CN115717125A - 同种异体t细胞、其制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过在T细胞中表达相关功能蛋白，下调细胞表面TCR分子，从而制备得到移植物抗宿主反应减轻的同种异体T细胞。

Description

同种异体T细胞、其制备及应用

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及下调细胞表面TCR的同种异体T细胞、其制备及应用。

背景技术

同种异体T细胞具有多种临床用途，如同种异体的嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigen receptor-T，CAR-T)细胞和T佐剂细胞。随着肿瘤治疗的发展，CAR-T免疫疗法逐渐成为备受关注的治疗手段。CAR-T细胞所表达的CAR一般包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号传导域。通常CAR-T细胞是由患者T细胞经CAR基因转导并扩增而来，最后再回输到该患者体内。CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，而不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制。目前，美国FDA已经批准了两款自体CAR-T细胞产品上市，分别是诺华的Kymriah和凯特的YesCAR-Ta，用于难治性复发性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的治疗。相关临床试验证明，CAR-T作为个性化的活细胞药物极具抗肿瘤潜力(Maude et al.2018；Park et al.2018；Schuster etal.2017；)。

上述两款CAR-T药物的制备及回输策略均是采集患者自体的外周血，分离得到T细胞，通过病毒载体将CAR的编码基因整合到T细胞的基因组上，然后进行扩大培养，最后回输到患者体内。这种完全个体化的CAR-T细胞生产不仅生产周期长，成本较高，而且也给回输治疗带来许多不确定因素。例如，分离得到的T细胞数量不足或功能失常导致的CAR-T细胞制备失败、细胞制备中患者疾病快速进展而失去治疗窗口等。因此，CAR-T领域的一个共同奋斗目标是利用合适健康供者的外周血T细胞来制备即用型(off-the-shelf)同种异体CAR-T细胞，可以有效避免或解决上述生产和治疗相关问题。

制备同种异体CAR-T细胞，首先需要解决一个重大安全难题，即移植物对宿主的排斥反应。“排斥反应”包括移植物抗宿主反应(graft-versus-host disease，GVHD)。移植物抗宿主反应是移植物中同种异型反应性T细胞识别宿主同种异型组织抗原而诱发的针对受者正常组织和器官的免疫排斥反应，严重时会致命。移植物抗宿主反应是通过异体T细胞表面的TCR(T cell receptor，TCR)介导的。TCR为所有成熟T细胞表面的特征性标志。TCR以非共价键在胞内与多个CD3亚基结合并组装，最终在细胞表面以TCR-CD3抗原识别复合物的形式存在。

下调细胞表面TCR-CD3的一个手段是利用功能蛋白。Sullivan等发现HHV-6a，HHV-6b和HHV-7的U24蛋白均在肿瘤T细胞Jurkat中具有较好的有效地下调细胞表面TCR和CD3e的能力蛋白水平，且三者的活性无显著性差异性(Sullivan et al.2008；Sullivan etal.2010)。但是，这三个U24蛋白是否能下调人原代T细胞的表面TCR/CD3水平，并长期保持，而且不影响同种异体T细胞的其它活性(如CAR蛋白活性；免疫表型，扩增能力等)，目前无人研究。本领域尚未发现可以高效表达活性分子同时利用病毒蛋白下调细胞表面TCR的方法和细胞。

发明内容

为此，本发明提供一种T细胞，该T细胞表达感兴趣的活性分子和下调细胞表面TCR的功能蛋白。

在一个或多个实施方案中，该T细胞的细胞表面TCR分子的表达水平低于表达相同活性分子但未表达所述功能蛋白的对照CAR-T细胞。

在一个或多个实施方案中，所述T细胞含有所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列；优选地，所述T细胞含有所述活性分子的表达框和所述功能蛋白的表达框，或所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于同一表达框内。

在一个或多个实施方案中，所述活性分子是嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体特异性结合选自以下的肿瘤抗原中的一种或多种：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段，以及CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。

在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自β疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)病毒。

在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)病毒。

在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒。

在一个或多个实施方案中，所述下调细胞表面TCR的功能蛋白选自：HHV-6a、HHV-6b、HHV-7中能直接靶向抑制TCR分子表达的功能蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白是U24蛋白或与其具有至少70％相同性的突变体。

在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白选自：来自HHV-6a的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体、来自HHV-6b的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体和来自HHV-7的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体。

在一个或多个实施方案中，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸，第9位为脯氨酸，第11位为酪氨酸，第14位为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸，第31位为谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，第83位为氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸，第87位为赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸。

在一个或多个实施方案中，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸、第14位为丙氨酸、第31位为天冬酰胺、第83位异亮氨酸、第87位为甘氨酸。

在一个或多个实施方案中，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第14位为丙氨酸、第31位为天冬酰胺、第83位为异亮氨酸、第87位为甘氨酸。

在一个或多个实施方案中，来自HHV-6b的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸。

在一个或多个实施方案中，来自HHV-7的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第7位为脯氨酸、第8位为脯氨酸、第10位为酪氨酸。

本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子选自：

(1)含活性分子的编码序列和下调细胞表面TCR的功能蛋白的编码序列的核酸分子；

(2)(1)所述核酸分子的互补序列；和

(3)(1)或(2)的片段。

在一个或多个实施方案中，所述活性分子和所述功能蛋白如本文任一实施方案所述。

本发明还提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的核酸分子。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有所述活性分子的表达框和所述功能蛋白的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于该表达框内。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

本发明还提供一种慢病毒，其含有本文所述的核酸构建物。

本发明还提供一种宿主细胞，其含有本文所述的核酸分子、核酸构建物或慢病毒。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文任一实施方案所述的T细胞。

本发明还提供本文任一实施方案所述的功能蛋白或其编码序列在制备其细胞表面的TCR分子的表达下调的T细胞中的应用，或在制备癌症治疗用的T细胞中的应用。

本发明还提供一种抑制T细胞表面表达TCR的方法，所述方法包括在T细胞内同时表达本文任一实施方案所述的活性分子和功能蛋白的步骤。

附图说明

图1：各组慢病毒转染T细胞，体外培养T细胞至第9天，流式细胞术检测CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体TCR或CD3平均荧光强度。

图2：各组慢病毒转染T细胞，体外培养T细胞至第11天，流式细胞术检测CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体TCR或CD3平均荧光强度。

图3：各组慢病毒转染T细胞，体外培养T细胞至第23天，流式细胞术检测CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体TCR或CD3平均荧光强度。

图4：各组T细胞体外扩增倍数，PCTL396相比对照组无差异，PCTL292相比对照增加2倍以上。

图5：各组T细胞杀伤效率，与对照组无差异。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

发明人发现，在原代T细胞中HHV-6a和HHV-6b的U24蛋白具有下调TCR的活性，且HHV-6b的U24蛋白在CAR-T扩增后期能更优地维持下调TCR的作用；相比而言，HHV-7的U24蛋白在原代T细胞上完全无下调TCR的功能。另外，发明人发现转导HHV-6a U24组的CAR-T细胞比对照组以及转导HHV-6b U24组的CAR-T细胞扩增明显加快。这些意外发现对于根据不同的用途，来选择合适的U24蛋白制备同种异体T细胞药物，具有重大指导意义。

因此，本发明通过表达相关功能蛋白下调细胞表面TCR分子和感兴趣的活性分子，制备能抑制细胞表面TCR分子的表达的同种异体T细胞。采用本发明方法制备得到的T细胞中，TCR的表面表达被抑制，这些T细胞有效地避免了移植物抗宿主反应，与宿主间的排斥反应被消除或降低。

本文所述“活性分子”指在细胞(特别是T细胞)中表达后发挥相应功能的分子，包括但不限于：来源于病毒、细菌、植物、动物的蛋白或多肽、小分子活性肽、抗原或其片段(例如抗原表位、抗原决定簇)、抗体或其片段(例如重链、轻链、Fab、Fv、scFv)、抗原受体(例如嵌合抗原受体CAR)、融和蛋白或多肽等。

在表达一些靶点抗原时，本发明T细胞可以是免疫佐剂。免疫佐剂又称免疫增生剂，其同抗原一起或预先注入机体内，能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型。

在活性分子是嵌合抗原受体的实施方式中，本发明T细胞是CAR-T细胞。本文所述CAR-T细胞包含靶向感兴趣肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)和下调细胞表面TCR的功能蛋白或其功能片段。本发明还提供一类CAR-T细胞，该类细胞含有编码靶向感兴趣肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子与编码下调细胞表面TCR的功能蛋白的核酸分子。

本文中，合适的T细胞可以是本领域周知的各种T细胞，尤其是细胞免疫疗法中常规使用的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞等，以及上述细胞的任意一种或多种的混合物。本文中，CAR-T细胞指至少表达嵌合抗原受体的T细胞。

本文中，嵌合抗原受体具有本领域周知的含义，它是一种人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原并杀死肿瘤细胞。

适用于本文的嵌合抗原受体可以是本领域周知的各种CAR。通常，CAR依次包含结合肿瘤抗原的多肽、铰链区、跨膜区和一个或多个胞内信号区。结合肿瘤抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。本文所述“肿瘤抗原”或“肿瘤表面抗原”包括在肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。肿瘤特异性抗原特异性地在肿瘤细胞表面表达，在正常组织中无表达。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞表面过度表达，在正常组织中低表达。肿瘤相关抗原包括：免疫细胞的表面抗原，例如CD19；参与生长和分化信号的抗原；参与肿瘤血管生成的抗原；和肿瘤支撑结构的肿瘤间质和细胞外基质抗原。

本文中，感兴趣的肿瘤抗原包括但不限于实体瘤抗原、髓系肿瘤抗原以及非B细胞谱系血液肿瘤的抗原。合适的实体瘤抗原包括但不限于EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白(Legumain)、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段。合适的B细胞抗原包括但不限于CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。

在优选的实施方案中，本发明结合肿瘤抗原的多肽是特异性结合上述任一种肿瘤抗原的单链抗体。本文中，单链抗体(scFv)指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成的具有结合抗原能力的抗体片段。感兴趣的单链抗体可来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。本文中，特异性结合是指抗体或其抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。

适用于本发明的抗肿瘤抗原的抗体可衍生自本领域周知的各种抗肿瘤抗原的单链抗体。单链抗体可含有感兴趣抗体的重链可变区和轻链可变区，或由重链可变区和轻链可变区以及任选的接头组成。重链可变区和轻链可变区之间可通过熟知的接头连接。本文中，接头或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及Furin 2A肽(F2A)。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3-25个氨基酸残基，例如3-15、5-15、10-20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-20个，例如2-15、2-10、2-8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。接头长度通常为15-20个氨基酸。在某些实施方案中，本发明不同蛋白或多肽之间由(GGGS)n连接，其中n为1～5的整数。在某些实施方案中，本发明单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由(GGGS)n连接，其中n为1～5的整数。在某些实施方案中，本发明单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由GSTSGGGSGGGSGGGGSS连接。

在某些实施方案中，感兴趣的肿瘤抗原是CD19，感兴趣的单链抗体是特异性结合CD19的单链抗体。在一个或多个实施方案中，抗CD19单链抗体源自FMC63。示例性地，抗CD19单链抗体的轻链可变区序列包含SEQ ID NO:1第23-129位氨基酸或由其组成；抗CD19单链抗体的重链可变区序列包含SEQ ID NO:1第148-267位氨基酸或由其组成，其中，重链可变区和轻链可变区通过含G和S的接头序列连接。示例性的特异性结合CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第23-267位氨基酸残基所示，

CAR中所含的其它部分，如铰链区、跨膜区和胞内信号区可以是常规用于构建各类CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区。

本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本发明CAR的铰链区本领域周知。适用于本文的铰链区可选自CD8α铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4胞外铰链区。在一个或多个实施方案中，铰链区是人CD8α铰链区。所述人CD8α铰链区可衍生自本领域周知的CD8α多肽链。示例性地，人CD8α铰链区的序列包含SEQ ID NO:1第268-312位氨基酸或由其组成。

适用于本发明CAR的跨膜区本领域周知。本文中，跨膜区可选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种或多种。在一个或多个实施方案中，跨膜区是人CD8跨膜区。所述人CD8跨膜区可衍生自本领域周知的CD8蛋白。示例性地，人CD8跨膜区的序列包含SEQ ID NO:1第313-336位氨基酸或由其组成。

适用于本发明CAR的一个或多个胞内区本领域周知。本文中，胞内信号区可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和Fc310/中的任意一种或多种的胞内区。在一个或多个实施方案中，胞内区包含41BB胞内区和/或人CD3胞内区。所述41BB胞内区和CD3胞内区可分别衍生自本领域周知的41BB和CD3蛋白。示例性地，41BB胞内区的序列包含SEQ ID NO:1第337-378位氨基酸或由其组成；CD3胞内区的序列包含SEQ ID NO:1第379-490位氨基酸或由其组成。

嵌合抗原受体还可包括信号肽。信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列。信号肽可以是膜蛋白信号肽，如CD8信号肽、CD28信号肽和CD4信号肽。示例性的信号肽氨基酸序列可包含SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基或由其组成。

因此，本发明嵌合抗原受体的氨基酸序列，从N端到C端，通常为任选的信号肽、靶向感兴趣肿瘤抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区和一个或多胞内信号区。示例性的嵌合抗原受体的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1第23-490位氨基酸残基或由其组成，或者包含SEQ IDNO:1第1-490位氨基酸残基或由其组成。

形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区和胞内信号区等，相互之间可直接连接，或者可通过本领域周知的接头序列连接，例如前文所述的含G和S的接头序列。

本文中，下调细胞表面TCR的功能蛋白是病毒蛋白。所述功能蛋白可来自疱疹病毒科(Herpesviridae)。在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、β疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)和/或γ疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)。在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自选自下述的病毒：单纯疱疹病毒属(Simplexvirus)、水痘病毒属(Varicellovirus)、传染性喉气管炎病毒属(Iltovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、老鼠细胞巨大型病毒属(Muromegalovirus)、玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)、马立克病毒属(Mardivirus)、淋巴隐伏病毒属(Lymphocryptovirus)、猴病毒属(Rhadinovirus)和鱼疱疹病毒属(Ictalurivirus)。在一个或多个实施方案中，所述功能蛋白来自单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、HHV(人疱疹病毒)-6a、HHV-6b、HHV-7、HHV-8或EB病毒。优选地，所述功能蛋白是来自诸如HHV-6a、HHV-6b、HHV-7的病毒蛋白。

优选的功能蛋白是能直接靶向抑制TCR分子表达的功能蛋白。示例性的优选蛋白包括但不限于U24。在一个或多个实施方案中，所述U24来自上述病毒。在一个或多个实施方案中，所述U24来自HHV-6a、HHV-6b或HHV-7。在某些实施方案中，本发明使用来自HHV-6a的蛋白U24或与其具有70％相同性的同源物。来自HHV-6a的蛋白U24的氨基酸序列可如SEQ IDNO:1第516-602位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，本发明使用来自HHV-6b的蛋白U24或与其具有70％相同性的同源物或突变体。来自HHV-6b的蛋白U24的氨基酸序列可如SEQID NO:3第516-603位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，本发明使用来自HHV-7的蛋白U24或与其具有70％相同性的同源物。来自HHV-7的蛋白U24的氨基酸序列可如SEQ ID NO:4第516-597位氨基酸残基所示。

本发明也包括所述活性分子、多肽或蛋白的突变体。所述突变体包括：与参照序列具有至少70％，至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性(如活化T细胞、结合TCR、抑制TCR表达)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在所述氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该参照序列的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

示例性地，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸，第9位为脯氨酸，第11位为酪氨酸，第14位为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸，第31位为谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸，第83位为氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸，第87位为赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸。示例性地，来自HHV-6b的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸。示例性地，来自HHV-7的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第7位为脯氨酸、第8位为脯氨酸、第10位为酪氨酸。

本发明的活性分子(例如嵌合抗原受体)和下调细胞表面TCR的功能蛋白或多肽之间可直接连接，或者可通过接头序列连接，例如前文所述的含G和S的接头序列。或者，活性分子和下调细胞表面TCR的功能蛋白或多肽之间还包含能够在单个载体上表达多个多顺反子的连接序列，例如2A肽。本领域周知，2A肽是一种能诱导蛋白自剪切的短肽，包括F2A、P2A、T2A肽等。在一个或多个实施方案中，2A肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1第494-515位氨基酸或由其组成。2A肽也可通过常规的含G和S的接头与两侧的多肽相连。

本发明包括编码本发明所述多肽或蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本文所述核酸分子包括经密码子优化而发生变化的序列，只要核酸分子所编码的氨基酸序列不变即可。经密码子优化的序列可对具体物种表现出更适合的表达性。本领域周知对核酸分子序列进行密码子优化的方法。

本发明的核酸分子可以是活性分子例如CAR的编码序列和下调细胞表面TCR的功能蛋白的编码序列，或者是活性分子的表达框和该功能蛋白的表达框。本文中，编码序列指核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR、单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内信号区或病毒蛋白)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。本文中，表达框指表达感兴趣基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和PolyA加尾信号序列。本文所述的核酸分子可以是独立的两个核酸分子，分别含活性分子的编码序列和含所述功能蛋白的编码序列，如分别是活性分子的表达框和功能蛋白的表达框；或者，所述含活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列可经由接头连接为一个核酸分子，如活性分子的编码序列和功能蛋白的编码序列在同一表达框内，或者是两个表达框经由合适的接头连接为同一核酸分子。在某些实施方案中，本发明的核酸分子为活性分子的编码序列和功能蛋白的编码序列同处一表达框的核酸分子，其含有启动子、编码所述活性分子和功能蛋白的核酸序列以及PolyA加尾信号。

在某些实施方案中，所述编码序列或表达框整合到T细胞的基因组中。因此，在这些实施方案中，本文所述的T细胞的基因组中稳定整合了包含编码本文所述活性分子和功能蛋白的表达框。

在一个或多个实施方案中，本发明的核酸分子含有下述序列的编码序列或其互补序列：抗肿瘤抗原的单链抗体、人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB胞内区、人CD3胞内区、F2A肽、下调TCR表达的病毒蛋白。在一个或多个实施方案中，本发明核酸分子包含以下核酸序列或由其组成：(1)SEQ ID NO:2第67-2397位核苷酸或SEQ ID NO:2；(2)SEQ ID NO:3第23-603位氨基酸的编码序列或SEQ ID NO:3的编码序列；(3)SEQ ID NO:4第23-597位氨基酸的编码序列或SEQ ID NO:4的编码序列；(4)(1)、(2)或(3)的互补序列。

在某些实施方案中，所述核酸分子是核酸构建物，其含有本文所述活性分子和/或功能蛋白的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸可以多种方式被操作以保证活性分子和下调TCR的功能蛋白或多肽的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5’末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，或者是同源重组载体。具体而言，可将本文活性分子和/或功能蛋白的编码序列克隆入许多类型的载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。克隆载体可用于提供本发明活性分子与功能蛋白的编码序列，如含活性分子的编码序列与功能蛋白的编码序列的一个核酸分子。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。通常通过可操作地连接本发明的编码序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒等。同源重组载体用于将本文所述的表达框整合到宿主基因组中。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，当使用逆转录病毒载体时，逆转录病毒载体通常含有复制起始位点、3’LTR、5’LTR、本文所述的编码序列以及任选的可选择的标记。

合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列、延伸生长因子-1α(EF-1α)、类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子等。

为了评估活性分子或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

本文所述的多核苷酸通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。或者，也可直接合成本文所述的核酸分子。

本文示例性的含活性分子例如CAR与功能蛋白的编码序列的核酸分子的核苷酸序列可如SEQ ID NO:2所示。将本文的核酸分子引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。核酸分子如载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。慢病毒是逆转录病毒科下的属。慢病毒载体是一种较复杂的逆转录病毒载体。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的慢病毒，其包括本文所述的表达框，并能将本文所述的表达框整合到宿主细胞的基因组中。在一个或多个实施方案中，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol、vsvg和/或rev。可采用本领域周知的方法制备本文所述的慢病毒。例如，首先制备得到含有本文所述表达框的慢病毒载体，然后在合适的宿主细胞中进行病毒包装，并分离纯化得到所需的慢病毒。用于慢病毒包装的试剂为本领域所周知，如常规的慢病毒载体系统(Tronolab)包括pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的干扰质粒。

本文所述，宿主细胞含有本文所述的核酸分子。宿主细胞既包括最终用于疾病治疗目的的T细胞，也包括生产T细胞(例如CAR-T细胞)过程中使用到的各种细胞，如大肠杆菌细胞，以用于如提供本发明蛋白的编码序列或提供本文所述的载体。在某些实施方案中，本文提供一种稳定表达本文所述功能蛋白的T细胞(例如CAR-T细胞)。

适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基中进行培养备用。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸，或含有本文所述的慢病毒载体，或感染了本文所述的慢病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的活性分子例如CAR和功能蛋白或多肽。

本文还包括一种T细胞培养物，该培养物含有本文所述的T细胞以及合适的培养基。培养基可以是本领域常规用于培养T细胞的培养基。

本文还提供一种药物组合物，该药物组合物中含有本文所述的T细胞以及药学上可接受的辅料。本文中，药学上可接受的辅料是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于T细胞给药的辅料。

通常，药物组合物中含有治疗有效量的T细胞。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。

本发明还包括一种细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的活性分子(例如CAR)和功能蛋白或多肽，和给对象施用T细胞。施用的T细胞能够杀死或协助杀死接受者的肿瘤细胞。例如，免疫佐剂T细胞可以增强机体对抗原的免疫应答能力。又如，由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

本文中，适合使用本文所述的活性分子(例如CAR)、功能蛋白或多肽、核酸分子、病毒、T细胞以及药物组合物治疗的疾病与所述核酸分子以及T细胞所表达的嵌合抗原受体中的单链抗体有关。因此，本文所述的疾病包括与前文所述的肿瘤抗原相关的各类癌症，包括实体瘤和血液肿瘤，如腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌和前列腺癌等实体瘤，以及白血病和淋巴瘤，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病等。在肿瘤抗原是CD19的实施方案中，可采用本文所述的包含抗CD19单链抗体的CAR、功能蛋白或多肽、它们的编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒或CAR-T细胞治疗的疾病优选为CD19介导的疾病；例如急性/慢性B系淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤等。

本发明的T细胞可被单独施用或作为药物组合物施用。本发明的细胞或药物组合物可以以适于治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由各种因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗肿瘤抗原介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

在某些实施方案中，本文还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的载体。试剂盒还可含有适用于将所述载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转染入细胞的说明书。

本发明采用抗CD19抗体(具体是衍生自克隆号FMC63的scFV)的基因序列作为示例，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB胞内区、人CD3胞内区和下调TCR表达的功能蛋白等序列信息，全基因合成嵌合抗原受体的基因片段，插入到慢病毒载体中。重组质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转化方法是基于慢病毒转化方法。该方法具有转化效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上。本发明制备的T细胞表面基本不表达TCR，与宿主的排斥反应降低。

下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

仪器和材料：

仪器：生物安全柜(海尔、HR40-IIA2)，CO₂培养箱(Thermo、3111)，流式细胞仪(BD、FACSCantoll)，酶标仪(Molecular Derices、SpectraMax M4)

试剂：Anti-CD3抗体(BV421)(Biolegend、300434)，Anti-TCR抗体(PE-Cy7)(Biolegend、306720)，FBS(Lonsera、S711-001S)，X-vivo15(Lonza、04-418Q)，DynabeadsCD3/CD28(Lifetechnology、40203D)，Ficoll(达优、DKW-LSH-0250)，Tscm(Novoprotein，GMP-1647)，Novonectin(Novoprotein、GMP-1647)，抗人CCR7(BV421)(BD、562555)，抗人CD45RA(PE-Cy7)(BD、560675)，Luciferase检测(Promega、E6120)，抗人CD3(FITC)(BD、562555)，CAR19-ideotype(自标)。

实施例1，载体构建

1.从NCBI网站数据库搜索到人CD8α铰链区、人CD8跨膜区、41BB胞内区、人CD3、和HHV-6a U24、HHV-6b U24、HHV-7U24基因序列信息，抗CD19单链抗体克隆号为FMC63，这些序列在网站https://www.thermofisher.com/order/geneartgenes上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

2.采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD19-scFv基因、人CD8铰链区基因、人CD8跨膜区基因、41BB胞内区基因、人CD3胞内区、F2A和HHV-6aU24或HHV-6b U24或HHV-7U24基因序列进行连接，形成完整的基因序列信息。其中CD19-CAR-F2A-HHV-6a U24包含SEQ ID NO:2所示序列，CD19-CAR-F2A-HHV-6b U24包含SEQ ID NO:3所示序列的编码序列，CD19-CAR-F2A-HHV-7U24其包含SEQ ID NO:4所示序列的编码序列。

3.该CAR分子的核苷酸序列经无缝克隆到慢病毒质粒pWPXL(Addgene)的Bamh1-Ecor1位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。

4.将重组质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的CD19-CAR-F2A-HHV-6a U24或CD19-CAR-F2A-HHV-6b U24或CD19-CAR-F2A-HHV-7U24序列比对来验证序列是否正确。测序引物为

正义引物：TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID NO:5)

反义引物：GGCATTAAAGCAGCGTATCCAC(SEQ ID NO:6)。

实施例2，病毒包装

经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，采用磷酸钙法将纯化的质粒转染293T细胞，进行慢病毒包装实验(Molecular Therapy-Methods&Clinical Development,2016,3:16017)，由此制备得到的慢病毒命名为PCTL292(CD19-CAR-F2A-HHV-6a U24)，PCTL396(CD19-CAR-F2A-HHV-6b U24)，PCTL397(CD19-CAR-F2A-HHV-7U24)。

采用相同的方法，用绿色荧光蛋白GFP替换上述质粒中的病毒蛋白，制备得到慢病毒PCTL135(CAR19-F2A-GFP)作为对照。

实施例3，PBMC以及T细胞的分离

选择HBV、HCV和HIV检测阴性的健康供者，肘正中静脉抽血100ml，Ficoll密度梯度离心分离PBMC白膜层，根据全血流式检测CD3+T细胞百分比，计算CD3+T细胞数，按DynaBeads CD3/CD28与CD3+T细胞比例3：1，吸取使用量磁珠，与白膜层细胞孵育30min，分离CD3+T细胞，CD3+T细胞经Dynabeads CD3/CD28(Lifetechnology、40203D)活化24小时后流式检测CD25+CD69+T细胞比例。

实施例4，慢病毒转导和T细胞培养

CD3+T活化后，进行慢病毒转导。用Novonectin包被24孔板37℃孵育2小时，将细胞悬液与分别与前述制备得到的各种慢病毒(MOI＝8)、F108(10ug/ml)、Tscm(2U/ml)配置成转导体系置于包被的24孔板中，细胞密度调整至1.0E+06/ml，500g离心30min，离心后37℃CO₂培养箱静置培养48h。转染后以含5％FBS Xvivo15培养液培养，隔日补充Tscm(终浓度2U/ml)，计数细胞，调整细胞密度至0.5E+06/ml，培养至9、11、23天数。

实施例5，CAR阳性率以及CAR+T细胞TCR或CD3平均荧光强度

计数各组CAR-T细胞，分别取5.0E+05细胞于不同1.5ml EP管，2000rpm，5min离心收集细胞，弃去培养液，用无菌4％BSA重悬洗涤细胞2次，后用100ul 4％BSA重悬细胞，每管细胞加入抗人TCR或CD3抗体8ul，旋涡混匀，4℃孵育30min；染色完毕，重复洗涤细胞，将CAR19-ideotype抗体1：500稀释，用稀释后的抗体溶液重悬细胞，每管200ul，旋涡混匀，4℃孵育30min，染色完毕，重复洗涤细胞，500ul 4％BSA重悬细胞，每管加入7AAD抗体4ul，旋涡混匀，常温避光孵育10min，孵育完成后，转移至流式管，流式检测CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体TCR或CD3平均荧光强度。结果如图1-3所示。

图1-3分别是T细胞培养至第9天(图1)、11天(图2)、23天(图3)的CAR19转染效率以及CAR19+T细胞群体TCR或CD3平均荧光强度。可以看出，PCTL292(HHV-6a U24)和PCTL396(HHV-6b U24)均具有制备TCR分子表达下调的CAR-T细胞的能力，其中PCTL396的下调TCR的能力略强于PCTL292。

实施例6，T细胞体外扩增分析

各组慢病毒转染的T细胞，体外培养T细胞至第4，7，9，11，14，17天，计算细胞增殖倍数(检测当天细胞数/用于转染的细胞数)。

结果如图4所示。PCTL396 T细胞相比对照组无差异，PCTL292 T细胞的扩增能力相比对照增加2倍以上。

实施例7，细胞杀伤

1.取出NC-T(未进行慢病毒转染的T细胞)、各组CAR-T细胞，于显微镜下观察细胞生长状态是否正常，吹打混匀，将NC-T、各组CAR-T细胞收集于离心管中，计数细胞，离心收集细胞，用T细胞培养液X-VIVO15(不含Tscm)重悬离心收集的细胞沉淀，并将细胞密度调整至5.0E+07细胞/mL。

2.取出靶细胞，于显微镜下观察细胞状态是否正常，将靶细胞分别收集于15mL或50mL离心管中，并计数细胞，用RPMI 1640(不含FBS)重悬离心收集的细胞沉淀，并将细胞密度调整至5.0E+06细胞/mL。

3.于1.5mL离心管中将上述调整好密度的效应细胞NC-T和CAR-T分别与靶细胞按不同效靶比(1:1、2.5:1、5:1、10:1、20:1)混合，用X-VIVO15将总体积补足200积补(靶细胞10ul，效应细胞量根据效靶比确定)，将上述配制的200配制杀伤体系分别移入96孔V型板中共孵育24小时后，轻轻吹打混匀96孔板V型板中各孔细胞，并分别转移100μ0细胞悬液入白壁底不透96孔板中，加入80μL ONE-Glo^TMLuciferase Assay Substrate，吹吸混匀，室温避光孵育10分钟后上Luminoskan Ascent化学发光分析仪检测荧光素酶报告基因的荧光强度。

结果如图5所示，各组TCR分子表达下调T细胞的肿瘤杀伤能力与对照(PCTL135)相比没有差异，各组均显示了高体外肿瘤细胞杀伤能力。

实施例8，突变文库的筛选

1)Sullivan等发现HHV-6a，HHV-6b和HHV-7的U24蛋白通过影响细胞的内体循环从而抑制了细胞表面TCR的表达，同时也影响到了细胞表面转铁蛋白受体的表达。为了增强U24蛋白下调TCR的特异性，选取PCTL292和PCTL396的U24进行核酸随机突变以找寻只下调细胞表面TCR，但不下调转铁蛋白受体的U24突变体。

2)设计引物进行上述突变文库的构建。按照实施例1和实施例2的方法制备得到慢病毒PCTL292和PCTL396突变体文库。

3)按照实施例3和实施例4的方法制备得到PCTL292和PCTL396突变T细胞文库。

4)按照实施例5的方法检测PCTL292和PCTL396突变T细胞文库的TCR和CD3的表达情况，以及转铁蛋白受体的表达。

5)流式分选出只下调细胞表面TCR，但不下调转铁蛋白受体的T细胞克隆，并进行基因组高通量测序以确定最终的突变文库结果。

表1显示从PCTL292文库中筛选得到的突变体。

表1

	突变氨基酸	占比
			野生型		85％
突变体1	V14A,D31N	5％
			突变体2	N83I	5％
突变体3	R87G	5％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州方德门达新药开发有限公司

<120> 同种异体T细胞、其制备及应用

<130> 198069

<141> 2021-08-25

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 602

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

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<211> 1809

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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accagatga 1809

<210> 3

<211> 603

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

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1 5 10 15

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<211> 597

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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180 185 190

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225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

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305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

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450 455 460

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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Val Lys Gln

485 490 495

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tcaagcctca gacagtggtt c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ggcattaaag cagcgtatcc ac 22

Claims (10)

1.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞表达感兴趣的活性分子和下调细胞表面TCR的功能蛋白；优选地，所述功能蛋白来自疱疹病毒科(Herpesviridae)病毒；优选地，所述活性分子是嵌合抗原受体。

2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞含有所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列；优选地，所述T细胞含有所述活性分子的表达框和所述功能蛋白的表达框，或所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于同一表达框内。

3.如权利要求1或2所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞具有选自以下的一个或多个特征：

所述功能蛋白来自β疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)病毒，优选地，所述功能蛋白来自玫瑰疹病毒属(Roseolovirus)病毒，

所述嵌合抗原受体从N端至C端含有：抗肿瘤抗原的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内区；

所述嵌合抗原受体特异性结合选自以下的肿瘤抗原中的一种或多种：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、muthsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的多肽片段，以及CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、CXCR5、CXCR7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。

4.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述功能蛋白选自以下的一种或多种：来自HHV-6a的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体、来自HHV-6b的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体、来自HHV-7的蛋白U24或与其具有至少70％相同性的突变体，

优选地，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸、第14位为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、第31位为谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、第83位为氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸、第87位为赖氨酸、组氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸；来自HHV-6b的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸；来自HHV-7的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第7位为脯氨酸、第8位为脯氨酸、第10位为酪氨酸；

更优选地，来自HHV-6a的蛋白U24的突变体具有选自以下的一个或多个突变：第8位为脯氨酸、第9位为脯氨酸、第11位为酪氨酸、第14位为丙氨酸、第31位为天冬酰胺、第83位异亮氨酸、第87位为甘氨酸。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自：

(1)含活性分子的编码序列和下调细胞表面TCR的功能蛋白的编码序列的核酸分子；

(2)(1)所述核酸分子的互补序列；和

(3)(1)或(2)的片段；

优选地，所述活性分子和所述功能蛋白如权利要求3或4中所述。

6.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求5所述的核酸分子，

优选地，所述核酸构建物含有所述活性分子的表达框和所述功能蛋白的表达框；或所述核酸构建物为一表达框，其中所述活性分子的编码序列和所述功能蛋白的编码序列处于该表达框内；或

所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

7.一种慢病毒，其含有权利要求6所述的核酸构建物。

8.一种宿主细胞，其含有权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的核酸构建物或权利要求7所述的慢病毒。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-4中任一项所述的T细胞。

10.下调细胞表面TCR的功能蛋白或其编码序列在制备细胞表面的TCR的表达下调的T细胞中的应用，或在制备癌症治疗用的T细胞中的应用，所述下调细胞表面TCR的功能蛋白如权利要求1-4中所述。

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