CN116903740B - 靶向ror1的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向ROR1的抗体及其应用。本发明的ROR1抗体表现出优异的特异性和结合能力，其衍生的嵌合抗原受体显示出了对肿瘤细胞优异的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域。具体地，涉及一种靶向ROR1的抗体及其应用。
背景技术
ROR1蛋白是由ROR1基因编码的受体酪氨酸激酶蛋白，全称为无活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1(Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1)或神经营养性酪氨酸激酶，受体相关蛋白1(Neurotrophic tyrosine kinase,receptor-related 1)。ROR1蛋白包含937个氨基酸残基，可以分为胞外的类免疫球蛋白结构域、富含半胱氨酸结构域和Kringle结构域，跨膜段，胞内的酪氨酸激酶结构域、富含丝氨酸/苏氨酸结构域、富含脯氨酸结构域及C端的富含丝氨酸/苏氨酸结构域。
在正常情况下，ROR1蛋白主要在胚胎发生时期表达。在小鼠胚胎中ROR1表达区域包括中央神经系统、早期肢芽、软骨生长盘、心脏、肺及中肾。在正常成人组织中，ROR1蛋白表达于未成熟的B淋巴细胞，部分胰腺细胞以及部分胃部细胞。ROR1抗体Zilovertamab(又称cirmtuzumab或UC-961)也在临床实验中显示了良好的安全性。
ROR1蛋白在血液瘤和实体瘤的多种肿瘤组织中高表达，血液瘤中包括急性淋巴癌、慢性淋巴癌、弥漫性大B细胞淋巴癌、滤泡细胞淋巴癌、套细胞淋巴癌，实体瘤中包括乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、间皮瘤等。其中，ROR1的高表达与慢性淋巴癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、黑色素瘤患者总生存期降低相关。在癌症发生机制方面，ROR1蛋白在结合WNT5A蛋白之后激活非经典WNT信号通路、MAPK-ERK信号通路和PI3K信号通路，同时抑制了p38蛋白的磷酸化，导致细胞增殖和上皮-间质转化增加，细胞凋亡降低。
综上所述，ROR1是一个在肿瘤组织中广泛表达，并具有良好安全性的靶点，利用抗体、抗体偶联药物、CAR-T和CAR-NK等手段靶向ROR1蛋白，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向ROR1的抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
(1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab3)
SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
SEQ ID NO:8所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:10所示的LCDR1，
SEQ ID NO:11所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:12所示的LCDR3；或
(2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab4)
SEQ ID NO:13所示的HCDR1，
SEQ ID NO:14所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；或
(3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab1)
SEQ ID NO:1所示的HCDR1，
SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:6所示的LCDR3；或
(4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab6)
SEQ ID NO:19所示的HCDR1，
SEQ ID NO:20所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:21所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
(5)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab7)
SEQ ID NO:25所示的HCDR1，
SEQ ID NO:26所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(6)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab11)
SEQ ID NO:25所示的HCDR1，
SEQ ID NO:26所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(7)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab12)
SEQ ID NO:45所示的HCDR1，
SEQ ID NO:46所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:47所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:48所示的LCDR1，
SEQ ID NO:49所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:50所示的LCDR3；或
(8)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab8)
SEQ ID NO:30所示的HCDR1，
SEQ ID NO:31所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:32所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:33所示的LCDR1，
SEQ ID NO:34所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:35所示的LCDR3；或
(9)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab9)
SEQ ID NO:36所示的HCDR1，
SEQ ID NO:37所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:38所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:39所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(10)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab13)
SEQ ID NO:51所示的HCDR1，
SEQ ID NO:52所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:53所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:54所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
(1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab3)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:56所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:10所示的LCDR1，
SEQ ID NO:11所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:12所示的LCDR3；或
(2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab4)
SEQ ID NO:58所示的HCDR1，
SEQ ID NO:59所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；或
(3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab1)
SEQ ID NO:55所示的HCDR1，
SEQ ID NO:56所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:6所示的LCDR3；或
(4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab6)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:21所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
(5)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab7)
SEQ ID NO:61所示的HCDR1，
SEQ ID NO:62所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(6)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab11)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:42所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:43所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:44所示的LCDR3；或
(7)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab12)
SEQ ID NO:65所示的HCDR1，
SEQ ID NO:66所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:47所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:48所示的LCDR1，
SEQ ID NO:49所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:50所示的LCDR3；或
(8)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab8)
SEQ ID NO:61所示的HCDR1，
SEQ ID NO:64所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:32所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:33所示的LCDR1，
SEQ ID NO:34所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:35所示的LCDR3；或
(9)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab9)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:38所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:39所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；或
(10)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab13)
SEQ ID NO:67所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:53所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:54所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。
在另一优选例中，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括所述的三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区；所述轻链包括所述的三个轻链CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。
在另一优选例中，所述靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段选自下组：骆驼Ig、IgNAR、Fab片段、Fab'片段F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fv、单链Fv抗体(“scFv”)、双scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)以及单域抗体(sdAb，纳米抗体)。
在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括单特异性、双特异性、三特异性抗体或多特异性抗体。
在另一优选例中，所述抗体特异性结合ROR1。
在另一优选例中，所述抗体对人ROR1的亲和力的KD值(M)为1.0E-10～1.0E-8。
在另一优选例中，所述抗体为单链抗体(scFv)，具有选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID NO.68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或SEQ ID NO.79、80、81、82、83、84、85、86、87、88。
在另一优选例中，所述单链抗体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO.68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或SEQ ID NO.79、80、81、82、83、84、85、86、87、88所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性(其中CDR不变或基本不变)。
本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；
以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述元件(i)融合在一起的额外的融合元件(或融合多肽片段)。
本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有靶向ROR1的抗体单链可变区序列scFv，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
(1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab3)
SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
SEQ ID NO:8所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:10所示的LCDR1，
SEQ ID NO:11所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:12所示的LCDR3；或
(2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab4)
SEQ ID NO:13所示的HCDR1，
SEQ ID NO:14所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；或
(3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab1)
SEQ ID NO:1所示的HCDR1，
SEQ ID NO:2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:6所示的LCDR3；或
(4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab6)
SEQ ID NO:19所示的HCDR1，
SEQ ID NO:20所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:21所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
(5)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab7)
SEQ ID NO:25所示的HCDR1，
SEQ ID NO:26所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(6)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab11)
SEQ ID NO:25所示的HCDR1，
SEQ ID NO:26所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(7)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab12)
SEQ ID NO:45所示的HCDR1，
SEQ ID NO:46所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:47所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:48所示的LCDR1，
SEQ ID NO:49所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:50所示的LCDR3；或
(8)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab8)
SEQ ID NO:30所示的HCDR1，
SEQ ID NO:31所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:32所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:33所示的LCDR1，
SEQ ID NO:34所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:35所示的LCDR3；或
(9)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab9)
SEQ ID NO:36所示的HCDR1，
SEQ ID NO:37所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:38所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:39所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(10)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab13)
SEQ ID NO:51所示的HCDR1，
SEQ ID NO:52所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:53所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:54所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。
在另一优选例中，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
(1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab3)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:56所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:9所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:10所示的LCDR1，
SEQ ID NO:11所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:12所示的LCDR3；或
(2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab4)
SEQ ID NO:58所示的HCDR1，
SEQ ID NO:59所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；或
(3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab1)
SEQ ID NO:55所示的HCDR1，
SEQ ID NO:56所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:3所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:6所示的LCDR3；或
(4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab6)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:21所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:22所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:24所示的LCDR3；或
(5)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab7)
SEQ ID NO:61所示的HCDR1，
SEQ ID NO:62所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:27所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:28所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:29所示的LCDR3；或
(6)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab11)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:42所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:43所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:44所示的LCDR3；或
(7)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab12)
SEQ ID NO:65所示的HCDR1，
SEQ ID NO:66所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:47所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:48所示的LCDR1，
SEQ ID NO:49所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:50所示的LCDR3；或
(8)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab8)
SEQ ID NO:61所示的HCDR1，
SEQ ID NO:64所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:32所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:33所示的LCDR1，
SEQ ID NO:34所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:35所示的LCDR3；或
(9)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab9)
SEQ ID NO:57所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:38所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:39所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；或
(10)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：(Ab13)
SEQ ID NO:67所示的HCDR1，
SEQ ID NO:60所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:53所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:54所示的LCDR1，
SEQ ID NO:23所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:40所示的LCDR3；其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。
在另一优选例中，所述scFv还包含重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。
在另一优选例中，所述的连接肽为(G4S)3或(G4S)4。
在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：
VH-VL,(A)；VL-VH,(B)
式中，VH为所述抗体重链可变区；VL为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述连接肽为(G4S)n，，较佳地n为3-5；更佳地n为3。
在另一优选例中，所述scFv如式B(VL-VH)所示，具有选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID NO.68、69、70、71、72、73、74、75、76、77；或
所述scFv如式A(VH-VL)所示，具有选自下组的氨基酸序列：
SEQ ID NO.79、80、81、82、83、84、85、86、87、88。
在另一优选例中，所述的抗体单链可变区包括人源的、鼠源的、人鼠嵌合的抗体单链可变区。
在另一优选例中，所述scFv如式A(VH-VL)所示。
在另一优选例中，所述抗原结合结构域靶向ROR1的细胞外区域。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有下式I结构：
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为无或信号肽序列；
scFv为靶向ROR1的scFv；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为CD3ζ胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述的L为选自下组蛋白的信号肽：CD8、CD4、CD16、CD56、CD137、CSF2、DAP12、EF1、GM-CSF、IL-8、IL-21或其组合。
在另一优选例中，所述的L来源为CD8来源的信号肽。
在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：
VH-VL,(A)；VL-VH,(B)
式中，VH为所述抗体重链可变区；VL为所述抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述scFv如式A(VH-VL)所示。
在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、Fc、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为CD28来源的铰链区。
在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，C为CD28来源的共刺激信号分子。
本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，如本发明的第二方面所述的重组蛋白，或如本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体CAR。
在另一优选例中，所述多核苷酸为分离的。
本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为逆转录病毒载体。
本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明的第五方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞为NK细胞或T细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)，其中，NK细胞的来源包括外周血、脐带血、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)等。
在另一优选例中，所述宿主细胞为免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第一方面所述的抗体或本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体。
在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
本发明的第七方面，提供了一种制备CAR-NK细胞或CAR-T细胞的方法，所述的CAR-NK细胞或CAR-T细胞表达本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：
将本发明的第四方面所述的多核苷酸或本发明的第五方面所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述CAR-NK细胞或CAR-T细胞。
本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、如本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、或本发明的第六方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物为制剂，优选为液态制剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的第二方面所述的重组蛋白、或其组合；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十方面，提供了一种本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的宿主细胞、本发明的第八方面所述的药物组合物或本发明的第九方面所述的免疫偶联物的用途，
(a)制备检测试剂或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗ROR1相关疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述ROR1相关疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性淋巴癌、慢性淋巴癌、弥漫性大B细胞淋巴癌、滤泡细胞淋巴癌、套细胞淋巴癌、或其组合。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、间皮瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤为ROR1阳性肿瘤；较佳地选自下组：慢性淋巴癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述检测为免疫测定法。
在另一优选例中，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十一方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中ROR1蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面中的重组蛋白接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在ROR1蛋白。
在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述方法为细胞免疫化学(Immunocytochemistry staning，ICC)检测方法，或免疫组化(ImmunohistochemistryIHC)检测方法，或whole cell(全细胞)ELISA检测方法，cell lysate(细胞裂解物)ELISA检测方法。
本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第六方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面所述的重组蛋白。
本发明的第十三方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第九方面所述的免疫偶联物、或其组合。
本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有本发明的第十三方面所述的检测板。
本发明的第十五方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第十二方面所述的宿主细胞或本发明的第八方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了抗ROR1 scFv-Fc抗体SDS-PAGE结果。
图2显示了抗ROR1抗体BLI测定结果。
图3显示了抗ROR1抗体EC50测定结果。
图4显示了抗ROR1 CAR分子结构。
图5显示了肿瘤细胞系表面ROR1蛋白表达检测结果。
图6显示了分选后CAR-NK92细胞系CAR分子表达检测结果。
图7显示了抗ROR1 CAR NK92对AGS,MDA-MB-231,MDA-MB-468细胞的杀伤结果。
图8显示了抗ROR1 CAR NK92对JeKo-1-Luc细胞的多轮杀伤结果。
图9显示了抗ROR1 CAR NK92对JeKo-1-Luc细胞的单轮杀伤结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，进行了大量的筛选，首次意外获得了一系列靶向ROR1抗体。筛选所得抗体具有优异的生物活性，进一步基于此构建了靶向ROR1的嵌合型抗原受体结构，表达所述嵌合型抗原受体的NK细胞对靶细胞表现出优越的杀伤能力。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因修饰的多肽或糖蛋白。可以使用任何合适的标准技术如蛋白酶解消化或涉及操作并表达编码抗体可变域和任选地抗体恒定域的DNA的重组基因工程技术，例如，从完整抗体分子衍生抗体的抗原结合片段。这类DNA是已知的和/或从例如商业来源、DNA文库(包括例如，噬菌体抗体文库)轻易可获得或可以合成。可以对所述DNA测序并化学地或通过使用分子生物学技术操作，例如以将一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适布局，或以引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
如本文所用，抗原结合片段或抗原结合结构域的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，独立的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。
如本文所用，抗原结合片段或抗原结合结构域一般将包含至少一个可变域。可变域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合可读框的至少一个CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以按任何合适的排列彼此相对设置。例如，可变区可以是二聚体并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可选地，抗原结合结构域可以含有单体性VH或VL结构域。
在一个给定的抗体的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences ofProteins of Immunological Interest,(1983)，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际Immuno GeneTics database(IMGT)，EU编号系统，以及基于loop结构位置的Chothia定义。
应理解，本发明中的CDR的精确氨基酸序列边界可以任选地利用上述提及的不同指派系统定义。优选地，除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，本发明抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用，术语“本发明的嵌合抗原受体”、“本发明的CAR”可以互换使用，指本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向ROR1的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别ROR1细胞外区域的抗体，尤其是特异性识别ROR1序列的第24至41位氨基酸残基的抗体，较佳地为单链抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
优选的，本发明的CAR的结构包括信号肽、抗原识别序列(抗原结合结构域)、连接区、跨膜区、共刺激因子信号区和CD3zeta信号传导区(ζ链部分)，连接顺序如下：
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)
NK细胞
自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞侵袭。近年来，NK细胞在过继性细胞免疫治疗中表现出极大的应用前景。NK的来源广泛，包括外周血、脐带血、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)等。
NK-92细胞是从一位患有急性非霍奇金淋巴瘤的50岁男性患者的外周血单核细胞衍生来的一株白细胞介素-2(IL2)依赖型NK细胞株。NK-92细胞是目前唯一被FDA批准的临床试验的NK细胞系，这株细胞的细胞毒性很强、经济、off-the-shelf、容易规模化制备，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者没有对NK-92细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险，不表达KIRs，处于组成型激活状态，到目前为止表现出很好的临床安全性。
如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“CARNK”、“本发明CAR-NK细胞”均指表达本发明第一方面的嵌合抗原受体CAR的CAR-NK细胞
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述载体为逆转录病毒载体。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明抗体、CAR的逆转录病毒载体(RV)转导的细胞(例如，NK细胞、T细胞等)。转导的NK细胞可引起CAR-介导的NK-细胞或T细胞应答。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NK细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明CAR的NK细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中NK细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和CAR-NK细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-NK细胞能够在体内存续，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。
本发明的CAR-修饰NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
药物组合物
本发明的抗体、融合蛋白、或CAR-修饰的NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-15、IL-18、IL-21或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的嵌合抗原受体，其细胞外抗原结合结构域为特定的抗ROR1 scFv，该特定的抗ROR1 scFv结合特定的绞链区和胞内结构域，形成的CAR显示出了极大的对肿瘤细胞的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。
(2)本发明的CAR-NK细胞具有较高的活化程度，对ROR1阳性的靶细胞具有优异的细胞毒性。
(3)本发明的抗体对靶细胞的结合能力及亲和动力学优异。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1ROR1抗体特性
ROR1相关抗体经由抗原免疫抗体产生区域基因片段人源化小鼠后，进行杂交瘤筛选得到，候选scFv采用VL-(G4S)3-VH形式，序列如表2所示。使用Kabat和Chothia注释的CDR序列如表3、表4所示。以下实验使用scFv-human IgG Fc形式的抗体进行。
使用SDS-PAGE检测抗体表达及纯化情况结果如图1所示，结果显示抗体表达及纯化结果良好。具有代表性的抗体对人ROR1蛋白的生物膜干涉(Biolayer Interferometry，BLI)测定结果如图2所示。
使用人乳腺癌细胞MDA-MB-231对所有抗体进行流式结合分析，结果如图3所示。所有抗体的BLI数据及EC50数据总结于表5。
表2抗ROR1抗体scFv序列
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表3基于Kabat的CDR序列
注：SEQ:SEQ ID NO.表4基于Chothia的CDR序列
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注：SEQ:SEQ ID NO.
表5抗ROR1抗体动力学数据及EC50结果总结
结果表明，Ab.7、Ab.11、Ab.12、Ab.1均展现了优异的ROR1亲和力。
实施例2ROR1 CAR结构设计
ROR1 CAR结构的scFv来源于实施例1中部分筛选所得抗体，对应抗体名称及scFv中轻链和重链的排序进行命名。其中，
CAR1L代表该CAR分子的scFv来自抗体Ab.1，且采用VL-Linker-VH的结构，CAR1H则采用VH-Linker-VL的结构。
ROR1 CAR结构如图4所示，包含信号肽(signal peptide，SP)、scFv、铰链区、跨膜区(transmembrane,TM)、共刺激结构域(costimulatory domain，CD)和CD3ζ结构域。其中信号肽包括以下序列(表6)，本发明的数据基于CD8αSP、CD28hinge、CD28TM以及CD28CD结构。scFv由VL-Linker-VH或者VH-Linker-VL构成，其中linker可以是(G4S)3或(G4S)4等。其中，
CAR1L的scFv序列如SEQ ID NO.68所示；
CAR3L的scFv序列如SEQ ID NO.69所示；
CAR4L的scFv序列如SEQ ID NO.70所示；
CAR6L的scFv序列如SEQ ID NO.71所示；
CAR7L的scFv序列如SEQ ID NO.72所示；
CAR8L的scFv序列如SEQ ID NO.73所示；
CAR9L的scFv序列如SEQ ID NO.74所示；
CAR11L的scFv序列如SEQ ID NO.75所示；
CAR12L的scFv序列如SEQ ID NO.76所示；
CAR13L的scFv序列如SEQ ID NO.77所示；
Velos-LH的scFv序列如SEQ ID NO.78所示。
表6信号肽序列
| 信号肽名称 | 序列 | SEQ ID No: |
| IL-21SP | MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLV | 93 |
| CD8αSP | MALPVTALLLPLALLLHAARP | 94 |
| CSF2SP | MWLQSLLLLGTVACSIS | 95 |
| DAP12SP | MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSG | 96 |
| CD16SP | MWQLLLPTALLLLVSA | 97 |
| CD56SP | MLQTKDLIWTLFFLGTAVS | 98 |
| IL-8SP | MTSKLAVALLAAFLISAALC | 99 |
表7部分抗ROR1 CAR分子的scFv序列
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实施例3肿瘤细胞表面ROR1表达检测
用流式细胞术检测了AGS、JeKo-1、MDA-MB-231及MDA-MB-468肿瘤细胞表面ROR1的表达情况，检测方法如下。
3.1取2E5-3E5待测肿瘤细胞，300g，4℃离心5min，弃去上清。
3.2加入200μL FACS Buffer(1％ FBS溶于PBS)，300g，4℃离心5min，弃去上清。
3.3配制一抗溶液，ROR1抗体使用PE anti-human ROR1 Antibody(Biolegend,357805)，1：100配制。
3.4加入100μL/孔一抗溶液，吹打混匀，4℃孵育30min。
3.5孵育完成后，加入100μL FACS Buffer，300g，4℃离心5min，弃去上清.
3.6加入200μL/well FACS Buffer，吹吸混匀，300g，4℃离心5min，弃去上清。
3.7重复3.6一次。
3.8加入200μL/well FACS Buffer，重悬，使用流式细胞仪进行检测。
结果表明AGS，JeKo-1,MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞均表达ROR1蛋白(图5)。
实施例4.病毒包装及NK92细胞感染
逆转录病毒的包装载体分别为BaEV-TR、pCMV-gag-pol，携带CAR分子的载体为pMSCV，这些载体由本实验室设计后交于金唯智合成、抽提。病毒包装、细胞感染及分选过程如下：
4.1将状态良好的HEK-293T细胞消化后重悬于DMEM完全培养基中，以8E5/mL10mL/盘的数量接种于10cm培养皿中。
4.2置于培养箱培养16h后，观察细胞密度，当密度为90％左右时开始进行质粒转染。
4.3取2个1.5ml离心管，分别加入500μL Opti-MEMTMI减血清培养基(Gibco,31985062)，在其中一个离心管中加入7.5μg BaEV-TR、10μg pCMV-gag-pol以及20μg相应的表达CAR的pMSCV载体，混合均匀，为Opti-MEM-质粒混合液；在另一个离心管中加入40μLPEIpro溶液(polyplus,115-010)，混合均匀，为Opti-MEM-PEI混合液。
4.4将Opti-MEM-质粒混合液加入Opti-MEM-PEI混合液中，并充分吹吸混匀，室温放置15min，形成转染复合物。
4.5将上述转染复合物逐滴加入HEK-293T培养上清中，并摇晃混匀，继续培养4-6h。
4.6吸去培养上清，补充15mL DMEM完全培养基，培养48h。
4.7收集培养上清，补充15mL DMEM完全培养基，继续培养24h；收集的上清保存于4℃。
4.8收集细胞培养上清，并与对应的48h培养上清合并。
4.9利用Lenti-X Concentrator(Takara,631232)对病毒进行浓缩。
4.10用100μL NK92细胞培养基将病毒重悬，取出5μL用于滴度测定，剩余病毒暂存于4℃。
4.11滴度测定使用K562细胞进行，感染时补充5μg/mL polybrene(Sigma-Aldrich,TR-1003),感染48h后测定K562阳性率，计算病毒滴度。
4.12取4E5 NK92细胞于6孔板中，按MOI＝2加入病毒浓缩液，并添加终浓度为5ug/ml的polybrene(Sigma-Aldrich,TR-1003)，混合均匀；
4.13将细胞在32℃，800g的条件下离心1h，培养过夜；
4.14将NK92取出，离心重悬于新鲜的NK92培养基中，继续培养4天后进行流式检测。
4.15将培养中的ROR1-CAR NK92细胞充分吹吸混匀，并使其分散为单个细胞，取1mL至1.5ml离心管中，用于NC-200细胞计数。
4.16根据计数结果取1E7待分选细胞于离心管中，300g离心5min，弃去上清。
4.17用10mL MACS Buffer重悬细胞，300g离心5min，弃去上清。
4.18用2mL 3ug/mL Biotinylated Huamn ROR1 His,AvitagTM(Acro Biosystem,RO1-H82E6)稀释液(稀释于PBS)重悬细胞，4℃孵育30min。
4.19孵育完成后，加入5mL的MACS Buffer,300g离心5min，弃去上清。
4.20加入5mL MACS Buffer再洗一次，弃去上清。
4.21加入80μL MACS Buffer重悬细胞。
4.22加入20μL Anti-Biotin MicroBeads(Miltenyi,130-090-485),充分混匀。
4.23 4℃孵育15min。
4.24孵育完成后，加入2mL MACS Buffer洗一次。
4.25使用500μL MACS Buffer重悬。
4.26将吸附柱LS(Miltenyi,130-042-401)装载在磁力架上，用3mL的MACS Buffer润洗柱子。
4.27将4.25的细胞加到柱中。
4.28加3mL MACS Buffer于柱中，未被磁吸的细胞将被洗脱流出。
4.29重复4.28两次。
4.30取一个15mL离心管，将柱子从磁力架上取下，置于离心管上。
4.31向柱中加入5mL MACS Buffer，将柱塞推入柱中，冲洗出被磁珠标记的细胞。
4.32将15mL管中的细胞充分混匀，然后取200μL分选得到的细胞进行NC-200计数。
4.33分选得到的细胞300g离心5min，弃上清。
4.34用适量体积的NK92培养基重悬，置于37℃，5％ CO2培养箱培养。
4.35分选后4天进行CAR阳性率测定。取1E5-2E5待测细胞，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.36加入200μL FACS Buffer洗一遍，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.37混匀后每个样品加入100μL抗原蛋白悬液，抗原蛋白浓度2ug/mL，吹打混匀，4℃孵育30min-60min。
4.38孵育完成后，加入100μL/sample FACS Buffer，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.39加入200μL/sample FACS Buffer，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.40配制检测抗体streptavidin-PE(Biolegend,#405203)，稀释比例为1：200，混匀后每个样品加入100μL检测抗体，吹打混匀，4℃孵育30min-60min。
4.41孵育完成后，加入100μL/sample FACS Buffer，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.42加入200μL/sample FACS Buffer，700g，4℃离心2min，弃掉上清。
4.43重复step4.42一次。
4.44加入200μL/sample FACS Buffer重悬，流式细胞仪检测。
流式结果表明，感染病毒并经过磁珠分选后，除CAR3H阳性率为91.1％以外，各组NK92细胞抗ROR1 CAR分子的阳性率均达到了95％以上(图6)。
实施例5.检测ROR1-CAR NK92对靶细胞的杀伤能力
使用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)检测抗ROR1 CAR NK92对AGS，MDA-MB-231和MDA-MB-468靶细胞的杀伤能力，具体操作步骤如下，
5.1.1提前24h将NK92培养基中的IL-2撤除。
5.1.2取出RTCA E96 Plate，每孔加入50μL对应的完全培养基，在RTCA程序中新建实验，完成实验相关设定，将E-plate放入之后锁定，仪器自动进行基线测定，基线测定一般在一分钟内完成。
5.1.3消化靶细胞，按照AGS细胞-2E4/孔，MDA-MB-231-4E4/孔和MDA-MB-468-4E4/孔的细胞量，50μL/孔的体积接种于E-plate中。
5.1.4接种之后，室温放置30min，将E-plate放入记录槽内，至少30min扫描一次记录细胞生长情况。
5.1.5观察靶细胞电阻状况，在快速生长期加入抗ROR1 CAR NK92效应细胞。
5.1.6按照实验设定效靶比(E:T)加入效应细胞，将E-plate放置在板位上，10min后开始杀伤步骤的记录。
5.1.7在第一轮杀伤到达底线或Cell Index不再降低后，可以选择准备多轮靶细胞刺激，处理对应靶细胞，按5.3的设定量添加靶细胞，添加体积为50μL/孔，将E-plate放置在板位上，10min后开始杀伤步骤的记录。
由RTCA方法记录的杀伤结果见图7，可以发现在该实验条件下各组CAR-NK92对AGS，MDA-MB-231,MDA-MB-468均有良好的杀伤作用。
使用Luciferase报告基因检测了抗ROR1 CAR NK92对JeKo-1-Luciferase靶细胞的杀伤能力，具体操作步骤如下，
5.2.1进行杀伤实验的CAR NK92效应细胞提前24h撤除IL-2。
5.2.2靶细胞JeKo-1-Luc充分吹吸混匀并计数，然后使用适量体积的RPMI1640完全培养基重悬。
5.2.3将靶细胞转移至96孔平底板，2E4/孔，100μL/孔。
5.2.4效应细胞充分吹吸混匀并计数，取合适的效应细胞数，300g，室温5min，离心后用适量体积的RPMI1640完全培养基重悬。
5.2.5将效应细胞转移至靶细胞96孔平底板，50μL/孔，37℃，5％ CO2培养箱共培养，对于单轮杀伤结果，共培养时间为6小时。对于多轮杀伤结果，共培养时间为24小时。
5.2.6每孔加入60μL ONE-Glo并混匀。
5.2.7反应3min后，取100μL反应液至96孔白色平底板中，使用酶标仪检测发光信号强度。
5.2.8在第一轮效应细胞靶细胞共培养24h后，可以选择加入2E4/孔，50μL/孔JeKo-1细胞，进行第二轮刺激，第二轮刺激共培养时间为16h。
5.2.9每孔加入80μL ONE-Glo并混匀。
5.2.10反应3min后，取200μL反应液至96孔白色平底板中，使用酶标仪检测发光信号强度，然后计算细胞毒性。
由Luciferase报告基因方法记录的杀伤结果见图8及图9，可以发现在该实验条件下各组CAR-NK92对JeKo-1-Luciferase细胞有良好的杀伤作用。
结果表明，优选的CAR-NK92为表达CAR3L、CAR4L、CAR1L、CAR6H的NK细胞。其中，CAR3L-NK、CAR4L-NK、CAR1L-NK、CAR6H-NK在E:T＝1:1，第一轮杀伤中(16小时)即可以表现出大于75％的特异性杀伤活性；CAR3L-NK、CAR4L-NK在E:T＝1:1，6小时的单轮杀伤中即可以快速地表现出特异性的杀伤活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
1.一种靶向ROR1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:13所示的HCDR1，
SEQ ID NO:14所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案；或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:58所示的HCDR1，
SEQ ID NO:59所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。
2.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i) 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段；
以及(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。
3.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有靶向ROR1的抗体单链可变区序列scFv，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:13所示的HCDR1，
SEQ ID NO:14所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3
其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案；或
所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：
所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:58所示的HCDR1，
SEQ ID NO:59所示的HCDR2，和
SEQ ID NO:15所示的HCDR3；
且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
SEQ ID NO:16所示的LCDR1，
SEQ ID NO:17所示的LCDR2，和
SEQ ID NO:18所示的LCDR3；
其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，如权利要求2所述的重组蛋白，或如权利要求3所述的嵌合抗原受体CAR。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种制备CAR-NK细胞或CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述的CAR-NK细胞或CAR-T细胞表达权利要求3所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：
将权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述CAR-NK细胞或CAR-T细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求3所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9. 一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：
(a) 抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的重组蛋白、或其组合；和
(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、酶、或其组合。
10.如权利要求9所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记物为放射性核素。
11.一种权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求8所述的药物组合物或权利要求9或10所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，
(a)制备检测ROR1相关疾病的试剂或试剂盒；和/或
(b)制备预防和/或治疗ROR1相关疾病的药物或制剂；
所述ROR1相关疾病为ROR1阳性肿瘤；
所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合；其中
所述血液肿瘤选自下组：慢性淋巴癌、弥漫性大B细胞淋巴癌、套细胞淋巴癌、或其组合；所述实体瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或其组合。
12.一种体外非诊断性非治疗性检测样品中ROR1蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1) 将样品与权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求2的重组蛋白接触；
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在ROR1蛋白。
13. 一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；和
(b) 从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求2所述的重组蛋白。
14.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求9或10所述的免疫偶联物、或其组合。
15. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(1) 第一容器，所述第一容器中含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段；和/或
(2) 第二容器，所述第二容器中含有抗权利要求1所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有本发明的权利要求14所述的检测板。
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