WO2023125813A1 - 抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供一种嵌合抗原受体，其抗原结合域包括含抗间皮素单域抗体的间皮素结合分子。含有本文所述嵌合抗原受体的免疫细胞具有更高的细胞杀伤效果。

Description

抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用 技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体治疗领域，具体涉及抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
间皮素(MSLN)基因位于染色体1p13.3，全长8kD。该基因包含有1884bp的开放阅读框，编码17个外显子，628个氨基酸。MSLN的前体蛋白是长约69kD的以糖基磷脂肽肌醇锚定在细胞膜上的糖蛋白，可以被蛋白水解酶水解成2部分，其中N端为31kD的可溶性蛋白，具有巨核细胞刺激活性，被称为巨核细胞强化因子(megakaryocyte potentiating factor，MPF)；而C端为长约40kD的膜结合蛋白，具有细胞黏附性，被称为MSLN。MSLN在膜蛋白的结构可以分为三个不同区段，其中Ⅰ区为配体CA125的结合位置。
间皮素作为一种分化抗原在多种恶性肿瘤中均呈高表达，与肿瘤的发生、发展密切相关，该靶点是最具有潜力的抗肿瘤靶点之一，已有众多大型药企瞄准该靶点进行开发，目前进入临床试验的药物形式包括CAR-T、单抗、ADC等。在过去近20年里，开发了多种抗间皮素的单克隆抗体，主要包括SS1P免疫毒素和MORAB-009。SS1P是重组的免疫毒素，由scFv与截短的假胞外菌毒素融合组成，主要介导细胞杀伤作用；MORAB-009是由SS1P序列重组的IgG1抗体，主要引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
SS1P抗体结合在间皮素Ⅰ区，并且可以阻断CA125和间皮素的结合。该抗体也被用于CAR-T的治疗，但疗效均不理想(Jiang,H.等，Protein Cell 8,926–931，2017；Adusumilli,P.S.等，Sci.Transl.Med.6,261ra151，2014；Lanitis,E.等，Mol.Ther.20,633–643，2012)。纳米抗体具有稳定性高、穿透力强、结合表位广的天然优势(Muyldermans S.Annu Rev Biochem.2013；82:775-97.)。本领域尚无将MSLN纳米抗体用于CAR-T的治疗的报道。
目前，虽然CAR-T疗法在治疗血液瘤上取得了巨大的成效，但在针对实体瘤方 面的响应率较低。CAR-T疗法联合PD-1抑制剂是治疗实体瘤新兴疗法。美国纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial Sloan KetteringCancer Center)的研究人员构建了一种可以分泌抗PD-1单链抗体(scFv)的CAR-T细胞(Sarwish Rafiq等，Nat Biotechnol 2018 Oct；36(9):847-856)。但研究发现，传统的scfv抗体在T细胞中表达量低，难以充分发挥PD-1抑制剂的效果，这主要是由于scfv抗体本身易聚集、折叠易错配、热稳定性低等性质导致的(Martin N等，Macromol Biosci.2017 Feb；17(2))。而纳米抗体则具有易表达、稳定性高、亲和力高等天然优势。根据纳米抗体自身优势、MSLN和PD-1生物学机制，开发一种基于MSLN纳米抗体的CAR-T，以及同时联合自分泌PD-1纳米抗体的疗法，已经成为亟待解决的问题。
发明内容
本文一方面提供一种嵌合抗原受体，包含任选的信号肽序列、含抗间皮素单域抗体的间皮素结合分子、铰链区、跨膜区、胞内区。
在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单域抗体是间皮素III区(近膜端)的特异性单域抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗间皮素单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-27、73中任一所示的序列。优选地，该CDR1包含SEQ ID NO:5、11、14、15、17、21、27、73中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR2包含SEQ ID NO:28-47、74中任一所示的序列。优选地，该CDR2包含SEQ ID NO:29、35、37、38、39、43、40、74中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR3包含SEQ ID NO:48-72、75中任一所示的序列。优选地，该CDR3包含SEQ ID NO:49、55、58、59、61、65、72、75中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:76-120的任一VHH的FR区。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体VHH如SEQ ID NO:76-120中任 一所示。优选地，所述抗间皮素单域抗体如SEQ ID NO:77、83、85、86、87、89、93、100、103中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述间皮素结合分子是包含一条、两条或多条所述单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、包含抗间皮素单域抗体的间皮素结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第1-22位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区和IgG4Fc CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区是CD8铰链区；更优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第149-203位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，更优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:121第204-231位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激域为CD28的胞内结构域；优选地，所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第231-272位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第273-384位氨基酸残基所述。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:121 或122或123所示。
本发明还提供一种嵌合抗原受体，其抗原结合域包含抗间皮素单域抗体。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体可以如上述任一方案所述。
本发明还提供核酸分子，包含选自以下的序列：
(1)本文任一实施方案所述嵌合抗原受体的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。
在一个或多个实施方案中，所述编码序列是DNA或RNA。
本发明第二方面还提供核酸构建物，其包含本发明任一实施方案所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含PD-1结合分子的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含转座酶的编码序列和/或PD-1结合分子的编码序列，所述转座酶用于转座嵌合抗原受体和/或PD-1结合分子的编码序列，例如将转座嵌合抗原受体和/或PD-1结合分子的编码序列或表达框整合到基因组中。
在一个或多个实施方案中，转座酶的编码序列是DNA或RNA。
在一个或多个实施方案中，PD-1结合分子的编码序列是DNA或RNA。
在一个或多个实施方案中，PD-1结合分子包括：PD-1抗体或其抗原结合片段，PD-1重链抗体或其抗原结合片段，包含一条、两条或多条PD-1单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体。
在一个或多个实施方案中，所述PD-1结合分子(例如PD-1单域抗体)还包含Fc区域。优选地，Fc区域是IgG4的Fc区域，序列如SEQ ID NO:133所示。
在一个或多个实施方案中，核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体或整合载体。
在一个或多个实施方案中，所述表达载体是组成型表达载体。优选地，所述组成型表达载体是转座载体。
在一个或多个实施方案中，嵌合抗原受体的编码序列位于所述转座酶的识别序 列之间。
在一个或多个实施方案中，PD-1结合分子的编码序列位于所述转座酶的识别序列之间。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶是PiggyBac转座酶(PB酶)。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶如CN105154473A中所述。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含CAR的表达框。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物还包含转座酶的表达框和/或PD-1结合分子的表达框。所述一种、两种或三种表达框包含在一个或多个载体中。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述转座酶的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述转座酶的编码序列处于该表达框内。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述PD-1结合分子的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述PD-1结合分子的编码序列处于该表达框内。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框、所述转座酶的表达框和所述PD-1结合分子的表达框；或所述核酸构建物为两表达框，其一包含所述嵌合抗原受体的编码序列、所述转座酶的编码序列和所述PD-1结合分子的编码序列的任一，另一包含其余的编码序列；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列、所述转座酶的编码序列、所述PD-1结合分子的编码序列处于该表达框内。
在一个或多个实施方案中，核酸构建物是一个或多个载体，各载体包含一个或两个或三个本文任一实施方案中所述的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含：
一种载体，其包含(a)CAR的表达框和任选的(b)转座酶的表达框和/或PD-1结合分子的表达框；
两种载体，其中，所述两种载体(a)分别包含CAR的表达框和PD-1结合分子的表达框，任选地，所述两种载体中任一还包含转座酶的表达框，或者(b)一种包含转座酶的表达框，另一种包含CAR的表达框和PD-1结合分子的表达框；
三种载体，其分别包含CAR的表达框、PD-1结合分子的表达框和转座酶的表达框。
本发明另一方面还提供了一种编码序列的组合，包含权利要求1-4任一项所述嵌合抗原受体的编码序列，还包含转座酶的编码序列和/或PD-1结合分子的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述编码序列的组合任一编码序列可自由选择为DNA或RNA。例如，三种编码序列均为DNA，或三种编码序列均为RNA，或三种的任意一种或二种选择为DNA。
在一个或多个实施方案中，编码序列的组合包括嵌合抗原受体的编码序列、转座酶的编码序列和PD-1结合分子的编码序列，且三种编码序列均为DNA。
在一个或多个实施方案中，编码序列的组合包括嵌合抗原受体的编码序列、转座酶的编码序列和PD-1结合分子的编码序列，且嵌合抗原受体的编码序列和PD-1结合分子的编码序列为DNA，转座酶的编码序列为RNA，进一步优选为mRNA。
在一个或多个实施方案中，所述编码序列的组合中，编码序列可位于同一个核酸分子中，也可以位于不同的核酸分子中。例如，嵌合抗原受体的编码序列、转座酶的编码序列和PD-1结合分子的编码序列位于同一个核酸分子；或者嵌合抗原受体的编码序列与转座酶的编码序列位于同一个核酸分子中，而PD-1结合分子的编码序列位于另一个核酸分子中；或者嵌合抗原受体的编码序列、转座酶的编码序列和PD-1结合分子的编码序列分别位于三个核酸分子中。
本发明另一方面提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：
(1)包含和/或表达本文任一实施方案中所述的嵌合抗原受体，和/或任选包含、表达和/或分泌PD-1结合分子，和/或
(2)包含本文所述的核酸分子和/或核酸构建物，和/或
(3)包含本文所述的编码序列组合。
所述转座酶和PD-1结合分子如本文第二方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞含有：(a)本文任一实施方案中所述的嵌合抗原受体的编码序列；任选含有(b)本文任一实施方案中所述的PD-1结合分子的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述细胞含有：本文任一实施方案中所述的嵌合抗原受体的编码序列和本文任一实施方案中所述的PD-1结合分子的编码序列。
本发明另一方面提供一种药物组合物，含有药学上可接受的辅料和：
(1)本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(i) 转座酶和/或其编码序列，和/或(ii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
(2)本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物、编码序列的组合或细胞。
所述转座酶和PD-1结合分子如本文第二方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括间皮素介导的癌症。优选地，所述癌症还包括PD-1介导的癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括选自间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
本发明另一方面提供试剂在制备活化的免疫细胞(例如T细胞)中的应用，所述试剂含有：
(1)本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(i)转座酶和/或其编码序列，和/或(ii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
(2)本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物、编码序列的组合或细胞。
所述转座酶和PD-1结合分子如本文第二方面中所述。
本发明另一方面提供试剂在制备治疗癌症的药物中的应用，所述试剂含有：
(1)本文任一实施方案所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(i)转座酶和/或其编码序列，和/或(ii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
(2)本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建物、编码序列的组合或细胞。
所述转座酶和PD-1结合分子如本文第二方面中所述。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括间皮素介导的癌症。优选地，所述癌症还包括PD-1介导的癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括选自间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤中的一种或多种。
本发明还提供一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的细胞或药物组合物。
在一个或多个实施方案中，所述癌症包括间皮素介导的癌症。优选地，所述癌 症还包括PD-1介导的癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。
在一个或多个实施方案中，所述治疗有效量是为1-100*10 6个细胞/鼠，优选5*10 6个细胞/鼠。
在一个或多个实施方案中，细胞或药物组合物通过静脉注射给予。
附图说明
图1：MSLN CAR-T细胞D5-D13增殖曲线和增殖倍数。标注如图1，D中所示。A-C：来源于3个志愿者(AC-201908B、AC-201909A、AC-201910A)的外周血制备的CAR-T的D5-D13增殖曲线；D：来源于上述3个志愿者的外周血制备的CAR-T的D5-D13的平均增殖曲线；E：来源于上述3个志愿者的外周血制备的CAR-T的D5-D13的平均增殖倍数曲线。
图2：MSLN CAR-T培养D5-D13的细胞活率曲线。
图3：MSLN CAR阳性T细胞数的变化及D13时CAR阳性率。A：MSLN CAR阳性T细胞数；B：CAR阳性率。
图4：D13检测的CD3+细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例
图5：Day13细胞群体中记忆型T细胞的比例
图6：预实验中冻存复苏的MSLN CAR-T针对mesothelin阴性(A：H520)和阳性(B：H226；C：ASPC-1)的不同肿瘤细胞体外杀伤统计结果。
图7：72h mock-T和MSLN CAR-T对Mesothelin阳性的两种肿瘤细胞的杀伤率(E:T＝1：1)。A：SKOV3；B：H226。
图8：mock-T和不同的MSLN CAR-T与mesothelin阳性的肿瘤细胞共孵育72h后的细胞因子释放情况。A：IFN-gamma；B：IL-2；C：TNF-alpha。
图9：细胞D5-13增殖曲线和增殖倍数。A-C：来源于3个志愿者(AC201906A、AC201908A、AC201909A)的外周血制备的CAR-T的D5-D13增殖曲线；D：来源于上述3个志愿者的外周血制备的CAR-T的D5-D13的平均增殖曲线；E：来源于上述3个志愿者的外周血制备的CAR-T的D5-D13的平均增殖倍数曲线。标注如图9，D中所示。
图10：细胞培养D5-13的细胞活率。
图11：MSLN CAR阳性T细胞数的变化及Day13时CAR阳性率。A：MSLN CAR阳性T细胞数；B：CAR阳性率。
图12：D13检测的CD3+细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
图13：Day13细胞群体中记忆型T细胞的比例。
图14：两种记忆型T细胞在抗原刺激前后的比例变化。
图15：抗原刺激前后，细胞分泌抗体浓度对比。
图16：48h mock-T和CAR-T在不同效靶比下对SKOV3-PDL1的杀伤率。
图17：48h mock-T和CAR-T在不同效靶比下对H226的杀伤率。
图18：mock-T和MSLN CAR-T对肿瘤细胞的杀伤曲线。A：CAR-T细胞对H226和SKOV-PDL1细胞杀伤率统计(E:T＝1：4，杀伤时间72h)；B：对H226细胞代表性杀伤曲线；C：对SKOV3-PDL1细胞代表性杀伤曲线。
图19：mock-T和MSLN CAR-T与mesothelin&PDL1阳性的肿瘤细胞共孵育48h后的细胞因子释放情况。A：IL-2；B：IFN-gamma；C：TNF-alpha。
图20：高、中、低给药剂量下NCI-H226-PDL1肿瘤体积变化。
图21：高、中、低给药剂量下Skov3-PDL1肿瘤体积变化。
图22：高、中、低给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠体重变化。
图23：高、中、低给药剂量下Skov3-PDL1荷瘤小鼠体重变化。
图24：高、中、低给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠生存曲线。
图25：高、中、低给药剂量下Skov3-PDL1荷瘤小鼠生存曲线。
图26：高、中、低给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠PD1抗体血药浓度变化。A、B：低给药剂量；C、D：中给药剂量；E、F：高给药剂量。
图27：高、中、低给药剂量下Skov3-PDL1荷瘤小鼠PD1抗体血药浓度变化。A、B：低给药剂量；C、D：中给药剂量；E、F：高给药剂量。
图28：高给药剂量下NCI-H226-PDL1肿瘤体积变化。
图29：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠体重变化。
图30：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠生存曲线。
图31：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠PD1抗体血药浓度变化(A：质量浓度；B：摩尔浓度)。
图32：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠每微升血液中CAR-T(A：CD3+T细胞、B：CD8+T细胞、C：CAR+T细胞、D：CAR+T细胞在CD3+T细胞中的比例)血药浓度变化。
图33：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠外周血细胞因子浓度变化。A：IL-2；B：IL-4；C：TNF-alpha；D：IL-6；E：IFN-gamma；F：IL-10。
图34：常用给药剂量下肿瘤体积和体重变化(A和C：NCI-H226-PDL1的肿瘤体积和体重变化；B和D：Skov3-PDL1肿瘤体积和体重变化)。
图35：CAR-T细胞制备数据。A：增殖倍数；B：细胞活率；C：CAR阳性率；D：Tcm和Tem；E：CD4/8；F：抗体分泌。
图36：CAR-T细胞的PD-1抗体分泌量和细胞因子分泌量。A：CAR-T细胞在抗原刺激6h和48h后的PD-1抗体分泌量；B：CAR-T细胞在无抗原刺激和有抗原刺激6h和48h后的细胞因子分泌量。
图37：CAR-T细胞的杀伤性能。A-B：两个不同志愿者(09B和09A01)来源的PBMC制备的Mock-T和CAR-T在对H226-PDL1肿瘤细胞的80小时的杀伤率；C-D：两个不同志愿者(09B和09A01)来源的PBMC制备的Mock-T和CAR-T在对H226-PDL1肿瘤细胞的杀伤曲线。
图38：CAR-T细胞的杀伤性能。A-B：三个不同志愿者(09B,09A01，12A)来源的PBMC制备的Mock-T和CAR-T在对SKOV3-PDL1肿瘤细胞的100小时的杀伤率；C-D：两个不同志愿者(09B和09A01)来源的PBMC制备的Mock-T和CAR-T在对SKOV3-PDL1肿瘤细胞的杀伤曲线。
图39：小鼠体内实验流程示意图。
图40：不同剂量CAR-T对肿瘤的抑制作用。A-D分别表示0.2E6、1E6、5E6、20E6剂量的结果。
图41：不同剂量的小鼠体重和生存率。A-D分别表示0.2E6、1E6、5E6、20E6剂量的小鼠体重；E：20E6剂量的小鼠生存率。
图42：不同剂量下的外周血CD3+T细胞数。
图43：CAR阳性细胞比例。A：CAR-T回输14天时，不同剂量下的外周血CAR+T细胞在CD3+T细胞中的比例。B：回输前各组细胞的CAR+比例。
图44：pNB338B-1444-CAR载体结构图。
图45：常用给药剂量下PD1抗体血药浓度变化(A：NCI-H226-PDL1，B：Skov3-PDL1)。
图46：常用给药剂量下CAR-T血药浓度变化(A-D：NCI-H226-PDL1，E-H：Skov3-PDL1)。
具体实施方式
本发明提供一种靶向间皮素的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有任选的信号肽序列、含抗间皮素单域抗体序列的间皮素结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。
本文中，抗原的“结合分子”是特异性结合抗原的蛋白质，包括但不仅限于，抗体、抗体的抗原结合片段、重链抗体、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv)。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。
本文所述“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。示例性地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:132所示序列。
如本文所用，术语“单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”、“纳米抗体”，“单一可变域”可互换使用，均指特异性识别和结合于抗原的单域多肽或蛋白。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
本文中，重链抗体和抗体旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，下述针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最 可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方 面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。
抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。
“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。本发明任一实施方案所述的结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
术语“免疫细胞”是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，其实例包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。优选地，免疫细胞为例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和巨噬细胞。在某些实施方案中，本发明的免疫细胞包括T细胞，例如CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
本文所述“间皮素结合分子”包含抗间皮素单域抗体，所述单域抗体的互补决 定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11，其中，X 1为G、E、T或A，X 2为S、N、P、A、H、D、K、I或F，X 3为I、S、V、T、D、L、A、M或H，X 4为F、S、I、A、L或G，X 5为N、S、G、A、D、T、E、R或H，X 6为I、L、F、Y、E或N，X 7为N、A、G、D、K、Y、L或S，X 8为A、Y、V、D或N，X 9为E或无、X 10为F或无、X 11为A或无。在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8，其中，X 1为G、E、T或A，X 2为S、N、P、A、H、D、K、I或F，X 3为I、S、V、T、D、L、A、M或H，X 4为F、S、I、A、L或G，X 5为N、S、G、A、D、T、E或H，X 6为I、L、F、Y或N，X 7为N、A、G、D、K、Y或S，X 8为A、Y、V或N。在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是GX 2X 3X 4X 5X 6X 7A，其中，X 2为S、N、A、D、I或F，X 3为I、V、T、D、A、L或S，X 4为F、S、I、A或L，X 5为N、S、A、D、E、T或H，X 6为I、F、N或Y，X 7为N、G、D或Y。优选地，SEQ ID NO:1是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8，其中，X 1为G、E、T或A，X 2为S、N、P、H或I，X 3为I、S、T、D、L或A，X 4为F、I或L，X 5为S、T或E，X 6为I、F或Y，X 7为N、A、D或Y，X 8为A或Y。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-27、73中任一所示的序列。优选地，CDR1包含SEQ ID NO:5、11、14、15、17、21、27、73中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:2是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中，X 1为I、M、A、T或L，X 2为S、G、N、D、T或V，X 3为S、N、A、R、G或T，X 4为S、T、G、D或N，X 5为N、G、T或I，X 6为S、R、N、D、K、T或G，X 7为D、T、S、I或K，X 8为N、T、G、D或无，X 9为T、K、G或无，X 10为G、R或无，X 11为V、T或无，X 12为T或无。在一个或多个实施方案中，X 3为S、N、A、R或T。在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:2是IX 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9，其中，X 2为S、G、N或D，X 3为S、N、A或T，X 4为S、T、G、D或N，X 5为N或G，X 6为S、R、N、D或K，X 7为D、T、S或K，X 8为N、T或无，X 9为T、K或无。优选地，SEQ ID NO:2是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中，X 1为I、A或T，X 2为S、G、N或T，X 3为S或R，X 4为T、G或D，X 5为N、G或T，X 6为S、R、N、K或T，X 7为D、T、S、I或K，X 8为N、G或无，X 9为T、G或无，X 10为G或无，X 11为V或无，X 12为T或无。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR2包含SEQ ID NO:28-47、74中任一所示的序列。优选地，CDR2包含SEQ ID NO:29、35、37、38、39、43、40、74中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:3是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12X 13X 14X 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21X 22X 23，其中，X 1为N、H、A或Q，X 2为L、A、G或V，X 3为S、R、E、G、D或T，X 4为N、A、R、G、D、K、V、T、I、E或Q，X 5为Y、F、K、S、C、I、D、G、H或R，X 6为D、A、V、G、R、N、P、T、C、Q或S，X 7为R、Y、T、A、D、K、L、E、S或G，X 8为K、S、F、T、D、Q、E、G、P、R、Y或N，X 9为D、G、I、H、S、Y、Q、K、T、R或V，X 10为R、Y、H、N、T、D、P、V、K、C、L或S，X 11为Y、D、E、P、F、S、L、I或无，X 12为P、V、Q、A、Y、F、N、D、R或无，X 13为D、A、Y、V、Q、P或无，X 14为Y、L、P、A、E或无，X 15为C、S、M、P、T或无，X 15为C、S、M、P或无，X 16为V、D、S、Y或无，X 17为L、F、V、D或无，X 18为R、G、M、S或无，X 19为D、N、S或无，X 20为Y、L或无，X 21为Y或无，X 22为A或无，X 23为D或无。在一个或多个实施方案中，X 1为N、H、A或Q，X 2为L、A、G或V，X 3为S、R、E、G、D或T，X 4为N、A、R、G、D、K、V、T、I或Q，X 5为Y、F、K、S、C、I、D、G、H或R，X 6为D、A、V、G、R、N、P、T、C、Q或S，X 7为R、Y、T、A、D、K、L、E、S或G，X 8为K、S、F、T、D、Q、E、G、P、R、Y或N，X 9为D、G、I、H、S、Y、Q、K、T或V，X 10为R、Y、H、N、T、D、P、V、K、C或S，X 11为Y、D、E、P、F、S、L或无，X 12为P、V、Q、A、Y、F、N、D或无，X 13为D、A、Y、V、Q或无，X 14为Y、L、P、A、E或无，X 15为C、S、M、P或无，X 16为V、D、S、Y或无，X 17为L、F、V、D或无，X 18为R、G、M、S或无，X 19为D、N、S或无，X 20为Y、L或无，X 21为Y或无，X 22为A或无，X 23为D或无。在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:3是AX 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12X 13X 14X 15X 16X 17X 18X 19，其中，X 2为A、G或V，X 3为S、E、G、D或T，X 4为N、R、D、K、T或I，X 5为Y、F、K、I、D、G、H或R，X 6为D、A、G、N、P、T、C、Q或S，X 7为R、Y、T、A、D、K、L或G，X 8为K、S、F、D、Q、G、P、Y或N，X 9为D、G、I、S、Y、Q、K或V，X 10为R、Y、H、T、D、P、V、K或C，X 11为Y、D、E、F、S、L或无，X 12为P、V、A、Y、F、N、D或无，X 13为D、A、Y、V或无，X 14为Y、P、E或无，X 15为S、P或无，X 16为D、Y或无，X 17为F、D或无，X 18为G、S或无，X 19为N或无。优 选地，SEQ ID NO:3是AX 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12X 13X 14X 15X 16X 17X 18X 19，其中，X 2为A或V，X 3为S、E、G或D，X 4为N、R、D或I，X 5为Y、F、K、D或H，X 6为D、G、P、C或S，X 7为R、Y、D、K或L，X 8为K、Q、G或N，X 9为D、S、Y或Q，X 10为R、Y、D、V或S，X 11为Y、D、F、S、L或无，X 12为P、F、或无，X 13为D、V或无，X 14为P或无，X 15为S或无，X 16为D或无，X 17为F或无，X 18为G或无，X 19为N或无。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR3包含SEQ ID NO:48-72、75中任一所示的序列。优选地，CDR3包含SEQ ID NO:49、55、58、59、61、65、72、75中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的CDR1含有如SEQ ID NO:4-27、73中任一所示的序列，CDR2含有SEQ ID NO:28-47、74中任一所示的序列，CDR3包含SEQ ID NO:48-72、75中任一所示的序列。优选地，抗间皮素单域抗体的含有以下组a1到组a26中任一组所示的CDR1、CDR2和CDR3：
组 CDR1 CDR2 CDR3
a1 4 28 48
a2 5 29 49
a3 6 30 50
a4 7 31 51
a5 8 32 52
a6 9 33 53
a7 10 34 54
a8 11 35 55
a9 12 36 56
a10 13 32 57
a11 14 37 58
a12 15 38 59
a13 16 31 60
a14 17 39 61
a15 18 40 62
a16 19 41 63
a17 20 42 64
a18 21 43 65
a19 22 32 66
a20 13 32 67
a21 23 44 68
a22 24 45 69
a23 25 46 70
a24 26 47 71
a25 27 40 72
a26 73 74 75
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的FR1可选自表A中各抗体编号的VHH的FR1，VHH的FR2可选自表1中各抗体编号的VHH的FR2，VHH的FR3可选自表1中各抗体编号的VHH的FR3，VHH的FR4可选自表1中各抗体编号的VHH的FR4。在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:76-120的任一VHH的FR区。
在一个或多个实施方案中，抗间皮素单域抗体如SEQ ID NO:76-120中任一所示。优选地，所述单域抗体如SEQ ID NO:77、83、85、86、87、89、93、100、103中任一所示。
本文所述间皮素结合分子是包含一条、两条或多条本文所述的抗间皮素单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。所述重链抗体的抗原结合片段是单链重链抗体。所述重链抗体还包含重链恒定区。在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。在一个或多个实施方案中，所述CH2和CH3是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG4的CH2和CH3。
本文中提及的间皮素结合分子和抗间皮素单域抗体包含CN202011584014或CN202011582948中所述的所有间皮素结合分子和抗间皮素单域抗体，上述专利申请的全文以其中各实施方案具体和单独地被引用而纳入本文。
CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8信号肽可以是本领域常用于CAR的各种人CD8信号肽序列。在某些实施方案中，所述人CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:121第1-22位氨基酸所示。
CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8铰链区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8铰链区序列。在某些实施方案中，所述人CD8铰链区的氨基酸序列可如SEQ ID NO:121第149-203位氨基酸所示。
CAR的跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、 CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的人CD28跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD28跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第204-231位氨基酸所示。
可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域。适用于本发明的人CD28共刺激域可以是本领域常用于CAR的各种人CD28共刺激域序列。在某些实施方案中，所述CD28共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第231-272位氨基酸序列所示。
类似地，CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。适用于本发明的CD3ζ胞内信号域可以是本领域已知的各种用于CAR的CD3ζ胞内信号域。在某些实施方案中，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第273-384位氨基酸序列所示。
形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。作为例子，接头可由SEQ ID NO:7-18中任一氨基酸序列组成。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
在示例性实施方案中，CAR从N端到C端依次含有CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域。在具体实施例中，具有上述结构的示例性CAR如SEQ ID NO:121-123中任一所示。在某些实施方案中，本发明CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:121第23-384位氨基酸所示或 如SEQ ID NO:122第23-377位氨基酸或如SEQ ID NO:123第23-378位氨基酸所示。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括任一实施方案所述的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在任一实施方案所述的CAR的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所 不同的核苷酸序列。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明也涉及核酸构建物，术语“核酸构建物”或“多核苷酸构建物”是指一个或多个的单链或双链的核酸分子，它是从天然产生的基因中分离的，或经修饰而含有以自然界中不存在的方式的核酸片段。术语“核酸分子”主要指代物理核酸分子，术语“核酸序列”主要指代核酸分子上的核苷酸序列，但两个术语可互换使用，尤其是相对于能够编码蛋白质或蛋白质结构域的核酸分子，或核酸序列而言。该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述CAR的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
在本发明的一些实施方案中，所述核酸构建物还包含PD-1结合分子的编码序列。PD-1结合分子包括但不限于：PD-1抗体或其抗原结合片段，PD-1重链抗体或其抗原结合片段，包含一条、两条或多条PD-1单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体。本文中提及的PD-1结合分子和抗PD-1单域抗体分别包含CN202011582908中所述的所有PD-1结合分子和所有抗PD-1单域抗体，该专利申请的全文以其中各实施方案具体和单独地被引用而纳入本文。如该专利申请所述，PD-1结合分子是包含一条、两条或多条所述PD-1单域抗体的单价或多价单域抗体、多特 异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
因此，本文所述抗PD-1单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1、CDR2和CDR3分别包括CN202011582908中的SEQ ID NO:1、2和3所示的序列。示例性地，本文所述抗PD-1单域抗体中，CDR1包括CN202011582908中的SEQ ID NO:4-39、320中任一所示的序列；CDR2包括CN202011582908中的SEQ ID NO:40-75中任一所示的序列；CDR3包括CN202011582908中的SEQ ID NO:76-183中任一所示的序列。在一个或多个实施方案中，本文所述抗PD-1单域抗体含有CN202011582908中的组a1到组a136中任一组所示的CDR1、CDR2和CDR3。本文所述抗PD-1单域抗体VHH可如CN202011582908中的SEQ ID NO:184-319中任一所示。优选地，本文所述抗PD-1单域抗体如CN202011582908中的SEQ ID NO:197、200、223-309中任一所示。此外，本文所述抗PD-1单域抗体的各CDR或全长可如CN202011582908中的任一实施方案所述。
示例性地，抗PD-1单域抗体的CDR1如SEQ ID NO:124或128所示，CDR2如SEQ ID NO:125或129所示，CDR3如SEQ ID NO:126或130所示；抗PD-1单域抗体VHH的序列如SEQ ID NO:127或131所示。
本文所述PD-1结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗PD-1单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。本文中，重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。所述重链抗体的抗原结合片段是单链重链抗体。所述重链抗体还包含重链恒定区。在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。在一个或多个实施方案中，所述CH2和CH3是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG4的CH2和CH3。
因此，在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含CAR和PD-1结合分子的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述PD-1结合分子的表达框。所述两种表达框包含在一个或两个载体中。或者，所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述PD-1结合分子的编码序列处于该表达框内。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。术语“载体”能够将基因序列转移到靶细胞中。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导所关注基因的表达并且可以将基因序列转移到靶细胞中的任何核酸构建物，这可 以通过整个或部分载体的基因组整合，或作为染色体外元件的载体的瞬时或可遗传性保持来实现。因此，该术语包括克隆载体、表达载体以及整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。核酸构建物可以是一个或多个载体，各载体包含一个或两个或三个本文任一实施方案中所述的表达框。
本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
核酸构建物可以是克隆载体或表达载体。所述表达载体优选是组成型表达载体，例如转座载体(或称“转座子载体”)。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’ITR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’ITR)。因此，在本发明的一些实施方案中，所述核酸构建物还包含转座酶的编码序列，所述转座酶用于转座嵌合抗原受体和/或PD-1结合分子的编码序列，例如将嵌合抗原受体和/或PD-1结合分子的编码序列或表达框整合到基因组中。所述转座酶可以是本领域已知的任何适用于人细胞的转座酶，例如是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’ITR和3’ITR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。5’ITR和3’ITR之间包含本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及polyA加尾信号序列。示例性的转座酶是PB酶。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN105154473A(本文将其内容以引用的方式纳入本文)的SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN105154473A 的SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7的SEQ ID NO:5所示。示例性的载体骨架为CN111206043A和CN114729361A中所述的pNB338B和pS338B。
因此，在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含CAR和转座酶的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述嵌合抗原受体的表达框和所述转座酶的表达框。所述两种表达框包含在一个或两个载体中。或者，所述核酸构建物为一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列和所述转座酶的编码序列处于该表达框内。
在某些情况中，本文所述核酸构建物包含CAR、转座酶和PD-1结合分子的编码序列。所述核酸构建物可含有三表达框，即所述嵌合抗原受体的表达框、所述转座酶的表达框和所述PD-1结合分子的表达框；所述三种表达框可包含在一个、两个或三个载体中。或者，所述核酸构建物含量有两表达框，其一包含所述嵌合抗原受体的编码序列、所述转座酶的编码序列和所述PD-1结合分子的编码序列的任一，另一其余的编码序列；所述两种表达框可包含在一个或两个载体中；还或者，所述核酸构建物含有一表达框，其中所述嵌合抗原受体的编码序列、所述转座酶的表达框所述PD-1结合分子的编码序列处于该表达框内。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物包含：一种载体，其包含(a)CAR的表达框和任选的(b)转座酶的表达框和/或PD-1结合分子的表达框；两种载体，其中，所述两种载体(a)分别包含CAR的表达框和PD-1结合分子的表达框，任选地，所述两种载体中任一还包含转座酶的表达框，或者(b)一种包含转座酶的表达框，另一种包含CAR的表达框和PD-1结合分子的表达框；或三种载体，其分别包含CAR的表达框、PD-1结合分子的表达框和转座酶的表达框。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。合适的启动子的另一个例子为IFNγ驱动的启动子。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑 使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。
因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的CAR和任选的抗PD-1结合分子。本文所述细胞(例如T细胞)还可包含或表达转座酶或其编码序列。
本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平 持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR和任选的抗PD-1结合分子，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体以及CAR-T细胞治疗的疾病优选为间皮素介导的癌症。优选地，所述疾病还受益于抗PD-1抗体疗法，为PD-1介导的癌症。
具体而言，本文中，“间皮素介导的癌症”尤其包括各种类型的卵巢癌、胸膜间皮瘤(如上皮性间皮瘤)、胰腺癌，以及宫颈、子宫内膜、头、颈、阴道、肺及食管的鳞癌。在某些实施方案中，所述间皮素介导的疾病为恶性胸膜间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌及肺腺癌。“受益于抗PD-1抗体疗法”的疾病或“PD-1介导的癌症”包括胃癌、黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受的辅料(例如载体、稀释剂或赋形剂)组合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的 T细胞的药物组合物可以以10 4至10 9个细胞/kg体重的剂量，优选10 5至10 6个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗间皮素介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实验操作方法：
人外周血单核细胞PBMC的分离和冻存
先将人单采血用DPBS稀释1-2倍，然后将稀释的血液轻轻加到在ficoll上层，避免两种溶液混合在一起(血液：Ficoll＝3:4)；800g，离心20min(离心机升速为1，降速为0)，离心完毕用移液器吸取白膜层至新离心管；加入3倍体积DPBS后充分混匀之后，放入离心机中离心1500rpm，10min后去掉上清，此步骤重复2-3遍；计数后按5*10^6个细胞/ml体积补充AIM-V培养基，5％CO2 培养箱过夜。培养后将收集悬浮细胞计数后冻存。
CAR-T制备操作步骤
人单个核细胞(PBMCs)利用Ficoll密度梯度离心法(GE)从健康人供体外周血分离得到。分离得到的PBMCs以1×10 6/mL浓度在AIM-V培养液中过夜培养后用无血清冻存液(新赛美)冻存保藏于上海细胞治疗集团细胞库，冻存密度为1×10 7/mL。新鲜或冻存后复苏的PBMCs采用Lonza 4D电转仪进行电转，电转过程根据电转仪说明书操作步骤进行优化。100ul电转液重悬5-7×10 6PBMCs,将6ug pNB338B-1444-CAR质粒，或4ug pNB338B-1444-CAR+4ug pS338B-1182质粒加入到细胞悬液中，用EO-115程序进行电转。电转后的PBMCs加到含2ml 37℃预热的AIM-V(+2％FBS)培养液的12孔板中培养4-6h，然后转移到抗原包被过的六孔板中(5ug/ml CD28抗体+5ug/ml MNSL抗原)，将培养液补充至4ml,并加入终浓度为500IU/ml的IL-2。阴性对照组采用6ug Mock-T质粒进行电转，细胞培养板采用5ug/ml CD3抗体+5ug/ml CD28抗体进行包被，其余操作过程与上述实验组相同并同步进行。电转后的PBMCs在上述培养液中培养5天后，进行第一次传代，之后每2-3天进行一次传代，第13天CAR-T细胞制备完成。传代过程中的PBMCs培养于含2％FBS和100IU/ml IL-2的AIM-V培养液中，传代细胞密度为5×10 5/mL。细胞数目和细胞活率利用CountStar检测并记录。
CAR-T细胞制备过程及制备完成，利用流式细胞仪检测细胞表面CAR阳性率及其它表面标志物。以下抗体用于流式细胞仪检测：Anti-mesothelin,Anti-human CD3 PE-Cy5/CD4 PE/CD8 FITC Cocktail(Biolegend),anti-CD45RO(Biolegend),anti-CD62L(Biolegend),anti-CCR7(Biolegend),anti-CD107a,anti-PD1,anti-TIM3,anti-LAG3和anti-PDL1。
RTCA细胞杀伤
CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用利用xCELLigence RTCA设备(Roche Applied Science,Canada)进行检测，检测过程根据设备操作说明书进行。将适量(5×10 3-2×10 4)靶细胞(肿瘤细胞)重悬于50ul培养液，接种到RTCA设备配套的微孔板中(16孔或96孔)。肿瘤细胞在RTCA设备上培养约24h，待细胞指数(cell index,CI,指示细胞生长情况)达到1.5左右，按照不同的效靶比(效应细胞:靶细胞)，将不同数量的效应细胞(CAR-T细胞)重悬于50ul培养液中，与肿瘤细胞混合，继续在RTCA设备上培养3-5天。细胞杀伤曲线由RTCA设备 记录，数据用RTCA Pro 2.3.0软件进行分析。
抗体分泌量检测
自分泌PD1纳米抗体靶向MSLN的CAR-T细胞制备过程中及制备完成后的PD1纳米抗体的分泌量用ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法进行检测。制备过程中，细胞按照5×10 5/mL密度进行传代，将第5-7和第11-13天的上清收集，检测PD1抗体分泌量。制备完成后，将5×10 5/mL的CAR-T细胞接种到5ug/ml MSLN抗原包被好的细胞培养板中，培养48h后，收集上清检测PD1抗体分泌。以下抗体用于ELISA检测PD1纳米抗体分泌量：anti-1182-VHH(乘黄纳米公司，氨基酸序列如SEQ ID NO:134所示)。
实施例1，含有间皮素纳米抗体的CAR及CAR-T细胞
通过使用不同序列的纳米抗体来源的MSLN CAR与benchmarker中的MSLN CAR构建质粒并通过电转的方式将基因转入健康人来源的PBMC中构建非病毒载体的MSLN CAR-T细胞，验证CAR-T细胞在体外的表现，包括增殖能力、CAR阳性率、体外对靶细胞的杀伤能力、细胞因子分泌水平等指标。
1.1、MSLN CAR-T细胞质粒构建
实验仪器：普通PCR仪(耶拿，TRIO)、电泳仪(Bio-Rad，1645050)、电泳槽(Bio-Rad，1704483)、台式微量离心机(Thermo，Pico17)、金属浴加热模块(Thermo，DCD)、电热恒温水槽(上海一恒，DK-8D)、自动凝胶成像仪(天能Tanon，2500)
实验试剂
Figure PCTCN2022143407-appb-000001
实验方法
根据MSLN纳米抗体的序列合成全长核酸序列和引物，通过PCR获得大量目的片段，对pNB338B载体(其序列及结构参见CN109988759A中“pNB338B-E”)进行双酶切(EcoR1和Sal1)获得载体片段，将目的片段和载体片段通过DNA连接酶连接获取质粒。将构建的载体进行测序，序列正确后大量提取该质粒。其中，pNB338B-1444-CAR的载体结构如图44所示。MSLN3[1444]纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示(包含其的CAR如SEQ ID NO:122所示)，MSLN3[1450]纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示(包含其的CAR如SEQ ID NO:123所示)。MSLN3[Scfv]的氨基酸序列如CN109306014A的SEQ ID NO:3所示。
1.2、制备靶向间皮素CAR-T细胞
通过电转的方法制备Mock-T和MSLN CAR-T。
实验仪器：电转仪(Lonza 4D)、自动化细胞计数器(Invitrogen CountessⅡFL)、显微镜(江南XD-202)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、冷藏柜(青岛海尔)、二氧化碳培养箱(Thermo)、台式低速离心机(湘仪)、Pico17台式微量离心机(Thermo)、
实验试剂
Figure PCTCN2022143407-appb-000002
实验方法
人外周血单核细胞PBMC的分离和冻存
详见实验操作方法。
PBMC细胞复苏以及MSLN CAR-T制备
三种供体PBMC(AC-201909A、AC-201908B、AC-201910A)的密度为6.08E+06～9.67E+06个/mL，活率均超过90％。单质粒电转时，质粒浓度为每个样本6μg。详见实验操作方法。
实验结果
Figure PCTCN2022143407-appb-000003
1.3、MSLN CAR-T细胞体外增殖和阳性率检测
非病毒载体CAR-T制备后培养周期一般为13天，最终通过总细胞的增殖和最终的CAR阳性细胞比例得出CAR-T细胞的最终得率，所以本实验的目的旨在通过增殖情况和阳性率来评价所制备mock-T细胞和MSLN CAR-T细胞的质量。
实验仪器:自动化细胞计数器(Invitrogen CountessⅡFL)、显微镜(江南XD-202)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)、冷藏柜(青岛海尔)、二氧化碳培养箱(Thermo)、台式低速离心机(湘仪)、流式细胞仪(Navios，AZ46353)Pico17台式微量离心机(Thermo)
实验试剂
试剂名称 生产厂家
AIM-V培养基 GIBCO
FBS GIBCO
DPBS Hyclone
注射用重组人白介素-2 山东泉港药业有限公司
无血清细胞冻存液 新赛美
0.4％台盼蓝染液 Gibco
生物素化的人间皮素抗原 恺佧生物
PE链霉亲和素 BD
实验方法
1)CAR-T细胞培养和传代
通过细胞计数和等密度传代的方法，计算各组细胞的增殖倍数并绘制细胞增殖曲线。传代密度为5×10 5个/mL，在Day5、8、11传代并计数；IL-2浓度为100U/mL。详见实验操作方法。
2)MSLN CAR-T阳性细胞比例检测
通过流式细胞检测的方法检测细胞在经过抗原富集后，增殖过程中CAR阳性率的变化来比较不同的CAR序列。详见实验操作方法。
实验结果
结果如图1-3和表1-3所示。结果显示：三个供体来源的PBMC制备的CAR-T 细胞增殖能力有一定差异；其中两个供体增殖较好，扩增倍数约20-38倍，一个供体增殖情况较差，仅为1.3-3.7倍；总体来看，MSLN3[1444]CAR-T细胞可以成功扩增，增殖能力与Mock-T细胞和MSLN3[Scfv]CAR-T细胞相当(图1)。此外，MSLN3[1444]CAR-T细胞与Mock-T细胞和MSLN3[Scfv]CAR-T细胞一样，均具有较高的活率(>90％)(图2)。MSLN3[1444]CAR-T细胞CAR阳性率达到约60％，与MSLN3[Scfv]CAR-T相当(图3)。
表1，MSLN CAR-T细胞D5-D13增殖数据
Figure PCTCN2022143407-appb-000004
表2，MSLN CAR-T培养D5-D13的细胞活率
Figure PCTCN2022143407-appb-000005
表3，MSLN CAR-T培养过程中阳性率的变化以及D13CAR阳性细胞数
Figure PCTCN2022143407-appb-000006
Figure PCTCN2022143407-appb-000007
1.4、MSLN CAR-T细胞表型检测
通过流式细胞仪检测MSLN CART的CD3/CD4/CD8、TCM/TEM来评价我们制备的CART细胞的表型。
实验仪器：自动化细胞计数器(Invitrogen CountessⅡFL)、显微镜(江南XD-202)、Pico17台式微量离心机(Thermo)、流式细胞仪(Navios，AZ46353)
实验试剂
Figure PCTCN2022143407-appb-000008
实验方法
1)MSLN CART CD3/CD4/CD8检测
抗人CD3PE-Cy5/CD4PE/CD8FITC Cocktail流式抗体。实验过程详见实验操作方法。
2)MSLN CART TCM/TEM检测
2μL PE/Cy5抗人CD45RO、2μL FITC抗人CD197和2μL PE抗人CD62L流式抗体。实验过程详见实验操作方法。
实验结果
结果如表4-5和图4-5所示。结果显示：mock-T组和纳米抗体间皮素组(1444和1450)CAR-T细胞CD3阳性比例均较高约85％-97％；MSLN3[Scfv]CAR-T细胞CD3阳性比例略低，约75％-84％。所有组别CD3阳性细胞中CD4与CD8比例总体趋势一致，CD4比例高于CD8比例。所有组别Tcm与Tem比例总体趋势一致，Tcm比例高于Tem比例。与Mock-T细胞相比，MSLN3[Scfv]CAR-T细胞和MSLN3[1444]CAR-T细胞的CD4/CD8和Tcm/Tem均有一定程度的下降(图4，图5)。
表4，Day13天检测MSLN CAR-T的T细胞分群
Figure PCTCN2022143407-appb-000009
表5，Day13检测细胞中记忆型T细胞的分群
Figure PCTCN2022143407-appb-000010
1.5、MSLN CAR-T体外细胞毒性的检测
本实施例研究不同序列的MSLN CAR-T的体外药效学特性，检测其与间皮素阳性表达的肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌情况以及其对靶细胞的特异性杀伤能力。使用间皮素阴性的肿瘤细胞和间皮素阳性的肿瘤细胞进行体外杀伤实验，以证明候选序列对于间皮素抗原具有特异性杀伤的能力。
实验样本
表2所示的AC-201908B、AC-201909A和AC-201910A以及使用相同方法获得的YP-201903A04、YP-201903A23和YP-201903A24，其样本信息如下表所示。
Figure PCTCN2022143407-appb-000011
Figure PCTCN2022143407-appb-000012
靶细胞信息如下表所示：
细胞类型 表面MSLN+ 活率
H520 10.3％ 91％
AsPC-1 78.1％ 96％
H226 99.1％ 98％
SKOV3 75.4％ 96％
实验仪器：自动化细胞计数器(Invitrogen CountessⅡFL YSB195)、显微镜(江南XD-202YSB126)、生物安全柜、冷藏柜(TCL)、二氧化碳培养箱(Thermo)、实时细胞分析仪(ACEA XCELLIgence RTCA TP，SB0475，配套耗材：E-Plate 16、E-Plate 96)、台式离心机(小)(Thermo Fisher)、台式离心机(大)(湘仪)
实验试剂
试剂名称 生产厂家 规格 货号
AIM-Ⅴ培养基 Gibco 1000mL A3021002
胎牛血清(FBS) Gibco 500mL 10099141
IL-2 山东泉港药业有限公司 200万U/支 国药准字20020004
Trypan Blue Stain(0.4％) Invitrogen 100mL 15250-061
DMEM细胞培养基 CORNING 500mL/瓶 10-013-CER
0.25％胰蛋白酶消化液 新赛美 125mL C125C1
人IL-2 ValukineTM ELISA KIT NOVUS 96孔 VAL110
人TNF-αValukineTM ELISA KIT NOVUS 96孔 VAL105
人IFN-γValukineTM ELISA KIT NOVUS 96孔 VAL104
实验方法
1)细胞杀伤
(1)YP-201903A04、YP-201903A23和YP-201903A24：靶细胞为H520、AsPC-1、H226，效靶比(E:T)＝1：1
(2)AC-201908B、AC-201909A和AC-201910A：靶细胞为：SKOV3、H226， 效靶比(E:T)＝1：1、1：4、1：16
Figure PCTCN2022143407-appb-000013
Cell index:细胞指数，反应肿瘤细胞生长状况和细胞数目。
实验过程详见实验操作方法。
2)细胞因子释放检测
与靶细胞共孵育72h后取出96孔板，用ELISA的方法检测上清中的细胞因子释放的情况。
实验结果
结果如图6-8和表6所示，结果显示我们利用转座酶质粒系统制备的CAR-T细胞具有特异性杀伤间皮素阳性肿瘤细胞的功能(图6，图7)。与间皮素阳性的肿瘤细胞共培养，可以有效刺激MSLN3[Scfv]CAR-T细胞和MSLN3[1444]CAR-T细胞分泌IFN-γ，IL-2和TNF-α(图8)。
表6，mock-T和MSLN CAR-T与间皮素阳性肿瘤细胞共孵育72h后的细胞因子释放
Figure PCTCN2022143407-appb-000014
上述结果表明，纳米抗体来源的MSLN CAR序列在体外筛选中，与单链抗体序列相比，具有相似或更好的增殖能力、MSLN CAR的阳性率、CD4+T/CD8+T分群占比、记忆型T细胞比例；针对间皮素阳性的肿瘤细胞具有特异性杀伤的能力。
实施例2，自分泌PD1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的体外实验
通过使用纳米抗体来源的PD1抗体序列与benchmarker Keytruda的序列构建质粒并通过双质粒电转系统将基因转入健康人来源的PBMC中构建非病毒载体的aPD1MSLN CAR-T细胞，通过比较这些CAR-T细胞在体外的表现，包括增殖能力、CAR阳性率、抗体分泌水平以及分泌型抗体对免疫检查点抑制剂的阻断作用，来验证 CAR-T细胞自分泌抗体的功能。
2.1、自分泌PD1纳米抗体的质粒构建
使用示例性PD1纳米抗体(aPD1[1182]，SEQ ID NO:127)作为目的片段，pS338B(参见CN111206043A)载体作为骨架载体进行双酶切(EcoR1和BamH1)，其余实验仪器、实验试剂、实验方法同实施例1的1.1。
2.2、自分泌PD1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的制备
通过电转的方法制备Mock-T、aPD1-MSLN CAR-T，获得细胞和细胞上清样本用于检测分析。
实验仪器、试剂和方法同实施例1的1.2。其中aPD1-MSLN CAR-T为双质粒(实施例1的1.1和实施例2的2.1所构建的质粒)电转的CAR-T细胞，其表达基于纳米抗体的MSLN CAR和PD1纳米抗体。单质粒电转时，质粒浓度为每个样本6μg；双质粒电转时，每种质粒的浓度为4μg每个样本。
实验结果
Figure PCTCN2022143407-appb-000015
2.3、aPD1-MSLN CAR-T体外增殖和阳性率检测
验证双质粒系统下，使MSLN CAR-T细胞能够自分泌PD1(aPD1-MSLN CAR-T)时，是否能够实现细胞正常增殖以及保证一定的MSLN CAR阳性率，并获得细胞以及细胞上清样本用于检测细胞分泌PD1抗体的情况。实验仪器、试剂和方法同实施例1的1.3。
实验结果
结果如表7-9和图9-11所示。
表7，细胞D5-D13细胞增殖总数以及增殖倍数
Figure PCTCN2022143407-appb-000016
Figure PCTCN2022143407-appb-000017
表8，细胞培养D5-13的细胞活率
Figure PCTCN2022143407-appb-000018
表9，细胞培养D8-13MSLN CAR阳性率的变化以及CAR+细胞获得量
Figure PCTCN2022143407-appb-000019
2.4、细胞表型检测
实验目的
通过流式细胞仪检测自分泌PD1抗体MSLN CART的CD3/CD4/CD8、TCM/TEM来评价我们制备的CART细胞的表型。实验仪器、试剂和方法同实施例1的1.4。
实验结果
结果如表10-11和图12-13(AC-201908A)所示。
表10，Day13天检测MSLN CAR-T的T细胞分群
Figure PCTCN2022143407-appb-000020
Figure PCTCN2022143407-appb-000021
表11，MSLN CAR-T中，D13天记忆型T细胞的分群
Figure PCTCN2022143407-appb-000022
2.5细胞自分泌抗体检测
在细胞制备的过程中，通过ELISA方法检测细胞在制备终点之前是否具有自分泌抗体的能力以及分泌抗体浓度的范围。
实验仪器：多功能酶标仪(TECAN Spark)
实验试剂：
Figure PCTCN2022143407-appb-000023
Figure PCTCN2022143407-appb-000024
实验方法
取5×10 5个细胞在两天时间内培养的细胞上清样本，进行ELISA检测上清中抗体分泌的浓度，并通过计算得出细胞分泌上清的物质的量浓度。详见实验操作方法。
计算公式为：物质的量浓度＝质量浓度/分子量kDa/1000
本次实验细胞上清样本设置4倍、40倍、400倍稀释。
实验结果
结果如表12所示，结果表明自分泌PD1纳米抗体的间皮素CAR-T细胞在制备过程中可以成功分泌PD1纳米抗体，且PD1纳米抗体的分泌能力随着时间推移而呈下降趋势。
表12，细胞制备后D11-13抗体分泌浓度
Figure PCTCN2022143407-appb-000025
2.6细胞功能检测
通过使用CAR-T细胞所靶向的抗原给所制备的CAR-T细胞一定刺激，检测细胞表型的变化以及抗体分泌量的变化，评价CAR-T细胞受到特定抗原刺激后的响应能力。
实验仪器、试剂和方法同实施例1的1.4。
实验方法
用5μg/mL浓度的间皮素抗原包被12孔细胞培养板后，加入细胞样本5×10^5个，1mL培养体系培养48h，收取细胞和细胞上清分别进行流式检测和ELISA检测。并按照2.4、2.5的分析方法，分析Tcm(CD45RO+CCR7+CD62L+)和Tem(CD45RO+CCR7-CD62L-)的比例及PD1纳米抗体分泌量。
实验结果
结果如表13-14和图14-15所示。结果表明，较刺激前，CAR-T细胞受抗原刺激后，Tcm比例下降，Tem比例升高；CAR-T细胞受抗原刺激后，PD1纳米抗体的分泌量较刺激前大幅提高。
表13，间皮素抗原刺激48h后细胞中记忆型T细胞分群比例
Figure PCTCN2022143407-appb-000026
表14，间皮素抗原刺激48h后细胞上清中抗体浓度
Figure PCTCN2022143407-appb-000027
2.7、aPD1-MSLN CAR-T体外细胞毒性检测
验证自分泌PD1抗体的MSLN CAR-T细胞的体外药效学特性，检测其与间皮素阳性表达以及PDL1高表达的肿瘤细胞共培养后细胞因子的分泌情况以及其对靶细胞的特异性杀伤能力，进而对CAR-T细胞进行评价。
效应细胞
Figure PCTCN2022143407-appb-000028
靶细胞
细胞类型 表面MSLN+ 表面PDL1 活率
SKOV3-PDL1 72.3％ 99.9％ 96％
H226 98.3％ 37.7％ 96％
实验仪器、试剂和方法同实施例1的1.5。靶细胞选择为SKOV3-PDL1、H226，效靶比(E：T)＝1：1、1:4、1：16
细胞因子释放检测中，IL-2所有实验样本统一稀释5倍、10倍后进行检测；TNF-α所有实验样本统一稀释3倍后进行检测；IFN-γ所有实验样本统一稀释10倍、100倍后进行检测。
实验结果
结果如图16-18和表15所示，结果显示，自分泌PD1抗体可显著提高间皮素CAR-T对H226细胞的杀伤效率(图16)，对SKOV3-PDL1细胞的杀伤效率无显著影响(图17)。这表明我们制备的自分泌PD1纳米抗体的靶向间皮素的CAR-T细胞可以有效杀伤间皮素阳性的肿瘤细胞，并且可以提高间皮素CAR-T对于某些类型的间皮素和PDL1双阳性的肿瘤细胞的杀伤效果。与H226细胞和Skov3-PDL1肿瘤细胞共培养，可以提高CAR-T细胞分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力；而且，相较于不分泌PD1抗体的间皮素细胞，自分泌PD1抗体的间皮素CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后，IFN-γ和TNF-α的分泌量显著提高(图19)。
表15，mock-T和MSLN CAR-T与间皮素&PDL1阳性的肿瘤细胞共孵育48h后的细胞因子释放
Figure PCTCN2022143407-appb-000029
实施例3，自分泌D1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的体内药效实验
3.1、实验动物和细胞
6-8周NPSG重度免疫联合缺陷小鼠prkdc scidIl2rg null(北京菲诺克生物科技有限 公司)
肿瘤细胞
高表达PDL1的Skov3-PDL1(ATCC)
高表达PDL1的NCI-H226-PDL1(ATCC)
自分泌含Fc的PD1抗体的CAR-T细胞构建过程：将aPD1[1182]纳米抗体序列构建到pCDNA3.4-IgG4载体上获得pCDNA3.4-1182-Fc载体，然后经ExpiCHOTM(Thermo Fisher)表达系统表达，表达一周后收取上清进行Protein A(GE)纯化。然后使用Nanodrop检测蛋白质量，HPLC检测蛋白纯度。从pCDNA3.4-1182-FC载体上双酶切获得1182-Fc编码序列，导入pS338B骨架载体，其余实验仪器、实验试剂、实验方法同实施例2。
3.2、接种和给药方案
NPSG重度免疫联合缺陷小鼠皮下接种肿瘤细胞。
表16，接种方案及分组
Figure PCTCN2022143407-appb-000030
在肿瘤体积达到100-150mm 3时开始给药。给药方案按表17执行。
表17，NPSG小鼠给药方案及分组
Figure PCTCN2022143407-appb-000031
表17的药物中，CD19-1182-VHH是指自分泌1182-VHH的靶向CD19的CAR-T，CAR的氨基酸序列和编码序列分别如CN109971712A中的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，1444是指MSLN3[1444]CAR-T，1444-1182-VHH是指aPD1[1182]-MSLN3[1444]CAR-T，1444-1182-FC是指aPD1[1182-Fc]-MSLN3[1444]CAR-T。
3.3、高、中、低给药剂量下肿瘤体积变化
H226结果如图20所示，自分泌PD1抗体的给药组在多个给药剂量下均出现疗效的显著性差异。0.05*10^6剂量组(1444 VS 1444-1182-VHH:P＝0.0283，1444 VS 1444-1182-FC:P＝0.0010),0.5*10^6剂量组(1444 VS 1444-1182-VHH:P＝0.1722，1444 VS 1444-1182-FC:P＝0.0104)，5*10^6剂量组(1444 VS 1444-1182-VHH:P＝0.0051，1444 VS 1444-1182-FC:P＝0.0006)。
Skov3结果如图21所示，自分泌PD1抗体的给药组在多个给药剂量下均出现疗效的显著性差异。0.05*10^6剂量组(1444 VS 1444-1182-VHH:P＝0.7479，1444 VS 1444-1182-FC:P＝0.0757),0.5*10^6剂量组(1444 VS 1444-1182-VHH:P＝0.0002，1444 VS 1444-1182-FC:P<0.0001)。
3.4、高、中、低给药剂量下动物体重变化
H226结果如图22所示，自分泌PD1抗体的给药组，体重变化相对于其它给药组下降较小，长期来看较为平稳，除高剂量给药组外均保持平稳或上升状态，总的来看自分泌PD1抗体的给药组体重下降未超过20％。
Skov3结果如图23所示，自分泌PD1抗体的给药组，体重变化相对于其它给药组下降较小，长期来看较为平稳，除低剂量给药组外均保持平稳或上升状态，总的来看自分泌PD1抗体的给药组体重下降未超过20％。
3.5、高、中、低给药剂量下生存率
H226结果如图24所示，自分泌PD1抗体的给药组，生存期相对于其它给药组有明显优势，长期来看较为平稳，随着给药剂量的增加死亡率略有上升。
Skov3结果如图25所示，自分泌PD1抗体的给药组，生存期相对于其它给药组有明显优势，长期来看较为平稳，随着给药剂量的增加死亡率略有上升。
3.6、高、中、低给药剂量下PD1抗体血药浓度变化
H226结果如图26所示，自分泌PD1抗体的给药组，PD1抗体血药浓度与给药剂量正相关，且携带F C段的PD1抗体血药浓度明显高于不携带F C段的PD1抗体，而且且携带F C段的PD1抗体在体内的半衰期更长。
Skov3结果如图27所示，自分泌PD1抗体的给药组，PD1抗体血药浓度与给药剂量正相关，且携带F C段的PD1抗体血药浓度明显高于不携带F C段的PD1抗体，而且且携带F C段的PD1抗体在体内的半衰期更长。
实施例4，自分泌PD1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的高剂量药物安全性
4.1、试验材料
实验动物和细胞：6-8周MHC-I KO B-NDG重度免疫联合缺陷小鼠prkdc scidIl2rg null(百奥赛图生物科技有限公司)。MHC-I敲除后能够最大程度的减轻CAR-T回输后产生的移植物抗宿主疾病(GVHD)，有利于对药物的安全性进行长期观察。
肿瘤细胞：高表达PDL1的NCI-H226-PDL1(ATCC)
实验过程：同实施例3
4.2、接种和给药方案
表18.接种方案
Figure PCTCN2022143407-appb-000032
表19.给药方案及分组
Figure PCTCN2022143407-appb-000033
表19的药物中，CD19-CAR-T是指靶向CD19的CAR-T，CAR的氨基酸序列和编码序列分别如CN109971712A中的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，BMK-CAR-T是指CAR的抗原结合域为YP218scFv的CAR-T，其与MSLN3[1444]CAR-T的区别在于YP218为scfv形式抗体，1444为纳米抗体，二者均结合于间皮素III区，YP218scFv如CN105026429A中的YP218scFv所示。
4.3、肿瘤体积变化
图28显示自分泌PD1抗体的给药组在此给药剂量下均能使肿瘤完全消退，与阳性对照药物BMK相比，其疗效具有显著性差异(BMK VS 1444-1182-VHH:P<0.0001，BMK VS 1444-1182-FC:P<0.0001)。
4.4、体重变化
图29显示自分泌带F C段的PD1抗体的给药组，体重变化相对于其它给药组下降较小，长期来看较为平稳，长期观察至100天，大部分体重未出现下降20％的现象。
4.5、生存期
图30显示自分泌PD1抗体的给药组，生存期相对于其它给药组有明显优势，长期来看变化趋势较为平稳，其中自分泌带F C段的PD1抗体的给药组小鼠生存期超过100天。
4.6、PD-1抗体血药浓度变化
图31显示自分泌PD1抗体的给药组，携带F C段的PD1抗体血药浓度明显高于不携带F C段的PD1抗体，而且携带F C段的PD1抗体在体内的半衰期更长。给药后随着肿瘤的消退，抗体分泌逐渐减少。
4.7、外周血CAR-T细胞数量变化
图32显示给药后CAR-T细胞出现增殖高峰期，之后随着肿瘤的消退有下降趋势。其中CD3+、CD8+和CAR+细胞的变化趋势接近一致。CAR阳性率在给药后出现短暂下降，之后基本保持稳定，每微升血液细胞数量越少时，检测误差会相应增大。
4.8、外周血细胞因子浓度变化
图33结果显示给药后，干扰素-γ和白介素-6出现显著的分泌，其中白介素-6分泌主要集中在阴性对照组和BMK阳性对照组，而自分泌PD1抗体的给药组几乎无分泌。干扰素-γ在各组均出现明显分泌，与T细胞发挥杀伤功能相关。其余细胞因子白介素-2、白介素-4、白介素-10、TNF未检测出明显分泌，检测下限约为10pg/ml，接近此浓度可认为未检测到。
4.9、试验动物临床观察
表20：高给药剂量下NCI-H226-PDL1荷瘤小鼠临床表现
Figure PCTCN2022143407-appb-000034
Figure PCTCN2022143407-appb-000035
临床观察结果显示阴性对照组、BMK阳性对照组和1444-1182-VHH(抗体未携带F C段)三个组小鼠生存状况略差于1444-1182-F C给药组。1444-1182-F C给药组动物的生存期均超过100天。
实施例5，常用给药剂量下药效、药代和安全性验证试验
5.1、试验材料
实验动物和细胞
试验小鼠：同实施例4
肿瘤细胞：
高表达PDL1的Skov3-PDL1(ATCC)
高表达PDL1的NCI-H226-PDL1(ATCC)
实验过程：同实施例3
BMK-1182CAR-T细胞制备过程参照“CAR-T制备操作步骤”，过程简要说明如下：新鲜或冻存后复苏的PBMCs采用Lonza 4D电转仪进行电转，电转体系为100ul，质粒用量为4ug pNB338B-1444-CAR+4ug pS338B-1182质粒，电转程序为EO-115，传代过程、检测时间及检测指标均与其他CAR-T细胞保持一致。
5.2、接种和给药方案
表21.接种方案及分组
Figure PCTCN2022143407-appb-000036
表22.给药方案及分组(NCI-H226-PDL1)
Figure PCTCN2022143407-appb-000037
表22的药物中，CD19-1182同上述CD19-1182-VHH，Meso3CAR(BMK)同上述BMK-CAR-T，Meso3CAR(BMK)-1182-FC与Meso3CAR(BMK)的区别在于还自分泌1182-FC。
表23.给药方案及分组(Skov3-PDL1)
Figure PCTCN2022143407-appb-000038
5.3、肿瘤体积和体重变化
图34显示阳性对照组和试验组在此给药剂量下均能使肿瘤完全消退。
5.4、PD-1抗体血药浓度变化
结果如图45所示。结果显示自分泌PD1抗体的给药组，所分泌的携带F C段的PD1抗体在体内的药物代谢特点较为相似，随着肿瘤的清除和消退，均表现出先上升 后下降的趋势，并且在两个不同肿瘤的荷瘤小鼠模型中得到验证。并且，在不影响疗效情况下，PD1抗体血药浓度最低，系统性毒副作用产生的风险最小，安全性最高。
5.5、外周血CAR-T细胞数量变化
结果如图46所示，给药后CAR-T细胞出现增殖高峰期，之后随着肿瘤的消退有下降趋势。其中CD3+、CD8+和CAR+细胞的变化趋势接近一致。CAR阳性率在给药后出现短暂下降，之后基本保持稳定。与靶向血液瘤的CD19CAR-T相比，靶向间皮素的CAR-T在外周血中的浓度明显降低，提示这些CAR-T主要位于肿瘤局部而非外周血中，从而实现精准靶向治疗的目的。
实施例6，其他MSLN CAR-T细胞以及自分泌PD1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的体外实验
此实施例中，CAR-T细胞所用的CAR质粒上表达PB酶的表达序列去除，PB酶以mRNA的形式加入电转体系，与质粒一起电转入T细胞以使其表达；PD1抗体分泌型质粒变化：启动子由CMV启动子更换为IFNγ驱动的启动子。
CAR-T制备方法简述：电转体系、电转程序及传代过程均与之前CAR-T制备相同，电转体系中质粒及其他组分添加情况：单质粒6ug+20ug PBase mRNA+200IU RNase抑制剂或双质粒4ug CAR质粒+4ug分泌型质粒+20ug PBase mRNA+200IU RNase抑制剂。
发明人构建了：
含有间皮素纳米抗体MSLN3[1444]的CAR-T细胞(简称1444)、自分泌PD1纳米抗体1194nla(SEQ ID NO:131)的含有间皮素纳米抗体MSLN3[1444]的CAR-T细胞(简称“1444+1194nla”或“1444-1194”)，上述细胞的CAR序列如SEQ ID NO:122所示；以及
含有间皮素纳米抗体MSLN3[2339](SEQ ID NO:103)的CAR-T细胞(简称2339)、自分泌PD1纳米抗体1194nla的含有间皮素纳米抗体MSLN3[2339]的CAR-T细胞(简称“2339+1194nla”或“2339-1194”)，上述细胞的CAR序列如SEQ ID NO:121所示。
结果如图35-38所示：
图35显示，所有CAR-T细胞均能有效增殖，且均具有较高活率(90％以上) 和较高的CAR阳性率；CD3/4/8比例，除Donor 04A偏低外，其余Donor差异较小，约1:1；Tcm和Tem各个Donor差异较小。
图36显示，制备过程中anti-PD1(1194nla)分泌水平较低，0-150ng/ml之间；随着时间推移，1194nla分泌量逐渐减少；1444+1194nla组分泌量与2339+1194nla组分泌量无明显差异。刺激6h后，1194nla分泌量较低，在100ng/ml以下；刺激48后，1194nla分泌量较6h有明显提高；刺激48h后，1444+1194nla组分泌量略高于2339+1194nla组。抗原刺激48h，各组CAR-T细胞产生细胞因子的能力较未刺激前明显升高。1444组和2339组CAR-T产生IL-2，IFNγ和TNFα的能力差异较小，均比BMK(meso3CAR)高。
图37显示，1444组和2339组均能有效杀伤H226-PDL1细胞；对H226-PDL1的杀伤能力，2339组强于1444组；自分泌1194nla对MLSN CAR-T杀伤能力有一定的提升。
图38显示，1444组和2339组均能有效杀伤SKOV3-PDL1细胞；对SKOV3-PDL1的杀伤能力，1444组强于2339组；自分泌1194nla对MLSN CAR-T杀伤能力有一定的提升。
实施例7，其他MSLN CAR-T细胞以及自分泌PD1纳米抗体的MSLN CAR-T细胞的体内量效实验
实验过程
重度免疫缺陷小鼠NPSG小鼠(菲诺克)皮下接种肿瘤细胞1E7的NCI-H226-PDL1，接种大约21天，肿瘤生长至100-120mm 3，进行分组以及静脉CAR-T回输，每组的回输量分为4个剂量梯度(分别为0.2E6，1E6，5E6，20E6)，后续进行药效、体重和存活的观察。每周采集一次外周血，检测外周血中CD3的比例和数量。实验方案如下表和图39所示。
组别 小鼠数目 药物 剂量(10^6)
1 6 Vehicle ‐‐
2 6 MOCK‐T 0.2
3 6 2339‐1194 0.2
4 6 1444‐1194 0.2
5 6 MOCK‐T 1
6 6 2339‐1194 1
7 6 1444‐1194 1
8 6 MOCK‐T 5
9 6 2339‐1194 5
10 6 1444‐1194 5
11 6 MOCK‐T 20
12 6 2339‐1194 20
13 6 1444‐1194 20
实验结果如图40-43所示。
图40显示，2339-1194和1444-1194在不同的剂量下(1E6,5E6和20E6)可以抑制肿瘤的生长，抑制率超过70％。2339-1194和1444-1194抑瘤作用相当。
图41显示，在不同的给药剂量下，小鼠的体重变化在20％范围之内，安全性良好。2339-1194和1444-1194在体重变化和生存率方面没有明显差异。
图42显示，外周血CD3+T细胞在14天时达到峰值，21天时降至低谷，此时肿瘤已基本消退。
图43显示，CAR-T回输14天时，外周血CAR+比例在不同的给药剂量下相对稳定(60％-70％之间)。
结论
自分泌PD1抗体的MSLN CAR-T细胞可以分泌PD1抗体以及表达靶向间皮素抗原的嵌合抗原受体。它同时具备自分泌免疫检查点抗体的能力和靶向特定抗原的特异性杀伤能力，比普通的CAR-T细胞分泌细胞因子的能力更强，杀伤率更高。

Claims (11)

  1. 一种嵌合抗原受体，其抗原结合域包括含抗间皮素单域抗体的间皮素结合分子，
    优选地，所述抗间皮素单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，其中，
    SEQ ID NO:1是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11，其中，X 1为G、E、T或A，X 2为S、N、P、A、H、D、K、I或F，X 3为I、S、V、T、D、L、A、M或H，X 4为F、S、I、A、L或G，X 5为N、S、G、A、D、T、E、R或H，X 6为I、L、F、Y、E或N，X 7为N、A、G、D、K、Y、L或S，X 8为A、Y、V、D或N，X 9为E或无、X 10为F或无、X 11为A或无，
    SEQ ID NO:2是X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12，其中，X 1为I、M、A、T或L，X 2为S、G、N、D、T或V，X 3为S、N、A、R、G或T，X 4为S、T、G、D或N，X 5为N、G、T或I，X 6为S、R、N、D、K、T或G，X 7为D、T、S、I或K，X 8为N、T、G、D或无，X 9为T、K、G或无，X 10为G、R或无，X 11为V、T或无，X 12为T或无，
    SEQ ID NO:3是
    X 1X 2X 3X 4X 5X 6X 7X 8X 9X 10X 11X 12X 13X 14X 15X 16X 17X 18X 19X 20X 21X 22X 23，其中，X 1为N、H、A或Q，X 2为L、A、G或V，X 3为S、R、E、G、D或T，X 4为N、A、R、G、D、K、V、T、I、E或Q，X 5为Y、F、K、S、C、I、D、G、H或R，X 6为D、A、V、G、R、N、P、T、C、Q或S，X 7为R、Y、T、A、D、K、L、E、S或G，X 8为K、S、F、T、D、Q、E、G、P、R、Y或N，X 9为D、G、I、H、S、Y、Q、K、T、R或V，X 10为R、Y、H、N、T、D、P、V、K、C、L或S，X 11为Y、D、E、P、F、S、L、I或无，X 12为P、V、Q、A、Y、F、N、D、R或无，X 13为D、A、Y、V、Q、P或无，X 14为Y、L、P、A、E或无，X 15为C、S、M、P、T或无，X 16为V、D、S、Y或无，X 17为L、F、V、D或无，X 18为R、G、M、S或无，X 19为D、N、S或无，X 20为Y、L或无，X 21为Y或无，X 22为A或无，X 23为D或无；
    优选地，所述嵌合抗原受体包括含抗间皮素单域抗体的间皮素结合分子、铰链区、跨膜区、胞内区。
  2. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述间皮素结合分子是包含一条、两条或多条所述单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
  3. 如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
    抗间皮素单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-27、73中任一所示的序列；和/或
    抗间皮素单域抗体的CDR2包含SEQ ID NO:28-47、74中任一所示的序列；和/或
    抗间皮素单域抗体的CDR3包含SEQ ID NO:48-72、75中任一所示的序列。
  4. 如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还具有选自以下的一项或多项特征：
    所述信号肽包括CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，
    所述铰链区包括CD8铰链区、IgD铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，
    所述跨膜区包括CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区或DAP10跨膜区，
    所述胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域，
    所述胞内共刺激域包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)或DNAX激活蛋白10的胞内结构域，
    所述胞内信号域包括CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。
  5. 一种核酸分子，包含选自以下的序列：
    (1)权利要求1-4中任一项所述嵌合抗原受体的编码序列，
    (2)(1)的互补序列，和
    (3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段，
    优选地，
    所述片段是引物，和/或
    所述编码序列是DNA或RNA。
  6. 一种核酸构建物，其包含权利要求5所述的核酸分子，
    优选地，所述核酸构建物还包含选自以下的一项或多项特征：
    所述核酸构建物还包含PD-1结合分子的编码序列，
    所述核酸构建物还包含转座酶的编码序列，所述转座酶用于转座嵌合抗原受体和/或PD-1结合分子的编码序列，
    转座酶的编码序列是DNA或RNA，
    PD-1结合分子的编码序列是DNA或RNA，
    核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体，
    所述转座酶是PiggyBac转座酶。
  7. 一种编码序列的组合，包含权利要求1-4任一项所述嵌合抗原受体的编码序列，还包含转座酶的编码序列和/或PD-1结合分子的编码序列，优选地，所述编码序列是DNA或RNA，所述转座酶是PiggyBac转座酶。
  8. 一种细胞，所述细胞：
    (1)(a)包含和/或表达权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体，并且任选地(b)包含、表达和/或分泌PD-1结合分子，和/或
    (2)包含权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求6所述的核酸构建物，和/或
    (3)包含权利要求7所述的编码序列组合；
    优选地，所述细胞是T细胞。
  9. 一种药物组合物，含有药学上可接受的辅料和：
    (1)(i)权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(ii)转座酶和/或其编码序列，和/或(iii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
    (2)权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的核酸构建物、权利要求7所述的编码序列的组合、或权利要求8所述的细胞。
  10. 试剂在制备活化的免疫细胞中的应用，所述试剂含有：
    (1)(i)权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(ii)转座酶和/或其编码序列，和/或(iii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
    (2)权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的核酸构建物或权利要求7编码序列的组合。
  11. 试剂在制备治疗癌症的药物中的应用，所述试剂含有：
    (1)(i)权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体和/或其编码序列，任选还包含(ii)转座酶和/或其编码序列，和/或(iii)PD-1结合分子和/或其编码序列，或
    (2)权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的核酸构建物、权利要求7所述的编码序列的组合、或权利要求8所述的细胞，
    优选地，所述癌症包括间皮素介导的癌症，任选还包括PD-1介导的癌症，
    更优选地，所述癌症选自：间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、肺腺癌、胃癌、黑色素瘤、肺癌、头颈部癌、肾细胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤。
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