ＭＨＣ）に制限されないように、腫瘍抗原を効果的に認識し、特定の抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができる。現在、米国ＦＤＡは、難治性・再発性の非ホジキンリンパ腫と急性リンパ性白血病の治療に用いられる、２つの自己由来ＣＡＲ－Ｔ細胞製品、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）のＫｙｍｒｉａｈとＫｉｔｅＰｈａｒｍａのＹｅｓＣＡＲ－Ｔａを承認した。関連する臨床試験により、ＣＡＲ－Ｔは完全に個別化された生細胞薬として、大きな抗腫瘍の可能性があることが証明される（ＭａｕｄｅＳＬ、ＬａｅｔｓｃｈＴＷ、ＢｕｅｃｈｎｅｒＪらＴｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎａｎｄｙｏｕｎｇａｄｕｌｔｓｗｉｔｈＢ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０１８、３７８（５）：４３９－４４８；ＰａｒｋＪＨ、ＲｉｖｉeｒｅＩ、ＧｏｎｅｎＭらＬｏｎｇ－ｔｅｒｍｆｏｌｌｏｗ－ｕｐｏｆＣＤ１９ＣＡＲｔｈｅｒａｐｙｉｎａｃｕｔｅｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０１８、３７８（５）：４４９－４５９；ＳｃｈｕｓｔｅｒＳＪ、ＳｖｏｂｏｄａＪ、ＣｈｏｎｇＥＡらＣｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓｉｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙＢ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａｓ［Ｊ］．ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、３７７（２６）：２５４５－２５５４）。

これら２つのＣＡＲ－Ｔ薬品の調製と注入し戻す策略は、どちらも、患者自身の末梢血を収集し、Ｔ細胞を単離し、ウイルスベクターを使用し、ＣＡＲのコード遺伝子をＴ細胞のゲノムに組み込み、増幅培養してから患者の体に注入し戻す。このように完全に個別化されたＣＡＲ－Ｔ細胞の生産は、生産サイクルが長く、コストがかかるだけでなく、注入し戻す治療にも多くの不確実性が伴う。例えば、単離されたＴ細胞の数の不足や誤作動によるＣＡＲ－Ｔ細胞調製の失敗や、細胞調製中に患者の疾患が急速に進行することによる治療機会の喪失などがある。そのため、ＣＡＲ－Ｔ分野では、上記の生産・治療に関する問題を、効果的に回避・解決し、生産コストを大幅に削減するために、健常なドナー由来の既製（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＯＴＳ）に共通の期待が寄せられる。

同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製には、まず安全面での大きな課題、すなわち、移植片対宿主反応（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）を解決することが必要である。ＧＶＨＤは、移植片に含まれる同種異系反応性Ｔ細胞が、宿主の同種異系組織抗原を認識することによって引き起こされる、レシピエントの正常な組織や臓器の免疫拒絶反応であり、重症例では致命的となる可能性がある。ＧＶＨＤは、異系Ｔ細胞の表面にあるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって仲介される。ＴＣＲは、すべての成熟Ｔ細胞の表面にある特徴的なマーカーである。ＴＣＲは、細胞内で小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、ＥＲ）内の複数のＣＤ３サブユニットと非共有結合で、結合・組み立て、最終的に、細胞表面でＴＣＲ－ＣＤ３抗原認識複合体として存在する。

２０１２年、Ｐｒｏｖａｓｉらは、遺伝子編集技術を使って、同種異系Ｔ細胞における移植片対宿主反応の問題を解決しようとしていることを報告した（ＰｒｏｖａｓｉＥ、ＧｅｎｏｖｅｓｅＰ、ＬｏｍｂａｒｄｏＡ、ｅｔａｌ．ＥｄｉｔｉｎｇＴｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｔｏｗａｒｄｓｌｅｕｋｅｍｉａｂｙｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓａｎｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２、１８（５）：８０７）。彼らは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＺＦＮ）で、ドナーＴ細胞のＴＣＲ遺伝子を特異的にノックアウトし、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が形成されないようにして、Ｔ細胞が宿主抗原を認識できないようにし、ＧＶＨＤ反応をなくすことに成功した。その後、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅｓ）やＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）など、さまざまな新規遺伝子編集技術も実験室レベルでの成功が報告されている（ＢｅｒｄｉｅｎＢ、ＭｏｃｋＵ、ＡｔａｎａｃｋｏｖｉｃＤ、ｅｔａｌ．ＴＡＬＥＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄｅｄｉｔｉｎｇｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＴ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｓｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｂｙｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ、２０１４、２１（６）：５３９；ＲｅｎＪ、ＺｈａｏＹ．ＡｄｖａｎｃｉｎｇｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ｃｅｌｌ、２０１７、８（９）：６３４－６４３）。しかし、現在までのところ、同種異系ＣＡＲ－Ｔの臨床例は、ごく限られた数しか報告されていない（ＱａｓｉｍＷ、ＺｈａｎＨ、ＳａｍａｒａｓｉｎｇｈｅＳ、ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｍｉｓｓｉｏｎｏｆｉｎｆａｎｔＢ－ＡＬＬａｆｔｅｒｉｎｆｕｓｉｏｎｏｆｕｎｉｖｅｒｓａｌＴＡＬＥＮｇｅｎｅ－ｅｄｉｔｅｄＣＡＲＴｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、９（３７４）：ｅａａｊ２０１３）。遺伝子編集に基づく同種異系ＣＡＲ－Ｔの臨床研究が、なかなか進まない主な理由は、遺伝子編集に伴う安全性への懸念（例えばオフターゲッティングによる誤っている遺伝子編集）、遺伝子編集が生体内でのＴ細胞の持続性低下を抑える可能性、および生産・調製で遭遇する障壁（例えば、多数のプロセスステップ、Ｔ細胞へのダメージが大きい）に起因すると思われる。

また、非遺伝子編集に基づく同種異系ＣＡＲ－Ｔ技術も業界に注目されている。この技術は、１９９５年の報告書に由来し、著者らは、小胞体保留シグナルを持つ特異的抗体を細胞内に発現させると、ＩＬ－２受容体タンパク質が小胞体内に効果的に保留され、細胞表面からほぼ完全に消失し、遺伝子編集と同様の機能欠損が達成されることを見いだした（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎＪＨ、ＳｏｄｒｏｓｋｉＪＧ、ＷａｌｄｍａｎｎＴＡ、ｅｔａｌ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆｔｈｅｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙｈｕｍａｎｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｙｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｔｈｅａｌｐｈａｓｕｂｕｎｉｔｏｆｔｈｅｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ、１９９５、９２（８）：３１３７－３１４１）。最近、この技術は借用され、表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を効果的にダウンレギュレートするペプチドの見つけ出しや、一般的なパターンが存在するかどうか（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のどのタンパク質またはそのエピトープが、ペプチドに含まれる抗体によって最も効果的に認識されるか）を確認することなどに用いられる。しかし、本研究の結果としては、異なるターゲットの抗体、同じターゲットの異なる抗体クローン、異なるＥＲ保留シグナル、異なるリンカーなどの因子がいずれも、これらの抗体配列の表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のダウンレギュレート活性に影響を与えることが明らかになった（ＫａｍｉｙａＴ、ＷｏｎｇＤ、ＰｎｇＹＴ、ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅＴ－ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒＴｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄａｄｖａｎｃｅｓ、２０１８、２（５）：５１７－５２８；ＷＯ２０１９０３２９１６Ａ１；ＵＳ２０１８００８６８３１Ａ１）。

表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体がダウンレギュレートまたは欠失されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、現在の自家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の効果を向上させる可能性がある。患者の自己Ｔ細胞から調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞には、患者自身の腫瘍を認識するＴＣＲ／ＣＤ３複合体も同時に存在することもあるが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＣＡＲの同時活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を誘発し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の治療効果に影響を与えることが知られる（ＹａｎｇＹ、ＫｏｈｌｅｒＭＥ、ＣｈｉｅｎＣＤらＴＣＲｅｎｇａｇｅｍｅｎｔｎｅｇａｔｉｖｅｌｙａｆｆｅｃｔｓＣＤ８ｂｕｔｎｏｔＣＤ４ＣＡＲＴｃｅｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎａｎｄｌｅｕｋｅｍｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７、９（４１７）：ｅａａｇ１２０９）。

この分野では、あらゆるドナー由来のＴ細胞と、当該細胞の表面にあるＴＣＲ／ＣＤ３複合体を効率的にダウンレギュレートする方法の開発が急務となっている。この分野では、あらゆるドナー由来のＴ細胞と、治療用タンパク質を発現しつつ、当該細胞の表面にあるＴＣＲ／ＣＤ３複合体を効率的にダウンレギュレートする方法の開発が急務となっている。

したがって、本発明は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を効率的にダウンレギュレートする試薬、方法と細胞を提供する。

本明細書の一つの様態では、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことを特徴とする工学的修飾Ｔ細胞を提供する。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたような配列ＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴ（ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸である）を含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたような配列ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹ（ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸である）を含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＬには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたような配列ＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔ（ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である）を含む。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₂は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₃は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₄は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₅は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₆は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₇は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₈は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₉は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₀は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₁は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインである。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₂は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。

一つ又は複数の実施の形態において、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられる。

一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられる。

一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。

一つ又は複数の実施の形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４２；（２）前記ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３を含むＳＥＱＩＤＮＯ：４２バリアント；（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列；から選べられ、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４３；（２）前記ＬＣＤＲ３を含むＳＥＱＩＤＮＯ：４３バリアント；（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列から選べられる。一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ３は、本明細書に記載された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、前記ポリペプチドは、一本鎖抗体である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、局在化配列と任意的なシグナルペプチドを含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる；好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つを含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記局在化配列と抗体の間に、リンカーを含み、前記リンカーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、前記Ｔ細胞は、さらに治療用タンパク質を発現する；好ましくは、治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記Ｔ細胞は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有し、又は、前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置する。

前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置する実施の形態において、治療用タンパク質のコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列の間に、連結配列を含み、前記連結配列は、一つのベクターに複数のシストロンを発現することを可能にする。

一つ又は複数の実施の形態において、前記連結配列は、２Ａペプチドのコード配列である。

一つ又は複数の実施の形態において、２Ａペプチドは、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａペプチドを含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記キメラ抗原受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、抗腫瘍抗原の一本鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内領域を含有する。

一つまたは複数の実施の形態において、前記のキメラ抗原受容体は、以下から選べられる腫瘍抗原の一つ又は複数と特異性的に結合する：ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソセリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－糖ペプチド、ｓＴｎ－Ｏ－糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ｌｅｇｕｍａｎ、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶＥ６又はＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸溶性カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４と、ＭＨＣに提示されたこれらの抗原のいずれか一つのポリペプチドフラグメント、及びＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ７／４／３ＲとＩＬ４Ｒ。

一つ又は複数の実施の形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ１ＦｃＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ＦｃＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域とＣＤ４細胞外ヒンジ領域からなる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域とＤＡＰ１０膜貫通領域の一つ又は複数から選べられる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞内領域は、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＬＣＫ、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζとＦｃ３１０の一つ又は複数の細胞内領域から選べられる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドを含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記抗腫瘍抗原の一本鎖抗体は、抗ＣＤ１９一本鎖抗体である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記細胞内領域は、４－１ＢＢ細胞内領域とヒトＣＤ３ζ細胞内領域を含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の２３－１２９位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１４８－２６７位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記ヒンジ領域の配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の２６８－３１２位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記膜貫通領域の配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３１３－３３６位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記４－１ＢＢ細胞内領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３３７－３７８位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる；ＣＤ３ζ細胞内領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３７９－４９０位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

一つ又は複数の実施の形態において、キメラ抗原受容体のシグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１－２２位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる。

本発明のもう一つの様態では、工学的修飾Ｔ細胞を提供し、前記Ｔ細胞は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むか、又は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ前記抗体又は抗原結合フラグメントの抗原結合活性を保留する突然変異体を含む；ただし、前記抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、下記ＨＣＤＲを有する：ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されたＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＩＳＹＴ、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴ、ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹ、ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸であり、
前記軽鎖可変領域は、下記ＬＣＤＲを有する：
ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されたＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＹ、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されたＬＣＤＲ２：ＤＴＳ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔ、ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である
ことを特徴とする。

好ましくは、Ｘ₁－Ｘ₁₂は、本明細書に記載された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられる。一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられる。一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。

一つ又は複数の実施の形態において、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４２；（２）前記ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３を含むＳＥＱＩＤＮＯ：４２バリアント；（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列；から選べられ、及び／又は、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４３；（２）前記ＬＣＤＲ３を含むＳＥＱＩＤＮＯ：４３バリアント；（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列から選べられる。

一つ又は複数の実施の形態において、前記抗体は、一本鎖抗体である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる。好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つを含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸である。

一つ又は複数の実施の形態において、前記局在化配列と抗体の間に、リンカーを含み、好ましくは、前記リンカーは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、前記Ｔ細胞は、さらに、治療用タンパク質を発現し、好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体である。

本発明は、前記抗体のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＧＹＴＦＩＳＹＴであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＳＶＳＹであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＤＴＳであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔである；ただし、Ｘ₁－Ｘ₁₂は、請求項１０に記載された通りで、かつＨＣＤＲ２は、ＩＮＰＲＳＧＹＴではなく、ＨＣＤＲ３は、ＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹではなく、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＳＮＰＰＴではないことを特徴とする抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

一つ又は複数の実施の形態において、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示されるが、そのＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３の配列は、請求項１０又は１１に示された通りである；前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に示されるが、そのＬＣＤＲ３の配列は、請求項１０又は１１に示された通りである。

本発明は、さらに、局在化配列と、本明細書に記載された細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドと、任意的なシグナルペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。

一つ又は複数の実施の形態において、前記局在化配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの間に、リンカーを含む。前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りである。

一つ又は複数の実施の形態において、前記融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－８０４位又は５３８－８０４位に示された通りである。

本発明のもう一つの様態では、（１）治療用タンパク質のコード配列と、本明細書に記載された細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチド；（２）本明細書に記載された融合タンパク質のコード配列；（３）本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列；および（４）（１）又は（２）又は（３）の相補配列又はフラグメント；から選べられる核酸分子を提供する。好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体である。

一つ又は複数の実施の形態において、治療用タンパク質のコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列の間に、連結配列を含み、前記連結配列は、一つのベクターに複数のシストロンを発現することを可能にする。

一つ又は複数の実施の形態において、前記治療用タンパク質と前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとの特徴は、本明細書に記載された通りである。

本発明のもう一つの様態では、核酸構築物を提供し、前記核酸構築物は、本明細書に記載された核酸分子を含む。

一つ又は複数の実施の形態において、前記核酸構築物は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有する；又は、前記核酸構築物は、発現カセットであり、ただし、前記治療用タンパク質のコード配列と前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、当該発現カセットに位置する。

一つまたは複数の実施の形態において、前記の核酸構築物は、クローニングベクター又は発現ベクターである。

本発明のもう一つの様態では、レンチウイルスを提供し、前記レンチウイルスは、本明細書に記載された核酸分子、核酸構築物を含有する。

本発明のもう一つの様態では、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞が、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は本明細書に記載された融合タンパク質と任意的な治療用タンパク質を含有、発現及び／又は分泌する。前記宿主細胞は、本明細書に記載された核酸分子、核酸構築物及び／又はレンチウイルスを含む。

本発明のもう一つの様態では、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、融合タンパク質と任意的な治療用タンパク質、核酸分子、核酸構築物、レンチウイルス又は細胞を含有する医薬品組成物を提供する。

本発明のもう一つの様態では、細胞表面ＴＣＲをダウンレギュレートするＴ細胞の調製、又は癌症治療用のＴ細胞の調製における細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド又はそのコード配列、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、融合タンパク質と任意的な治療用タンパク質、核酸分子、核酸構築物、レンチウイルスの応用を提供する。好ましくは、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、本明細書に記載された通りである。

図１は、異なる抗ＣＤ３抗体配列を含むポリペプチドが、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３タンパク質レベルに及ぼす影響を示す。図２は、異なる抗ＣＤ３抗体配列を含むポリペプチドが、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３タンパク質レベルに及ぼす影響を示す。図３は、ＣＴＡＢ１抗体配列を含むポリペプチドが、異なるドナー由来のＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３タンパク質レベルに及ぼす影響を示す。図４は、ＣＴＡＢ１抗体配列を含むポリペプチドを単独で発現させる場合、Ｔ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３タンパク質レベルをダウンレギュレートさせることを示す。図５ａ－５ｇは、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとキメラ抗原受容体の共発現下でのＴ細胞サブセット割合を示す。図６は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとキメラ抗原受容体の共発現下でのＴ細胞のインビトロ増殖を示す。図７は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとキメラ抗原受容体の共発現下でのＴ細胞の細胞毒性活性を示す。図８は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとキメラ抗原受容体の共発現下でのＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌能を示す。図９は、点変異ポリペプチドを含む細胞ライブラリーの表面マーカー分布および細胞ソーティング際に用いられるゲーティングを示す。図１０は、例示的な点変異ポリペプチドが、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３をダウンレギュレートする活性を示す。図１１ａ－１１ｃは、例示的な点変異ポリペプチドが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫サブセットの分布に影響を及ぼさないことを示す。図１２は、例示的な点変異ポリペプチドの発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ増殖に影響を及ぼさないことを示す。図１３は、例示的な点変異ポリペプチドの発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性活性に影響を及ぼさないことを示す。

本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下に具体的に記載される技術的特徴（実施例など）を互いに組み合わせて、好ましい技術を形成することができることを理解すべきである。

本発明には、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現することで、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現が低下する工学的修飾Ｔ細胞を調製する。本発明の方法で調製して得るＴ細胞には、当該ポリペプチドを発現しないコントロールと比較し、細胞表面にＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現レベルは、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９９％又は完全に抑制される。

本明細書中、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。「抗体」とは、標的抗原に特異的に結合することを可能にするのに十分な免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。当技術分野で知られているように、天然の完全な抗体は、２つの同一の重鎖ポリペプチドと２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含む４量体である。各重鎖は、少なくとも四つのドメインを含む：アミノ末端の可変ドメインＶＨ、定常ドメインＣＨ１、定常ドメインＣＨ２とカルボキシ末端の定常ドメインＣＨ３。各軽鎖は、二つのドメインを含む：アミノ末端の可変ドメインＶＬとカルボキシ末端定常ドメインＣＬ。各可変ドメインは、三つの「相補性決定領域」：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３、および四つの「フレーム」領域：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３和ＦＲ４を含む。「抗原結合フラグメント」とは、抗体に、標的抗原に特異的に結合することができるフラグメントを指す。抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド結合で結合するＦｖフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単離されたＣＤＲ又はＣＤＲセット、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、単一ドメイン抗体、ラクダ抗体、マスク抗体、小モジューラー免疫薬、二機能性抗体、ナノボディ、Ｈｕｍａｂｏｄｙ抗体を含む。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を、短いペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）で連結してなる抗体である。

好ましい実施の形態において、本発明に、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、特異的にＣＤ３に結合する抗ＣＤ３抗体であり、より好ましくは、抗ＣＤ３一本鎖抗体（ｓｃｆｖ）である。一つ又は複数の実施の形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３、ＣＴＡＢ１、ＣＴＡＢ２、ＣＴＡＢ４又はＣＴＡＢ３から選べられる。好ましくは、抗ＣＤ３一本鎖抗体は、これらの抗ＣＤ３抗体から誘導される。例示的に、ＵＣＨＴ１ｓｃｆｖのＶＬとＶＨ配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：４５と４６を含むか、又はそれからなる；ＯＫＴ３ｓｃｆｖのＶＬとＶＨ配列は、それぞれに、ＳＥＱＩＤＮＯ：４７と４８を含むか、又はそれからなる。好ましい実施の形態において、抗ＣＤ３一本鎖抗体は、ＣＴＡＢ１から誘導してなるものである。

好ましい実施の形態において、前記抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域は、下記ＨＣＤＲを有する：ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されたＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＩＳＹＴ、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴ、ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹ、ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸である；前記軽鎖可変領域は、下記ＬＣＤＲを有する：ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されたＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＹ、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されたＬＣＤＲ２：ＤＴＳ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔ、ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である。

一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₂は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₃は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₄は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₅は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₆は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₇は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₈は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₉は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₀は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₁は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₂は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。

好ましくは、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられる。一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられる。一つ又は複数の実施の形態において、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。

一部の実施の形態において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示された配列を含むか、又は以下に示されたＨＣＤＲのＳＥＱＩＤＮＯ：４２のバリアントを含むか、又はそれからなる：ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されたＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＩＳＹＴ、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴ、ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹ、ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₂は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₃は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₄は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₅は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₆は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₇は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである。

一つ又は複数の実施の形態において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に示された配列を含むか、又は以下に示されたＬＣＤＲのＳＥＱＩＤＮＯ：４３のバリアントを含むか、又はそれからなる：ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されたＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＹ、ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されたＬＣＤＲ２：ＤＴＳ、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔ、ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₈は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₉は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₀は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₁は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインである。一つ又は複数の実施の形態において、Ｘ₁₂は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。

一部の実施の形態において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示された配列を含み、ただし、ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられ、及び／又は、ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。一つ又は複数の実施の形態において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に示された配列を含み、ただし、ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられる。

本明細書の細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの軽鎖可変領域と重鎖可変領域との間は、直接に連結しても良く、又は、本分野によく知られるリンカー配列、例えば、前文に記載されたＧとＳを含むリンカー配列を介して連結しても良い。

本発明において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、前記抗体（特に本明細書に記載された抗ＣＤ３抗体）又はその抗原結合フラグメントと少なくとも７０％の配列同一性を有し、かつ前記抗体又は抗原結合フラグメントとの抗原結合活性を保留する突然変異体である。前記突然変異体は、参照配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有し、かつ参照配列の生物学活性（例えばＴ細胞を活性化し、ＴＣＲに結合する）を保留するアミノ酸配列を含む。例えばＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｐで、二つのアライメントされた配列の間の配列同一性を計算できる。突然変異体は、前記アミノ酸配列に一つ又は複数の突然変異（插入、欠失、及び／又は置換）を有しつつ、当該参照配列の生物学活性を保留するアミノ酸配列も含む。前記複数の突然変異は、通常に、１－５０個以下、例えば１－２０、１－１０、１－８、１－５又は１－３個を指す。置換は、好ましくは、保存的置換である。ｓｃＦｖに対して、突然変異の後、相変わらず参照配列の生物学活性を保留できれば、突然変異は、ＣＤＲ領域に（前に記載されたＣＤＲ領域の内の突然変異も含む）、又はＦＲ領域に発生しても良い。例えば、本分野中、類似の特性のアミノ酸による保存的置換は、一般に、タンパク質またはポリペプチドの機能を変化させない。「近いまたは類似の特性を有するアミノ酸」は、例えば、類似の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーを含み、これらのファミリーは、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を帯びない極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐型側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）と、芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本発明のポリペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖クラスからの別のアミノ酸残基で置換しても、その活性に実質的に影響を与えない。一部の実施の形態において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、融合タンパク質であり、さらに、ポリペプチドをサブセル構造へ引導することができる局在化配列も含む。前記局在化配列は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に位置しても良い。前記サブセル構造は、ゴルジ体又は小胞体、プロテアソーム、細胞膜又はリソソームを含むが、これらに限定されない。前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列を含む。局在化配列が、その隣接するポリペプチドと直接に連結しても良く、又は、本分野によく知られるリンカー配列、例えば前文に記載されたＧとＳを含むリンカー配列を介して連結しても良い。一つ又は複数の実施の形態において、局在化配列と、その隣接するポリペプチド（例えば抗体又はその抗原結合フラグメント）との間に、配列ＳＥＱＩＤＮＯ：４１を有する。

本明細書に記載された「小胞体保留配列」又は「小胞体保留シグナル」は、短いペプチドシグナル配列である。小胞体保留配列は、ゴルジ体の膜に、対応する受容体を持ち、還流小胞を介して小胞体へ輸送されることができる。本発明に適される小胞体保留配列は、本分野によく知られる小胞体保留配列であっても良い。小胞体保留配列は、隣接するポリペプチドのＣ端に位置しても良い。前記「小胞体体保留配列」又は「ゴルジ体保留配列」は、ＡＥＫＤＥＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）、ＫＤＥＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）、ＫＫＸＸ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）、ＫＸＤ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）、ＫＸＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）又はＹＱＲＬ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）を含み、又はそれからなるが、これらに限定されなく、ただしＸは、任意なアミノ酸である。プロテアソーム局在化配列は、抗体配列を、Ｅ３ユビキチンリガーゼに標的するドメイン配列に連結し、かつＥ３ユビキチンリガーゼタンパク質の核酸配列と共発現させることで達成する。Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質は、高親和性で抗体のＦｃドメインに結合し、かつユビキチン－プロテアソーム複合体を動員し、抗体結合分子（例えば、タンパク質とペプチド）を分解することができる。Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）遺伝子（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のようなもの）から選択されるアミノ酸配列をコードし、抗体とＦｃドメインを含む的融合タンパク質の形成に用いられる構造体ドメイン配列に標的する。前記「プロテアソーム局在化配列」は、ＰＥＳＴモチーフを含むが、これに限定されない。前記「リソソーム局在化配列」は、ＫＦＥＲＱを含むが、これに限定されない。

細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、さらに、シグナルペプチドを含んでも良い。シグナルペプチドは、膜タンパク質シグナルペプチドであっても良く、例えば抗体重鎖のシグナルペプチド、抗体軽鎖のシグナルペプチド、ＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチドとＣＤ４シグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる。

当該工学的修飾Ｔ細胞に、さらに治療用ポリペプチドを発現しても良い。同種異系の治療において、これらのＴ細胞は、移植片対宿主反応を効果的に避ける。自身に注入し戻す治療において、本発明の方法で調製して得るＴ細胞が、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＣＡＲとの同時活性化によるＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇を避け、これによって、治療效果を向上する。

本明細書に記載された「治療用タンパク質」または「治療用ペプチド」とは、細胞（特にＴ細胞）内で発現し、対応する治療活性を発揮する分子を意味し、自然のもの、自然から単離されたものであっても良く、製造されたものであっても良く、ウイルス、細菌、植物または動物由来のタンパク質またはペプチド、低分子活性ペプチド、抗原またはそのフラグメント（例えば抗原エピトープ、抗原決定基）、抗体またはそのフラグメント（例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ）、抗原受容体（例えばキメラ抗原受容体ＣＡＲ）、融合タンパク質またはペプチドを含むが、これらに限定されない。

したがって、本発明は、さらに、興味がある腫瘍抗原に標的するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。本発明は、さらに、興味がある腫瘍抗原に標的するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドと、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。

本明細書において、適切なＴ細胞は、当技術分野で周知の様々なＴ細胞、特に細胞性免疫療法で従来から使用されている様々なＴ細胞であっても良く、末梢血Ｔリンパ球、細胞傷害性キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサー／制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞、腫瘍浸潤リンパ球など、および上記の細胞の任意の１つまたは複数の混合物を含むが、これらに限定されない。本明細書において、ＣＡＲ－Ｔ細胞とは、少なくともキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を指す。

本明細書において、キメラ抗原受容体は、当分野に公知される意味を有し、それは、人工的に改造された受容体であり、腫瘍抗原を認識する特異性分子（例えば抗体）を免疫細胞（例えばＴ細胞）に固定化し、免疫細胞に腫瘍抗原またはウイルス抗原を認識させ、腫瘍細胞を殺することができる。本明細書での使用に適したキメラ抗原受容体は、当分野で公知される様々なＣＡＲであっても良い。通常に、ＣＡＲが、腫瘍抗原と結合するポリペプチド、ヒンジ領域、膜貫通領域と一つ又は複数の細胞内シグナル領域を含む。

腫瘍抗原と結合することに適するポリペプチドは、天然ペプチドまたは人工的に合成されるペプチドであっても良い；好ましは、人工的に合成されるポリペプチドは、一本鎖抗体又はＦａｂフラグメントである。本明細書に記載された「腫瘍抗原」又は「腫瘍表面抗原」は、腫瘍細胞表面で発現される腫瘍特異性抗原と腫瘍関連抗原を含む。腫瘍特異性抗原は、特異的に腫瘍細胞表面で発現され、正常な組織で発現されない。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の表面で過剰に発現し、正常組織では低く発現する。腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９などの免疫細胞の表面抗原；増殖・分化シグナルに関わる抗原；腫瘍の血管新生に関与する抗原；腫瘍を支える構造の腫瘍間質・細胞外マトリックス抗原；を含む。

本明細書において、興味がある腫瘍抗原は、固形腫瘍抗原、骨髄性腫瘍抗原、および非Ｂ細胞系統の血液腫瘍の抗原を含むが、これらに限定されない。適切な固形腫瘍抗原は、以下を含むが、これらに限定されない：ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソセリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ－Ｏ－糖ペプチド、ｓＴｎ－Ｏ－糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ｌｅｇｕｍａｎ、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、葉酸受容体α、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＨＰＶＥ６又はＥ７、ＭＬ－ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、チログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸溶性カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＮＡ－１７、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４と、ＭＨＣに提示されたこれらの抗原のいずれか一つのポリペプチドフラグメント。適切なＢ細胞抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７９、ＣＤ２６９、Ｆｌｔ３、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ－１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ７、ＩＬ－７／３Ｒ、ＩＬ７／４／３ＲとＩＬ４Ｒを含むが、これらに限定されない。

好ましい実施の形態において、本発明の腫瘍抗原と結合するポリペプチドは、前記のいずれか一つの腫瘍抗原と特異性的に結合する一本鎖抗体である。本明細書において、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）とは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ区）アミノ酸配列と重鎖可変領域（ＶＨ区）アミノ酸配列をヒンジで連結してなる、抗原と結合する能を有する抗体フラグメントを指す。興味がある一本鎖抗体は、興味がある抗体から由来しても良い。興味がある抗体は、ヒトマウスキメラ抗体およびヒト化抗体を含むヒト抗体であっても良い。抗体は、分泌型または膜固定型であっても良い；好ましくは膜固定型である。本明細書において、特異的な結合とは、抗体またはその抗原結合フラグメントとその標的抗原との間の反応を指す。ある実施形態において、ある抗原と特異性的に結合する抗体（又はある抗原に対する特異性を有する抗体）とは、抗体は、約１０^-5Ｍより低く、例えば、約１０^-6Ｍ、１０^-7Ｍ、１０^-8Ｍ、１０^-9Ｍ又は１０^-10Ｍより低く、又はより低い親和性（ＫＤ）で、当該抗原と結合するものである。

本発明に適する抗腫瘍抗原の抗体は、本分野によく知られる各抗腫瘍抗原の一本鎖抗体から誘導されても良い。一本鎖抗体は、興味がある抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含んでも良く、又は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域及び任意的なリンカーからなる。重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、公知されるリンカーを介して連結されてもよい。本明細書において、リンカー又はヒンジは、異なるタンパク質又はポリペプチドの間を連結するポリペプチドフラグメントであり、その目的は、タンパク質又はポリペプチドの機能又は活性を維持するために、連結されたタンパク質又はポリペプチドをそれぞれの空間的コンフォメーションに保つことである。例示的なリンカーは、Ｇ及び／又はＳを含有するリンカーを含む。通常、リンカーには、一つ又は複数の前後方向に繰り返されるモチーフを含有する。例えば、当該モチーフは、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＳＳＳＳＧ、ＧＳＧＳＡとＧＧＳＧＧであっても良い。好ましくは、当該モチーフは、リンカー配列中で隣接し、繰り返し部分の間にアミノ酸残基は挿入されていない。リンカー配列は、１、２、３、４又は５個の繰り返しモチーフの組成を含んでも良い。リンカーの長さは、３－２５個のアミノ酸残基、例えば３－１５、５－１５、１０－２０個のアミノ酸残基であっても良い。ある実施の形態において、リンカー配列は、ポリグリシンリンカー配列である。リンカー配列におけるグリシンの数は、特に制限されなく、通常に、２－２０個、例えば２－１５、２－１０、２－８個である。グリシンとセリン以外に、リンカーには、他の既知なアミノ酸残基、例えばアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）などを含んでも良い。リンカーの長さは、通常に、１５－２０個のアミノ酸である。ある実施の形態において、本発明の異なるタンパク質またはポリペプチドは、（ＧＧＧＳ）ｎを介して連結され、ここでｎは、１～５の整数である。ある実施の形態において、本発明の一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、（ＧＧＧＳ）ｎによって連結され、ただしｎは、１～５の整数である。ある実施の形態において、本発明の一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、ＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）を介して連結される。

腫瘍抗原の一本鎖抗体は、抗ＣＤ１９一本鎖抗体である実施の形態において、興味がある腫瘍抗原は、ＣＤ１９であり、興味がある一本鎖抗体は、特異的にＣＤ１９に結合する一本鎖抗体である。一つ又は複数の実施の形態において、抗ＣＤ１９一本鎖抗体は、ＦＭＣ６３から誘導される。例示的に、抗ＣＤ１９一本鎖抗体の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の２３－１２９位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる；抗ＣＤ１９一本鎖抗体の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１４８－２６７位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる、ただし、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、ＧとＳを含むリンカー配列を介して連結される。

ＣＡＲに含まれる他の部分、例えばヒンジ領域、膜貫通領域と細胞内シグナル領域は、各類ＣＡＲを構築するための通常的なヒンジ領域、膜貫通領域と細胞内シグナル領域であっても良い。

本明細書において、ヒンジ領域とは、免疫グロブリンの重鎖ＣＨ１とＣＨ２機能領域の間の領域を指し、当該領域は、プロリンが豊富で、αヘリックスを形成せず、伸長およびある程度の歪みを起こしやすく、抗体の抗原結合部位と抗原エピトープの間の相補的結合に寄与する。本発明に適するＣＡＲのヒンジ領域は、本分野によく知られるものである。本明細書での使用に適したヒンジ領域は、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ１ＦｃＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域、ＩｇＤヒンジ領域、ＣＤ２８細胞外ヒンジ領域、ＩｇＧ４ＦｃＣＨ２ＣＨ３ヒンジ領域とＣＤ４細胞外ヒンジ領域から選べられても良い。一つ又は複数の実施の形態において、ヒンジ領域は、ヒトＣＤ８αヒンジ領域である。前記ヒトＣＤ８αヒンジ領域は、本分野によく知られるＣＤ８αポリペプチド鎖から誘導されてもよい。例示的に、ヒトＣＤ８αヒンジ領域の配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の２６８－３１２位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

本明細書において、膜貫通領域は、ＣＤ２８膜貫通領域、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ３ζ膜貫通領域、ＣＤ１３４膜貫通領域、ＣＤ１３７膜貫通領域、ＩＣＯＳ膜貫通領域とＤＡＰ１０膜貫通領域の一つ又は複数から選べられても良い。好ましは、本明細書に用いられるキメラ抗原受容体の膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域である。例示的な膜貫通領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３１３－３３６位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる。

本明細書において、細胞内シグナル領域は、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、ＬＣＫ、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＣＤ３ζとＦｃ３１０／から選べられる任意的な一つ又は複数の細胞内シグナル領域であっても良く、好ましは、４－１ＢＢ細胞内シグナル領域とＣＤ３ζと細胞内シグナル領域である。本明細書の例示的な細胞内シグナル領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３３７－４９０位のアミノ酸残基に示された通りである。一つ又は複数の実施の形態において、前記４－１ＢＢ細胞内領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３３７－３７８位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる；ＣＤ３ζ細胞内領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の３７９－４９０位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。

治療用タンパク質、例えばキメラ抗原受容体は、さらにシグナルペプチドを含んでも良い。シグナルペプチドは、新しく合成されたタンパク質の分泌経路への移動を導く短いペプチド鎖で（長さ５－３０個のアミノ酸）、多くの場合、新しく合成されたポリペプチド鎖におけるタンパク質の膜貫通移動（ポジショニング）をガイドするＮ末端アミノ酸配列を指す。シグナルペプチドは、膜タンパク質シグナルペプチドであっても良く、例えばＣＤ８シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチドとＣＤ４シグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１－２２位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる。

因此、一つ又は複数の実施の形態において、前記ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、任意的な抗腫瘍抗原の一本鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、一つ又は複数の細胞内領域を含有する。例示的なキメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の２３－４９０位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる、又はＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１－４９０位のアミノ酸残基を含むか、又はそれからなる。

本明細書のキメラ抗原受容体を構成する前記の各部、例えばシグナルペプチド、一本鎖抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域、ヒンジ領域、膜貫通領域と細胞内シグナル領域などは、互いに直接連結されてもよく、または前述のＧおよびＳを含有するリンカー配列などの当分野で公知されるリンカー配列を介して連結されても良い。本発明の治療用タンパク質および細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの間は、直接に連結されてもよく、又はリンカー配列、例えば前文に記載されたＧとＳを含むリンカー配列を介して連結されても良い。又は、治療用タンパク質および細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの間に、さらに、一つのベクターで複数のポリシストロンを発現できる連結配列、例えば２Ａペプチドを含む。本分野によく知られるように、２Ａペプチドは、リボソームスキッピング（ｒｉｂｏｓｏｍｅｓｋｉｐｐｉｎｇ）を引導できる短いペプチドであり、Ｆ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａペプチドなどを含む。一つ又は複数の実施の形態において、２Ａペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の４９４－５１５位のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。２Ａペプチドは、ＧとＳを含む従来のリンカーを介して、両側のポリペプチドに接続しても良い。

本発明は、本発明に記載された細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形式又はＲＮＡ形式であっても良い。ＤＮＡ形式は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は人工的に合成されるＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であっても良い。ＤＮＡは、コード鎖と非コード鎖であっても良い。本発明は、ポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドの縮重変異体、即ち、同じのアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドも含む。

本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列が変化しない限り、コドン最適化によって変更された配列を含む。コドン最適化された配列は、具体的な生物種に対して、より適した発現力を示すことができる。本分野には、ポリヌクレオチド配列をコドン最適化する方法は、よく知られるものである。

本発明のポリヌクレオチドは、治療用タンパク質、例えばＣＡＲのコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列であっても良く、又は、治療用タンパク質の発現カセットと当該タンパク質又はポリペプチドの発現カセットであっても良い。本明細書において、コード配列とは、核酸配列の中の、そのタンパク質産物（例えばＣＡＲ、一本鎖抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、細胞内シグナル領域、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド等）のアミノ酸配列を直接に確定する部分を指す。コード配列の境界は、通常にｍＲＮＡの５’オープンリーディングフレームのすぐ上流のリボソーム結合部位（原核細胞の場合）と、ｍＲＮＡの３’オープンリーディングフレームのすぐ下流の転写終結配列によって決定される。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡと組換え核酸配列を含んでも良いが、それらに限定されない。本明細書において、発現カセットとは、プロモーター、遺伝子コード配列とＰｏｌｙＡテールシグナル配列を含む、興味がある遺伝子を発現するために必要な完全なエレメントを指す。本明細書に記載されたポリヌクレオチドは、独立の二つの核酸分子であっても良く、それぞれに、治療用タンパク質のコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列を含み、例えば、それぞれに、治療用タンパク質の発現カセットとポリペプチドの発現カセットである；又は、前記治療用タンパク質のコード配列和前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列は、リンカーを介して連結して一つの核酸分子になってもよく、例えば、治療用タンパク質のコード配列とポリペプチドのコード配列は、同じ発現カセット内に位置し、又は二つの発現カセットは、適当なリンカーを介して同一の核酸分子に連結される。ある実施の形態において、本発明のポリヌクレオチドは、治療用タンパク質のコード配列とポリペプチドのコード配列が同じ発現カセットに位置する核酸分子であり、プロモーター、前記治療用タンパク質とポリペプチドをコードする核酸配列およびＰｏｌｙＡプラステール・シグナルを含む。一つ又は複数の実施の形態において、前記ポリヌクレオチドは、任意的な小胞体保留配列のコード配列も含む。

ある実施の形態において、前記のコード配列又は発現カセットは、Ｔ細胞のゲノムに組み込まれる。そして、これらの実施の形態において、本明細書に記載されたＴ細胞のゲノムには、本明細書に記載された治療用タンパク質とポリペプチドをコードする発現カセットが安定して組み込まれている。

一つ又は複数の実施の形態において、本発明のポリヌクレオチドは、下記配列のコード配列を含む：抗腫瘍抗原の一本鎖抗体、ヒトＣＤ８αヒンジ領域、ヒトＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域、Ｆ２Ａペプチド、抗体ポリペプチド、および小胞体保留配列。一つ又は複数の実施の形態において、ポリヌクレオチドは、以下の核酸配列を含むか、又はそれらからなる：（１）本明細書に記載された治療用タンパク質のコード配列と本明細書に記載された細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチド；（２）本明細書に記載された融合タンパク質のコード配列；と（３）（１）又は（２）の相補配列又はフラグメント。一つ又は複数の実施の形態において、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：５１を含むか、又はそれからなる。

本発明は、核酸構築物にも関し、当該核酸構築物は、本明細書に記載されたポリヌクレオチド、およびこれらの配列と作動可能に連結される一つ又は複数の制御配列を含む。前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド又はタンパク質（治療用タンパク質及び／又はダウンレギュレートのポリペプチド）の発現を確保するために、本発明に記載されたポリヌクレオチドは、様々な方法で操作されても良い。核酸構築物をベクターに挿入する前に、発現ベクターの異なり又は要求によって、核酸構築物を操作しても良い。組換えＤＮＡ方法でポリヌクレオチド配列を変化させる技術は、本分野で既知される。

制御配列は、適切なプロモーター配列であっても良い。プロモーター配列は、通常に、発現しようとするタンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。プロモーターは、選択される宿主細胞に転写活性を示す任意的なヌクレオチド配列であっても良く、突然変異のもの、短縮されるもの、およびヘテロ接合プロモーターを含み、且つ、宿主細胞と相同または異種の細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。制御配列は、適切な転写ターミネーター配列であっても良く、宿主細胞に識別され、転写を停止する配列である。ターミネーター配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端と、作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能を有する任意的なターミネーターは、本発明に使えられる。制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリード配列であっても良い。リード配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端と、作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能を有する任意的なターミネーターは、本発明に使えられる。

ある実施の形態において、上記の核酸構築物は、ベクターである。ベクターは、クローニングベクターであっても良く、発現ベクターであっても良く、又は相同組換えベクターであっても良い。本発明のポリヌクレオチドは、多くの種類のベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドにクローニングすることができる。クローニングベクターは、本発明の治療用タンパク質とポリペプチドのコード配列、例えば、治療用タンパク質のコード配列とポリペプチドのコード配列を含む一つの核酸分子を提供するために用いられてもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターの形式で細胞に提供することができる。本発明のポリヌクレオチドの発現は、通常、本発明のポリヌクレオチドをプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。当該ベクターは、真核生物細胞への複製および組み込みに適したものとすることができる。一般的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を制御する転写および翻訳のターミネーター、開始配列、プロモーターを含む。ウイルスベクター技術は、当技術分野でよく知られ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、ウイルス学および分子生物学の他のマニュアルに記載される。ベクターとして使えるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスとレンチウイルスを含むが、それらに限定されない。相同組換えベクターは、本明細書に記載の発現カセットを宿主ゲノムに組み込むために使用される。

通常に、好適なベクターが、少なくとも一つの生命体で機能する複製開始部位、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼサイトと一つ又は複数の選択可能なマーカーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、複製開始部位、３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、本明細書に記載されたポリヌクレオチド、および任意的な選択可能なマーカーを含むレンチウイルスベクターを使用する。

適切なプロモーターの例として、即時型サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列が挙げられる。当該プロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベル発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。好適なプロモーターの他の例としては、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）が挙げられる。しかし、他の構成的プロモーター配列も使用することができ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、鳥白血病ウイルスプロモーター、ＥＢＶ即時初期プロモーター、Ｒｏｕｓサルコーマウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーター（アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーターなど）を含むが、これらに限定されない。

治療用タンパク質、ポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクションまたは感染させようとする細胞集団から発現細胞の同定および選択を容易にするための選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むこともできる。他の点では、選択可能なマーカーを別のＤＮＡに搭載し、コトランスフェクション過程で使用することができる。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方は、宿主細胞での発現を可能にするために適切な制御配列によってフランキングされていてもよい。有用な選択可能なマーカーが、例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。

レポーター遺伝子は、トランスフェクションされた可能性のある細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、レポーター遺伝子の発現が適切な時期に測定される。適切なレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでも良い。適切な発現系はよく知られており、既知の技術を用いて調製することができる、あるいは市販されている。

本文に記載されたポリヌクレオチドは、通常にＰＣＲ増幅法で得られる。具体的に、本文に開示されたヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列に従ってプライマーを設計し、市販のｃＤＮＡライブラリー又は本分野の当業者が既知の一般的な方法で作成するｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、増幅で関連する配列を得られる。配列が長い場合、２回又はそれ以上のＰＣＲ増幅を実行し、各回で増幅されたフラグメントを正しい順序でつなぎ合わせることがよくある。また、本明細書に記載された核酸分子を直接に合成しても良い。

遺伝子を細胞に導入する方法、および遺伝子を細胞に発現させる方法は、当技術分野で知られている。ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により宿主細胞内に導入することができる。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、脂質トランスフェクション法、パーティクルボンバードメント法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などがある。興味があるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡベクターやＲＮＡベクターの使用を含む。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段としては、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系；水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質系が挙げられる。

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法としては、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターを用いる方法があり、哺乳類、例えばヒトの細胞への遺伝子挿入方法として最も広く利用されている。その他のウイルスベクターとしては、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来しても良い。哺乳類細胞への遺伝子導入には、ウイルスを用いたシステムが数多く開発された。例えば、レトロウイルスは、遺伝子導入システムに使用するための便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野で知られている技術を用いてベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージされることが可能である。その後、組換えウイルスを単離し、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏで対象細胞に送達することができる。この分野では多くのレトロウイルス系が知られる。レンチウイルスはレトロウイルス科の一属である。レンチウイルスベクターは、レトロウイルスベクターの中でもより複雑なタイプのベクターである。レンチウイルスのパッケージングに使用される試薬は当分野で公知されるものであり、例えば、従来のレンチウイルスベクターシステムにおけるｐＲｓｖ－ＲＥＶ、ｐＭＤｌｇ－ｐＲＲＥ、ｐＭＤ２Ｇ、および標的干渉プラスミドが含まれる。一つの実施の形態において、レンチウイルスベクターｐＷＰＸＬを使用する。

したがって、ある実施形態では、本発明は、本明細書に記載されたレトロウイルスベクターと、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｓｖｇ及び／又はｒｅｖなどの対応するパッケージング遺伝子とを含むＴ細胞の活性化のためのレンチウイルスも提供する。

本明細書において、宿主細胞は、本明細書に記載された抗体及び／又は融合タンパク質および任意的な治療用ポリペプチドを含有、発現及び／又は分泌する。本明細書において、細胞がある分子（例えばポリペプチド）を発現、分泌、含有する又は含むことを言及すると、「含有」とは、前記分子は、前記細胞内又は表面に含まれることを指す；「発現」とは、当該細胞が前記分子を産生することを指す；「分泌」とは、当該細胞が、発現された分子を細胞外へ分泌することを指す。宿主細胞は、本発明のタンパク質をコードする配列又は本明細書に記載されたベクターを提供するために、最終的に疾患治療の目的で使用されるＴ細胞を含むことだけでなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞の産生過程で使用されるさまざまな細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）も含む。ある実施の形態において、本明細書が、本明細書に記載された細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを安定的に発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。

本発明で使用するのに適したＴ細胞は、様々な供給源からの様々な種類のＴ細胞であってよい。例えば、Ｔ細胞は健康個体のＰＢＭＣから由来しても良い。いくつかの実施の形態において、Ｔ細胞を得た後、適当量（例えば３０～８０ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ｎｇ／ｍｌ）のＣＤ３抗体で刺激して活性化し、適当量（例えば３０～８０ＩＵ／ｍｌ、例えば５０ＩＵ／ｍｌ）を含むＩＬ２培地で培養してもよい。

したがって、ある実施の形態において、本発明は、遺伝子修飾のＴ細胞を提供し、当該遺伝子修飾のＴ細胞は、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含有し、又は本明細書に記載されたレンチウイルスベクターを含有し、又は本明細書に記載されたレンチウイルスに感染され、又は本明細書に記載された方法で調製して得、又は本明細書に記載された治療用タンパク質とポリペプチドを安定的に発現する。

本発明のＴ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、ｉｎｖｉｖｏで強固なＴ細胞増殖を経て、血液中および骨髄中に高レベルで長時間持続し、特異的なメモリーＴ細胞を形成することができる。特定の理論に拘束されることではないが、本発明のＴ細胞は、代替抗原を発現する標的細胞を遭遇・排除した後、生体内で中枢記憶様の状態に分化することができる。

本明細書は、Ｔ細胞培養物も含み、当該培養物は、本明細書に記載されたＴ細胞及び適切な培地を含む。培地は、当分野で従来のＴ細胞の培養に用いられる培地であっても良い。

本明細書は、医薬品組成物も提供し、当該医薬品組成物には、本明細書に記載されたＴ細胞及び薬学的に許容される補助原料を含有する。本明細書において、薬学的に許容される補助原料とは、対象および有効成分と、薬理学的および／または生理学的に適合性のある担体、希釈剤および／または賦形剤を指し、ｐＨ調整剤、界面活性剤、糖質、アジュバント、酸化防止剤、キレート剤、イオン強度増強剤、防腐剤を含むが、これらに限定されない。より具体的に、適切な薬学的に許容される補助原料は、Ｔ細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）の投与のために当分野で一般的に使用されるものであっても良い。

通常に、医薬品組成物は、治療有効量のＴ細胞を含有する。治療有効量とは、対象の疾患または病状を治療、予防、軽減および／または緩和することができる用量を指す。治療有効量は、患者の年齢、性別、疾患とその重症度、患者の他の体調などの要因に従って決定することができる。本明細書において、対象または患者は、一般に、哺乳動物、特にヒトを指す。

本明細書は、さらにキットを提供し、前記キットは、本明細書に記載された核酸構築物を含有する。キットはまた、前記核酸構築物を細胞にトランスフェクトするのに適した様々な試薬、および任意的に、前記組換え発現ベクターを細胞にトランスフェクトするように当業者に指示するための説明書を含んでも良い。

本発明は、さらに、本明細書に記載の治療用タンパク質およびペプチドを発現するようにＴ細胞を遺伝子修飾することと、Ｔ細胞を対象に投与することとを含む細胞療法を含む。例えば、投与されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞によって誘導される抗腫瘍免疫応答には、能動的なものと受動的なものとがある。あるいは、ＣＡＲを介した免疫応答は、養子免疫療法ステップの一部であっても良くただし、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＡＲの抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する。

したがって、本発明のＣＡＲ、ポリペプチド、そられのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、ウイルス又はＣＡＲ－Ｔ細胞による治療に適した疾患は、ＣＡＲに含まれる腫瘍抗原に対する一本鎖抗体に関連する。したがって、本明細書に記載された疾患は、上記の腫瘍抗原に関連する様々なタイプのがん、例えば固形腫瘍とび血液腫瘍を含み、具体的に、腺癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、頸部癌、胃癌、胆管癌、胆嚢癌、食道癌、膵臓癌および前立腺癌などの固形腫瘍およびＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、および急性骨髄性白血病などの白血病とリンパ腫を含む。腫瘍抗原はＣＤ１９である実施の形態において、本明細書に記載された抗ＣＤ１９一本鎖抗体を含むＣＡＲ、ポリペプチド、それらのコード配列、核酸構築物、発現ベクター、病毒又はＣＡＲ－Ｔ細胞によって治療する疾患は、好ましくは、ＣＤ１９に誘導される疾患である；例えば急性・慢性Ｂ細胞性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫などである。

本発明のＴ細胞は、単独で投与してもよく、医薬品組成物として投与してもよい。本発明の細胞または医薬品組成物は、疾患の治療（または予防）に適した方法で投与することができる。投与量や投与頻度は、患者の病状や、患者の病気の種類や重症度など様々な要因によって決定される。組成物の投与は、注射、注入、埋め込みまたは移植によるものを含む、任意の便利な方法で実施することができる。本明細書に記載された組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、脊髄内、筋肉内、静脈内注射または腹腔内注射により患者に投与することができる。一つの実施の形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施の形態において、本発明のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内注射により投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、感染部位に直接注入することができる。

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＴ細胞又はその組成物は、当該技術分野において既知の他の治療法と組み合わせてもよい。化学療法、放射線療法、免疫抑制剤などを含むが、これらに限定されない。例えば、腫瘍抗原を介する疾患の治療のために当該技術分野で知られている放射線療法または化学療法剤と組み合わせて治療することができる。

本明細書において、「抗腫瘍効果」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移の減少、余命の延長、がんに伴う様々な生理的症状の改善などの生物学的効果を指す。

本発明では、抗ＣＤ１９抗体（具体的にはクローン番号ＦＭＣ６３に由来するｓｃＦＶ）の遺伝子配列を例として、ヒトＣＤ８αヒンジ領域、ヒトＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域、抗ＣＤ３単鎖抗体などの配列情報をＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索し、キメラ抗原受容体の遺伝子断片を全長合成してレンチウイルスベクターに挿入する。組換えプラスミドは２９３Ｔ細胞にウイルスをパッケージングし、Ｔ細胞に感染させ、Ｔ細胞に当該キメラ抗原受容体を発現させる。本発明には、キメラ抗原受容体遺伝子修飾を達成するＴリンパ球の形質転換方法は、レンチウイルス形質転換法に基づくものである。この方法は、形質転換効率が高く、外来遺伝子を安定して発現させることができ、生体外培養で臨床級のＴリンパ球数に達するまでの時間を短縮できるという利点がある。この形質転換Ｔリンパ球の表面に、形質転換された核酸が転写・翻訳されて発現する。本発明に調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、特異的な腫瘍細胞に対して強い殺傷機能を有し、エフェクター／ターゲット比が２．５対１である場合、異なる抗ＣＤ３クローン単鎖抗体を含むＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効率は、９８％を超える。

示例的な実施の形態
１、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことを特徴とする工学的修飾Ｔ細胞。

２、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたような配列ＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴを含み、ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸であり、又は
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたような配列ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹを含み、ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸である；又は
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＬには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたような配列ＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔを含み、ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である
ことを特徴とする実施の形態１に記載されたＴ細胞。

３、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする実施の形態２に記載されたＴ細胞：
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２には、Ｘ₁アミノ酸は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Ｘ₂アミノ酸は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンであり、Ｘ₃アミノ酸は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、Ｘ₄アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである；
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３には、Ｘ₅アミノ酸は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ₆アミノ酸は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ₇アミノ酸は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである；
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３には、Ｘ₈アミノ酸は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ₉アミノ酸は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ₁₀アミノ酸は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ₁₁アミノ酸は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインであり、Ｘ₁₂アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。

４、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つのセットつ又は複数のセットを含むことを特徴とする実施の形態１～３のいずれか一つに記載されたＴ細胞：
（１）以下のＬＣＤＲ３配列のうち一つ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、
（２）以下のＨＣＤＲ２配列のうち一つ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、
（３）ＨＣＤＲ３配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４。

５、前記ポリペプチドは、一本鎖抗体であることを特徴とする実施の形態１－４のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

６、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、局在化配列と任意的なシグナルペプチドを含み、好ましくは
前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる；好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つに示された配列を含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸であり、
前記局在化配列と抗体との間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りであり；
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示された通りである
ことを特徴とする実施の形態１－５のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

７、さらに治療用タンパク質を発現し、好ましくは、治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であることを特徴する実施の形態１－６のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

８、前記Ｔ細胞は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有し、又は、前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置することを特徴とする実施の形態７に記載されたＴ細胞。

９、Ｔ細胞は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むか、又は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ前記抗体又は抗原結合フラグメントの抗原結合活性を保留する突然変異体を含む；ただし、前記抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、下記ＨＣＤＲを有する：
ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されたＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＩＳＹＴ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２：Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴ、ただしＸ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄は、任意なアミノ酸であり、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹ、ただしＸ₅、Ｘ₆、Ｘ₇は、任意なアミノ酸であり、
前記軽鎖可変領域は、下記ＬＣＤＲを有する：
ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されたＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＹ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されたＬＣＤＲ２：ＤＴＳ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔ、ただしＸ₈、Ｘ₉、Ｘ₁₀、Ｘ₁₁、Ｘ₁₂は、任意なアミノ酸である
ことを特徴とする工学的修飾Ｔ細胞。

１０、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする実施の形態９に記載されたＴ細胞：
Ｘ₁は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ₂は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンであり、
Ｘ₃は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ₄は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、
Ｘ₅は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ₆は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ₇は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ₈は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ₉は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ₁₀は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ₁₁は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインであり、
Ｘ₁₂は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。

１１、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする実施の形態９又は１０に記載されたＴ細胞：
ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられ、
ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられ、
ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。

１２、重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下から選べられる：
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、
（２）ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３の配列の実施の形態１０又は１１に示されたＳＥＱＩＤＮＯ：４２バリアント、
（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列、及び／又は
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下から選べられる：
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４３、
（２）ＬＣＤＲ３の配列の実施の形態１０又は１１に示されたＳＥＱＩＤＮＯ：４３バリアント；
（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列
ことを特徴とする実施の形態９－１１のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

１３、前記抗体は、一本鎖抗体であることを特徴とする実施の形態９－１２のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

１４、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、局在化配列と任意的なシグナルペプチドを含み、好ましくは
前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる；好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つに示された配列を含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸である；
前記局在化配列と抗体との間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りであり、
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示された通りである
ことを特徴とする実施の形態９－１２のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

１５、さらに治療用タンパク質を発現し、好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であることを特徴する実施の形態９－１４のいずれか一つに記載されたＴ細胞。

１６、前記Ｔ細胞は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有し、又は、前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置することを特徴とする実施の形態１５に記載されたＴ細胞。

１７、抗体のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＧＹＴＦＩＳＹＴであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄ＳＧＹＴであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＲＳＸ₅Ｘ₆Ｘ₇ＤＹＤＧＦＡＹであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＳＶＳＹであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＤＴＳであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＱＱＷＸ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂Ｔである；ただし、Ｘ₁－Ｘ₁₂は、実施の形態１０に記載された通りで、かつＨＣＤＲ２は、ＩＮＰＲＳＧＹＴではなく、ＨＣＤＲ３は、ＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹではなく、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＳＮＰＰＴではなく、
好ましくは、前記抗体のＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３は、実施の形態１１に記載された通りである
ことを特徴とする抗体又はその抗原結合フラグメント。

１８、前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示されたが、そのＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３の配列は、実施の形態１０又は１１に示された通りである；
前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に示されたが、そのＬＣＤＲ３の配列は、実施の形態１０又は１１に示された通りである
ことを特徴とする実施の形態１７に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント。

１９、局在化配列と、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドと、任意的なシグナルペプチドとを含むことを特徴とする融合タンパク質；好ましくは、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、実施の形態９－１８のいずれか一つに記載され、好ましくは、
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示され、
前記局在化配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとの間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示され、
前記融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－８０４位に示され、又はＳＥＱＩＤＮＯ：４４の－８０４位に示された。

２０、核酸分子は、以下から選べられる：
（１）治療用タンパク質のコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列を含む的核酸分子；
（２）実施の形態１９に記載された融合タンパク質のコード配列；
（３）実施の形態１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列；および
（４）（１）、（２）又は（３）の相補配列又はフラグメント；
好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であり、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、実施の形態９－１４に記載された通りである
ことを特徴とする核酸分子。

２１、実施の形態２０に記載された核酸分子を含むことを特徴とする核酸構築物；
好ましくは、前記核酸構築物は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有する；又は、前記核酸構築物は、発現カセットであり、ただし、前記治療用タンパク質のコード配列と前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、当該発現カセットに位置する；或いは
前記核酸構築物は、クローニングベクター又は発現ベクターである。

２２、実施の形態２０に記載された核酸分子又は実施の形態２１に記載された核酸構築物を含有することを特徴とするレンチウイルス。

２３、実施の形態１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は実施の形態１９に記載された融合タンパク質と任意的な治療用タンパク質を発現及び／又は分泌する；好ましくは、実施の形態２０に記載された核酸分子、実施の形態２１に記載された核酸構築物及び／又は実施の形態２２に記載されたレンチウイルスを含むことを特徴とする宿主細胞。

２４、実施の形態９－１６のいずれか一つに記載されたＴ細胞、実施の形態１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、実施の形態１９に記載された融合タンパク質、実施の形態２０に記載された核酸分子、実施の形態２１に記載された核酸構築物及び／又は実施の形態２２に記載されたレンチウイルス、および薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする医薬品組成物。

２５、細胞表面のＴＣＲをダウンレギュレートしたＴ細胞の調製、又は癌症治療用のＴ細胞の調製における細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド又はそのコード配列、実施の形態２０に記載された核酸分子、実施の形態２１に記載された核酸構築物及び／又は実施の形態２２に記載されたレンチウイルスの応用、ただし、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、実施の形態９－１４に記載された通りである。

以下、実験的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、特に指定がない限り、説明のためにのみ提供され、限定することを意図していない。したがって、本発明は、以下の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形例を含むと解釈されるべきである。実施例で使用される方法と試薬は、特に明記しない限り、当技術分野における従来の方法と試薬である。

実施例１－ベクター構築
１、ヒトＣＤ８αヒンジ領域、ヒトＣＤ８膜貫通領域、４－１ＢＢ細胞内領域、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域、抗ヒトＣＤ１９抗体（クローンＦＭＣ６３）の重鎖・軽鎖可変領域、コントロール抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３）の重鎖・軽鎖可変領域の遺伝子配列情報をＮＣＢＩホームページデータベースから検索した。残りの抗体配列は、独自の抗ヒトＣＤ３抗体クローンから得られたものである。関連するすべてのアミノ酸配列は、コードするアミノ酸配列が変わらないようにしながら、ヒトの細胞での発現に適したコドン最適化がウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｇｅｎｅａｒｔｇｅｎｅｓ上で行われる。

２、上記配列をオーバーラップＰＣＲにより、抗ＣＤ１９－ｓｃＦｖ遺伝子、ヒトＣＤ８ヒンジ領域遺伝子、ヒトＣＤ８膜貫通領域遺伝子、４－１ＢＢ細胞内領域遺伝子、ヒトＣＤ３ζ細胞内領域、Ｆ２ＡおよびＣＤ３－ｓｃＦｖ遺伝子、小胞体保留配列（ＡＥＫＤＥＬ）の順で連結し、完全遺伝子配列情報を形成させた。シグナルペプチドのコード配列を含む配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５１の１－６６位の残基又は１５４６－１６１１位の残基に示され、アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の１－２２位の残基と５１６－５３７位の残基に示された。

３、当該ＣＡＲ分子のヌクレオチド配列を、レンチウイルスプラスミドｐＷＰＸＬ（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にシームレスにクローニングし、コンピテント大腸菌（Ｓｔｂｌ３）へ形質転換させた。

４、組換えプラスミドは、シーケンスのために、蘇州金唯智バイオテクノロジー株式会社に送られ、シーケンス結果は、合成しようとする配列と比較され、シーケンスが正しいかどうかが検証した。シーケンシングプライマーは
アセンス配列：ＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４９）
アンチセンス配列：ＣＣＡＧＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）

実施例２－ウイルスパッケージング
正しくシーケンシングした後、Ｑｉａｇｅｎ社のプラスミド精製キットを使用し、プラスミドを抽出・精製し、精製したプラスミドをリン酸カルシウム法で２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、レンチウイルスパッケージング実験（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１６，３：１６０１７）を行い、これによって、以下のレンチウイルスベクターを調製して得た：コントロール（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＧＦＰ）、サンプル１（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＵＣＨＴ１ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル２（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＯＫＴ３ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル３（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＣＴＡＢ１ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル４（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＣＴＡＢ２ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル５（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＣＴＡＢ３ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル６（ＣＡＲ１９－Ｆ２Ａ－ＣＴＡＢ４ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）、サンプル７（ＣＴＡＢ１ｓｃｆｖ－ＡＥＫＤＥＬ）。

実施例３－ＰＢＭＣおよびＴ細胞の単離
末梢血ＰＢＭＣの分離、Ｔ細胞の分離と活性化、レンチウイルス形質導入、インビトロでの培養
ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ検査が陰性の健康なドナーを選び、肘正中皮静脈から血液を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により、ＰＢＭＣバフィーコート層を分離し、全血フローサイトメトリーで検出されたＣＤ３＋Ｔ細胞の割合に基づいてＣＤ３＋Ｔ細胞の数を計算し、ＤｙｎａＢｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８とＣＤ３＋Ｔ細胞の比率が３：１の場合、使用量の磁気ビーズを吸引し、バフィーコート層細胞と３０分間インキュベートし、ＣＤ３＋Ｔ細胞を分離し、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＤｙｎａｂｅａｄｓＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって２４時間活性化し、ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の比率を、フローサイトメトリーによって検出した。

実施例４－レンチウイルス形質導入とＴ細胞培養
ＣＤ３＋Ｔが活性化された後、レンチウイルスの形質導入が行われる。２４ウェルプレートをＮｏｖｏｎｅｃｔｉｎでコーティングし、３７℃で２時間インキュベートし、細胞懸濁液および上記のように調製された様々なレンチウイルス（ＭＯＩ＝３）、Ｔｓｃｍ（２Ｕ／ｍｌ、近岸タンパク質会社）は、形質導入システムを形成し、コーティングされた２４ウェルプレートに配置され、細胞密度を１．０Ｅ＋０６／ｍｌに調整し、５００ｇで３０分間遠心分離した後、５％ＣＯ₂インキュベーター内で３７℃で４８時間放置・培養した。レンチウイルスでのトランスフェクションの後、５％ＦＢＳを含むＸｖｉｖｏ１５液体培地で培養し、Ｔｓｃｍ（最終濃度２Ｕ／ｍｌ）を１日おきに補充し、細胞をカウントし、細胞密度を０．５Ｅ＋０６／ｍｌに調整し、８－１０日目に細胞を回収した。

実施例５－ＣＡＲ陽性率およびＣＡＲ－Ｔ細胞ＴＣＲ又はＣＤ３平均蛍光強度
５．０Ｅ＋０５個の細胞を数え、回収し、細胞を２回洗浄し、４％ＢＳＡを含む１００ｕｌのバッファーに再懸濁させた。各チューブの細胞に８ｕｌの抗ヒトＴＣＲまたはＣＤ３抗体を加え、ボルテックスしてよく混ぜ、４℃で３０分間インキュベートした。染色インキュベーション後、細胞を繰り返し洗浄し、蛍光標識された抗ＣＡＲ１９抗体またはプロテインＬを５００倍に希釈し、細胞をチューブあたり２００ｕｌで再懸濁し、ボルテックスし、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を繰り返し洗浄し、４％ＢＳＡを含む５００ｕｌのバッファに再懸濁し、各チューブに４ｕｌの７ＡＡＤ染料を加え、ボルテックスして混合し、室温で遮光して１０分間インキュベートした。最後に、サンプルをフローチューブに移し、ＣＡＲ１９トランスフェクション効率とＣＡＲ１９＋Ｔ細胞集団のＴＣＲまたはＣＤ３表面レベルをＣａｌｉｂｒフローメーターで測定した。

まず、広く使われている２種類の抗ヒトＣＤ３マウス由来抗体（ＯＫＴ３、ＵＣＴＨ１）を評価した。臨床応用においてマウス配列による拒否反応を回避するため、ヒト化し、細胞レベルでテストした。その結果を図１および表１に示すように、ヒト化ＵＣＨＴ１抗体配列を含むポリペプチドを発現させると、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートする活性がある程度示し、形質導入された陽性細胞（ＣＡＲ＋）では、ＴＣＲ－およびＣＤ３－集団の割合が、それぞれ４８．２２％および４５．８％であった。特許ＵＳ２０１８００８６８３１Ａ１も、ＵＣＨＴ１抗体配列を試験し、その図５には、異なるドナー由来のＴ細胞について、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の表面ダウンレギュレーションレベルがかなり異なることを示している。ドナー１の場合、トランスフェクトされた陽性細胞中のＴＣＲ－集団の割合は：１７．１／（１７．１＋１４．１）＊１００％＝５４．８％で、本発明で得られた結果に近いものである。一方、ドナー２では、トランスフェクションされた陽性細胞中のＴＣＲ－集団の割合は４２．５／（４２．５＋６．７９）＊１００％＝８６．２％となり、ドナー１とは大きな差が生じた。

ヒト化ＯＫＴ３配列を含むポリペプチドは、ＵＣＴＨ１配列を含むポリペプチドよりも細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートする活性が高かった（図１、表１）。ＣＡＲ＋細胞におけるＴＣＲ－とＣＤ３－集団の割合は、それぞれ７０．６２％と６６．０９％まで増加したが、ＴＣＲ／ＣＤ３＋集団の割合は依然として高く、ＣＡＲ－Ｔ細胞の精製にとって大きな困難および臨床応用における大きなリスクとなることが予想される。他の３つの抗ＣＤ３抗体配列を含むポリペプチド（図２、表１）は、ＯＫＴ３配列を含むポリペプチドに近い活性を示し、ＣＡＲ＋ＴＣＲ－／ＣＡＲ＋の割合は４８．８１～６８．９５％であった。

予想に反して、抗体ＣＴＡＢ１配列を含むポリペプチドは、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体レベルのダウンレギュレーションに最も有効であり、９６．７５％ものＣＡＲ＋細胞が表面ＴＣＲを発現していなかった；９５．８２％ものＣＡＲ＋細胞が表面ＣＤ３を発現していなかった（図１、表１）。

実施例６－異なるドナーＴ細胞のＣＡＲ陽性率およびＣＡＲ－Ｔ細胞の表面ＴＣＲ又はＣＤ３タンパク質レベル
実施例３及び実施例４の方法に従って、異なるドナー由来のＣＴＡＢ１配列ポリペプチドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞を調製し、実施例５の方法に従って、ＣＡＲ１９トランスフェクション効率及びＣＡＲ１９＋Ｔ細胞集団のＴＣＲ又はＣＤ３の平均蛍光強度をフローサイトメトリーによって測定した。

その結果を図３に示すように、ＣＴＡＢ１配列を発現するポリペプチドは、異なるドナーのＣＡＲ－Ｔ細胞において、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を安定的にダウンレギュレートする能力を発揮した。計算結果を表２に示すが、トランスフェクションされた陽性細胞（ＣＡＲ＋）におけるＴＣＲ陰性集団の割合は、ドナー間で９５％を下回らず、ＣＴＡＢ１配列を含むポリペプチドが幅広いドナーのＴ細胞に適合することが示された。

実施例７－ＣＴＡＢ１抗体配列を含有するポリペプチドを発現することが、効率的にＴ細胞表面のＴＣＲとＣＤ３レベルをダウンレギュレートした
ＣＴＡＢ１抗体配列を含むポリペプチドの活性を確認するために、実施例２に従って、治療用タンパク質を発現しなくＣＴＡＢ１配列を含むペプチドのみを発現するレンチウイルスベクターを調製し、実施例３及び４の方法に従って対応するＴ細胞を調製し、実施例５の方法に従ってフローサイトメトリーにより表面ＴＣＲ又はＣＤ３レベルを測定した。

その結果を図４に示すように、ＣＴＡＢ１抗体配列を含むポリペプチドを単独で発現させた場合でも、ＴＣＲとＣＤ３の表面発現を効率的に抑制することができた。

実施例８－細胞表現型分析
各群のＣＡＲ－Ｔ細胞を数え、遠心分離により１．０Ｅ＋０６個の細胞を回収し、滅菌した４％ＢＳＡ再懸濁液で２回洗浄した後、４％ＢＳＡ再懸濁液２００ｕｌに細胞を再懸濁した。各サンプルには、必要に応じて以下の抗ヒト抗体を添加した：ＣＤ４（ＡｍＣｙａｎ）、ＣＤ８（ＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ４５ＲＡ（ＰＥ－Ｃｙ７）とＣＣＲ７（ＢＶ４２１）。各抗体５ｕｌを加え、ボルテックスミキサーでよく混合し、４℃で３０分間インキュベートした。染色インキュベーションが完了した後に、細胞を繰り返し洗浄し、４％ＢＳＡを含む５００ｕｌのバッファに再懸濁し、各チューブに４ｕｌの７ＡＡＤ染料を加え、ボルテックスして混合し、室温で遮光して１０分間インキュベートした。サンプルをフローチューブに移し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｒフローメーターでＴ細胞の各グループのＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＡの発現を分析し、Ｔ細胞の免疫表現型を解析した。

結果は、図５ａ－５ｇに示された。すべてのグループには、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋ＴおよびＣＡＲ＋ＣＤ４＋Ｔの割合は、正常であり、細胞表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を最も効果的にダウンレギュレートするＣＴＡＢ１抗体配列を含むポリペプチド細胞のグループを含めて、グループ間で有意差はなかった。

実施例９－Ｔ細胞インビトロ増殖分析
各グループのレンチウイルスベクターでＴ細胞をトランスフェクトし、Ｔ細胞を１日おきにカウントし、Ｔ細胞をインビトロで８日目まで培養し、細胞増殖倍数を計算した（８日目の細胞数／トランスフェクションに使用した細胞数）。

結果は、図６に示された。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体表面の発現がダウンレギュレートしたＴ細胞の増殖能は、コントロールと比較して、すべてのグループで低下せず、程度の差こそあれ、増加した。

実施例１０－Ｔ細胞による腫瘍標的細胞の殺傷
ＮＣ－Ｔ細胞（レンチウイルスでトランスフェクションされないＴ細胞）および各グループのＣＡＲ－Ｔ細胞をカウント・回収し、Ｔ細胞液体培地Ｘ－ＶＩＶＯ１５（Ｔｓｃｍなし）で細胞密度を５．０Ｅ＋０７／ｍＬに調整した。標的細胞をカウント・回収し、ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳなし）を用いて細胞密度を５．０Ｅ＋０６／ｍＬに調整した。１．５ｍｌ遠心チューブに、上記で密度が調整したエフェクター細胞を、異なるエフェクター／ターゲット比（１：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１）に基づき、標的細胞と混合し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５で全量を２００ｕｌまで補足した。９６－ウェルのＶプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間培養した後、軽く吹きつけ、各ウェルの細胞を混ぜ、細胞懸濁液１００ｕｌを白壁中実底の９６ウェルプレートに移した。８０μＬのＯＮＥ－Ｇｌｏ（ＴＭ）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質を加え、よく吹き混ぜてから、遮光して室温で１０分間インキュベートし、ＬｕｍｉｎｏｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ化学発光分析装置で蛍光強度を測定した。

結果は、表３と図７に示された。ＣＴＡＢ３抗体配列を含むポリペプチドを発現させたグループの細胞を除き、各グループの細胞はいずれも腫瘍標的細胞を高い効率で殺すことができた。

実施例１１－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌能
各グループのレンチウイルにストランスフェクションされたＴ細胞を８日目まで生体外培養し、ＴＣＲ依存性Ｔ細胞活性化抗体ＯＫＴ３を、最終濃度がそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。各グループのＣＡＲ－Ｔ細胞サンプルを、Ｘ－ＶＩＶＯ１５液体培地で適当倍率に希釈し、必要な枚数を取り出し、各ウェルに希釈液ＲＤ１－５１を１００μｌずつ加え、希釈したサンプルを均一まで混合し、１００μｌ採ってウェルに加えた（１５分間以内）；シールフィルムで蓋をして、室温で２時間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、溶液をウェルから完全に除去し、洗浄液を加えて、１分間放置し、これらの操作を繰り返して合計４回洗浄した；各ウェルに、ヒトＩＦＮ－γカップリング試薬２００μｌを加え、新しいシールフィルムで蓋をして、室温で２時間インキュベーションした；各ウェルに基質溶液２００μｌを加えて、室温で遮光して３０分間インキュベーションした；インキュベーションが完了した後、各ウェルに終了溶液を加えて、十分に混合してから、マイクロプレートリーダーで検出（設定波長４５０ｎｍ、校正波長５７０ｎｍ／５４０ｎｍ）した。

結果は、表４と図８に示された。コントロールグループと比較して、すべての実験グループでのＩＦＮ－γの分泌は低下し、ただし、ＣＴＡＢ１抗体配列を含む細胞では、ＩＦＮ－γの分泌能が完全に失われ、この細胞の細胞表面には、機能的なＴＣＲ／ＣＤ３複合体が存在しないことがわかり、これまでの実験結果と完全に一致することが示された。

実施例１２－突然変異ライブラリーの作成とスクリーニング
１）標的ＣＤ３抗体配列のアミノ酸点変異を選別し、表面ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の発現をより効果的にダウンレギュレートする変異、あるいはそのＭＨＣ－Ｉエピトープを除去する変異、あるいはＴ細胞増幅を促進する変異など、応用上の利点を有する変異を探した。突然変異ライブラリーの位置１は、目標ｓｃｆｖの軽鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４３の９０－９５位のアミノ酸ＷＳＳＮＰＰ）にあり、位置２は、目標ｓｃｆｖの重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２の５０－５４位のアミノ酸ＹＩＮＰＲ）にあり、位置３は、目標ｓｃｆｖの重鎖（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２の９８－１０２位のアミノ酸ＲＳＡＹＹ）にある。

２）上記変異体ライブラリーを構築するために、ＮＮＫ縮重スプライマーを設計した。実施例１および実施例２の方法に従って、レンチウイルス標的突然変異体ライブラリーを作成した。

３）実施例３及び実施例４の方法に従って、標的突然変異Ｔ細胞のライブラリーを作成した。

４）実施例５の方法によって、標的突然変異Ｔ細胞ライブラリーにおけるＴＣＲおよびＣＤ３の発現状況を検出した。結果は図９に示すとおり、標的突然変異ライブラリー細胞は、ＴＣＲとＣＤ３の発現をダウンレギュレートする能を示している。

５）ＴＣＲダウンレギュレーション能が最も高いＴ細胞クローン亜集団をフローサイトメトリーでソーティングし、ゲノムハイスループットシーケンスを行い、最終的な突然変異体ライブラリーの結果を確定し、結果は表５に示され、ライブラリに占める割合が高い上位２３の突然変異体を示した。発見された突然変異体は、さらに応用的な利点をもたらすかどうかを分析するために使用することができ、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体のダウンレギュレーションの効率の向上、Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖の促進、あるいは本来の配列に存在するＭＨＣエピトープの排除等を含むが、これらに限定されない。

（６）例として、表５のライブラリ結果に基づき、発見された突然変異配列を、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ＿ｖ３．ｐｈｐ上でＭＨＣ－Ｉエピトープ解析を行い、当該ウェブサイトの解析結果によって、突然変異体ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＷＳＴＱＲＰＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）および突然変異体ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＷＳＧＱＰＰＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）は、ＣＤ３抗体標的抗体配列のＭＨＣ－Ｉエピトープを除去した。

７）突然変異体ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＷＳＴＱＲＰＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２５）と突然変異体ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＷＳＧＱＰＰＴ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２７）を選択し、突然変異体プラスミドを構築した。

（８）上記実施例の方法に従って、２つの突然変異体を含む当該ＣＡＲ－Ｔ指標を検出し、その結果を図１０～１３に示した。

図１０によれば、突然変異体１と突然変異体２は、突然変異しないコントロールと同程度に、細胞表面におけるＴＣＲおよびＣＤ３の発現を抑制していることが示された。図１１は、突然変異体１と突然変異体２が、突然変異しないコントロールと一致するＴ細胞免疫表現型の割合を示している。図１２－１３は、増幅能と腫瘍細胞死滅能を示し、図１２に示すように、突然変異体は、突然変異しないコントロールと同等の増幅効率を示し、図１３に示すように、突然変異体は、突然変異しないコントロールと同等の腫瘍細胞死滅能を示す。

これらの結果は、突然変異しないコントロールと比較して、突然変異体１および突然変異体２を含むＴ細胞は、突然変異しない抗体配列に存在するＭＨＣ－Ｉエピトープを除去すること、およびこれら２つの突然変異体はコントロールと比較して細胞の免疫表現型分布、細胞増殖およびキメラ抗原受容体を介した標的細胞殺傷に影響を与えないことを示した。

本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきのは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。

Claims

細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの重鎖可変領域（ＶＨ）と、アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２、又は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である一つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むことを特徴とする工学的修飾Ｔ細胞。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたような配列ＨＣＤＲ２：Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＳＧＹＴを含み、ただしＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４は、任意なアミノ酸であり、又は
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＨには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示された配列ＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＤＹＤＧＦＡＹを含み、ただしＸ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は、任意なアミノ酸である；又は
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのＶＬには、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたような配列ＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｔを含み、ただしＸ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２は、任意なアミノ酸である
ことを特徴とする請求項１に記載されたＴ細胞。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする請求項２に記載されたＴ細胞：
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２には、Ｘ_１アミノ酸は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、Ｘ_２アミノ酸は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンであり、Ｘ_３アミノ酸は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、Ｘ_４アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンである；
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３には、Ｘ_５アミノ酸は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ_６アミノ酸は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ_７アミノ酸は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインである；
前記配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３には、Ｘ_８アミノ酸は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ_９アミノ酸は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｘ_１０アミノ酸は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、Ｘ_１１アミノ酸は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインであり、Ｘ_１２アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つのセットつ又は複数のセットを含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一つに記載されたＴ細胞：
（１）以下のＬＣＤＲ３配列のうち一つ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４、
（２）以下のＨＣＤＲ２配列のうち一つ：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２、
（３）ＨＣＤＲ３配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４。
前記ポリペプチドは、一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１－４のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、局在化配列と任意的なシグナルペプチドを含み、好ましくは
前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる；好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つに示された配列を含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸であり、
前記局在化配列と抗体との間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りであり；
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示された通りである
ことを特徴とする請求項１－５のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
さらに治療用タンパク質を発現し、好ましくは、治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であることを特徴する請求項１－６のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
前記Ｔ細胞は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有し、又は、前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置することを特徴とする請求項７に記載されたＴ細胞。
Ｔ細胞は、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドを発現し、前記ポリペプチドは、抗体又はその抗原結合フラグメントを含むか、又は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ前記抗体又は抗原結合フラグメントの抗原結合活性を保留する突然変異体を含む；ただし、前記抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、下記ＨＣＤＲを有する：
ＳＥＱＩＤＮＯ：３に示されたＨＣＤＲ１：ＧＹＴＦＩＳＹＴ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：９に示されたＨＣＤＲ２：Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＳＧＹＴ、ただしＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４は、任意なアミノ酸であり、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１３に示されたＨＣＤＲ３：ＡＲＳＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＤＹＤＧＦＡＹ、ただしＸ_５、Ｘ_６、Ｘ_７は、任意なアミノ酸であり、
前記軽鎖可変領域は、下記ＬＣＤＲを有する：
ＳＥＱＩＤＮＯ：６に示されたＬＣＤＲ１：ＳＳＶＳＹ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：７に示されたＬＣＤＲ２：ＤＴＳ、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１５に示されたＬＣＤＲ３：ＱＱＷＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｔ、ただしＸ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０、Ｘ_１１、Ｘ_１２は、任意なアミノ酸である
ことを特徴とする工学的修飾Ｔ細胞。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする請求項９に記載されたＴ細胞：
Ｘ_１は、セリン、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ_２は、スレオニン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、チロシン、システイン、バリン又はイソロイシンであり、
Ｘ_３は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ_４は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンであり、
Ｘ_５は、アラニン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ_６は、チロシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ_７は、チロシン、リジン、ヒスチジン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン又はシステインであり、
Ｘ_８は、セリン、アラニン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ_９は、スレオニン、セリン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、メチオニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、
Ｘ_１０は、グルタミン、アスパラギン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、バリン、イソロイシン、アラニン、ロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、リジン、アルギニン又はヒスチジンであり、
Ｘ_１１は、プロライン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン又はシステインであり、
Ｘ_１２は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロライン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、以下から選べられる一つ又は複数の特徴を有することを特徴とする請求項９又は１０に記載されたＴ細胞：
ＬＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９、ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５、ＳＥＱＩＤＮＯ：２６、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７、ＳＥＱＩＤＮＯ：２８、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９、ＳＥＱＩＤＮＯ：３０、ＳＥＱＩＤＮＯ：３１、ＳＥＱＩＤＮＯ：３２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３３、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４から選べられ、
ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２から選べられ、
ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４である。
重鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下から選べられる：
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４２、
（２）ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３の配列は、請求項１０又は１１に示されたＳＥＱＩＤＮＯ：４２バリアント、
（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列、及び／又は
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、以下から選べられる：
（１）ＳＥＱＩＤＮＯ：４３、
（２）ＬＣＤＲ３の配列の請求項１０又は１１に示されたＳＥＱＩＤＮＯ：４３バリアント；
（３）（１）又は（２）と９５％以上の同一性を有する配列
ことを特徴とする請求項９－１１のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
前記抗体は、一本鎖抗体であることを特徴とする請求項９－１２のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、局在化配列と任意的なシグナルペプチドを含み、好ましくは
前記局在化配列は、小胞体保留配列、ゴルジ体保留配列、Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合配列、プロテアソーム局在化配列又はリソソーム局在化配列から選べられる；好ましくは、前記小胞体保留配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３５－４０からのいずれか一つに示された配列を含むか、又はそれらからなり、ただし、Ｘは、任意なアミノ酸である；
前記局在化配列と抗体との間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示された通りであり、
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示された通りである
ことを特徴とする請求項９－１２のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
さらに治療用タンパク質を発現し、好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であることを特徴する請求項９－１４のいずれか一つに記載されたＴ細胞。
前記Ｔ細胞は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有し、又は、前記治療用タンパク質のコード配列と、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、同じ発現カセットに位置することを特徴とする請求項１５に記載されたＴ細胞。
抗体のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＧＹＴＦＩＳＹＴであり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４ＳＧＹＴであり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＲＳＸ_５Ｘ_６Ｘ_７ＤＹＤＧＦＡＹであり、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＳＳＶＳＹであり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＤＴＳであり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＱＱＷＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｔである；ただし、Ｘ_１－Ｘ_１２は、請求項１０に記載された通りで、かつＨＣＤＲ２は、ＩＮＰＲＳＧＹＴではなく、ＨＣＤＲ３は、ＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹではなく、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＳＮＰＰＴではなく、
好ましくは、前記抗体のＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３は、請求項１１に記載された通りである
ことを特徴とする抗体又はその抗原結合フラグメント。
前記抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４２に示されたが、そのＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３の配列は、請求項１０又は１１に示された通りである；
前記抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４３に示されたが、そのＬＣＤＲ３の配列は、請求項１０又は１１に示された通りである
ことを特徴とする請求項１７に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント。
局在化配列と、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドと、任意的なシグナルペプチドとを含むことを特徴とする融合タンパク質；好ましくは、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、請求項９－１８のいずれか一つに記載され、好ましくは、
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－５３７位に示され、
前記局在化配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドとの間に、リンカーを含み、前記リンカーは、好ましくは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４１に示され、
前記融合タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４４の５１６－８０４位に示され、又はＳＥＱＩＤＮＯ：４４の－８０４位に示された
ことを特徴とする融合タンパク質。
核酸分子は、以下から選べられる：
（１）治療用タンパク質のコード配列と細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列を含む的核酸分子；
（２）請求項１９に記載された融合タンパク質のコード配列；
（３）請求項１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列；および
（４）（１）、（２）又は（３）の相補配列又はフラグメント；
好ましくは、前記治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体であり、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、請求項９－１４に記載された通りである
ことを特徴とする核酸分子。
請求項２０に記載された核酸分子を含有することを特徴とする核酸構築物；
好ましくは、前記核酸構築物は、前記治療用タンパク質の発現カセットと、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドの発現カセットを含有する；又は、前記核酸構築物は、発現カセットであり、ただし、前記治療用タンパク質のコード配列と前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドのコード配列とは、当該発現カセットに位置する；或いは
前記核酸構築物は、クローニングベクター又は発現ベクターである。
請求項２０に記載された核酸分子又は請求項２１に記載された核酸構築物を含有することを特徴とするレンチウイルス。
請求項１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、又は請求項１９に記載された融合タンパク質と任意的な治療用タンパク質を発現及び／又は分泌する；好ましくは、請求項２０に記載された核酸分子、請求項２１に記載された核酸構築物及び／又は請求項２２に記載されたレンチウイルスを含むことを特徴とする宿主細胞。
請求項９－１６のいずれか一つに記載されたＴ細胞、請求項１７又は１８に記載された抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１９に記載された融合タンパク質、請求項２０に記載された核酸分子、請求項２１に記載された核酸構築物及び／又は請求項２２に記載されたレンチウイルス、および薬学的に許容される担体を含有することを特徴とする医薬品組成物。
細胞表面のＴＣＲをダウンレギュレートしたＴ細胞の調製、又は癌症治療用のＴ細胞の調製における細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチド又はそのコード配列、請求項２０に記載された核酸分子、請求項２１に記載された核酸構築物及び／又は請求項２２に記載されたレンチウイルスの応用、ただし、前記細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体をダウンレギュレートするポリペプチドは、請求項９－１４に記載された通りである。