CN114144430B - Cd7-car-t细胞及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

一种CD7‑CAR‑T细胞及其制备和应用。具体地，一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR的抗原结合结构域包括一个或多个CD7纳米抗体。一种包含该CAR的CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞的内源性CD7表达是被阻断的。CAR‑T细胞可以用于T细胞肿瘤的治疗。

Description

CD7-CAR-T细胞及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种CD7-CAR-T细胞及其制备和应用。
背景技术
T细胞来源的恶性肿瘤代表着一种典型的血液系统恶性肿瘤，在儿童和成人患者中都具有很高的复发率和死亡率，目前尚无非常有效的治疗手段。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤，大约占成人急性淋巴细胞白血病病例的25％和儿童急性淋巴细胞白血病病例的15％左右。T-ALL在临床上的症状主要有感染、贫血、发热、异常出血等，T-ALL进展很快，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统和睾丸等组织器官，如果没有及时有效的治疗方法，患者发病后很快就会死亡。目前，对于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的治疗策略主要包括强化化疗，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，抗病毒治疗和分子靶向治疗。但是，强化化疗通常不能阻止疾病治疗后的复发。对于那些在初次治疗后复发的患者，补救性化疗方案的缓解率大约只有20-40％。另外，虽然造血干细胞移植可能是目前唯一可以治愈的方案，但是也会伴有移植物抗宿主病带来的生命危险。
近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法显示出非常显著的临床疗效，作为一种新型的过继性免疫治疗技术，被用于治疗多种实体肿瘤和血液肿瘤，其中疗效最显著的是针对B细胞来源的淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗。CAR-T疗法是通过基因修饰患者的T淋巴细胞，以主要组织相容性复合物非依赖性的方式靶向和消除恶性肿瘤。有效应用该技术的关键之一是选择一个合适的靶点来构建对应的CAR分子。最佳的靶抗原应该只在肿瘤细胞表达，不在正常细胞表达，或者也可以表达在那种正常细胞短暂缺失后，临床上有应对方案的细胞上。
CD7分子在大多数的T细胞急性淋巴细胞白血病和部分T细胞急性髓系白血病细胞上是高表达的。有很多研究小组已经报道了CD7分子在T细胞急性淋巴细胞白血病细胞上是高表达的，但在一群正常的T淋巴细胞中是不表达的。CD7分子通过与其配体K12/SECTM1的结合在T细胞活化期间起到共刺激信号的作用，但是，CD7似乎对T细胞的发育和功能不会产生关键性的影响，有研究证明破坏了CD7分子的小鼠T祖细胞依然会产生正常的T细胞发育和体内平衡，基本没有引起T细胞效应功能的变化。因此，CD7分子可能是一个针对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的非常合适的治疗靶点。但是用CD7-CAR-T细胞靶向治疗T细胞急性淋巴细胞白血病依然面临着很大的问题，这是因为正常的效应T细胞和T细胞肿瘤都表达CD7抗原会导致CD7-CAR-T细胞的自相残杀，CD7-CAR-T细胞很难在体外制备成功。尽管最近有报道显示，在小鼠实验中，T-ALL细胞可被同时敲除了CD7和T细胞受体的CD7-CAR-T同种异体CD7-CAR-T细胞消除，但在实际应用中很难保证可以达到100％的敲除率，在临床应用中可能还是会存在移植物抗宿主病(GVHD)的风险。
因此，本领域需要开发一种新的CD7-CAR-T制备方法，使其可以在体外正常扩增，也不影响CAR-T的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CD7-CAR-T细胞及其制备和应用。
具体地，本发明的内容包括：
1.本发明构建了一种有效阻断T细胞表面CD7分子表达的CD7载体和方法。
2.本发明构建了6种基于CD7纳米抗体序列及人源化抗体序列的CD7-CAR-T细胞。
3.本发明提供了CD7阻断质粒的结构和序列。
4.本发明提供了6种CD7-CAR载体的结构和序列。
5.本发明提供了不同结构的CD7-CAR-T细胞对T细胞肿瘤细胞的体内外杀伤结果。
6.本发明提供了CD7-CAR-T细胞对CD7阳性的急性髓系白血病细胞的体外杀伤结果。
在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR的抗原结合结构域包括一个或多个CD7纳米抗体。
在另一优选例中，所述的CD7纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
在另一优选例中，所述的CAR还包含ICOS来源的跨膜区和/或ICOS来源的胞内共刺激区。
在另一优选例中，所述的CAR包含ICOS来源的胞内共刺激区和4-1BB来源的胞内共刺激区。
在另一优选例中，所述的CAR包含CD28来源的胞内共刺激区和4-1BB来源的胞内共刺激区。
在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：
L-VHH-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为信号肽序列；
VHH为包含一个或两个CD7纳米抗体的抗原结合结构域；
H为铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述CAR的结构如图18所示。
在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述L为CD8来源的信号肽。
在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在另一优选例中，所述的VHH包括两个CD7纳米抗体，较佳地，所述的两个CD7纳米抗体通过连接肽相连，更佳地，所述的连接肽如SEQ ID NO：8所示。
在另一优选例中，所述的CD7纳米抗体包括人源化的纳米抗体和骆驼源纳米抗体，优选为人源化的纳米抗体。
在另一优选例中，所述的VHH为一个人源化的CD7纳米抗体。
在另一优选例中，所述的H为来源于选自下组的蛋白的铰链区：Fc、CD8、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为Fc片段，优选地，所述的Fc片段为人IgG4Fc片段。
在另一优选例中，所述的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。
在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：ICOS、CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM为ICOS来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述ICOS来源的跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：ICOS、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的C为ICOS和/或4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述ICOS来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在另一优选例中，所述4-1BB来源的共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示。
在另一优选例中，所述CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示。
在另一优选例中，所述CAR(优选地为C端)还包括细胞自杀元件。
在另一优选例中，所述的CAR与细胞自杀元件通过自剪切元件相连接。
在另一优选例中，所述细胞自杀元件与所述CAR的CD3ζ通过T2A连接。
在另一优选例中，所述的细胞自杀元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、EGFRt、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞自杀元件为tEGFR。
在另一优选例中，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
在另一优选例中，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在另一优选例中，所述CAR为PA3-17 CAR。
在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在另一优选例中，所述CAR识别SEQ ID NO：49的第28-37位所示的抗原表位。
在本发明的第二方面，提供了一种CD7阻断分子，所述的CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的结构如下式II所示：
L’-VHH’-ER (II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L’为信号肽序列；
VHH’为包含两个CD7纳米抗体的结合区；
ER为内质网滞留序列。
在另一优选例中，所述L’的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在另一优选例中，所述VHH’的两个CD7纳米抗体通过连接肽相连，更佳地，所述的连接肽如SEQ ID NO：8所示。
在另一优选例中，所述VHH’的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在另一优选例中，所述VHH’为骆驼源的纳米抗体。
在另一优选例中，所述ER的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述CD7阻断分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的CAR和/或第二方面所述的CD7阻断分子。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子、或表达本发明第一方面所述的CAR和/或第二方面所述的CD7阻断分子。
在本发明的第六方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞含有本发明第四方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子、或表达本发明第一方面所述的CAR和/或第二方面所述的CD7阻断分子。
在另一优选例中，所述免疫细胞表面的CD7基因表达是被沉默的。
在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞，且所述T细胞的TCR基因表达是被沉默的。
在另一优选例中，所述免疫细胞表达外源性细胞自杀元件。
在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或
(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。
在另一优选例中，所述的免疫细胞中CAR与细胞自杀元件共表达。
在另一优选例中，所述的免疫细胞为T细胞，并且所述的T细胞为CD4+T细胞，优选地，所述的T细胞可以分泌IL-6。
在本发明的第八方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第六所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在本发明的第九方面，提供了一种本发明第一方面所述的CAR、第二方面所述的CD7阻断分子、或本发明第六方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤为T细胞肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为血液肿瘤。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述药物或制剂用于预防和/或治疗急性髓细胞白血病(AML)。
在本发明的第十方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR和/或第二方面所述的CD7阻断分子，包括以下步骤：
将本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。
在另一优选例中，所述免疫细胞为T细胞或NK细胞。
在本发明的第十一方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：
(1)提供一待改造的免疫细胞；和
(2)将用于表达本发明第一方面所述的CAR的第一表达盒导入到所述免疫细胞；和
(3)将用于表达本发明第二方面所述的CD7阻断分子的第二表达盒导入到所述免疫细胞，从而获得所述的工程化免疫细胞。
在另一优选例中，所述步骤(2)可在步骤(3)之前、之后、同时或交替进行，较佳地，所述的步骤(2)和步骤(3)同时进行。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，将第一病毒载体导入到所述免疫细胞，所述的第一病毒载体包含表达本发明第一方面所述的CAR的第一表达盒。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，将第二病毒载体导入到所述免疫细胞，所述的第二病毒载体包含表达本发明第二方面所述的CD7阻断分子的第二表达盒。
在另一优选例中，所述步骤(3)中，导入到所述免疫细胞中的第二表达盒至少可以阻断所述免疫细胞20％，较佳地10％，更佳地5％，最佳地2.5％的内源性CD7表达。
在本发明的第十二方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒用于刮备本发明第六方面所述的工程化的免疫细胞，且所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第三方面所述的核酸分子、或本发明第四方面所述的载体。
在本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒用于制备本发明第六方面所述的工程化的免疫细胞，且所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：
(1)第一病毒载体，所述第一病毒载体含有第一表达盒，所述的第一表达盒用于表达本发明第一方面所述的CAR；和
(2)第二病毒载体，所述第二病毒载体含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达本发明第二方面所述的CD7阻断分子。
在另一优选例中，所述的第一和第二病毒载体位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述的第一和第二病毒载体位于同一表达载体中。
在本发明的第十四方面，提供了一种试剂组合，所述的试剂组合包括：
(1)第一病毒载体，所述第一病毒载体含有第一表达盒，所述的第一表达盒用于表达本发明第一方面所述的CAR；和
(2)第二病毒载体，所述第二病毒载体含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达本发明第二方面所述的CD7阻断分子。
在另一优选例中，所述的第一病毒载体和第二病毒载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的第一表达盒和第二表达盒为相同种类的慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的试剂组合用于制备本发明第六方面所述的工程化的免疫细胞。
在本发明的第十五方面，提供了一种本发明第六方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤为T细胞肿瘤。
在本发明的第十六方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第六方面所述的细胞、或本发明第八方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤为血液肿瘤，较佳地为急性髓细胞白血病(AML)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CD7阻断对T细胞表面CD7表达的影响。图1A显示了对照T细胞表面CD7的阳性率，图1B显示了阻断CD7后的T细胞表面CD7的阳性率。
图2显示了阻断CD7后对T细胞的扩增影响。Ctrl T代表T细胞，CD7-CAR代表只转染了CD7-CAR病毒的T细胞，CD7-blocking&CD7-CAR代表同时转染了CD7-CAR病毒和CD7阻断病毒的T细胞。
图3显示了CD7阻断对T细胞表型的影响。Blank代表对照T细胞，CD19-CAR代表CD19-CAR-T细胞，CD7-Blocking&CD19-CAR代表阻断CD7的CD19-CAR-T细胞，CD7-Blocking代表阻断CD7的T细胞，CD7-Blocking&CD7-CAR代表阻断了CD7的CD7-CAR-T细胞。图3A显示了第7天的细胞流式检测结果，图3B显示了第14天的细胞流式检测结果。
图4显示了CD7阻断对CAR-T细胞功能影响。图4A显示了阻断CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)和对照CD19-CAR-T细胞(CD19-CAR)表面CD7和CD19-CAR的表达情况。图4B显示了在效靶比为1∶1的条件下，两种CAR-T细胞对Raji细胞的细胞毒性。图4C显示了在效靶比为5∶1的条件下，两种CAR-T细胞对Raji细胞的细胞毒性。
图5显示了CD7阻断对CAR-T细胞细胞因子分泌能力的影响。CD7-Blocking代表阻断CD7的T细胞，CD7-blocking&CD19-CAR代表阻断CD7的CD19-CAR-T细胞。
图6显示了CD7-CAR-Jurkat细胞与靶细胞孵育后CD69的表型变化。
图7显示了不同结构CD7-CAR-T的转染效率。
图8显示了CD7-CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤细胞的体外杀伤结果。图8A显示了CD7-CAR-T细胞对CEM细胞的杀伤结果，图8B显示了CD7-CAR-T细胞对Jurkat细胞的杀伤结果。
图9显示了CD7-CAR-T细胞与靶细胞孵育后细胞因子的释放情况。
图10显示了CD7-CAR-T细胞对CD7过表达细胞293-T细胞杀伤结果。
图11显示了CD7-CAR-T细胞与293T-CD7细胞孵育后细胞因子的释放情况。
图12显示了CD7-CAR-T细胞对原代肿瘤细胞的细胞毒性。
图13显示了CD4阳性CD7-CAR-T细胞及CD8阳性CD7-CAR-T细胞的制备及流式检测。图13A显示了分选的CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞流式检测结果；图13B显示了2种CAR-T细胞表面CD7和CD7-CAR的流式检测结果。
图14显示了CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM细胞的持续体外结果。图14A显示了CAR-T细胞经多次抗原刺激的示意图。图14B显示了CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM的多次重复杀伤结果。
图15显示了CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞经多次抗原刺激后细胞因子的释放情况。
图16显示了动物实验方案及小鼠的生存曲线。图16A所示为动物实验方案；图16B所示为目前小鼠的生存曲线。
图17显示了CD7阻断序列结构图。
图18显示了不同CD7-CAR载体的结构图。
图19显示了流式检测CD7抗体与不同截短型抗原结合的结果。其中，上图为ELISA检测结果，下图为流式检测结果。
图20显示了流式检测CD7抗体与不同位点突变的抗原结合的结果。
图21显示了CD7抗体的膜蛋白组阵列实验的结果。
图22显示了六株AML肿瘤细胞系表面CD7抗原的表达率检测。其中，图22A-图22F分别显示了KG-1细胞、HEL细胞、THP-1细胞、HL60细胞、AML5细胞和Kasumi-1细胞表面CD7抗原的表达率检测。
图23显示了CD7-CAR T细胞的构建和制备。其中，图23A显示了CD7-CAR和PEBL的结构，图23B显示了PEBL的阻断效果，图23C显示了CD7-CAR病毒滴度，图23D显示了CD7-CAR的表达率。
图24显示了CD7-CAR T对表达CD7的293T细胞具有特异性的杀伤。其中，图24A显示了分别加入T细胞和CD7-CAR T细胞后293T细胞和293T-CD7细胞的生长曲线，图24B显示了生长因子的分泌情况。
图25显示了CD7-CAR T对表达CD7的AML细胞具有较强的杀伤效果。其中，图25A显示了效应细胞与靶细胞按1∶1效靶比孵育48h后AML肿瘤细胞的凋亡结果，图25B显示了生长因子的分泌情况。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，构建了可阻断T细胞表面CD7表达的CD7阻断载体和包含CD7纳米抗体的CD7-CAR载体，并进一步构建了表面CD7表达被阻断的CD7-CAR-T细胞。实验表明，本发明的CD7-CAR-T细胞可以在体外正常扩增，对CD7阳性恶性肿瘤具有显著的特异性杀伤。在此基础上完成本发明。
具体地，
首先，本发明利用CD7纳米抗体序列构建了一种可阻断T细胞表面CD7表达的CD7阻断载体，并通过实验证明了本发明构建的CD7阻断载体可以有效阻断T细胞表面CD7分子的正常表达。
其次，本发明利用CD7纳米抗体序列及其人源化序列构建了6种不同结构的CD7-CAR载体，本发明公开了这6种CD7-CAR载体的相关片段及具体序列，包括CD7纳米抗体序列，人源化CD7纳米抗体序列，不同CAR结构中的铰链区序列，跨膜区序列及共刺激信号序列。本发明的CD7-CAR包括含有ICOS和41B共刺激信号的三代CAR，以及只含有CD28共刺激信号的二代CAR。
基于上述CD7阻断载体和CD7-CAR载体，本发明构建了一系列CD7-CAR-T细胞，其可在体外正常扩增，不会引起CAR-T细胞的自伤现象，同时对CD7阳性的T细胞恶性肿瘤具有显著的特异性杀伤，为临床上靶向治疗T细胞相关恶性肿瘤(T细胞白血病和淋巴瘤)奠定了基础。此外，本发明构建的CD7-CAR-T细胞还对T细胞肿瘤细胞CEM和肿瘤患者来源的原代T-ALL肿瘤细胞表现出很好的体内外杀伤效果。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
本申请的序列表中提供的各个序列所代表的含义如下表1所示。
表1序列表中各个序列的名称
嵌合抗原受体(CAR)
CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD7的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与ICOS和/或4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”是指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。作为本发明的优选方式，所述抗原结合结构域包含一个或多个特异性识别CD7的纳米抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本发明的CAR中的胞内结构域包括ICOS和/或4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。
本发明还提供了靶向CD7的CAR-T细胞，除非特别说明，本发明的CAR-T细胞表面的CD7表达是被阻断的，较佳地，被本发明第二方面所述的CD7阻断分子所阻断。
自杀基因开关
为进一步控制CAR-T细胞非肿瘤靶向和细胞因子释放综合征等不良，本发明中的CART细胞皆带有自杀基因开关，在外源性药物的作用下，可以有效清除体内的CAR-T细胞，阻断未知的或不可控的远期毒性，以保证患者的安全。
本发明中所用自杀基因开关可以为HSV-TK、iCasp9、CD20、mTMPK等。比较而言，HSV-TK、iCasp9和CD20对T细胞的清除能力等同，但是iCasp9和CD20的清除较迅速，HSV-TK清楚速度较慢。
iCasp9自杀基因包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性接头连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。当加入小分子后，能够促使其二聚话，从而诱导细胞的凋亡，而对未携带自杀基因的正常细胞无效用。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5，399，346、5，580，859、5，589，466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479：79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5，350，674和5，585，362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104-1×107个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
AML
急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一组高度异质性、克隆性造血干细胞疾病。早在近200年前就已经有发现白血病病例的报道了。但是在过去的几十年里白血病的治疗却几乎没有什么进展，年轻患者5年总生存率(OS)在40％左右，而对于占AML绝大多数的老年患者来说，5年生存率(OS)仅有10％-20％。而且仍然有很多的缺陷，比如对患者本身伤害大，复发率高，配对难，成本大等。
AML是一种非常难治的侵袭性造血干细胞恶性肿瘤，而且AML又是一种非常容易复发的疾病。因此，复发难治的AML急迫需要探索新型的治疗手段。开发AML的新型疗法，不仅仅只是需要关注其疗效性，更重要的是需要关注其安全性及对患者本身的毒性作用。
目前的AML的CAR-T治疗大多数会对患者产生毒性副作用，因此找到一个只在恶性细胞中选择性表达，在正常细胞中表达缺乏的抗原很重要。本申请证明了CD7-CAR T细胞可以有效的靶向CD7阳性的AML细胞，而不会对不表达CD7的细胞产生细胞毒性。
在前期的摸索实验中，先后用1∶5、1∶1、5∶1三个效靶比在24h和1∶2、1∶1、2∶1三个效靶比在24h，48h分别共孵育检测，结果均与图25相同。因此，可以确定CD7-CAR T的确可以特异性杀伤CD7阳性的肿瘤细胞。且杀伤效果与肿瘤细胞表达CD7抗原的强弱有关，对于不表达CD7抗原的肿瘤细胞没有检测到特异性杀伤活性。本申请的体外数据初步证明CD7-CART细胞可高效杀伤CD7阳性的AML肿瘤细胞。
虽然CD7-CAR T细胞不会对造血干细胞产生毒性，但是可能会对正常的CD7阳性的T细胞产生一定的毒性作用。然而幸运的是，前期研究显示大约有9％的正常T细胞不表达CD7，这些CD7阴性的正常T细胞拥有健全的T细胞活性功能，而且由于可以在CD7-CAR-T细胞治疗中生存下来，从而为患者提供了一个基本的免疫保护，避免了类似CD19-CAR-T细胞造成B细胞发育不全那样的副作用。因此，CD7-CAR-T细胞治疗导致T细胞发育不全的几率较低。
目前，已有多个CAR-T产品被FDA批准上市，首次尝试用于治疗CD19阳性的淋巴瘤的CD19CAR在临床中已经取得了显著的疗效，而且CAR T疗法无论是在血液瘤还是实体瘤方面都取得了巨大的进展，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。虽然CD33和CD123为现在AML治疗表达最广泛的靶点，但被证实虽然具有一定的临床疗效潜力，但却不能避免严重的造血系统毒性作用。因此，开发新的疗效性及安全性都较好的靶点尤为迫切。本申请为CD7CAR-T的应用临床提供了强有力的研究依据，为复发难治的AML患者带来了新的希望。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD7，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD7的CAR-T细胞引起抗表达CD7的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括CD7纳米抗体、Fc片段、跨膜区、和ICOS胞内区、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319：1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明构建了不同结构的CD7-CAR载体，并检测了相应CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤细胞的体外杀伤效果，筛选获得了杀伤效果最佳CD7-CAR结构，即CD7-CAR(PA3-17)。PA3-17中包含一个人源化的CD7纳米抗体，与其他结构的CAR相比，PA3-17的亲和力并不是最高的，但非常意外的是，转导CD7-CAR的T细胞的体外杀伤效果最好。PA3-17为第三代CAR，包含ICOS胞内共刺激区和4-1BB胞内共刺激区，跨膜区同样来源于ICOS，实验表明，上述结构促进T细胞的增殖，这对于转染并扩增来源于患者的T细胞(活性较低，数量较少)是非常有利的。
(b)本发明构建了可阻断T细胞表面CD7表达的CD7阻断载体，从而避免靶向CD7的CAR-T细胞的自伤现象。与现有技术中的电转相比，本发明通过慢病毒转染的方式阻断CD7表达，转染后的T细胞活性更好，CD7的阻断效果更稳定。并且，转染后的T细胞的杀伤活性和细胞因子的分泌基本不受影响，CD4+和CD8+的表行也不受影响。
(c)本发明的CAR-T细胞对CD7阳性恶性肿瘤具有显著的特异性杀伤，为临床上靶向治疗T细胞相关恶性肿瘤(T细胞白血病和淋巴瘤)奠定了基础。非常意外的是，发明人发现，相比正常T细胞，利用来源于患者的T细胞进行CD7-CAR(PA3-17)的转染，CAR-T细胞的杀伤活性更高，在效靶比1∶100时仍有较好的杀伤效果。
(d)本发明用人源化CD7纳米抗体序列构建的CD7-CAR-T细胞，能够进一步降低骆驼源的CD7抗体序列构建的CD7-CAR-T细胞在体内的免疫原性，提高临床治疗效果。
(e)本发明的CAR-T细胞对多种CD7阳性AML细胞株有良好的特异性杀伤能力，且杀伤效果与肿瘤细胞表达的CD7强度相关。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 CD7阻断分子对T细胞表面CD7分子的阻断效果
利用本领域的常规技术手段构建CD7阻断分子，结构如图17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将上述CD7阻断分子插入到慢病毒载体中，然后通过慢病毒包装技术，制备CD7阻断慢病毒并转染T细胞。通过流式细胞术检测T细胞表面CD7分子的变化。
结果如图1所示，1×106的细胞经50ul的CD7阻断病毒(CD7-blocking)转染后，T细胞表面基本检测不到CD7分子的表达(图1B所示)，而未转染CD7阻断病毒的T细胞表面CD7的阳性率为97％(图1A所示)，说明本实施例构建的CD7阻断分子可以完全阻断T细胞表面CD7的表达。
实施例2 CD7阻断分子对T细胞扩增的影响
本实施例检测并比较未转染CD7阻断病毒的对照T细胞(Ctrl T)，只转染了CD7-CAR慢病毒的CD7-CAR-T细胞(CD7-CAR)，以及同时转染了CD7阻断病毒和CD7-CAR病毒的CD7-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD7-CAR)的体外扩增情况。
结果如图2所示，与对照T细胞相比较，只转染了CD7-CAR慢病毒的CD7-CAR-T细胞(CD7-CAR)在体外很难扩增，其原因在于CAR-T细胞表面表达CD7分子，CD7-CAR-T细胞产生了自杀现象所导致的。而同时转染了CD7阻断病毒和CD7-CAR病毒的CD7-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD7-CAR)可以正常扩增，说明阻断CD7分子后基本不会影响CD7-CAR-T细胞的正常扩增。
实施例3 CD7阻断后对T细胞表型的影响
本实施例分析了对照T细胞(Blank)，CD19-CAR-T细胞(CD19-CAR)，阻断CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-Blocking&CD19-CAR)，阻断CD7的T细胞(CD7-Bloeking)，阻断CD7的CD7-CAR-T细胞(CD7-Blocking&CD7-CAR)细胞表面CD4和CD8的表型变化。
第7天(图3A)和第14天(图3B)的细胞流式检测结果显示，CD7分子阻断后基本不会影响CD4细胞和CD8细胞的分型。
实施例4 CD7阻断后对CAR-T细胞功能的影响
为了研究阻断CD7分子后是否影响CAR-T细胞的功能，利用实施例1中的CD7阻断分子构建了阻断CD7分子的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)，并对其进行细胞流式检测。
结果如图4A所示，与对照CD19-CAR-T细胞相比(CD19-CAR)，阻断CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)表面基本检测不到CD7分子的表达。
随后，分析了T细胞，阻断CD7的T细胞(CD7-Rlocking)，CD19-CAR-T细胞，阻断了CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)对Raji细胞(CD19阳性肿瘤细胞)和CEM(CD19阴性对照靶细胞)的细胞毒性。
结果如图4所示，在效靶比为1∶1和5∶1的条件下，与对照组(T细胞组)相比，阻断CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)与未阻断CD7的CD19-CAR-T细胞对Raji细胞都具有显著的细胞毒性(图4B，4C)，说明阻断CD7后不会影响CD19-CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性。
随后，进一步分析了T细胞，阻断CD7的T细胞(CD7-Rlocking)，CD19-CAR-T细胞，阻断CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)分别与Raji细胞孵育后细胞因子(IL-2，IFN-r，TNF-α，Granzyme B)的释放情况，效靶比为1∶1和5∶1，CEM为CD19阴性对照靶细胞。
结果如图5所示，与对照的T细胞组相比，阻断了CD7的CD19-CAR-T细胞(CD7-blocking&CD19-CAR)与未阻断CD7的CD19-CAR-T细胞类似，与Raji细胞孵育后有明显的细胞因子释放升高，进一步表明了阻断CD7分子后不会影响CAR-T细胞的功能。
实施例5 CD7-CAR-Jurkat细胞被靶细胞特异性激活
为了验证本发明构建的5种CD7-CAR(PA2-007-tEGFR，PA3-007d-tEGFR，PA3-007d-Fc，PA3-17，PA3-17d)是否可以被CD7阳性肿瘤细胞特异性活化，分别构建了5种CD7-CAR-Jurkat细胞，然后分别与CEM细胞共孵育后检测CD69的表达情况。
结果如图6所示，与CEM共孵育的5种CD7-CAR-Jurkat细胞表面CD69的表达明显升高，说明本发明构建的5种CD7-CAR-Jurkat细胞可以被CD7阳性肿瘤细胞CEM特异性激活。
实施例6 CD7-CAR-T细胞的构建及鉴定
图18显示了6种CD7-CAR的结构，为了进一步验证各CD7-CAR的功能，通过慢病毒共转染的方式(CD7-CAR慢病毒和CD7阻断病毒对T细胞进行共转染，阻断CD7-CAR-T细胞表面CD7分子的表达，避免CD7-CAR-T细胞的自相残杀)构建了6种CD7-CARF-T细胞(PA3-17，PA3-17d，PA3-007d-Fc，PA2-007-tEGFR，PA3-007-tEGFR，PA2-007-tEGFR)，并通过细胞流式检测了CAR-T细胞的CAR阳性率。
流式检测结果如图7所示，PA3-17的转染效率最高。
实施例7 CD7-CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤细胞的体外杀伤
利用实施例6构建的6种CD7-CAR-T细胞分别对CD7阳性肿瘤细胞CEM和Jurkat细胞进行体外杀伤实验，T细胞组(Blank T)和阻断了CD7的T细胞组(CD7-blocking)为对照效应细胞。
结果如图8所示。图8A显示了6种CD7-CAR-T细胞对CEM的细胞毒性，结果显示与对照组相比，在不同效靶比的条件下，6种CD7-CAR-T细胞对CEM细胞都具有显著的特异性杀伤，图8B显示了6种CD7-CAR-T细胞对Jurkat细胞的细胞毒性，结果显示与对照组相比，在不同效靶比的条件下，6种CD7-CAR-T细胞对Jurkat细胞都具有显著的特异性杀伤。
上述结果表明，6种CD7-CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤细胞株CEM和Jurkat都具有显著的特异性杀伤。PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T细胞在体外扩增和杀伤实验中表现更为突出。因此，后续实施例中选择PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T继续实验。
实施例8 CD7-CAR-T细胞被靶细胞特异性激活
分别将PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T与CEM细胞孵育，进一步检测细胞因子的释放情况(IL-2，IFN-γ，Granzyme B，TNF-α)，CD7-blocking-T为阴性对照细胞。
结果如图9显示，与CD7-blocking-T细胞相比，2种CD7-CAR-T细胞(PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T)与CEM细胞共孵育后，细胞因子的分泌量明显升高，说明CD7-CAR-T细胞(PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T)可以被CD7阳性的CEM细胞特异性激活。
实施例9 CD7-CAR-T细胞对CD7过表达细胞293-T细胞的抑制作用
为了进一步验证CD7-CAR-T细胞对CD7阳性靶细胞杀伤的特异性，利用CD7阴性的293T细胞构建了CD7过表达的293T-CD7细胞株，然后用艾森的RTCA仪器分析了CD7-CAR-T细胞(PA3-17，PA3-17d)对293T-CD7细胞生长的抑制作用。
结果如图10所示，在效靶比为10∶1的条件下，与对照的T细胞相比，CD7-CAR-T(PA3-17，PA3-17d)对293T-CD7细胞的生长具有显著的抑制作用，而对于野生型293T细胞，CD7-CAR-T(PA3-17，PA3-17d)细胞则没有表现出显著的特异性杀伤活性，从而证明了CD7-CAR-T(PA3-17，PA3-17d)细胞选择性地杀伤CD7阳性的靶细胞。
随后，进一步分析了上述杀伤实验中细胞因子的释放情况(IL-2，IFN-γ，Granzyme B，TNF-α)。
结果如图11所示，与对照T细胞相比，2种CD7-CAR-T细胞(PA3-17-CAR-T和PA3-17d-CAR-T)与CD7过表达的293T-CD7细胞共孵育后，细胞因子的分泌量明显升高，而2种CD7-CAR-T细胞与293T细胞孵育后基本检测不到细胞因子的释放，说明CD7-CAR-T细胞可以被CD7过表达的293T-CD7细胞特异性激活，而不能被CD7阴性的293T细胞特异性激活。
实施例10 CD7-CAR-T细胞对CEM的细胞毒性
利用来源于3个患者的T细胞制备CD7-CAR-T细胞(PA3-17)，对CEM肿瘤细胞进行了体外杀伤实验，取得了相似的实验结果，结果之一如下。
结果如图12所示，在效靶比为1∶100，1∶50，1∶30的低效靶比的条件下，与只阻断了CD7的T细胞组(CD7-blocking)相比，CD7-CAR-T细胞(PA3-17)对CEM具有更强的细胞毒性，说明本发明的CD7-CAR-T细胞对CEM细胞具有显著的特异性杀伤。
而且，可以在极低的效靶比(1∶100)时也有特异性杀伤，证明了利用来源于患者的T细胞制备的CD7-CAR-T细胞作为肿瘤系列杀手的巨大潜力。
实施例11 CD4+T细胞和CD8+T细胞的分选及CD7-CAR-T细胞的制备
为了进一步分析CD4+和CD8+表型的T细胞对CD7-CAR-T细胞的生物学活性有何影响，通过磁珠分选的方式分别获得了CD4阳性的T细胞和CD8阳性的T细胞，流式检测结果如图13A所示。
然后分别制备了CD8阳性的CD7-CAR-T细胞(PA3-17)和CD4阳性的CD7-CAR-T细胞(PA3-17)，流式检测如图13B所示。
实施例12 CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM细胞的体外杀伤
用CEM细胞对实施例11制备的CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞进行了多次刺激，如图14A所示。然后，分别检测了经多次抗原刺激的CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM细胞的细胞毒性。
结果如图14B所示，与CD8+T细胞和CD4+T细胞对照组相比，CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM都具有显著的特异性杀伤，但随着抗原刺激次数的不断增加，CD4+CD7-CAR-T细胞比CD8+CD7-CAR-T细胞对CEM细胞具有更持久的杀伤作用。
随后，进一步分析了第一次抗原刺激和第三次抗原刺激后CD4+CD7-CAR-T细胞和CD8+CD7-CAR-T细胞中细胞因子的释放情况，进行分析的细胞因子包括IFN-γ，TNF-α，6ranzyme B，IL-6。
结果如图15所示，随着抗原刺激次数的增加，CD4+CD7-CAR-T细胞的细胞因子释放能力强于CD8+CD7-CAR细胞，进一步说明经过多次抗原刺激后，CD4+CD7-CAR-T细胞可能比CD8+CD7-CAR-T细胞具有更持久的细胞活性。
实施例13 CD7-CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用
为了评估CD7-CD7-CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，用T-ALL细胞系CEM细胞构建了小鼠异种移植模型。动物实验的实验方案如图16A所示。在D0天每只小鼠尾静脉注射0.2×105细胞，分为5组，分别是PBS组，MockT(T细胞)组，IL-2组，CD7-CAR-T组，CD7-CAR-T+IL2组，每组5只小鼠，在D2天分别尾静脉给药，CD7-CAR-T组每只小鼠注射3×106个细胞，CD7-CAR-T+IL2组每隔一天注射IL-2，观察小鼠的生存期。
结果如图16所示，与对照组(PBS组，Mock-T组，IL-2组)相比，CD7-CAR-T组和CD7-CAR-T+IL2组可以显著延长小鼠的生存期(CD7-CAR-T组小鼠目前全部存活，生存期比对照组延长了10天，实验尚未完成，仍在继续观察中)，说明CD7-CAR-T细胞可以显著抑制小鼠体内T细胞肿瘤细胞的生产，具有显著的体内抗肿瘤作用。
实施例14 CD7抗体的抗原表位的确定
为了确定PA3-17-CAR中的人源化CD7纳米抗体序列所识别的抗原表位，利用CD7抗原片段制备了表达载体，从而表达不同截短型的CD7抗原片段，并检测了CD7抗体与不同截短型抗原的结合，具体方法如下。
14.1 CD7抗原片段表达载体制备
分析目的抗原CD7的胞外段氨基酸序列信息，设计抗原的截短片段，每个片段截短10个氨基酸，依次进行截短，设计引物，进行PCR并亚克隆至目的载体Lenti-CMV-puro中(信号肽使用IL2信号肽，MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO：50)，利用EcoRI酶切位点)。
CD7截短片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：33-48所示。
14.2 CD7抗原不同截短型的表达及流式检测
(a)从冰箱中取出LVTransm转染试剂及抗体表达载体，室温解冻后，用移液枪上下吹打完全混匀。取出PBS缓冲液，温热至室温。取0.5mL PBS至6孔板的一个孔，分别加入6μgCD7不同截短型表达载体，移液枪上下吹打充分混匀后，加入18μL LVTransm，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10分钟。
(b)将上述DNA/LVTransm复合物加入到1.5mL 293F细胞中，轻轻晃动充分混匀。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱，130RPM培养6-8小时后，加入1.5mL新鲜的FreeStyleTM293Expression Medium培养基，将细胞重新放回培养箱中继续培养。
(c)连续培养48h后，离心，分别收集细胞，进行流式检测。
14.3流式检测CD7抗体与不同截短型抗原的结合
(a)收集4.2步骤转染的细胞，将每种细胞分为2份，每份细胞的数量为5x 105个细胞；
(b)分别孵育CD7的抗体(1ug/孔)，充分混匀后，室温孵育1小时；
(c)800xg室温离心5分钟，去掉含有抗体的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
(d)加入1uL PE标记的Anti-human IgG，充分混匀后，室温避光孵育30min；
(e)800xg室温离心5分钟，去掉含有二抗的上清，使用PBS洗涤细胞3次；
(f)使用500uL PBS重悬细胞，进行流式分析。
流式检测CD7抗体(PA3-17-CAR中的CD7抗体序列)与不同截短型抗原结合的结果如图19所示。
结果显示，CD7的抗原表位在胞外段的前10个氨基酸；通过信号肽预测分析，IL2信号肽的切割位置会多切割两个氨基酸，因此抗原表位应该在3-12个氨基酸。为了保证抗原的结构完整，后续进一步进行抗原表位的检测，通过点突变的方案；将每个氨基酸突变为侧链最小的Gly。后续实验设计抗原的3-12个氨基酸的点突变，每个位点突变为Gly，进行基因合成后亚克隆至Lenti-CMV-puro，构建抗原突变载体。
流式检测CD7抗体与不同位点突变的抗原结合的结果如图20所示。
结果显示，CD7抗体的抗原表位主要在28-37氨基酸，主要位点为29V，31Q，33P和35C。但具体的是线性表位或者空间表位通过检测结果不能进行判断。
抗原表位信息如下：
其中，下划线标记的序列为信号肽，加粗字体标记的序列(第28-37位)为检测所得的表位，即为CD7抗体识别的具体抗原表位。
实施例15 CD7抗体的膜蛋白组阵列实验
膜蛋白组阵列(Membrane Proteome Array，MPA)是一个可以分析抗体或配体靶向人膜蛋白特异性的平台，MPA可用于确定抗体的靶向特异性。这个平台是使用流式细胞仪直接检测抗体与未固定细胞表面膜蛋白的结合，因此，所有靶蛋白都具有蛋白原有的天然构象和适当的翻译后修饰。
对PA3-17-CAR中的人源化CD7纳米抗体序列进行了表达，然后用膜蛋白组阵列的方法检测了CD7抗体的特异性及靶向性，研究其是否有脱靶毒性。
具体地，用包含超过5300多种人膜蛋白的文库对本发明的CD7抗体进行了检测，文库包括94％的所有单次跨膜蛋白，多次跨膜蛋白以及GPI瞄定蛋白。
结果如图21所示，本发明的人源化CD7纳米抗体只与CD7蛋白有特异性结合，与其它膜蛋白不会有特异性结合。另外，由于本发明的CD7抗体中含有人Fc片段，所以会与人Fc受体FCGR1A蛋白有微弱的结合(不是CD7抗体的非特异结合)，说明本发明的PA3-17-CAR只会特异性识别CD7蛋白，不会与其它蛋白结合，不会产生脱靶毒性，进一步证明了本发明的PA3-17-CAR的特异性和安全性。
实施例16-19涉及CD-CAR-T细胞在急性髓细胞白血病中的应用，实验中涉及的部分材料和方法如下：
实验中使用的KG-1，Kasumi-1细胞购自American Type Culture(ATCC；Manassas，VA，USA)，HEL，AML5，HL-60，THP-1，细胞系由苏州大学唐仲英血液学研究中心赵昀老师实验室馈赠。RPMI1640和DMEM培养基购自Invitrogen公司，Tex-MACSTMGMP培养基、CD3/CD28磁珠购自美天旎生物技术有限公司。Fc抗体和Human Granzyme B，Human TNF，Human IL-2，Human IFN-γ细胞因子试剂盒购自BD公司，凋亡试剂盒Annexin V-APC/7-AAD apoptosiskit购自杭州联科生物公司。
实验中涉及的细胞培养方法如下：
HEL细胞、Kasumi-1细胞应用添加10％FBS的RP-MI 1640培养基培养。KG-1细胞应用添加10％FBS的IMDM培养基培养。
取正常人外周血，用Ficoll法提取PBMC，置于24孔板中培养(1×106个/孔)中，每孔加20μlCD3/CD28磁珠激活T细胞，应用添加IL-7和IL-15的TexMACSTMGMP培养基培养。所有细胞均在含有5％CO2、37℃饱和湿度的细胞培养箱中培养。提取的T细胞在体外激活后进行CD7-CAR病毒和/或CD7阻断病毒(CD7-blocking)的转染，待细胞增殖数量足够时进行体外毒性实验。
RTCA检测CD7-CAR T对肿瘤细胞的特异性杀伤
第一天将1×104个/100μl的293T和293T-CD7肿瘤细胞100μl铺于RTCA板中，第二天按5∶1和10∶1的效靶比将效应细胞T细胞和CD7-CAR T细胞依次加入第一天所铺的RTCA板中，补液至200μl，细胞生长指数每隔15min监测一次，观察细胞生长曲线。结束观察后，取上清液检测细胞因子。
流式细胞术检测CD7-CAR T细胞对肿瘤细胞的毒性作用
1×105个肿瘤细胞离心后应用carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE)按照1∶1000稀释后取100μl孵育15分钟，PBS洗两遍后铺24孔板，按1∶1的效靶比分别加入T细胞和CD7-CAR T细胞，补液至2ml。48h后从细胞培养箱中取出，停止共孵育，上清保留检测细胞因子，细胞使用凋亡检测试剂盒处理后流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡比例。
细胞因子检测
使用cytometric bead array(CBA)system检测效应细胞与肿瘤细胞共孵育后上清液中T细胞和CD7-CAR T细胞产生的细胞因子量，取50ul上清液，使用Human Granzyme BCBA Flex Set D7 Kit，Human TNF Flex Set D9 Kit，Human IL-2 Flex Set A4 Kit和Human IFN-γCBA Flex Set E7 Kit细胞因子试剂盒处理后，流式细胞仪检测细胞因子分泌量。
统计学处理
采用GraphPad Prism5软件，两组间比较用t-tests检验。以或****P＜0.0001和*P＜0.1表示差异有统计学意义。
实施例16 CD7阳性的AML细胞株的筛选
使用流式细胞术检测肿瘤细胞表面CD7的表达情况。收集六株AML细胞，分别是AML5，KG-1，HEL，HL-60，THP-1和Kasumi-1，细胞，离心弃上清，用PH＝7.4的PBS洗一遍，应用FITC-CD7抗体(1∶100)孵育20分钟后，PBS清洗两遍后，应用500微升PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞表面CD7表达。
流式细胞术检测结果如图22所示，KG-1细胞CD7表达率为97.61％(图22A)，HEL细胞CD7表达率为69.32％(图22B)，THP-1细胞CD7表达率为3.36％(图22C)，HL-60细胞CD7表达率为1.19％(图22D)，AML5细胞CD7表达率为0.50％(图22E)，Kasumi-1细胞CD7表达率为0.17％(图22F)。因此，选择KG-1，HEL，Kasumi-1细胞(CD7高、中、低表达)进行后期实验。
实施例17构建CD7-CAR T细胞并阻断其表面CD7的表达
由于正常T细胞表面也会有CD7的表达，为了防止发生自相残杀，需要阻断正常T细胞表面的CD7表达，目前有两种阻断的方法，一是基因敲除，另一种是蛋白阻断剂(ProteinExpression Rlocker，PEBL，即实施例1构建的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的CD7阻断分子)，其可以将CD7蛋白截留在内质网和高尔基体上，从而阻止目标蛋白表达。在本实施例中，使用蛋白阻断剂阻断T细胞表面的CD7表达。
利用本领域的常规技术手段构建靶向CD7的CAR(共刺激分子为CD28和41BB的CAR，氨基酸序列如SEQ ID N0：51所示)，依次包括纳米抗体CD7，人Fc序列、共刺激分子CD28、41BB序列和CD3ζ序列。
按照常规方法制备慢病毒。T细胞激活48h后置于48孔板(5×105个/孔)中，加入量为MOI＝30的病毒和15μl的蛋白阻断剂(Protein Expression Blocker，PEBL)，终体系为100μl，转染15h后补加1000ulTexMACSTMGMP培养基进行培养。
使用流式细胞术检测肿瘤细胞表面CD7的表达情况及CD7-CAR-T的转染率。将CD7-CAR T细胞及T细胞分别取出2×106个细胞，PBS洗一遍后应用APC-FC抗体(1∶1000)孵育30分钟后，PBS洗两遍，再应用FITC-CD7抗体(1∶100)孵育20分钟后，PBS洗一遍，应用500微升PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞CD7-CAR阳性率。
CD7-CAR与PEBL结构如图23A所示，其中CD7-CAR为CD7纳米抗体与CD28和41BB两个共刺激域共同组成的三代CAR。将阻断剂包装成病毒后对T细胞进行转染，发现5μl的PEBL就可以很好的阻断T细胞中的CD7(图23B)。为了评估CD7-CAR的病毒的转染效率，进行滴度检测，计算后滴度大概为5×109(图23C)。
接下来将PEBL和CD7-CAR的病毒共转染T细胞后，CD7-CAR T细胞的阳性率检测为31.97％，且表面的CD7被阻断(图23D)，可以用于后期的细胞毒性实验。
实施例18 CD7-CAR T特异性的杀伤表达CD7的肿瘤细胞
为了验证CD7-CAR T是否特异性的杀伤CD7阳性的肿瘤细胞，用RTCA监测T细胞和CD7-CAR T细胞分别加入铺有293T细胞和293T-CD7细胞的孔板后，对肿瘤细胞生长曲线的变化。应用5∶1和10∶1两个效靶比，96小时后结果显示，T细胞和CD7-CAR T细胞对293T细胞的生长并没有明显的差异。而与T细胞相比，CD7-CAR T细胞可以明显的抑制293T-CD7细胞的生长(图24A)。收取RTCA检测的上清液检测细胞因子分泌，结果与生长曲线图相吻合，CD7-CAR T与293T-CD7细胞共孵育组的TNF，Granzyme B，INF-γ明显高于其他组(图24B)。因此，本申请的CD7-CAR T可以特异性的杀伤表达CD7蛋白的肿瘤细胞。
实施例19 CD7-CAR T细胞对CD7阳性的细胞的特异性杀伤能力
将T细胞和CD7-CAR T细胞分别和KG-1细胞，HEL细胞，Kasumi-1细胞按1∶1的效靶比共孵育48小时，应用流式细胞仪分别检测凋亡细胞比例。结果显示，与T细胞相比，与CD7-CAR T细胞共孵育的KG-1细胞和HEL细胞几乎全部处于凋亡阶段，而Kasumi-1细胞在T细胞组和CD7-CAR T组基本无差异(E∶T＝1∶1：t＝147.1，P＜0.0001；E∶T＝1∶1：t＝23.57，P＜0.0001；图25A)。
取共孵育细胞培养液上清检测细胞因子分泌情况，与杀伤结果一致，与高表达和中度表达CD7的肿瘤细胞共孵育的CD7-CAR T细胞组的细胞因子分泌量明显高于其它组(E∶T＝1∶1：t＝4.042，P＜0.5；E∶T＝1∶1：t＝52.72，P＜0.0001；E∶T＝1∶1：t＝3.787，P＜0.5；E∶T＝1∶1：t＝18.59，P＜0.0001；E∶T＝1∶1：t＝103.3，P＜0.0001；图25B)。进一步证明了CD7-CAR T细胞可以很好的特异性杀伤CD7阳性的AML肿瘤细胞。
小结：本发明的主要内容是用CD7纳米抗体序列构建了一种可以有效阻断T细胞表面CD7分子膜表达的载体，并通过一系列实验证明了本发明构建的CD7阻断载体可以有效阻断T细胞表面CD7分子的表达；然后构建了6种不同结构的新型CD7-CAR-T细胞，靶向治疗CD7阳性的恶性肿瘤细胞，例如T细胞白血病和淋巴瘤。本发明公开了阻断CD7膜表达序列的结构图及序列、6种不同结构的CD7-CAR的结构及序列，展示了不同CD7-CAR-T细胞对CD7阳性T细胞肿瘤株，CD7过表达细胞株及原代T肿瘤细胞的相关体外功能实验数据，展示了本发明构建的CD7-CAR-T细胞对T细胞肿瘤细胞株CEM的体内抗肿瘤作用。综上所述，本发明构建的新型CD7-CAR-T细胞可以作为治疗T细胞急性淋巴细胞白血病的一种新型治疗手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司
<120> CD7-CAR-T细胞及其制备和应用
<130> P2022-0010
<150> CN201911150678.7
<151> 2019-11-21
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7阻断分子
<400> 1
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccccatgg acgtgcagct gcaggaaagc ggaggaggac tggtgcaggc aggaggatct 120
ctgaggctgt cttgcgcagt gtccggatac ccctacagca gctactgcat gggttggttc 180
agacaggccc caggaaagga gagagaggga gtggccgcta tcgatagcga cggaagaacc 240
agatacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcc aggacaacgc caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaaccg gatgaagccc gaggacaccg ccatgtacta ttgcgccgct 360
cgcttcggac ctatgggttg cgtggatctg agcaccctga gctttggcca ttggggacag 420
ggaacccagg tcaccgtgtc catcactgga ggaggaggaa gcggaggagg aggatctgga 480
ggaggaggaa gcggaggagg aggatctatg gacgtgcagc tgcaggagag cggaggagga 540
ctggtgcagg caggaggatc tctgagactg tcttgcgccg tgtccggata cccttacagc 600
agctactgca tgggctggtt caggcaggct ccaggaaagg agagagaggg agtggcagcc 660
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caggacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgaacc ggatgaagcc cgaggatacc 780
gccatgtact attgcgccgc caggttcgga cctatgggtt gcgtggacct gagcacactg 840
agcttcggcc attggggaca gggaacacag gtcaccgtgt ccatcaccga gcagaagctg 900
atcagcgagg aggacctgaa ggacgagctg tga 933
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<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7阻断分子
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
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Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
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Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp
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Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
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Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
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Thr Val Ser Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Val Gln Leu Gln Glu
165 170 175
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
180 185 190
Ala Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg
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Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp
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Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
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Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys
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Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met
260 265 270
Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly
275 280 285
Thr Gln Val Thr Val Ser Ile Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
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Asp Leu Lys Asp Glu Leu
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<212> DNA
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<223> 信号肽
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atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atcccc 66
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号肽
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CD7纳米抗体
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gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agccaggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga accggatgaa gcccgaggac accgccatgt actattgcgc cgctcgcttc 300
ggacctatgg gttgcgtgga tctgagcacc ctgagctttg gccattgggg acagggaacc 360
caggtcaccg tgtccatcac t 381
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7纳米抗体
<400> 6
Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly
35 40 45
Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser
100 105 110
Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ile Thr
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接肽
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ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接肽
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser
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<223> 内质网滞留序列
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 内质网滞留序列
<400> 10
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Lys Asp Glu Leu
1 5 10
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<211> 2238
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 11
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccatggacg tgcagctgca ggaaagcgga ggaggactgg tgcaggcagg aggatctctg 120
agactgtctt gcgccgtgtc cggataccct tacagcagct attgcatggg ttggttccgg 180
caggccccag gaaaagagag agaaggagtg gccgccatcg atagcgacgg caggaccaga 240
tacgccgata gcgtgaaggg caggttcacc atcagccagg acaacgccaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaaccggat gaagcccgag gacaccgcta tgtactattg cgccgcccgc 360
ttcggaccaa tgggctgcgt ggatctgtcc acactgagct tcggccattg gggacaggga 420
acacaggtca ccgtgtccat caccaccact accccagcac cgaggccacc caccccggct 480
cctaccatcg cctcccagcc tctgtccctg cgtccggagg catgtagacc cgcagctggt 540
ggggccgtgc atacccgtgg tcttgacttc gcctgcgatt tttgggtgct ggtggtcgtg 600
ggaggagtgc tggcttgtta cagcctgctg gtgaccgtgg ccttcatcat cttctgggtc 660
cggagcaaga gaagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc cagaagacca 720
ggccctacca gaaagcacta ccagccctac gcccctccta gagacttcgc cgcctacaga 780
agccgcgtga aattcagccg cagcgcagat gctccagcct acaagcaggg gcagaaccag 840
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ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt 1260
gaatttaaag actcactctc cataaatgct acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc 1320
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 12
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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His Ala Ala Arg Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
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Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
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Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
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Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
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Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 13
atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60
cccatggacg tgcagctgca ggaaagcgga ggaggactgg tgcaggcagg aggatctctg 120
agactgtctt gcgccgtgtc cggataccct tacagcagct attgcatggg ttggttccgg 180
caggccccag gaaaagagag agaaggagtg gccgccatcg atagcgacgg caggaccaga 240
tacgccgata gcgtgaaggg caggttcacc atcagccagg acaacgccaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaaccggat gaagcccgag gacaccgcta tgtactattg cgccgcccgc 360
ttcggaccaa tgggctgcgt ggatctgtcc acactgagct tcggccattg gggacaggga 420
acacaggtca ccgtgtccat caccggaggc ggcggaagcg gaggcggagg ctctggcgga 480
ggcggaagcg gcggaggcgg atctatggac gtgcagctgc aggaaagcgg aggaggactg 540
gtgcaggcag gaggatctct gagactgtct tgcgccgtgt ccggataccc ttacagcagc 600
tattgcatgg gttggttccg gcaggcccca ggaaaagaga gagaaggagt ggccgccatc 660
gatagcgacg gcaggaccag atacgccgat agcgtgaagg gcaggttcac catcagccag 720
gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag atgaaccgga tgaagcccga ggacaccgct 780
atgtactatt gcgccgcccg cttcggacca atgggctgcg tggatctgtc cacactgagc 840
ttcggccatt ggggacaggg aacacaggtc accgtgtcca tcaccaccac taccccagca 900
ccgaggccac ccaccccggc tcctaccatc gcctcccagc ctctgtccct gcgtccggag 960
gcatgtagac ccgcagctgg tggggccgtg catacccgtg gtcttgactt cgcctgcgat 1020
ttttgggtgc tggtggtcgt gggaggagtg ctggcttgtt acagcctgct ggtgaccgtg 1080
gccttcatca tcttctgggt ccggagcaag agaagcagag gcggccacag cgactacatg 1140
aacatgaccc ccagaagacc aggccctacc agaaagcact accagcccta cgcccctcct 1200
agagacttcg ccgcctacag aagccgcgtg aaattcagcc gcagcgcaga tgctccagcc 1260
tacaagcagg ggcagaacca gctctacaac gaactcaatc ttggtcggag agaggagtac 1320
gacgtgctgg acaagcggag aggacgggac ccagaaatgg gcgggaagcc gcgcagaaag 1380
aatccccaag agggcctgta caacgagctc caaaaggata agatggcaga agcctatagc 1440
gagattggta tgaaagggga acgcagaaga ggcaaaggcc acgacggact gtaccaggga 1500
ctcagcaccg ccaccaagga cacctatgac gctcttcaca tgcaggccct gccgcctcgg 1560
cccggggagg gcagaggcag cctgctgaca tgtggcgacg tggaagagaa ccctggcccc 1620
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tgtaacggaa taggtattgg tgaatttaaa gactcactct ccataaatgc tacgaatatt 1740
aaacacttca aaaactgcac ctccatcagt ggcgatctcc acatcctgcc ggtggcattt 1800
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agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 2100
tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 2160
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<210> 14
<211> 892
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 14
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
35 40 45
Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp
115 120 125
Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
130 135 140
Val Ser Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
180 185 190
Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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580 585 590
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820 825 830
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Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
885 890
<210> 15
<211> 2775
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 15
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tacgccgata gcgtgaaggg caggttcacc atcagccagg acaacgccaa gaacaccctg 300
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ggcctcttca tgtaa 2775
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<211> 924
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 16
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1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
35 40 45
Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
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100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp
115 120 125
Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
130 135 140
Val Ser Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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515 520 525
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580 585 590
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Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
675 680 685
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
690 695 700
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
705 710 715 720
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
725 730 735
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
740 745 750
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
755 760 765
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
770 775 780
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
785 790 795 800
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
805 810 815
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
820 825 830
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
835 840 845
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
850 855 860
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
865 870 875 880
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
885 890 895
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
900 905 910
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
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<210> 17
<211> 2211
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 17
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acactgaagc gcggtcggaa gaagctgctg tacatcttta agcaaccctt catgaggcct 1800
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ggctgcgaac tgcgcgtgaa attcagccgc agcgcagatg ctccagccta caagcagggg 1920
cagaaccagc tctacaacga actcaatctt ggtcggagag aggagtacga cgtgctggac 1980
aagcggagag gacgggaccc agaaatgggc gggaagccgc gcagaaagaa tccccaagag 2040
ggcctgtaca acgagctcca aaaggataag atggcagaag cctatagcga gattggtatg 2100
aaaggggaac gcagaagagg caaaggccac gacggactgt accagggact cagcaccgcc 2160
accaaggaca cctatgacgc tcttcacatg caggccctgc cgcctcggta a 2211
<210> 18
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly
35 40 45
Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp
115 120 125
Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
130 135 140
Val Ser Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
180 185 190
Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
195 200 205
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly
210 215 220
Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln
225 230 235 240
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly
260 265 270
Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr
275 280 285
Gln Val Thr Val Ser Ile Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
290 295 300
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
305 310 315 320
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
325 330 335
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
340 345 350
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
355 360 365
Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
370 375 380
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
385 390 395 400
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
405 410 415
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
420 425 430
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
435 440 445
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
450 455 460
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
465 470 475 480
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
485 490 495
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
500 505 510
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Trp Leu Pro Ile
515 520 525
Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile
530 535 540
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
545 550 555 560
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
565 570 575
Leu Thr Asp Val Thr Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
580 585 590
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
595 600 605
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
610 615 620
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
625 630 635 640
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
645 650 655
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
660 665 670
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
690 695 700
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
705 710 715 720
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
725 730 735
<210> 19
<211> 1770
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 19
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccccatgc aggtgcagct ggtggaaagc ggaggaggac tggtgcagcc aggaggatct 120
ctgagactgt cttgcgccgc cagcggctac ccctacagca gctactgcat gggttggttc 180
agacaggccc caggacaggg actggaagca gtggcagcca tcgatagcga cggcagaaca 240
cgctacgccg attccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggataccg cagtgtacta ttgcgccgcc 360
cgctttggac ctatgggttg cgtggacctg agcacactga gcttcggcca ttggggacag 420
ggaacactgg tgacagtgtc cagcgagagc aaatacggcc ctccttgccc tccttgccca 480
gccccagaat ttgagggagg acctagcgtg ttcctgttcc ctcccaagcc caaggacacc 540
ctgatgatca gccggacccc agaagtcacc tgcgtggtgg tggacgtgtc tcaggaagac 600
cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 660
cccagagagg agcagttcca gagcacctac agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcat 720
caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcctagc 780
agcatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccta gagagcctca ggtgtacaca 840
ctgccccctt ctcaggagga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacttg cctcgtgaag 900
ggcttctacc ccagcgatat tgccgtggag tgggagtcta acggccagcc cgagaacaac 960
tacaagacca cccctcccgt gctggatagc gacggctctt tcttcctgta cagccggctg 1020
acagtggaca aaagtcgctg gcaggagggc aacgtgttca gttgcagcgt gatgcacgag 1080
gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtctctgt ctctcggcaa gtggctccct 1140
atcggttgcg ccgcctttgt cgtcgtctgt atcctcggct gcatcctcat ctgttggctc 1200
accaagaaga agtacagcag cagcgtgcac gaccccaacg gcgagtacat gttcatgcgg 1260
gccgtcaaca ccgccaagaa gagcagactg accgacgtga ccctgaagag aggcaggaag 1320
aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc atgcggccag tgcagacaac ccaggaggaa 1380
gacggctgct cttgcagatt ccccgaggaa gaagagggcg gttgcgagct gagagtgaag 1440
ttcagcagaa gcgccgacgc tccagcctat cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag 1500
ctgaacctgg gcaggagaga ggagtacgac gtgctggaca agaggagagg cagagaccca 1560
gagatgggcg gcaagcctag acggaagaac cctcaggagg gcctgtacaa cgaactgcag 1620
aaggacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagag gagaagaggc 1680
aagggacacg acggactgta ccagggactg agcacagcca ccaaggacac atacgacgcc 1740
ctgcacatgc aggctctgcc tcctagatga 1770
<210> 20
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 20
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala
370 375 380
Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu
385 390 395 400
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
405 410 415
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
420 425 430
Val Thr Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
435 440 445
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
450 455 460
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
465 470 475 480
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
485 490 495
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
500 505 510
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
515 520 525
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
530 535 540
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
545 550 555 560
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
565 570 575
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
580 585
<210> 21
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 21
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccccatgc aggtgcagct ggtggaaagc ggaggaggac tggtgcagcc aggaggatct 120
ctgagactgt cttgcgccgc cagcggctac ccctacagca gctactgcat gggttggttc 180
agacaggccc caggacaggg actggaagca gtggcagcca tcgatagcga cggcagaaca 240
cgctacgccg attccgtgaa gggcagattc accatcagcc gggacaacag caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggataccg cagtgtacta ttgcgccgcc 360
cgctttggac ctatgggttg cgtggacctg agcacactga gcttcggcca ttggggacag 420
ggaacactgg tgaccgtgtc tagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga 480
ggaggaagcg gaggaggagg atctatgcag gtgcagctgg tggaatcagg aggaggactg 540
gtgcagccag gaggatctct gaggctgtct tgtgccgcca gcggatatcc ttacagcagc 600
tactgcatgg gttggttccg gcaggctcca ggacagggac tggaagcagt ggcagctatc 660
gacagcgacg gaagaaccag atacgccgac agcgtgaagg gcagattcac catcagccgg 720
gacaacagca agaacaccct gtacctgcag atgaacagcc tgagggccga ggatacagcc 780
gtgtactatt gcgccgcccg ctttggacca atgggctgcg tggatctgag cacactgagc 840
ttcggccatt ggggacaggg aacactggtg accgtgtcca gcgagagcaa atacggccct 900
ccttgccctc cttgtccagc cccagagttt gagggaggcc ctagcgtgtt cctgtttcct 960
cccaagccca aggacaccct gatgatcagc aggaccccag aagtgacttg cgtggtggtg 1020
gacgtgtctc aggaggaccc cgaggtgcag ttcaattggt acgtggacgg cgtggaggtg 1080
cacaacgcta agaccaagcc cagggaggag cagttccaga gcacctacag ggtggtgtcc 1140
gtgctgacag tgctgcacca ggattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 1200
aacaagggcc tgcccagcag catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcctaga 1260
gagcctcagg tgtacacact gcctcctagc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1320
ctgacttgcc tcgtgaaggg cttctacccc agcgatatcg ccgtggagtg ggagtctaat 1380
ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctccagtgc tggatagcga cggctctttc 1440
ttcctgtaca gccggctgac cgtggacaag tctaggtggc aggagggcaa cgtgttcagc 1500
tgtagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1560
ctgggaaagt ggctccctat cggttgcgca gctttcgtcg tcgtctgcat cctgggttgc 1620
atcctcatct gctggctgac caagaagaag tacagctcta gcgtgcacga ccctaacggc 1680
gagtacatgt tcatgcgggc cgtcaacacc gccaagaaga gcaggctgac cgacgtgaca 1740
ctgaagaggg gccggaagaa gctgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggccagtg 1800
cagacaacac aggaggagga cggttgcagc tgcagatttc cagaggagga ggaaggcggc 1860
tgcgagctga gagtgaagtt cagccggagc gcagacgctc cagcttatca gcagggacag 1920
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc aggagggagg agtacgacgt gctggacaag 1980
aggagaggca gagatccaga gatgggcgga aagcccagga gaaagaaccc tcaggagggc 2040
ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg gccgaggctt acagcgagat cggcatgaag 2100
ggcgagagaa gaagaggcaa gggacacgac ggcctgtatc agggactgag cacagccaca 2160
aaggacacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcctc ctagatga 2208
<210> 22
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 22
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln
195 200 205
Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ala Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly
210 215 220
Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
225 230 235 240
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly
260 265 270
Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr
275 280 285
Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
290 295 300
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
305 310 315 320
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
325 330 335
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
340 345 350
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
355 360 365
Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
370 375 380
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
385 390 395 400
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
405 410 415
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
420 425 430
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
435 440 445
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
450 455 460
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
465 470 475 480
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
485 490 495
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
500 505 510
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Trp Leu Pro Ile Gly
515 520 525
Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly Cys Ile Leu Ile Cys
530 535 540
Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly
545 550 555 560
Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu
565 570 575
Thr Asp Val Thr Leu Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
580 585 590
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
595 600 605
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
610 615 620
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
625 630 635 640
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
645 650 655
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
660 665 670
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
675 680 685
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
690 695 700
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
705 710 715 720
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
725 730 735
<210> 23
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 截短的EGFR序列
<400> 23
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
50 55 60
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
85 90 95
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
115 120 125
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
130 135 140
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
145 150 155 160
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
180 185 190
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
195 200 205
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
210 215 220
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
225 230 235 240
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
260 265 270
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
275 280 285
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
290 295 300
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
340 345 350
<210> 24
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7纳米抗体人源化序列
<400> 24
Met Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser
20 25 30
Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Ala
35 40 45
Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val Asp Leu Ser Thr Leu Ser
100 105 110
Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc铰链区
<400> 25
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 26
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 26
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 27
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28跨膜区和胞内区
<400> 27
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 28
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ICOS跨膜区
<400> 28
Trp Leu Pro Ile Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Cys Ile Leu Gly
1 5 10 15
Cys Ile Leu Ile Cys Trp Leu
20
<210> 29
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ICOS胞内区
<400> 29
Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr
1 5 10 15
Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg Leu Thr Asp
20 25 30
Val Thr Leu
35
<210> 30
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 4-1BB胞内区
<400> 30
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD3ζ胞内信号传导区
<400> 31
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 32
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 连接肽
<400> 32
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 33
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 33
Ala Gln Glu Val Gln Gln Ser Pro His Cys Thr Thr Val Pro Val Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly Ile
20 25 30
Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu
35 40 45
Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln
65 70 75 80
Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn
85 90 95
Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln
100 105 110
Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala
130 135 140
Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val
145 150 155 160
Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
165 170 175
Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala
180 185 190
Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu
195 200 205
Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
210 215
<210> 34
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 34
Thr Thr Val Pro Val Gly Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys Ser Thr Ser
1 5 10 15
Gly Gly Leu Arg Gly Ile Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln
20 25 30
Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg
35 40 45
Phe Arg Gly Arg Ile Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile
50 55 60
Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln
65 70 75 80
Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val
85 90 95
Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro
100 105 110
Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp
115 120 125
Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu
130 135 140
Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly
145 150 155 160
Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp
165 170 175
Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His
180 185 190
Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
195 200 205
<210> 35
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 35
Ile Thr Cys Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly Ile Tyr Leu Arg Gln
1 5 10 15
Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu Asp Gly Val Val
20 25 30
Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp Phe Ser Gly Ser
35 40 45
Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr
50 55 60
Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser
65 70 75 80
Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg
85 90 95
Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr
100 105 110
Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro
115 120 125
Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu
130 135 140
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile
145 150 155 160
Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val
165 170 175
Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn
180 185 190
Gln Tyr Gln
195
<210> 36
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 36
Gly Ile Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr
1 5 10 15
Tyr Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg
20 25 30
Ile Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg
35 40 45
Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu
50 55 60
Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln
65 70 75 80
Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala
100 105 110
Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val
130 135 140
Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn
145 150 155 160
Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn
165 170 175
Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
180 185
<210> 37
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 37
Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr Asp
1 5 10 15
Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu
20 25 30
Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr
35 40 45
Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val
50 55 60
Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala
65 70 75 80
Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu
85 90 95
Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly
115 120 125
Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys
130 135 140
Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met
145 150 155 160
Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
165 170 175
<210> 38
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 38
Val Val Pro Thr Thr Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp Phe Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser
20 25 30
Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr
35 40 45
Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp
50 55 60
His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro
65 70 75 80
Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro
85 90 95
Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser
100 105 110
Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr
115 120 125
Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys
130 135 140
Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser
145 150 155 160
Pro Asn Gln Tyr Gln
165
<210> 39
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 39
Gly Arg Ile Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn Leu Thr Ile Thr Met
1 5 10 15
His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile
20 25 30
Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu
35 40 45
Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala
50 55 60
Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln
65 70 75 80
Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala
100 105 110
Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp
115 120 125
Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg
130 135 140
Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
145 150 155
<210> 40
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 40
Asn Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr
1 5 10 15
Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser
35 40 45
Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser
50 55 60
Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys
100 105 110
Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu
115 120 125
Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr
130 135 140
Gln
145
<210> 41
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 41
Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln
20 25 30
Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro
35 40 45
Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala
50 55 60
Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val
65 70 75 80
Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala
85 90 95
Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala
100 105 110
Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu
115 120 125
Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
130 135
<210> 42
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 42
Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu Val Leu Val
1 5 10 15
Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp
35 40 45
Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu
50 55 60
Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly
65 70 75 80
Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp
85 90 95
Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His
100 105 110
Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
115 120 125
<210> 43
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 43
Gly Thr Leu Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg
1 5 10 15
Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr
20 25 30
Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro
35 40 45
Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu
50 55 60
Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile
65 70 75 80
Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val
85 90 95
Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn
100 105 110
Gln Tyr Gln
115
<210> 44
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 44
Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala
1 5 10 15
Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala
20 25 30
Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu
35 40 45
Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val
50 55 60
Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn
65 70 75 80
Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn
85 90 95
Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
100 105
<210> 45
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 45
Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala Leu
1 5 10 15
Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser
20 25 30
Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly
35 40 45
Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys
50 55 60
Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met
65 70 75 80
Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
85 90 95
<210> 46
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 46
Pro Thr Gly Ser Ala Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro
1 5 10 15
Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr
35 40 45
Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys
50 55 60
Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser
65 70 75 80
Pro Asn Gln Tyr Gln
85
<210> 47
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 47
Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala Ser Ala Leu Pro Ala
1 5 10 15
Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Val Ala
20 25 30
Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Arg Asp
35 40 45
Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp Met Ser His Ser Arg
50 55 60
Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
65 70 75
<210> 48
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD7截短片段
<400> 48
Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys
20 25 30
Leu Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu
35 40 45
Asp Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr
50 55 60
Gln
65
<210> 49
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗原表位
<400> 49
Met Ala Gly Pro Pro Arg Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Ala Arg Gly Leu Pro Gly Ala Leu Ala Ala Gln Glu Val Gln Gln Ser
20 25 30
Pro His Cys Thr Thr Val Pro Val Gly Ala Ser Val Asn Ile Thr Cys
35 40 45
Ser Thr Ser Gly Gly Leu Arg Gly Ile Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Pro
50 55 60
Gln Pro Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr Glu Asp Gly Val Val Pro Thr Thr
65 70 75 80
Asp Arg Arg Phe Arg Gly Arg Ile Asp Phe Ser Gly Ser Gln Asp Asn
85 90 95
Leu Thr Ile Thr Met His Arg Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Thr Tyr
100 105 110
Thr Cys Gln Ala Ile Thr Glu Val Asn Val Tyr Gly Ser Gly Thr Leu
115 120 125
Val Leu Val Thr Glu Glu Gln Ser Gln Gly Trp His Arg Cys Ser Asp
130 135 140
Ala Pro Pro Arg Ala Ser Ala Leu Pro Ala Pro Pro Thr Gly Ser Ala
145 150 155 160
Leu Pro Asp Pro Gln Thr Ala Ser Ala Leu Pro Asp Pro Pro Ala Ala
165 170 175
Ser Ala Leu Pro Ala Ala Leu Ala Val Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu
180 185 190
Gly Leu Gly Val Ala Cys Val Leu Ala Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu
195 200 205
Cys Ser Trp Arg Asp Lys Asn Ser Ala Ala Cys Val Val Tyr Glu Asp
210 215 220
Met Ser His Ser Arg Cys Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Gln Tyr Gln
225 230 235 240
<210> 50
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号肽
<400> 50
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 51
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗原受体
<400> 51
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser
35 40 45
Gly Tyr Pro Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Arg Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Arg Met Lys Pro Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Phe Gly Pro Met Gly Cys Val
115 120 125
Asp Leu Ser Thr Leu Ser Phe Gly His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ile Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
145 150 155 160
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
165 170 175
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
180 185 190
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
195 200 205
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
210 215 220
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
245 250 255
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
260 265 270
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
275 280 285
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
290 295 300
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
305 310 315 320
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
325 330 335
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
340 345 350
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
355 360 365
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val
370 375 380
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
385 390 395 400
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser
405 410 415
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
420 425 430
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys
435 440 445
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
450 455 460
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
465 470 475 480
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
485 490 495
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
500 505 510
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
515 520 525
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
530 535 540
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
545 550 555 560
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
565 570 575
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
580 585 590
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
595 600

Claims (13)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述CAR的抗原结合结构域包括一个或多个CD7纳米抗体，所述的CD7纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示，所述CAR的结构如下式I所示：
L-VHH-H-TM-C-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L为信号肽序列；
VHH为包含一个或两个CD7纳米抗体的抗原结合结构域；
H为铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
2.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的CAR包含ICOS来源的胞内共刺激区和4-1BB来源的胞内共刺激区。
3.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的H为来源于Fc片段的铰链区。
4.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述的TM为ICOS来源的跨膜区。
5.如权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述CAR还包括细胞自杀元件。
6.如权利要求5所述的CAR，其特征在于，所述细胞自杀元件位于CAR的C端。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的CAR，或所述核酸分子编码权利要求1所述的CAR和一种CD7阻断分子；
所述的CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
8.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求7所述的核酸分子。
9.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞含有权利要求8所述的载体、或染色体中整合有外源的权利要求5所述的核酸分子、或表达权利要求1所述的CAR、或表达权利要求1所述的CAR和一种CD7阻断分子；
所述的CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
10.一种权利要求1所述的CAR、或权利要求9所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
11.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供一待改造的免疫细胞；和
(2)将用于表达权利要求1所述的CAR的第一表达盒导入到所述免疫细胞；和
(3)将用于表达一种CD7阻断分子的第二表达盒导入到所述免疫细胞，从而获得所述的工程化免疫细胞；
所述的CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
12. 一种试剂组合，其特征在于，所述的试剂组合包括：
(1) 第一病毒载体，所述第一病毒载体含有第一表达盒，所述的第一表达盒用于表达权利要求1所述的CAR；和
(2) 第二病毒载体，所述第二病毒载体含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达一种CD7阻断分子；
所述的CD7阻断分子包括一个或多个CD7纳米抗体和内质网滞留序列。
13.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求9所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
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