CN108239623B - 一种混合cart细胞的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种混合CART细胞的制备方法和用途。具体而言，本发明所制备的CART细胞是等量混合CD19‑CD28 CART细胞和CD19‑41BB CART细胞。本发明制备的混合CART细胞对特异性肿瘤细胞都具强烈的杀伤功能。本发明制备的混合CART细胞除了具有对肿瘤细胞的强烈杀伤功能以外还具有存活期长的特点。本发明所制备的混合CART细胞可以用于CD19介导的恶性肿瘤的免疫治疗包括白血病和淋巴瘤。本发明制备的混合CART细胞为基础研究和临床实验奠定了坚实基础。

Description

一种混合CART细胞的制备方法和应用
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及混合细胞CD19-CD28 CART细胞和CD19-41BB CART细胞及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CART)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CART细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CART细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。
嵌合抗原受体(CAR)是CART的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素(Science.1986.233(4770):p.1318-21.)。
CD19是一种B细胞表面的95kDa的糖蛋白，从B细胞发育的早期即开始表达，直至其分化为浆细胞。CD19是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员之一，作为B细胞表面信号转导复合物的组成元素之一，参与调控了B细胞受体的信号转导过程。在CD19缺陷的小鼠模型中，外周淋巴组织中B细胞的数量会出现明显的减少，对疫苗和丝裂原的应答也会下降，同时伴有血清Ig水平的减低。通常认为，CD19的表达只限于B细胞系(B-cell lineage)，而不表达于多能造血干细胞表面。CD19还表达于大多数B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、ALLs、CLLs、多毛细胞白血病，和一部分急性髓性白血病细胞的表面。因此，在对白血病/淋巴瘤的治疗中，CD19是一种非常有价值的免疫治疗靶点。重要的是，CD19不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面，包括多能造血干细胞，这一特征使CD19可以作为一种安全的治疗靶点，可将患者发生自身免疫性疾病或不可逆性骨髓毒性损伤的风险降至最低。当前，已经研制出了抗CD19的抗体或scFv片段，并且在小鼠模型和人类/灵长类动物中证明了其应用的前景。
嵌合型抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)将肿瘤特异性的概念引入了获得性细胞治疗。最初是将抗体来源的单链变异片段(single-chain variablefragments,scFVs)和CD3ζ胞内信号结构域通过T细胞受体铰链区和跨膜区结合在一起，即为第一代CAR。虽然用第一代CAR改造的T细胞在临床前研究有一定的作用，但临床上的研究效果不佳。CD3ζ的信号通路被激活后，会引起T细胞的增殖但也会引起T细胞的失活，所以需要对CAR进行更好的调节，从而优化T细胞在体内体外的增殖及存活能力。第二代CAR应运而生，相比于一代CAR，第二代CAR整合进了共刺激分子CD28或4-1BB。众所周知，对于T细胞的激活而言，需要两条重要的信号通路的激活，第一是MHC复合体和T细胞受体的结合，第二需要CD80或CD86和T细胞上的CD28的结合这一条共刺激信号。而4-1BB信号通路，有T细胞受体通路激活，可以增加活化T细胞的增殖以及细胞因子的分泌。第二代CAR将CD28或4-1BB整合的此种改进，增强了被改造T细胞的复制及存活能力。
而两种不同共刺激分子的二代CAR在临床上广泛应用，它们之间的功能差别也有了很多的研究。在体外，CD28或4-1BB CAR有着相似的抗肿瘤能力，但是在体内的临床前研究显示4-1BB CAR改造的T细胞可能有着更强的增殖能力和存活能力。特别的，在临床上的研究显示两种二代CAR改造的T细胞在体内都能够持续增殖，不过包含4-1BB共刺激分子的CAR改造的T细胞能够更久的存活。在针对急性淋巴瘤白血病的临床研究中，Davila等报道的CD19-28Z CAR T细胞能在体内存活1到3个月的。相似的，来自于NCI的CD19-CAR T细胞(CD28的共刺激分子)，报道的最长的存活时间为68天。而在另外的用CD19-4-1BB的CAR T细胞的研究中，CART细胞存活在6个月的达68％，而在此项研究中，B细胞发育不全的症状最高的患者可持续两年，显示了CD19-4-1BB的CART细胞连续持久的功能作用。
CD19-4-1BB-CART相比于CD19-CD28-CART在患者体内为何有着更久的存活性。对此现象，发表于Nature Medicine上的一篇文章进行了探究。文章的研究指出，CD3ζ本底的磷酸化，即本底的激活(这主要是来自于CAR的SCFV本身的聚集导致)，会导致CART细胞早期的耗竭(不过高效的CD19CAR除外)；而整合CD28共刺激分子的CAR会加剧这种对T细胞的耗竭效果，整合4-1BB共刺激分子的CAR则会减弱这种效果。为了更好的探讨4-1BB信号能够减轻T细胞衰竭的分子机制，研究者还比较了4-1BB-CART细胞和CD28-CART细胞转录组的不同，4-1BB的CART细胞表达的衰竭相关的指标低于CD28-CART细胞。这项研究从一个侧面解释了在临床的研究中，为何CD19-4-1BB的CART细胞相比于CD19-CD28的CART细胞有着更持久的存活。
目前有不同病毒载体(逆转录病毒或逆转录病毒)包装的CD19-CD28 CAR和CD19-4-1-BB CAR功能相互比较的研究，本发明将CD19-CD28 CART细胞与CD19-4-1-BB CART细胞等量混合后输入体内，因为具有相同的免疫微环境对评判两种CART细胞在体内的存活率和体内分布情况以及对肿瘤细胞的杀伤作用之间的比较 更具有平等性。同时体外实验也证实了混合的CART细胞具有较好的功能性，本发明也为临床实验奠定了基础。
发明内容
本发明第一方面提供一种制备CART细胞的方法，是将包含共刺激元件CD28CAR和共刺激元件4-1BBCAR进行等比例混合，得到所述CAR T细胞。本发明的特征在于，所述等量混合的CART细胞采用以下方法制备：先分别制备带有不同共刺激因子的CART细胞再进行等量混合。
本发明第二方面提供CART细胞，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到所述CAR T细胞。
本发明第三方面是CD3阳性T细胞制备，即从外周血中分离单核细胞，然后从单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞。
本发明第四方面是T细胞的活化方法，CD3阳性T细胞采用CD3/CD28抗体方法进行刺激活化。
本发明第五方面是逆转录病毒的包被方法，所用到的逆转录病毒载体采用Retronectin进行包被处理。
本发明第六方面是CART细胞的培养基，所制备的CART细胞用LONZA的X-vivo 15培养基+5％AB血清进行培养。CART细胞用含IL-2培养基进行培养。
本发明第七方面是CART细胞的培养天数，CART细胞在体外培养的时间为7-14天。
本发明第八方面是CART细胞应用范围，基因修饰的T细胞在制备治疗CD19介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述CD19介导的疾病包括白血病和淋巴瘤；更优选地，所述CD19介导的疾病包括B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
附图说明
图1为RV-CD19-28z CAR逆转录病毒表达载体(CD19-28)示意图。SP：信号肽；VL：轻链可变区；Lk：接头(G4S)3；VH：重链可变区；H：CD8α铰链区；TM：CD28跨膜区。
图2为RV-CD19-41BB CAR逆转录病毒表达载体(CD19-41BB)示意图。SP：信号肽；VL：轻链可变区；Lk：接头(G4S)3；VH：重链可变区；H：CD8α铰链区；TM：CD8跨膜区。
表1嵌合抗原受体各部分连接表
图3为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时的CAR表达效率和细胞活率检测。
图4为制备3天的CART细胞与靶细胞共培养4小时IFNγ的分泌检测。
图5为制备3天的CART细胞与靶细胞共培养4小时后对肿瘤细胞的杀伤作用检测。
具体实施方式
形成本发明的融合蛋白的上述各部分，即CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28或人CD8跨膜区、人CD28或人4-1BB胞内区人CD3ζ胞内区、相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。作为例子，接头可由以下氨基酸序列组成：G(SGGGG)2SGGGLGSTEF、RSTSGLGGGS(GGGGS)2G、QLTSGLGGGS(GGGGS)2G、GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA、GGSGG、GGGGSGGGGSGGGGS等。
在某些实施方案中，本发明抗CD19的轻链可变区和重链可变区之间由(GGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括由SEQ ID NO:1(CD19-CD28 CAR)和或SEQ ID NO:2(CD19-41BBCAR)依次串联形成的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在SEQ ID NO:1和2所示的序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多 肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1(CD19-CD28 CAR)和SEQ ID NO:2(CD19-41BB CAR)所示。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的融合蛋白的编码序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的融合蛋白的编码序列可以多种方式被操作以保证所述蛋白的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有 功能的任何终止子都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接编码CAR的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
编码本发明CAR的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。
适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。
在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。
本发明的CART细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CART细胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR，和CART细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CART细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
由CART细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CART细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
可治疗的癌症可以是非实体瘤，如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤。尤其是，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及CART细胞治疗的疾病优选为CD19介导的疾病，尤其是CD19介导的血液肿瘤。
具体而言，本文中，“CD19介导的疾病”包括但不限于白血病和淋巴瘤，例如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病、和急性髓性白血病。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CART细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的CART细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合各种放疗制剂进行治疗，这些放疗制剂包括：环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯、FK506、氟达拉滨、雷帕霉素和麦考酚酸等。在进一步的实施方案中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。
本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
实施例1：CD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ基因序列的确定
从NCBI网站数据库搜索到抗CD19抗体轻链和重链可变区、人的CD8α铰链区、人的CD28跨膜区和胞内区、人的CD3ζ胞内区基因序列信息，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/CodonOpt上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD19scFv、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区基因、人CD28胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的CD19-CD28 CAR基因序列。
用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒载体MSCV(Addgene)的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。
将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的mCD19-CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
正义:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC
反义:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC
经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。
本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。
实施例2：CD19scFv-CD8α-41BB-CD3ζ基因序列的确定
从NCBI网站数据库搜索到抗CD19抗体轻链和重链可变区、人的CD8α铰链区、人的CD8跨膜区、和人4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区基因序列信息，这些序列在 网站http://sg.idtdna.com/CodonOpt上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。
采用重叠PCR将上述序列依次按抗CD19scFv、人CD8α铰链区基因、人CD8跨膜区基因、人4-1BB胞内区基因、人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整的CD19-4-1BB CAR基因序列。
用NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切该CAR分子的核苷酸序列，经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒载体MSCV(Addgene)的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌(DH5α)。
将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的mCD19-CAR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：
正义:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC
反义:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC
经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。
本实施例所构建得到的质粒图谱如图2所示。
实施例3：逆转录病毒包装
1.第1天293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。
2.第2天293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为Retro backbone为12.5ug，Gag-pol为10ug，VSVg为6.25ug，CaCl2 250ul，H2O为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37度培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。
3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。
实施例4：逆转录病毒感染人的T细胞
1.用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的CD3+T细胞，用含5％AB血清(GEMINI)X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1×106/mL。将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人50ng/ml CD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗体(北京同立海元)，再加入100IU/ml的白细胞介素2(北京双鹭)，刺激培养48小时后病毒感染。
2.T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包被Non-tissue treated培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。
3.T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA的HBSS 室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的HBSS洗板两次。
4.病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。
5.弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1×106个，体积1ml，培养基为T细胞培养基中添加IL-2 200IU/ml。30℃，1000g，离心10min。
6.离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
7.感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。
8.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×105/ml左右，使细胞扩增。
由此获得分别感染了实施例3所示逆转录病毒的CART细胞，分别命名为CD19-28CART细胞(表达实施例1的CD19-28 CAR)和CD19-41BB CART细胞(表达实施例1的CD19-41BB CAR)。
实施例5：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞表面CAR蛋白的表达
分别离心收集感染后72小时的CART细胞和NT细胞(对照组)，PBS洗涤1次后弃上清，轻拍试管混匀细胞，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，再加入适量的Viability染料(invitrogen)，避光孵育15分钟。最后流式细胞仪检测CAR(anti-mouse IgGF(ab')antibody(Jackson Immunoresearch))。
本实施例结果由图3显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染T细胞72小时后，CD19-28 CAR+的表达效率达57.3％,CD19-41BB CAR+的表达效率达27.5％。两组CART细胞等比例混合后表达效率为35％。三组CART细胞的细胞活率良好都在90％左右。
实施例6：CART细胞与靶细胞共培养后IFNγ分泌检测
1.取制备好的CART细胞，重悬于Lonza培养基中，调整细胞浓度为1×106/mL。
2.实验组每孔含靶细胞(Jeko1)或阴性对照细胞(K562)2×105个，CART/NT细胞2×105个，100μl不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。加入BD GolgiStop(含monesin，每1ml培养基中加入1μl BD GolgiStop)，充分混匀后，37℃孵育4小时。收集细胞，作为实验组。
3.每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。仔细吸去或倒掉上清。
4.PBS洗细胞后，加入250μl/EP管Fixation/Permeabilization solution，4℃孵育20分钟以固定细胞及破膜。用1×BD Perm/WashTM buffer清洗细胞2次，1mL/次。
5.进行胞内因子染色，取适量IFN-γ细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BD Perm/WashTM buffer稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×BD Perm/WashTM buffer 1mL/次清洗细胞2次，然后用PBS重悬。
6.流式细胞仪检测。
本实施例结果显示在图4中，CD19-28 CART细胞、CD19-41BBCART细胞和两组细胞等比例混合后(CD19-28 CART：CD19-41BBCART＝1:1)在与Jeko1细胞共培养后CD8阳性细胞中IFNγ表达的百分率分别为40.3％、4.62％和10.7％；CD19-28 CART细胞、CD19-41BBCART细胞和两组细胞等比例混合后(CD19-28 CART：CD19-41BBCART＝1:1)在与Jeko1细胞共培养后CD4阳性细胞中IFNγ表达的百分率分别为27.3％、13.4％和14.1％。
实施例7：CART细胞与靶细胞共培养后检测肿瘤特异性细胞杀伤作用
1.K562细胞(不含CD19靶蛋白，为靶细胞的阴性对照细胞)重悬在无血清培养基(1640)中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1H,5Hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μM。
2.混匀，37℃孵育30min。
3.室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无酚红1640+5％AB血清)中，37℃孵育60min。
4.新鲜细胞毒性培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
5.Jeko1细胞(含CD19靶蛋白，为靶细胞)悬浮在含有0.1％BSA的PBS中，调整浓度为1×106/ml。
6.加入荧光染料CFSE(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester)至终浓度为1μM。
7.混匀，37℃孵育10min。
8.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记反应。
9.清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×106/ml。
10.清洗效应T细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5×106/ml。
11.在所有的实验中，感染了CAR的效应T细胞(CART cell)的细胞毒性和未感染的阴性对照效应T细胞(NT cell)的细胞毒性做比较，并且这些效应T细胞来自同一个病人。
12.CART和阴性对照效应T细胞，按照T细胞：靶细胞＝10:1 3:1 1:1的比例，于5ml无菌试验管(BD Biosciences)进行培养。每一个共培养组中，靶细胞为Jeko1细胞100,000个(50μl)，阴性对照细胞为100,000个K562细胞(50μl)。同时设置一组只包含Jeko1靶细胞和K562阴性对照细胞。
13.将共培养细胞置于37℃孵育16h。
14.孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-AAD(7-aminoactinomycin D)，冰上孵育30min。
15.不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。
16.分析使用7AAD阴性的活细胞设门，测定T细胞和靶细胞共培养后活的Jeko1靶细胞和活的K562阴性对照细胞的比例。
a)对于每一组共培养的T细胞和靶细胞，
靶细胞存活％＝Jeko1活细胞数/K562活细胞数。
b)细胞毒性杀伤细胞％＝100-校准的靶细胞存活％，即(无效应细胞时Jeko1活细胞数-含效应细胞时Jeko1活细胞数)/K562活细胞数的比例。
本实施例结果显示在图5中。图5显示，在效靶比为10:1情况下，两组细胞等比例混合后对靶细胞Jeko1的杀伤效率达到80％。远高于这两种细胞的单独杀伤效率。说明等比例混合后对肿瘤特异性细胞的杀伤效率更加强。
序列表
<110> 上海恒润达生生物科技有限公司
<120> 一种混合CART细胞的制备方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctgacattc agatgactca gaccacaagc agcctcagtg cgagcctggg ggacagggtg 120
actatcagct gccgggccag ccaggacatt tccaagtacc tgaattggta ccagcagaag 180
cccgatggta ctgtgaaact cctgatatat catacttcta ggctccattc cggggttcca 240
agccgattca gtggctccgg ttccggtaca gattattccc tgaccattag caacttggaa 300
caggaggaca ttgcaacgta tttctgtcag caaggcaaca cattgcccta cacattcggg 360
ggcgggacta aactcgaaat aactggcggc gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt 420
ggaggatcag aagtgaagct gcaggaaagt ggccccgggc tggtagcccc aagtcagtcc 480
ctgagtgtaa cctgtacagt gagtggagtg tctcttcctg actacggggt aagttggatt 540
cggcaacctc cacgcaaggg cctggagtgg ctcggcgtga tttggggatc tgagacaact 600
tactacaatt ccgccctgaa gagcaggctg accatcatta aggacaatag caagtcacag 660
gtgtttctga agatgaactc actgcagacc gacgacaccg ccatctatta ctgcgccaaa 720
cattattatt atggcgggag ttatgctatg gactactggg gccagggcac tagcgtcacc 780
gtcagcagta ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840
cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900
cggggactgg actttgcctg tgatatctac ttctgggtgc tggtcgtggt cggaggggtg 960
ctggcctgtt atagcctgct ggtgactgtc gccttcatta tcttctgggt gcggagcaag 1020
aggtctcgcg gtgggcattc cgactacatg aacatgaccc ctagaaggcc tggcccaacc 1080
agaaagcact accagccata cgcccctccc agagatttcg ccgcttatcg aagcgtgaag 1140
ttctcccgaa gcgcagatgc cccagcctat cagcagggac agaatcagct gtacaacgag 1200
ctgaacctgg gaagacggga ggaatacgat gtgctggaca aaaggcgggg cagagatcct 1260
gagatgggcg gcaaaccaag acggaagaac ccccaggaag gtctgtataa tgagctgcag 1320
aaagacaaga tggctgaggc ctactcagaa atcgggatga agggcgaaag aaggagagga 1380
aaaggccacg acggactgta ccaggggctg agtacagcaa caaaagacac ctatgacgct 1440
ctgcacatgc aggctctgcc accaagatga 1470
<210> 2
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctgacattc agatgactca gaccacaagc agcctcagtg cgagcctggg ggacagggtg 120
actatcagct gccgggccag ccaggacatt tccaagtacc tgaattggta ccagcagaag 180
cccgatggta ctgtgaaact cctgatatat catacttcta ggctccattc cggggttcca 240
agccgattca gtggctccgg ttccggtaca gattattccc tgaccattag caacttggaa 300
caggaggaca ttgcaacgta tttctgtcag caaggcaaca cattgcccta cacattcggg 360
ggcgggacta aactcgaaat aactggcggc gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt 420
ggaggatcag aagtgaagct gcaggaaagt ggccccgggc tggtagcccc aagtcagtcc 480
ctgagtgtaa cctgtacagt gagtggagtg tctcttcctg actacggggt aagttggatt 540
cggcaacctc cacgcaaggg cctggagtgg ctcggcgtga tttggggatc tgagacaact 600
tactacaatt ccgccctgaa gagcaggctg accatcatta aggacaatag caagtcacag 660
gtgtttctga agatgaactc actgcagacc gacgacaccg ccatctatta ctgcgccaaa 720
cattattatt atggcgggag ttatgctatg gactactggg gccagggcac tagcgtcacc 780
gtcagcagta ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840
cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900
cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020
cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080
gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140
gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 1200
aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 1260
gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 1320
ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 1380
agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1440
gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca aga 1473
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 引物
<400> 3
agcatcgttc tgtgttgtct c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 引物
<400> 4
tgtttgtctt gtggcaatac ac 22

Claims (4)

1.一种制备CART细胞的方法，其特征在于，是将CD19-CD28 CART细胞与CD19-41BBCART细胞按照1: 1 的比例等量混合，得到所述混合CART细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述等量混合的CART细胞采用以下方法制备：先分别制备带有不同共刺激因子的CART细胞再进行等量混合。
3.根据权利要求1所述的方法得到的混合CART细胞。
4.权利要求3 所述的混合CART细胞在制备治疗CD19 介导的疾病的药物中的用途，所述CD19 介导的疾病包括白血病和淋巴瘤。
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Application publication date: 20180703

Assignee: Shanghai Hengrun Dasheng biopharmaceutical Co.,Ltd.

Assignor: Shanghai Hengrun Dasheng Biotechnology Co.,Ltd.

Contract record no.: X2024310000143

Denomination of invention: A preparation method and application of mixed CART cells

Granted publication date: 20200324

License type: Common License

Record date: 20240911